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Este artículo se encuentra disponible en la siguiente URL: https://onlinelibrary.wiley.com/doi/epdf/10.1111/tbed.13737 En este artículo de investigación también participan: Marta Cerdà Cuéllar, Teresa Ayats, Jaume Jordá, Clara Marín y Santiago Vega. This is the pre-peer reviewed version of the following article: Sevilla-Navarro, S., Cerdà-Cuéllar, M., Ayats, T., Jordá, J., Marin, C., & Vega, S. (2021). Characterization of "Salmonella Frintrop" isolated from dromedary camels (Camelus dromedarius). Transboundary and Emerging Diseases, vol. 68, i. 2 (mar.), pp. 742?746, which has been published in final form at https://doi.org/10.1111/tbed.13737. This article may be used for non-commercial purposes in accordance with Wiley Terms and Conditions for Use of Self-Archived Versions. Este es el pre-print del siguiente artículo: Sevilla-Navarro, S., Cerdà-Cuéllar, M., Ayats, T., Jordá, J., Marin, C., & Vega, S. (2021). Characterization of "Salmonella Frintrop" isolated from dromedary camels (Camelus dromedarius). Transboundary and Emerging Diseases, vol. 68, i. 2 (mar.), pp. 742?746, que se ha publicado de forma definitiva en https://doi.org/10.1111/tbed.13737. Different studies have reported the prevalence and antibiotic resistance of Salmonella in dromedaries’ camels and its role in camelid-associated salmonellosis in humans, but little is known about the epidemiology of Campylobacter in dromedaries. Here we investigate the prevalence, genetic diversity and antibiotic resistance of Campylobacter and Salmonella in dromedary camels (Camelus dromedarius). A total of 54 individuals were sampled from two unique dromedary farms located in Tenerife (Canary Islands, Spain). Whilst all the samples were Campylobacter-negative, Salmonella prevalence was 5.5% (3/54) and the only serovar isolated was S. Frintrop. The pulsed field gel electrophoresis analysis revealed a low genetic diversity, with all isolates showing a nearly identical pulsotype (similarity > 95%). Our results indicate that dromedaries’ camels could not be a risk factor for Campylobacter human infection, but seems to be a reservoir for Salmonella transmission. Since camel ride has become one of the main touristic attractions in several countries and its popularity has considerably risen in the last years, a mandatory control, especially for zoonotic pathogens, such as Campylobacter and Salmonella should be implemented. Preprint

The emergence of new pathogens is a major threat to public and veterinary health. Changes in bacterial habitat such as a switch in host or disease tropism are typically accompanied by genetic diversification. Staphylococcus aureus is a multi-host bacterial species associated with human and livestock infections. A microaerophilic subspecies, Staphylococcus aureus subsp. anaerobius, is responsible for Morel’s disease, a lymphadenitis restricted to sheep and goats. However, the evolutionary history of S. aureus subsp. anaerobius and its relatedness to S. aureus are unknown. Population genomic analyses of clinical S. aureus subsp. anaerobius isolates revealed a highly conserved clone that descended from a S. aureus progenitor about 1000 years ago before differentiating into distinct lineages that contain African and European isolates. S. aureus subsp. anaerobius has undergone limited clonal expansion, with a restricted population size, and an evolutionary rate 10-fold slower than S. aureus. The transition to its current restricted ecological niche involved acquisition of a pathogenicity island encoding a ruminant host-specific effector of abscess formation, large chromosomal re-arrangements, and the accumulation of at least 205 pseudogenes, resulting in a highly fastidious metabolism. Importantly, expansion of ~87 insertion sequences (IS) located largely in intergenic regions provided distinct mechanisms for the control of expression of flanking genes, including a novel mechanism associated with IS-mediated anti-anti-sense decoupling of ancestral gene repression. Our findings reveal the remarkable evolutionary trajectory of a host-restricted bacterial pathogen that resulted from extensive remodelling of the S. aureus genome through an array of diverse mechanisms in parallel., Author summary The emergence of new pathogens is a major threat to public and veterinary health. Some bacteria such as Staphylococcus aureus, have the capacity to infect many different host species including humans and livestock while others such as the closely-related S. aureus subsp. anaerobius, associated with a single type of pathology called Morel’s disease in small ruminants, are highly niche-restricted. However, our understanding of the genetic basis for such differences in bacterial host-tropism is very limited. Here, we discovered that S. aureus subsp. anaerobius evolved from an S. aureus ancestor and underwent an array of extensive changes to its genome that accompanied the transition to its current restricted lifestyle. We observed genome decay involving loss of function of hundreds of genes, large intra-chromosomal rearrangements affecting most of the genome, acquisition of a pathogenicity island, and expansion of large numbers of insertion sequences that are inserted at intergenic sites around the genome. Importantly, we found that IS elements affect the expression of neighbouring genes in different ways including a novel mechanism of IS-enabled disruption of ancestral gene repression. Taken together, we provide a remarkable example of radical genomic changes associated with evolutionary transition from a multi-host to highly restricted host ecology.

Tesis doctoral.-- Universidad de Barcelona. Programa de doctorado en biotecnología., Mycoplasma pneumoniae y Mycoplasma genitalium son dos patógenos humanos que infectan tejido pulmonar y urogenital respectivamente. El mecanismo principal para llevar a cabo la infección es a través de la adhesión a las células huésped por una pequeña protuberancia llamada Organela terminal (OT). En la membrana de esta OT se encuentra un complejo multiproteico, denominado Nap, compuesto por un dímero de heterodímeros de las proteínas P1 y P40/P90 en M. pneumoniae, o P140 y P110 en M. genitalium. P1 ha sido el foco de numerosos estudios, identificándola como la adhesina principal del complejo Nap en M. pneumoniae. Además de la función de adhesión, las proteínas de los Naps también participan en otros procesos esenciales para la patogenicidad, como son la motilidad y la evasión del sistema inmune. En nuestro laboratorio se determinó hace unos años la estructura del ectodominio de la proteína P110 de M. genitalium (Aparicio et al., Nature comm. 2018). Continuando la investigación sobre las proteínas que componen el Nap, el objetivo principal de esta Tesis doctoral ha sido determinar la estructura tridimensional de P140 (M. genitalium) y de P1 y P40/P90 (M. pneumoniae), estudiando también el papel que desempeñan estas proteínas en adhesión, motilidad e inmunogenicidad. El primer capítulo presenta la obtención, mediante cristalografía de rayos X, de la estructura del dominio C de P140. La estructura se resolvió en dos grupos espaciales cristalográficos diferentes: I) tetragonal I422, a 1.43 Å de resolución, con una molécula en la unidad asimétrica y II) monoclínico C2, a 1.92 Å, con ocho moléculas en la unidad asimétrica. El análisis estructural ha proporcionado dos resultados que cabe destacar aquí: I) El dominio C de P140 puede formar oligómeros (octámeros) compactos; II) Por otro lado, las grandes diferencias entre las diversas conformaciones halladas del dominio C, cuando a posteriori se pudo disponer de la estructura del ectodominio completo de P140, indican la gran plasticidad de este dominio y sugieren un papel importante de esa plasticidad en el funcionamiento del Nap. El segundo capítulo corresponde a la determinación de la estructura de P140 y del complejo P110-P140. P140 se resolvió a través de un procedimiento en el cual fue crítica la información proporcionada por crio-tomografía electrónica (crio-ET) del Nap y por diversos cristales tanto de P140 como de P1. En este trabajo también se pudieron modelar diversas conformaciones del Nap a través del “docking” de las estructuras de P140 y P110 en los correspondientes mapas de crio-ET y de crio-microscopía electrónica (crio-EM).

La revolución genómica, a través del desarrollo de las tecnologías de secuenciación masiva (o de alto rendimiento, HTS), ha beneficiado enormemente a la Microbiología. Gracias a las posibilidades que ofrece esta tecnología, en los últimos años se ha incrementado en gran medida el número de estudios en microbiología clínica y epidemiología que la aplican. Sin embargo, su implementación rutinaria en clínica aún está lejos de ser una realidad en muchos países, por lo que se requiere de más investigación para madurar su uso y solventar los obstáculos que presenta. En este trabajo, el objetivo principal es mostrar la utilidad de esta tecnología para el estudio de tres patógenos bacterianos y su epidemiología, mediante su aplicación en cuatro casos distintos. En el primer capítulo se aborda el estudio de la epidemiología genómica de Neisseria gonorrhoeae en tres regiones españolas. Gracias a la obtención de los genomas completos, se pudo profundizar en su estructura poblacional y en su epidemiología. Asimismo, se pudo llevar a cabo la detección de determinantes de resistencia a antibióticos presentes en la población gonocócica en España. En el segundo capítulo se aplica por primera vez esta tecnología para la resolución de un caso de transmisión de gonorrea en el contexto de un caso forense de posibles abusos a una menor. Gracias a su poder de resolución, se pudo discriminar entre los aislados de los implicados en el caso y los aislados procedentes de pacientes control. Esto no fue posible con técnicas clásicas de biología molecular, por lo que se evidencia la utilidad de la HTS en este tipo de casos. En el tercer capítulo se investiga la relación genética entre los aislados de dos brotes nosocomiales producidos por Serratia marcescens. En esta ocasión, evaluamos el impacto de la elección de un genoma de referencia para investigar un brote. Si la referencia usada es demasiado cercana genéticamente a los aislados del brote no se podrá definir al brote como tal. Finalmente, en el cuarto capítulo se investiga la recombinación de Lactococcus garvieae a varios niveles taxonómicos. Su secuenciación usando reads largos permitió el ensamblado completo de su genoma, permitiendo un análisis más completo. The genomic revolution, through the development of the high-throughput, sequencing (HTS) technologies, has greatly benefited Microbiology. Thanks to the possibilities offered by HTS, in recent years the number of studies in clinical microbiology and epidemiology that apply it has increased. However, its routine implementation in the clinic is still far from being a reality in many countries, so more research is required to mature its use and solve the obstacles it presents. In this work, the main objective is to show the usefulness of this technology for the study of three bacterial pathogens and their epidemiology, through its application in four different cases. The first chapter addresses the study of the genomic epidemiology of Neisseria gonorrhoeae in three Spanish regions. Thanks to obtaining the complete genomes, it was possible to delve into its population structure and its epidemiology. Likewise, it was possible to carry out the detection of determinants of resistance to antibiotics present in the gonococcal population in Spain. In the second chapter, HTS is applied for the first time to solve a case of transmission of gonorrhea in the context of a forensic case of possible abuse of a minor. Thanks to its resolution power, it was possible to discriminate between isolates from those involved in the case and those from control patients. This was not possible with the classical molecular biology techniques. These results show the usefulness of HTS in this type of cases. The third chapter investigates the genetic relationship between the isolates of two nosocomial outbreaks produced by Serratia marcescens. On this occasion, we evaluate the impact of choosing a reference genome to investigate an outbreak. If the reference used is too close genetically to the isolates of the outbreak, the outbreak cannot be defined as such. Finally, the fourth chapter investigates the recombination of Lactococcus garvieae at different taxonomic levels. Its sequencing using long reads technology allowed the complete assembly of its genome, allowing a more complete analysis.

El conocimiento de la comunicación bacteriana, o quorum sensing (QS), es crucial para el desarrollo de nuevos agentes antimicrobianos. Esta tesis ofrece un enfoque novedoso para explicar la regulación del QS dependiente de proteínas LuxR bajo el marco de la teoría de la percolación. Además, propone nuevos mecanismos de inactivación de estos sistemas. En concreto, se centra sobre el diseño y optimización de nanopartículas a base de quitosano (CS NPs) para interferir con el QS. Un hallazgo clave de la tesis es que las CS NPs interaccionan con las bacterias e inhiben el QS en momentos específicos del crecimiento. El trabajo plasmado en esta tesis abre el horizonte para la aplicación de CS NPs al control de la virulencia de bacterias patógenas.

The abuse and misuse of antibiotics, such as through self-medication, treatment dropout, or cattle fattening, result in the emergence of resistant or multi-resistant pathogenic bacteria. This emergence could be due to an increased selective pressure that kills sensitive strains, new antibiotic resistances appearing at a faster rate than in nature, with higher minimum inhibitory concentrations (MICs), and than the drug discovery process. Awareness and a drop in consumption seem essential to slow down this rate of increased resistance. In this study, we asked ourselves if controlling the use of antibiotics and, hence, a drop in selective pressure are sufficient for resistant pathogenic bacteria to revert to their sensitive condition. To answer this question, we carried out a bibliographic review. The analyzed data suggests that bacteria will compensate for the fitness cost due to their high adaptive capacity. Therefore, bacterial resistance will not be reverted just by lowering the selective pressure. We suggest further research on bacterial evolution at the molecular level is necessary in order to find a solution to this problem as soon as possible. El abuso y el mal uso de los antibióticos como, por ejemplo, la automedicación, el abandono de tratamientos o su utilización para el engorde de animales de granja, da como resultado la aparición de bacterias patógenas resistentes o multirresistentes a antibióticos. Posiblemente, esto se deba a un exceso de presión selectiva que permite eliminar la competencia de cepas sensibles, apareciendo nuevas resistencias a antibióticos a una velocidad mayor que en la naturaleza, con concentraciones mínimas inhibitorias (CMI) más altas y en menos tiempo que el requerido para crear nuevos fármacos. Para frenar este avance, la sensibilización, la concienciación y la bajada en el consumo parecen fundamentales. En este estudio, nos preguntamos si el control del uso de los antibióticos y, por tanto, la bajada en la presión selectiva es suficiente para que las bacterias patógenas resistentes o multirresistentes reviertan a su condición de sensibles. Para dar respuesta a esta pregunta, hemos llevado a cabo un análisis bibliográfico. Tras analizar los datos, todo parece indicar que las bacterias resistentes no van a revertir al estado de sensibles tras bajar solamente la presión selectiva debido a su gran capacidad de adaptación. Sugerimos, entre otras cosas, una mayor investigación sobre la evolución bacteriana a nivel molecular, para encontrar cuanto antes una solución a este problema. O abuso e uso indevido de antibióticos, como por exemplo, a automedicação, o abandono de tratamentos ou o uso para engordar animais de criação, têm como resultado o aparecimento de bactérias patogénicas resistentes ou multirresistentes aos antibióticos. Provavelmente, devido ao excesso de pressão seletiva que permite eliminar a competência de cepas sensíveis, aparecendo novas resistências aos antibióticos com uma rapidez superior à que ocorre na natureza, com concentrações mínimas inibitórias (CIM) mais altas e em menos tempo do que o necessário, para a criação de novos medicamentos. Para conter este avanço é fundamental, a sensibilização, a conscientização e a diminuição do consumo. Neste estudo, questionamos se o controle do uso de antibióticos e portanto, a redução da pressão seletiva é suficiente, para que as bactérias patogénicas resistentes ou multirresistentes voltem à sua condição de sensíveis. Para responder a esta pergunta, realizamos uma análise bibliográfica. Depois de analisar os dados, tudo parece indicar que depois de baixar apenas a pressão seletiva, as bactérias resistentes não voltarão ao seu estado sensível, devido à sua grande adaptabilidade. Sugerimos, entre outras coisas, estudos adicionais sobre a evolução bacteriana a nível molecular, para encontrar uma solução para este problema, o mais breve possível.

Pathogenic bacteria and metastasic tumor cells try to spread to new parts of the human body and survive to the immune response. Since both need to overcome the same obstacles, the aim of the study is to find common characteristics between both processes, starting from the so called moonlighting proteins. Moonlighting proteins are multifunctional proteins and in bacteria are usually virulence factors. Therefore, functions associated with them are related to the infection and survival of the pathogen. It is wanted to identify the functions that are mostly shared between virulence moonlighting proteins and metastasic proteins. In order to perform this comparison, metastasic proteins were divided according to the processes in which they were involved: glucose metabolism, remodeling/regeneration of tissues, interaction with plasminogen and interaction with extracellular matrix. Subsequently, their GO terms were compared to those of the moonlighting proteins, differentiating which of them were virulence factors. The results obtained showed that GO terms related to the binding to extracelullar matrix, such as collagen, fibronectin or laminin, are widely represented among virulence moonlighting proteins and metastasic proteins. Further investigation is needed to prove if the binding sites used by both types of proteins are the same, if they share binding sequences or to discover new blocker drugs specific of these binding sites. Tanto las bacterias patógenas como las células tumorales metastásicas luchan por diseminarse por el cuerpo humano y sobrevivir a la respuesta del Sistema Inmunitario. Al tener que superar los mismos obstáculos, el objetivo del estudio es encontrar los puntos comunes entre ambos procesos, partiendo de las proteínas moonlighting. Las proteínas moonlighting son proteínas multifuncionales que en bacterias suelen actuar como factores de virulencia, por lo que las funciones asociadas a ellas están relacionadas con la infección y la supervivencia del patógeno. Se quiere comprobar qué funciones están compartidas en mayor medida entre proteínas moonlighting de virulencia y proteínas relacionadas con la metástasis. Para realizar la comparación, las proteínas metastásicas se dividieron por procesos en las que estaban involucradas: metabolismo de glucosa, remodelación/regeneración de tejidos, interacción con plasminógeno e interacción con la matriz extracelular. Posteriormente, se compararon sus códigos GO con los de las proteínas moonlighting, diferenciando las que son factores de virulencia de las que no. Los resultados obtenidos indican que los códigos GO relacionados con la unión a proteínas de la matriz extracelular, como el colágeno, fibronectina o laminina, están ampliamente representados entre las proteínas moonlighting de virulencia y proteínas metastásicas. Son necesarios más estudios para comprobar si los sitios de unión que utilizan ambos tipos de proteínas son los mismos, si comparten secuencias de unión, descubrir nuevos fármacos bloqueadores de sitios de unión etc. Tant els bacteris patògens com les cèl·lules tumorals metastàsiques lluiten per disseminar-se pel cos humà i sobreviure a la resposta del Sistema Immunitari. En haver de superar els mateixos obstacles, l'objectiu de l'estudi és trobar els punts comuns entre tots dos processos, partint de les proteïnes moonlighting. Les proteïnes moonlighting són proteïnes multifuncionals que en bacteris solen actuar com a factors de virulència, per la qual cosa les funcions associades a elles estan relacionades amb la infecció i la supervivència del patogen. Es vol comprovar quines funcions estan compartides en major mesura entre proteïnes moonlighting de virulència i proteïnes relacionades amb la metàstasi. Per a realitzar la comparació, les proteïnes metastàsiques es van dividir per processos en les quals estaven involucrades: metabolisme de glucosa, remodelació/regeneració de teixits, interacció amb plasminogen i interacció amb la matriu extracelul·lar. Posteriorment, es van comparar els seus codis GO amb els de les proteïnes moonlighting, diferenciant les que són factors de virulència de les quals no. Els resultats obtinguts indiquen que els codis GO relacionats amb la unió a proteïnes de la matriu extracelul·lar, com el col·lagen, fibronectina o laminina, estan àmpliament representats entre les proteïnes moonlighting de virulència i proteïnes metastásicas. Són necessaris més estudis per a comprovar si els llocs d'unió que utilitzen tots dos tipus de proteïnes són els mateixos, si comparteixen seqüències d'unió, descobrir nous fàrmacs blocadors de llocs d'unió etc.

Este artículo se encuentra disponible en la siguiente URL: https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/tbed.13470 This is the peer reviewed version of the following article: Sevilla, E., Marín, C., Delgado-Blas, JF., González-Zorn, B., Vega, S., Kuijper, E., Bolea, R. & Mainar-Jaime, RC. Wild griffon vultures (Gyps fulvus) fed at supplementary feeding stations: Potential carriers of pig pathogens and pig-derived antimicrobial resistance?. Transbounddary and Emergency Diseases, vol. 67, i. 3 (may 2020), pp. 1295-1305, which has been published in final form at https://doi.org/10.1111/tbed.13470. This article may be used for non-commercial purposes in accordance with Wiley Terms and Conditions for Use of Self-Archived Versions. Este es el post-print del siguiente artículo: Sevilla, E., Marín, C., Delgado-Blas, JF., González-Zorn, B., Vega, S., Kuijper, E., Bolea, R. & Mainar-Jaime, RC. Wild griffon vultures (Gyps fulvus) fed at supplementary feeding stations: Potential carriers of pig pathogens and pig-derived antimicrobial resistance?. Transbounddary and Emergency Diseases, vol. 67, i. 3 (may 2020), pp. 1295-1305, que se ha publicado de forma definitiva en https://doi.org/10.1111/tbed.13470 The carriage of two important pathogens of pigs, i.e. enterotoxigenic E. coli (ETEC) and Clostridioides difficile, was investigated in 104 cloacal samples from wild griffon vultures (Gyps fulvus) fed on pig carcasses at supplementary feeding stations (SFS), along with their level of antimicrobial resistance (AMR). E. coli was isolated from 90 (86.5%) samples but no ETEC was detected, likely because ETEC fimbriae confer the species specificity of the pathogen. Resistance to at least one antimicrobial agent was detected in 89.9% of E. coli isolates, being AMR levels extremely high (>70%) for tetracycline and streptomycin, and very high (>50%) for ampicillin and sulfamethoxazole-trimethoprim. Resistance to other critically important antimicrobials such as colistin and extended-spectrum cephalosporins was 2.2%, and 1.1%, respectively, and was encoded by the mcr-1 and blaSHV-12 genes. Multidrug resistance was displayed by 80% of the resistant E. coli and blaSHV-12 gene shared plasmid with other AMR genes. In general, resistance patterns in E. coli from vultures mirrored those found in pigs. C. difficile was detected in three samples (2.9%), two of them belonged to PCR-ribotype 078 and one to PCR-ribotype 126, both commonly found in pigs. All C. difficile isolates were characterized by a moderate to high level of resistance to fluoroquinolones and macrolides but susceptible to metronidazole or vancomycin, similar to what is usually found in C. difficile isolates from pigs. Thus, vultures may contribute somewhat to the environmental dissemination of some pig pathogens through their acquisition from pig carcasses and, more importantly, of AMR for antibiotics of critical importance for humans. However, the role of vultures would likely be much lesser than that of disposing pig carcasses at the SFS. The monitoring of AMR, and particularly of colistin resistant and ESLB-producing E. coli, should be considered in pig farms used as sources of carcasses for SFS.

Programa Oficial de Doutoramento en Química Ambiental e Fundamental. 5031V01 [Resumen] A continuación, se presenta un breve resumen de cada capítulo: Capítulo 1: El uso de RMN anisotrópica en el análisis estructural de moléculas pequeñas quirales se ha expandido en los años recientes. En la actualidad, las Constantes Dipolares Residuales (CDR) pueden ser aplicadas como una herramienta estándar en el mejoramiento eficiente de la determinación de la configuración relativa de compuestos de pequeño tamaño mediante RMN estándar. En la presente tesis doctoral hemos desarrollado otra metodología de RMN anisotrópica basada en medidas de anisotropía de desplazamiento químico residual de protones (1H RCSA) que ha sido aplicada, primero a moléculas modelo, estricnina, estrona, retrorsina y a-santonina, y posteriormente a nuevos productos naturales: a un meroditerpeno aislado del alga parda Sargassum muticum, a las tricloromammindas A y B aisladas del hongo no comestible Tricholoma equestre y, finalmente a un briarano de origen marino aislado de la gorgonia Briareum asbestinum recolectada de la penísula de Yucatán. Toda esta nueva metodología se ha podido realizar a través de la mejora de nuevos dispositivos de compresión y extensión de geles aplicados a tubos de RMN de menos de 5 mm. Este desarrollo de este tipo de dispositivos es una herramienta adicional que puede ser utilizada en el futuro por espectroscopistas en el campo de RMN anisotrópica. Por último, también hemos introducido un nuevo gel deuterado (PMMA-d8) derivado de polimetilmetacrilato deuterado como medio alineante. Capítulo 2: La detección y cuantificación de productos naturales presentes en trazas en mezclas complejas es aún un campo de investigación activo para los químicos. Desde la introducción en el mercado del detector de masas Orbitrap® se iniciado una revolución en las técnicas analíticas de detección. En la presente Tesis Doctoral hemos aprovechado esta tecnología para la detección y, en algunos casos, el aislamiento y la cuantificación de algunos productos naturales de origen marino de interés biológico. Las distintas aproximaciones en las técnicas de LC/HRMS empleadas fueron aplicadas a: La detection y el aislamiento de la producción de sideróforos en varias bacteria marinas patógenas: tipo vancrobactina en tres especies de Vibrio, tipo piscibactina en una cepa mutante de Vibrio alginolyticus, el sideróforo producido por las bacterias Edwardsiella tarda y Photobacterium damselae subsp. damselae. Detección y cuantification de AHLs en tres especies patógenas de Vibrio. Detección de (TTX) en el pez Diodon hystrix recolectado en El Salvador. [Resumo] A continuación amósase un resumo de cada capítulo. Capítulo 1 O uso da RMN anisotrópica na análise estrutural de moléculas pequenas quiraies, expandiuse nos anos recentes. Na actualidade, as Constantes Dipolares Residuais (CDR)poden ser aplicadas como unha ferramenta estándar na millora eficiente da determinación da configuración relativa de compostos de pequeno tamano mediante RMN estándar. Na presente Tese Doutoral desenvolvemos outra metodoloxía de RMN anisotrópica baseada en medidas de anisotropía de desprazamento químico residual de protones (1H RCSA) que foi aplicada, primeiro a moléculas modelo, estricnina, estrona, retrorsina e [alfa]-santonina, e posteriormente a novos produtos naturais: a un meroditerpeno illado do alga parda Sargassum muticum, ás tricloromammindas A e B illadas do fungo non comestible Tricholoma equestre e, finalmente a un briarano de orixe mariña illada da gorgonia Briareum asbestinum colleitada da penísula de Iucatán: Toda esta nova metodoloxía púidose realizar a través da mellora de novos dispositivos de compresión e extensión de xeles aplicados a tubos de RMN de menos de 5 mm. Este desenvolvemento deste tipo de dispositivos é unha ferramenta adicional que pode ser utilizada no futuro por espectroscopistas no campo de RMN anisotrópica. Por último, tamén introducimos un novo xel deuterado (PMMA-d8) derivado de polimetilmetacrilato deuterado como medio alineante. Capítulo 2 A detección e cuantificación de produtos naturais presentes en trazas en mesturas complexas é aínda un campo de investigación activo para os químicos. Desde a introdución no mercado do detector de masas Orbitrap® #iniciar unha revolución nas técnicas analíticas de detección. Na presente Tese Doutoral aproveitamos esta tecnoloxía para a detección e, nalgúns casos, o illamento e a cuantificación dalgúns produtos naturais de orixe mariña de interese biolóxico. As distintas aproximacións nas técnicas de LC/HRMS empregadas foron aplicadas a: A detection e o illamento da produción de sideróforos en varias bacteria mariñas patógenas: tipo vancrobactina en tres especies de Vibrio, tipo piscibactina nunha cepa mutante de Vibrio alginolyticus, o sideróforo producido polas bacterias Edwardsiella tarda e Photobacterium damselae subsp. damselae. Detección e cuantification de AHLs en tres especies patóxenas de Vibrio. Detección de (TTX) no peixe Diodon hystrix colleitado no Salvador. [Abstract] A summary of each chapter shall be presented below. Chapter 1: The use of anisotropic NMR in the structural analysis of chiral small molecules has expanded in recent years. Currently, Residual Dipolar Constants (RDC) can be applied as a standard tool in the efficient improvement of the determination of the relative configuration of small-sized compounds by standard NMR. In the present Thesis dissertation, we have developed another methodology of anisotropic NMR based on measures of anisotropy of residual chemical proton displacement (1H RCSA) that has been applied, firstly to compound-models, strychnine, estrone, retrorsine and [alfa]-santonin, and subsequently to new natural products: to an isolated meroditerpene of the brown alga Sargassum muticum, the trichloromaminades A and B isolated from the non-edible fungus Tricholoma equestre and, finally to a briarane of marine origin isolated from the gorgonian Briareum asbestinum collected from the peninsula of Yucatan (México). Chapter 2: The detection and quantification of natural products present in traces in complex mixtures is still an active field of research for chemists. Since the introduction of the Orbitrap® mass detector into the market, a revolution in analytical detection techniques has begun. In this Doctoral Thesis we have taken advantage of this technology for the detection and, in some cases, the isolation and quantification of natural products of marine origin of biological interest. The different approaches in the LC / HRMS techniques used were applied to: Detection and isolation of siderophore production in several pathogenic marine bacteria: vanchrovatin type in three Vibrio species, piscibactin type in a mutant strain of Vibrio alginolyticus, the siderophore produced by the bacteria Edwardsiella tarda and Photobacterium damselae subsp. damselae Detection and quantification of AHLs in three pathogenic Vibrio species. Detection of TTX in the fish Diodon hystrix collected in El Salvador.

Objetivo: Se evaluó la actividad antimicrobiana de un extracto crudo de B. bassiana y dos fracciones del mismo contra bacterias de importancia clínica. Métodos: El micelio de cepa B. bassiana se remojó en metanol durante una semana, después se evaporo en un rotovapor a 45°C aplicando vacío. El extracto metanólico se hizo pasar con dos fases móviles para obtener una fracción A y B. La fracciones A, B y el extracto crudo C se evaluaron contra las cepas Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Salmonella tiphy, Pseudomonas aeruginosa y Acinetobacter baumannii con la técnica de microdilución en placa. Resultados: En la fracción A se observó un efecto antimicrobiano contra Salmonella typhi, Pseudomonas aeruginosa y Acinetobacter baumannii el crecimiento bacteriano alcanzó el 70, 60 y 83 % respectivamente. La fracción B causó un efecto antimicrobiano en Klebsiella pneumoniae, S. typhi, P. aeruginosa y A. baumannii con un crecimiento bacteriano del 62, 58, 41 y 7 % respectivamente. Y El extracto crudo no causó inhibición del crecimiento en A. baumannii, pero para el resto de la bacterias hubo un crecimiento del 56 al 88 %. Conclusiones: Beauveria bassiana es un hongo entomopatógeno que produce diferentes metabolitos con actividad insecticida, citotóxica, antifúngica, antibiótica y antiviral. Este es el primer estudio de los efectos antimicrobianos de un extracto metanólico del hongo entomopatógeno B. bassiana contra cepas bacterianas de importancia clínica., Objective: The antimicrobial activity of a crude extract of B. bassiana and two fractions thereof against clinically important bacteria was evaluated. Methods: The mycelium of strain B. bassiana was soaked in methanol for a week, then it was evaporated in a rotovap at 45 ° C applying a vacuum. The methanolic extract was passed through two mobile phases to obtain a fraction A and B. Fractions A, B and crude extract C were evaluated against the strains Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Salmonella tiphy, Pseudomonas aeruginosa and Acinetobacter baumannii with the plate microdilution technique. Results: In fraction A an antimicrobial effect against Salmonella typhi, Pseudomonas aeruginosa and Acinetobacter baumannii was observed, bacterial growth reached 70, 60 and 83% respectively. Fraction B caused an antimicrobial effect in Klebsiella pneumoniae, S. typhi, P. aeruginosa and A. baumannii with a bacterial growth of 62, 58, 41 and 7% respectively. And the crude extract did not cause growth inhibition in A. baumannii, but for the rest of the bacteria there was a growth of 56 to 88%. Conclusions: Beauveria bassiana is an entomopathogenic fungus that produces different metabolites with insecticidal, cytotoxic, antifungal, antibiotic and antiviral activity. This is the first study of the antimicrobial effects of a methanolic extract of the entomopathogenic fungus B. bassiana against bacterial strains of clinical importance.

Pseudomonas syringae es una bacteria ubicua a nivel ambiental. Presenta una taxonomía compleja en la que se han descrito más de 60 patovares que causan enfermedad en muchas especies de plantas diferentes. Entre los patovares más importantes se encuentra el pv. syringae debido a su amplio rango de hospedador, y al arsenal de mecanismos de virulencia que posee. A principios de los años 90, se describió a Pseudomonas syringae pv. syringae (Pss) como el agente causal de la necrosis apical del mango (NAM). Pss aisladas de mango muestran características importantes para su biología, tanto en sus mecanismos de virulencia como para el fitness epifítico. En este trabajo, se plantea conocer en profundidad cómo han evolucionado las poblaciones de Pss a lo largo del tiempo sobre el mango Universidad de Málaga. Campus de Excelencia Internacional Andalucía Tech. Este trabajo ha sido financiado por ayuda de la Consejería de Economía, Innovación y Ciencia, Junta de Andalucía (Pl2-AGR-1473), cofinanciados con fondos FEDER (UE)

[EN] Wild birds have repeatedly been found to be involved in the dissemination of enteric bacterial pathogens in the environment. The aim of this study was to determine the occurrence of Salmonella and Campylobacter as well as the antimicrobial resistance in wild Bonelli's eagles nestlings in Eastern Spain. In addition, we compared the efficiency of two sampling methods (fresh faecal samples from nest and cloacal swabs from nestlings) for detection of both bacteria. A total of 28 nests with 45 nestlings were analysed. In the nest, Salmonella occurrence was 61 +/- 9.2%, while Campylobacter occurrence was 11 +/- 5.8% (p < 0.05). In the nestlings, Salmonella occurrence was 36 +/- 7.1%, while Campylobacter occurrence was 11 +/- 4.7% (p < 0.05). Eight Salmonella serovars were identified, and the most frequently isolated were S. Enteritidis, S. Typhimurium, S. Houston, and S. Cerro. Only one Campylobacter species was identified (C. jejuni). Regarding antimicrobial resistance, the Salmonella strains isolated were found to be most frequently resistant to ampicillin and to tigecycline; however, the sole Campylobacter strain recovered was multidrug resistant. In conclusion, this study demonstrated that wild Bonelli's eagles nestlings are greater carriers of Salmonella than of Campylobacter. Both Salmonella and Campylobacter isolates exhibited antimicrobial resistance. In addition, faecal samples from nests were most reliable for Salmonella detection, while cloacal swab from nestlings were most reliable for Campylobacter detection., We wish to thank the Ministry of Infrastructures, Territory and Environment (Regional Government/Generalitat Valenciana), the research group "Improvement of Production System-related Food Safety and End Products" research group (Veterinary Faculty, University CEU-Cardenal Herrera) and GEMAS (Study Group on Wildlife Medicine and Conservation) for their technical support. Moreover, we want to thank University CEU-UCH (Consolidacion de Indicadores INDI 18/19 and IDOC 18/12) for the financial support. The English text version was revised by N. Macowan English Language Service.

Programa Oficial de Doutoramento en Química Ambiental e Fundamental. 5031V01 [Resumen] Esta Tesis Doctoral está dividida en tres partes. En la primera parte, se describe la importancia de los sistemas de captación de hierro en bacterias patógenas de peces y el uso de proteínas receptoras de sideróforos como potenciales vacunas. En la segunda parte, se sintetizó un conjugado entre el sideróforo feroxamina y nanopartículas magnéticas y se realizaron ensayos de captura con Yersinia enterocolitica WC-A. Finalmente, se determinó la estructura plana y la estereoquímica del tetrapéptido cereusitin A producido por Bacillus cereus RKHC-09 y se detectó e identificó el complejo de Ga(III) de piscibactina en los sobrenadantes de los cultivos de Vibrio anguillarum RV22 y el mutante vabF, con el fin de establecer la importancia del sistema de capatación de hierro mediado por piscibatina en la viruencia de V. anguillarum. Capítulo I En este capítulo se habla de la importancia de la acuicultura y la necesidad de desarrollar nuevos tratamientos para el control de infecciones producidas por bacterias patógenas. Además, se describe de forma general el mecanismo de captación de hierro y las ventajas de emplear proteínas de membrana externa receptoras de sideróforos como vacunas. Se presenta la metodología de clonaje, expresión y purificación de las proteínas recombinantes FvtA (receptor del sideróforo vancrobactina producido por Vibrio anguillarum RV22) y FstC (receptor de los sideróforos amonabactinas biosintetizados por Aeromonas salmonicida subsp. salmonicida VT45). Adicionalmente, se expresó y purificó rFstB (receptor de acinetobactina producido por A. salmonicida subsp. salmonicida VT45). Finalmente, se muestran los resultados obtenidos al ensayar rFvtA, rFstB y rFstC como vacuna en lenguados infectados con vibriosis y forunculosis. Capítulo II Este capítulo está dedicado a la aplicación de sideróforos conjugados con nanopartículas magnéticas para el desarrollo de un mecanismo de detección de bacterias. Se describen las aplicaciones de los sideróforos en diferentes campos junto con el proceso de diseño de nanomateriales magnéticos y la versatilidad de estos para sintetizar conjugados para desarrollar aplicaciones. RESUMEN ii Se describe la síntesis del conjugado entre el sideróforo feroxamina y nanopartículas magnéticas funcionalizadas (MNP@SiO2@NH@Fa), su caracterización y su capacidad de captura de Yersinia enterocolitica WC-A. También, se muestra la síntesis de un análogo de enterobactina que puede ser empleado para la síntesis de conjugados. Capítulo III En este capítulo se hace una breve introducción de la importancia de los microorganismos marinos como productores de productos naturales, su actividad biológica y su gran diversidad estructural. También se expondrán los métodos más generales para la selección de condiciones para el cultivo y obtención de compuestos producidos por bacterias principalmente. Se muestra el proceso de elucidación estructural del tetrapéptido cereusitin A producido Bacillus cereus RKHC-09 mediante experimentos de resonancia magnética nuclear mono y bidimesionales y análisis de espectrometría de masas de baja y alta resolución. Adicionalmente, se determinó la estereoquímica absoluta de los aminoácidos presententes en la molécula por medio del método de Marfey. Finalmente se mostrará el proceso de detección del complejo de Ga(III) de piscibactina en el sobrenadante de cultivo de V. anguillarum RV22 y el mutante vabF por medio de cromatografía líquida acoplada a espectrometría de masas (LCMS). [Resumo] Esta Tese Doctoral está dividida en tres partes. Na primeira parte, descríbese a importancia dos sistemas de captación de ferro en bacterias patóxenas de peces e o uso de proteínas receptoras de sideróforos como potenciais vacinas. Na segunda parte, sintetizouse un conxugado entre o sideróforo feroxamina e nanopartículas magnéticas e realizáronse ensaios de captura con Yersinia enterocolitica WC-A. Finalmente, determinouse a estrutura plana e a estereoquímica do tetrapéptido cereusitin A producido por Bacillus cereus RKHC-09 e detectouse e identificouse o complexo de Ga(III) de piscibactina nos sobrenadantes dos cultivos de Vibrio anguillarum RV22 e o mutante vabF. Capítulo I Neste capítulo fálase da importancia da acuicultura e a necesidade de desenvolver novos tratamentos para o control de infeccións producidas por bacterias patógenas. Ademais, descríbese de forma xeral o mecanismo de captación de ferro e as vantaxes de empregar proteínas de membrana externa receptoras de sideróforos como vacunas. Preséntase a metodoloxía de clonaje, expresión e purificación das proteínas recombinantes FvtA (receptor do sideróforo vancrobactina producido por Vibrio anguillarum RV22) e FstC (receptor dos sideróforos amonabactinas biosintetizados por Aeromonas salmonicida subsp. salmonicida VT45). Adicionalmente, expresouse e purifico rFstB (receptor de acinetobactina producido por A. salmonicida subsp. salmonicida VT45). Finalmente, móstranse os resultados obtidos ao ensaiar rFvtA, rFstB e rFstC como vacuna en lenguados infectados con vibriosis e forunculosis. Capítulo II Este capítulo está dedicado á aplicación de sideróforos e nanopartículas magnéticas para o desenvolvemento dun mecanismo de detección de bacterias. Descríbense as aplicacións dos sideróforos en diferentes campos xunto co proceso de deseño de nanomateriales magnéticos e a versatilidad destes para sintetizar conxugados para desenvolver aplicacións. Descríbese a síntese do conxugado entre o sideróforo feroxamina e nanopartículas magnéticas funcionalizadas (MNP@SiO2@NH@Fa), o seu caracterización e a súa capacidade de captura de Yersinia enterocolitica WC-A. Tamén, móstrase a síntese dun análogo de enterobactina que pode ser empregado para a síntese de conxugados. Capítulo III Neste capítulo faise unha breve introdución da importancia dos microorganismos mariños como productores de produtos naturais, a súa actividade biolóxica e o seu gran diversidad estructural. Tamén se expoñerán os métodos máis xerais para a selección de condicións para o cultivo e obtención de compostos producidos por bacterias principalmente. Móstrase o proceso de elucidación estructural do tetrapéptido cereusitin A producido Bacillus cereus RKHC-09 mediante experimentos de resonancia magnética nuclear mono e bidimesionales e análise de espectrometría de masas de baixa e alta resolución. Adicionalmente, determinouse a estereoquímica absoluta por medio do método de Marfey. Finalmente mostrásese o proceso de detección do complexo de Ga(III) de piscibactina no sobrenadante de cultivo de V. anguillarum RV22 e o mutante vabF por medio de cromatografía liquida acoplada a espectrometría de masas (LC-MS). [Abstract] This Doctoral Thesis is divided into three parts. The first part describes the importance of iron uptake systems in fish pathogenic bacteria and the use of siderophore-receptor proteins as potential vaccine candidates. In the second part, the synthesis of a conjugate of feroxamine siderophore and magnetic nanoparticles is shown as an attempt to create a new surface able to capture Yersinia enterocolitica WC-A. Finally, in chapter III the structural and stereochemical determination of the tetrapeptide cereusitin A is described as well as the detection and identification of the piscibactin-Ga(III) complex in the supernatants of the cultures of Vibrio anguillarum RV22 and its vabF mutant. Furthermore, the piscibactin is shown as an important molecule in the iron uptake system and the virulence of V. aguillarum. Chapter I This chapter discusses the importance of aquaculture and the need to develop new treatments for the control of infections produced by pathogenic bacteria. In addition, the mechanism of iron uptake along with the advantages of using siderophores receptor outer membrane proteins as vaccines candidates is described broadly. Here are presented the methodology of cloning, expression and purification of the recombinant proteins FvtA (receptor of the siderophore vancrobactin produced by Vibrio anguillarum RV22) and FstC (receptor of the siderophores amonabactin biosynthesized by Aeromonas salmonicida subsp. salmonicida VT45). Additionally, the expression and purification of rFstB protein (acinetobactin receptor produced by A. salmonicida subsp. salmonicida VT45) is shown. Finally, the results obtained when testing rFvtA, rFstB and rFstC as a vaccine in flounders infected with vibriosis and forunculosis are presented. Chapter II This chapter is dedicated to the application of siderophores and magnetic nanoparticles to the study of a bacterial detection mechanism. The applications of siderophores in different fields are described along with the design process of magnetic nanomaterials and its versatility and capability in the conjugate synthesis to develop applications. The synthesis of the conjugate of feroxamine and functionalized magnetic nanoparticles (MNP@SiO2@NH@Fa), its characterization and capture capacity towards Yersinia enterocolitica WC-A are described. Also, the synthesis of an enterobactin analogue that can be used for the synthesis of conjugates is shown. Chapter III In this chapter is made a brief introduction of the importance of marine microorganisms as producers of natural products, their biological activity and their great structural diversity. Also, the most general methods for the selection of culture conditions in the obtainment of compounds mainly produced by bacteria are exposed. The structural elucidation process of the tetrapeptide cereusitin A produced by Bacillus cereus RKHC-09 is shown by mono and bidimensional nuclear magnetic resonance experiments as well as low and high resolution mass spectrometry analysis. Additionally, absolute stereochemistry was determined by means of the Marfey’s method. Finally, here is shown the procedure developed for the detection of piscibactin- Ga(III) complex from culture supernatant of V. anguillarum RV22 and its vabF mutant by liquid chromatography coupled to mass spectrometry (LC-MS).

En The ISME Journal. Heidelberg (Germany): Springer. Vol. 12, n. 9, pp. 2114-2128 (2018). Este artículo se encuentra disponible en la página web de la revista en la siguiente URL: https://www.nature.com/articles/s41396-018-0156-3 Phage-inducible chromosomal islands (PICIs) are a recently discovered family of pathogenicity islands that contribute substantively to horizontal gene transfer, host adaptation and virulence in Gram-positive cocci. Here we report that similar elements also occur widely in Gram-negative bacteria. As with the PICIs from Gram-positive cocci, their uniqueness is defined by a constellation of features: unique and specific attachment sites, exclusive PICI genes, a phage-dependent mechanism of induction, conserved replication origin organization, convergent mechanisms of phage interference, and specific packaging of PICI DNA into phage-like infectious particles, resulting in very high transfer frequencies. We suggest that the PICIs represent two or more distinct lineages, have spread widely throughout the bacterial world, and have diverged much more slowly than their host organisms or their prophage cousins. Overall, these findings represent the discovery of a universal class of mobile genetic elements.

El objetivo de este estudio fue determinar la presencia y la frecuencia de Campylobacter jejuni y Campylobacter coli, en la cadena de producción avícola en Costa Rica. Se evaluaron granjas, planta de proceso y puntos de venta del Gran Área Metropolitana. Para la detección y aislamiento de Campylobacter sp. se analizaron 84 muestras provenientes de la cadena avícola (24 muestras de carne de pollo tomadas en punto de venta, 20 enjuagues de carcasa y 40 de ciegos tomados en planta de beneficio), obtenidas en noviembre de 2012, siguiendo el protocolo ISO 10272-1:2006 modificado por el Departamento de Agricultura de Estados Unidos (USDA, por sus siglas en inglés). De las 84 muestras analizadas, 36 (42,8%) resultaron positivas para C. jejuni, y una (1,2%) para C. coli. La cantidad de muestras positivas según la Reacción en Cadena de Polimerasa (PCR), por tipo de muestra fue: para contenido cecal, 16 (n=40), para carcasas, 8 (n=20) y para punto de venta 12 (n=24). Dieciséis de las veinte granjas muestreadas fueron positivas. Hubo una alta frecuencia de Campylobacter en todos los puntos de la cadena muestreados, lo que podría estar asociado a modificaciones de parámetros relacionados con inocuidad en cada eslabón. El enfriamiento rápido y el uso de cloro en el agua en la planta de proceso, disminuyó la frecuencia de muestras positivas de Campylobacter spp.

[eng] The regulation of the expression of virulence genes in Salmonella enterica serovar Typhimurium is an intensively studied feature of Salmonella lifestyle. How Salmonella integrates environmental signals to activate virulence-related genes within the host has been explored. The genes encoded in Salmonella pathogenicity island I (SPI-1) required for the invasion of epithelial cells are well characterized, and many regulators involved in the activation of SPI-1 genes have been described. However, little is known about mechanism involved in the repression of SPI-1 under conditions were Salmonella does not require the expression of virulence-related genes. The expression of SPI-1 encoded genes have been reported to be a burden for Salmonella physiology and therefore mechanism to control shut down of SPI-1 under non permissive conditions might play a crucial role in Salmonella physiology. Here we describe that at exponential phase, CRP-cAMP, which acts as an activator at stationary phase, represses the expression of SPI-1 genes. The overall objective of this thesis was to characterize how CRP-cAMP silences SPI-1 expression under non-permissive conditions and to describe the molecular mechanism behind this phenotypic observation. In this thesis we i) define the target gene for the CRP-mediated regulation of SPI-1 ii) elucidate at which level of regulation CRP-cAMP modulates the expression of the SPI-1 genes master regulator hilD iii) characterize the involvement of CRP-cAMP dependent sRNA in hilD regulation iv) characterize the interaction of the CRP-cAMP dependent sRNA Spot 42 with the hilD 3’UTR region to regulate SPI-1 and v) explore the role of CRP-cAMP in the modulation of the SPI-1 repressor CsrA through the regulation of the long non-coding RNA csrB and csrC. CRP-cAMP represses hilA expression at exponential phase (non-permissive conditions for SPI-1 expression) and acts as an activator at stationary phase (permissive conditions for SPI-1 expression). CRP-cAMP mediated repression of hilA causes a concomitant attenuation in the expression level of SPI-1 encoded effector proteins. The regulation of SPI-1 during logarithmic growth phase occurs upstream of HilA by repressing hilD, hilC and rtsA expression and is mediated by the regulation of hilD expression at the post transcriptional level through the hilD 3’UTR. CRP-cAMP mediated regulation of hilD requires, in addition to the hilD 3’UTR, the sRNA chaperone Hfq and the major endonuclease RNAse E. CRP-cAMP represses the expression of the sRNA Spot 42 at exponential phase. We show that Spot 42 positively regulates hilD expression at exponential growth phase and requires of the presence of the hilD 3’UTR, the sRNA chaperone Hfq and the major endonuclease RNAse E. Interestingly, Spot 42 and the hilD 3’UTR region physically bind to Hfq. Spot 42 physically interacts with the last 150 nt of the hilD 3’UTR and unstructured region III of Spot 42 is required for the regulation of hilD. CRP-cAMP represses csrC but not csrB expression at exponential phase to regulate the expression of hilD. Remarkably, the CRP-cAMP dependent sRNA Spot 42 positively regulates the expression of csrC., [spa] La regulación de la expresión de genes de virulencia en Salmonella enterica serovar Typhimurium es una característica intensamente estudiada en Salmonella. La forma en que Salmonella integra señales ambientales para activar los genes relacionados con la virulencia dentro del huésped ha sido explorada. Los genes codificados en la isla de patogenicidad I de Salmonella (SPI-1) son necesarios para la invasión de células epiteliales, están bien caracterizados y se han descrito muchos reguladores implicados en su activación. Sin embargo, poco se sabe sobre el mecanismo implicado en la represión de SPI-1 en condiciones en las que Salmonella no requiere la expresión de genes relacionados con la virulencia. Es sabido que la expresión de genes codificados por SPI-1 son una carga para la fisiología de Salmonella y por lo tanto el mecanismo para controlar la represión de SPI-1 en condiciones no permisivas podría desempeñar un papel crucial en la fisiología de Salmonella. Aquí se describe que en fase exponencial, CRP-cAMP, que actúa como un activador en fase estacionaria, reprime la expresión de los genes SPI-1. El objetivo general de esta tesis fue caracterizar cómo el CRP-cAMP silencia la expresión de SPI-1 en condiciones no permisivas y describir el mecanismo molecular detrás de esta observación fenotípica. El CRP-cAMP reprime la expresión de hilA en la fase exponencial (condiciones no permisivas para la expresión de SPI-1) y actúa como un activador en fase estacionaria (condiciones permisivas para la expresión de SPI-1). La represión mediada por CRP-cAMP de hilA provoca una atenuación concomitante en el nivel de expresión de proteínas efectoras codificadas por SPI-1. La regulación de SPI-1 durante la fase de crecimiento logarítmico se produce aguas arriba de HilA mediante la represión hilD, hilC y rtsA expresión y está mediada por la regulación de hilD a nivel post transcripcional a través de la hilD 3'UTR. La regulación mediada por CRP-cAMP de hilD requiere, además de la hilD 3'UTR, la chaperona Hfq y la endonucleasa RNAsa E. CRP-cAMP reprime la expresión del sRNA Spot 42 en la fase exponencial. Mostramos que Spot 42 regula positivamente la expresión hilD en la fase de crecimiento exponencial, Spot 42 interacciona físicamente con los últimos 150 nt de la hilD 3'UTR.

24 páginas, 6 figuras, 3 tablas, The dUTPase (Dut) enzymes, encoded by almost all free-living organisms and some viruses, prevent the misincorporation of uracil into DNA. We previously proposed that trimeric Duts are regulatory proteins involved in different cellular processes; including the phage-mediated transfer of the Staphylococcus aureus pathogenicity island SaPIbov1. Recently, it has been shown that the structurally unrelated dimeric Dut encoded by phage ϕNM1 is similarly able to mobilize SaPIbov1, suggesting dimeric Duts could also be regulatory proteins. How this is accomplished remains unsolved. Here, using in vivo, biochemical and structural approaches, we provide insights into the signaling mechanism used by the dimeric Duts to induce the SaPIbov1 cycle. As reported for the trimeric Duts, dimeric Duts contain an extremely variable region, here named domain VI, which is involved in the regulatory capacity of these enzymes. Remarkably, our results also show that the dimeric Dut signaling mechanism is modulated by dUTP, as with the trimeric Duts. Overall, our results demonstrate that although unrelated both in sequence and structure, dimeric and trimeric Duts control SaPI transfer by analogous mechanisms, representing a fascinating example of convergent evolution. This conserved mode of action highlights the biological significance of Duts as regulatory molecules., This work was supported by grants, BIO2013-42619-P and BIO2016-78571-P, from the Ministerio de Economia y Competitividad (Spain) and grant Prometeo II/2014/029 from Valencian Government (Spain) to AM, and grants MR/M003876/1 from the Medical Research Council (UK), BB/N002873/1, from the Biotechnology and Biological Sciences Research Council (BBSRC, UK), and ERC-ADG-2014 Proposal n° 670932 Dut-signal from EU to JRP. EM was supported by CSIC JAE-Doc postdoctoral contract (Programa «Junta para la Ampliación de Estudios») co-funded by the European Social Fund. JRC and CA were supported by FPU13/02880 and FPI BES-2014-068617 predoctoral fellowships respectively. X-ray diffraction data collection was supported by Diamond Light Source block allocation group (BAG) Proposal, MX14739, and Spanish Synchrotron Radiation Facility ALBA Proposal 2016071762. The research leading to these results has received funding from the European Community's Seventh Framework Programme (FP7/2007-2013) under BioStruct-X, grant agreement N°283570. The funders had no role in study design, data collection and analysis, decision to publish, or preparation of the manuscript.

Pseudomonas syringae is a model bacterial pathogen that penetrates the leaf to reach the plant apoplast, where it replicates causing disease. In order to do that, the pathogen must interfere and suppress a two-tiered plant defense response: PTI (PAMP-Triggered Immunity, or basal resistance) and ETI (Effector-Triggered Immunity). P. syringae uses a type III secretion system to directly deliver effector proteins inside the plant cell cytosol, many of which are known to suppress PTI, some of which are known to trigger ETI, and a handful of which are known to suppress ETI. Bacterial infection can also trigger a systemic plant defense response that protects the plant against additional pathogen attacks known as SAR (Systemic Acquired Resistance). We are particularly interested in the molecular and cellular mechanisms involved in effector-mediated defense evasion by P. syringae, in particular those involved in the suppression of ETI and SAR, and/or mediation of hormone signaling. Here we present data describing effector-mediated interference with plant immunity, by means of acetylation of a key positive regulator of local and systemic responses. Our work identifies a novel plant target for effector function, and characterizes its function. This work illustrates how analyzing the means by which a given effector interferes with its target can provide novel information regarding eukaryotic molecular mechanisms. Universidad de Málaga. Campus de Excelencia Internacional Andalucía Tech. MINECO BIO2015-64391R y FEDER

Microbe associated molecular pattern (MAMP) receptors in plants recognize MAMPs and activate basal defences; however a complete understanding of the molecular and physiological mechanisms conferring immunity remains elusive. Pathogens suppress active defence in plants through the combined action of effector proteins. This talk presents results showing the chloroplast as a key component of early immune responses. MAMP perception triggers the rapid, large-scale suppression of nuclear encoded chloroplast-targeted genes (NECGs). Virulent Pseudomonas syringae effectors reprogramme NECG expression in Arabidopsis, target the chloroplast and inhibit photosynthetic CO2 assimilation through disruption of photosystem II. This activity prevents a chloroplastic reactive oxygen burst. These physiological changes precede bacterial multiplication and coincide with pathogen-induced abscisic acid (ABA) accumulation. MAMP pretreatment protects chloroplasts from effector manipulation, whereas application of ABA or the inhibitor of photosynthetic electron transport, DCMU, abolishes the MAMP-induced chloroplastic reactive oxygen burst, and enhances growth of a P. syringae hrpA mutant that fails to secrete effectors. Universidad de Málaga. Campus de Excelencia Internacional Andalucía Tech.

Two main types of noncoding small RNA molecules have been found in plants: microRNAs (miRNAs) and small interfering RNAs (siRNAs). They differ in their biogenesis and mode of action, but share similar sizes (20-24 nt). Their precursors are processed by Dicer-Like RNase III (dcl) proteins present in Arabidopsis thaliana, and in their mature form can act as negative regulators of gene expression, being involved in a vast array of plant processes, including plant development, genomic integrity or response to stress. Small-RNA mediated regulation can occurs at transcriptional level (TGS) or at post-transcriptional level (PTGS). In recent years, the role of gene silencing in the regulation of expression of genes related to plant defence responses against bacterial pathogens is becoming clearer. Comparisons carried out in our lab between the expression profiles of different mutants affected in gene silencing, and plants challenged with Pseudomonas syringae pathovar tomato DC3000, led us to identify a set of uncharacterized R genes, belonging to the TIR-NBS-LRR gene family, differentially expressed in these conditions. Through the use of bioinformatics tools, we found a miRNA* of 22 nt putatively responsible for down-regulating expression of these R genes through the generation of siRNAs. We have also found that the corresponding pri-miRNA is down-regulated after PAMP-perception in a SA-dependent manner. We also demonstrate that plants with altered levels of miRNA* (knockdown lines or overexpression lines) exhibit altered PTI-associated phenotypes, suggesting a role for this miRNA* in this defence response against bacteria. In addition we identify one of the target genes as a negative regulator of defence response against Pseudomonas syringae. Universidad de Málaga. Campus de Excelencia Internacional Andalucía Tech. MINECO, FEDER

The marine fish pathogen Photobacterium damselae subsp. piscicida (Phdp) is responsible for important disease outbreaks affecting several fish species including flatfish Solea senegalensis (Kaup). Phdp is able to avoid host defences by invasion and intracellular survival in non-phagocytic cells, mainly epithelial cells. Virulence factors reported in Phdp include restricting complement-mediated activity, apoptosis of phagocytes caused by exotoxins secretion, iron acquisition mechanisms such as siderophores that enable the pathogen to obtain iron from transferrin and ability to bind haemin and antioxidant enzymatic activities capable to counteract superoxide radicals (Do Vale et al., 2005; Andreoni and Magnano, 2014). Commonly, genes expressed during pathogen infection are important for pathogenicity. In vivo-induced antigen technology (IVIAT) (Handfield et al., 2000) has been used to identify in vivo-induced genes using pooled sera from fish that have experienced photobacteriosis. Materials and methods Sera were obtained from surviving S. senegalensis specimens after sublethal infection with Phdp (Lg41/01) and subsequently pooled and adsorbed against in vitro grown Phdp Lg41/01 and Escherichia coli BL21 (DE3) cells and lysates according to Handfield et al. (2000). The efficiency of sera adsorption was evaluated based on the immunoreactivity after each adsorption step with whole and lysed Phdp cells grown in vitro. A genomic expression library of Phdp Lg41/01 was generated in E. coli BL21 (DE3) using pET-30 expression system (Novagen, San Diego, CA, USA). The expression library was probed with adsorbed and non-absorbed sera using immunoblot technique. Reactive clones of in vivo-induced and in vitro antigens were obtained, purified and their inserted DNA sequenced (Macrogen Europe, Amsterdam, The Netherlands). Nucleotide sequences were compared against the NCBI protein database using BLASTx. Results A progressive reduction in sera immunoreactivity against in vitro grown Phdp cells was detected after the adsorption rounds, especially after the first adsorption step. Thus, following adsorption steps substantially removed antibodies against in vitro expressed antigens and resulted in relative enrichment in antibodies recognizing in vivo expressed antigens. The library from Phdp Lg14/01 constructed in E. coli BL21 (DE3) consisted of approximately 6500 recombinants. A total of 117 clones were selected for their reactivity with pooled adsorbed and non-adsorbed sera from convalescent S. senegalensis specimens after a first round of screening. In a second screening, 14 out of 117 candidate clones showed positive reaction, among which two clones were clearly positive and two gave weak reaction against adsorbed sera. Predicted proteins codified by inserted sequences have intracellular and membrane cell location and are involved in virulence, synthesis of intermediary products, energy metabolism and gene replication. Inosine-5’-monophosphate dehydrogenase (IMPDH) and alkyl hydroperoxide reductase (AhpC) have been identified as in vivo induced antigens expressed during S. senegalensis infection with Phdp. Iron/manganese superoxide dismutase (Fe/Mn-SOD) and alanyl-tRNA synthetase (AlaRS) proteins have also been identified, though with weak signal. Discussion and conclusion Identification of immunogenic bacterial proteins during Phdp infection is essential for understanding bacterial pathogenesis and development of effective vaccines. AhpC peroxidase activity has a protective role by reducing hydrogen peroxide, peroxynitrite and organic hydroperoxides. Immunization with AhpC conferred protection against Helicobacter pylori infection (O’Riordan et al., 2012). IMPDH catalyzes the conversion of products essential in de novo synthesis of guanine nucleotides. Adequate levels of purine nucleotides are critical for cell proliferation, nucleic acid replication, cell signaling and as a biochemical energy source. This gene is an important therapeutic target against bacterial diseases (Shu and Nair,2008). In conclusion, different genes expressed during Phdp infection in S. senegalensis have been identified. Among them, IMPDH and AhpC have been identified as in vivo induced antigens expressed during S. senegalensis infection with Phdp. Thus, they are likely to play a role in the virulence of Phdp. The antigenic character of these proteins makes them potential targets for the development of new vaccines. References Andreoni, F., and Magnani, M., 2014. Photobacteriosis: Prevention and Diagnosis. Journal of Immunology Research, 2014: 1-7. Do Vale, A., Silva, M.T., dos Santos, N.M., Nascimento, D.S., Reis Rodrigues, P., Costa Ramos, C., Ellis, A.E., and Azevedo, J.E., 2005. AIP56, a novel plasmid-encoded virulence factor of Photobacterium damselae subsp. piscicida with apoptogenic activity against sea bass macrophages and neutrophils. Molecular Microbiology, 58: 1025-1038. Handfield, M., Brady, L.J., Progulske-Fox, A., and Hillman, J.D., 2000. IVIAT: a novel method to identify microbial genes expressed specifically during human infections. Trends in Microbiology, 8: 336-339. O’Riordan A.A., Morales V.A., Mulligan L., Faheem N., Windle H.J., and Kelleher D.P., 2012. Alkyl hydroperoxide reductase: a candidate Helicobacter pylori vaccine. Vaccine, 30:3876-3884. Shu, Q., and Nair, V., 2008. Inosine monophosphate dehydrogenase (IMPDH) as a target in drug discovery. Medicinal Research Reviews, 28:219-232. Universidad de Málaga. Campus de Excelencia Internacional Andalucía Tech.

The Supplementary Material for this article can be found online at: http://journal.frontiersin.org/article/10.3389/fmicb.2015.00871, Pseudomonas putida strains are ubiquitous in soil and water but have also been reported as opportunistic human pathogens capable of causing nosocomial infections. In this study we describe the multilocus sequence typing of four P. putida strains (HB13667, HB8234, HB4184, and HB3267) isolated from in-patients at the Besançon Hospital (France). The four isolates (in particular HB3267) were resistant to a number of antibiotics. The pathogenicity and virulence potential of the strains was tested ex vivo and in vivo using different biological models: human tissue culture, mammalian tissues, and insect larvae. Our results showed a significant variability in the ability of the four strains to damage the host; HB13667 did not exhibit any pathogenic traits, HB4184 caused damage only ex vivo in human tissue cultures, and HB8234 had a deleterious effect in tissue culture and in vivo on rat skin, but not in insect larvae. Interestingly, strain HB3267 caused damage in all the model systems studied. The putative evolution of these strains in medical environments is discussed., Work in this study was supported by the ERANET Pathogenomics Program through the ADHERS-Signature Project (reference: BIO2008-04419-E)

Pseudomonas syringae es una bacteria fitopatógena de gran interés tanto académico como económico, ya que afecta a gran variedad de cultivos hortícolas y ornamentales. Durante la interacción entre P. syringae y la planta se producen fenómenos de evasión de defensa cuyo estudio es el objetivo principal de esta tesis. Las poblaciones bacterianas han sido consideradas durante mucho tiempo clonales, y como tales, genética y fenotípicamente idénticas. Sin embargo, trabajos realizados durante las últimas décadas han demostrado que en condiciones de estrés, como las que se encuentra una bacteria fitopatógena en su hospedador, se pueden formar distintas subpoblaciones bacterianas (biestabilidad). Estos cambios se han asociado en bacterias patógenas de animales a modificaciones epigenéticas que causan heterogeneidad fenotípica reversible sin alterar el genotipo (Casadesús y Low, 2013). Pseudomonas syringae es una bacteria fitopatógena, cuya virulencia es dependiente del Sistema de Secreción Tipo III (T3SS). Durante la tesis, se ha analizado la expresión de tres genes del T3SS: un gen que codifica para una proteína estructural (hrcU), un regulador general del sistema (hrpL) y un efector (hopAB1). Hemos demostrado que la expresión de los tres genes es heterogénea cuando la bacteria crece en medio mínimo (HIM), y esta heterogeneidad se convierte en bistabilidad para el caso del efector hopAB1 durante la fase de crecimiento exponencial. En el interior de la planta, la bistabilidad de hopAB1 se intensifica, y la expresión del regulador hrpL se vuelve bistable. Además, la bistabilidad se revierte en pocas horas, indicando un origen no genético del proceso. La separación de poblaciones bacterianas basada en la expresión de hopAB1 y la posterior inoculación en planta demuestra que dichas diferencias en expresión tienen un efecto en la virulencia de la bacteria. Durante la interacción planta-patógeno, las plantas detectan a los microorganismos mediante receptores de membrana que reconocen patrones moleculares asociados a patógenos (PAMPs). Este reconocimiento lleva a la planta a activar una respuesta de defensa generalista llamada PTI (PAMP-Triggered Immunity). Pseudomonas syringae, mediante su T3SS, puede translocar proteínas llamadas efectores al interior de la célula vegetal. Algunos de estos efectores suprimen la respuesta PTI, permitiendo a la bacteria crecer y colonizar. Sin embargo, la planta ha desarrollado receptores intracelulares capaces de reconocer algunos de estos efectores, desencadenando respuestas fuertes y específicas (ETI, Effector-Triggered Immunity), que dispara la muerte celular local (HR, Hypersensitive Response) y la activación de una respuesta sistémica en la planta (SAR, Systemic Acquired Resistance). El efector HopZ1a suprime PTI, ETI y SAR (Macho et al., 2010; Lewis et al., 2014). HopZ1a se autoacetila en la lisina 289 (Lee et al., 2012), aunque este residuo no es esencial para la actividad del efector (Rufian et al., 2015; Ma et al., 2015). Aunque se han propuesto varias dianas moleculares de HopZ1a dentro de la planta, ninguna guarda una relación directa con la supresión de defensa descrita previamente. Una de estas dianas, ZED1, es una pseudoquinasa cuya única función es la detección de la actividad de HopZ1a para activar una respuesta de defensa (Lewis et al., 2013). Además, otros efectores de la familia YopJ/HopZ acetilan MAPK quinasas en sus hospedadores. En Arabidopsis existen 10 MAPK quinasas, una de las cuales, ZIP1, está implicada en la activación de defensas basales. Este fenotipo nos llevó a proponer a ZIP1 como la diana mediante la cual HopZ1a suprime defensas. Hemos demostrado que la supresión de defensas de HopZ1a es dependiente de ZIP1, y que ambas proteínas interaccionan tanto in vitro como in planta. Además, HopZ1a acetila a ZIP1 en una lisina esencial para su función, y no descrita previamente.

This paper had as objective the isolation of different bacteria, which cause mastitis and, simultaneously, make emphasis on the differentiation of Mycoplasma species, taken from stored milk samples and individual cows. The animals and the milk were provided by farms from the Boyaca ́s high altitude plateau. The process was carried out through a convenience probabilistic sampling and also a descriptive, longitudinal and retrospective research, during 2010 and 2012. The researches took into account 30 technically managed milking farms, each with approximately 50 milking cows. Streptococcus agalactiae was isolated from 9.1%, being the most detected pathogen. The mean Staphylococcus aureusisolates was of 6.6%. Mycoplasma bovis was not found in any sample during the three year period of the research, while M californicum was recovered from 14 samples (1.5%) during this time lapse and M. alcalescens was detected in 31 samples (3%). Acholeplasma spp. was isolated from 19 samples (1.4%). This research corresponds to first report of Mycoplasma spp. Isolation from milk samples at the Altiplano Boyacense Colombia. El objetivo del presente trabajo fue el aislamiento de las dife-rentes bacterias causantes de mastitis, haciendo énfasis en la diferenciación de las especies de Mycoplasmas, de las muestras de leche de tanque y de vacas individuales, proce-dentes de fincas lecheras del Altiplano Boyacense. Mediante un muestreo probabilístico de conveniencia y por medio de un estudio descriptivo longitudinal retrospectivo, entre 2010 y 2012, se estudiaron 30 fincas, especializadas en la produc-ción de leche, con promedios de 50 animales en lactancia, por finca. Streptococcus agalactiae, se aisló en el 9,1% y se convirtió en el principal patógeno aislado. Staphylococcus aureus fue aislado, en promedio, en el 6,6%. Mycoplasma bovis, no se encontró en ninguna muestra, a través de los tres años. M. californicum, se recuperó a partir de 14 mues-tras, en los tres años (1,5%); M. alcalescens, de 31 muestras (3%), en los tres años y Acholeplasma spp., se aisló de 19 muestras (1,4%). Este trabajo es el primer reporte de aisla-miento de Mycoplasma spp., a partir de muestras de leche en Colombia, en el Altiplano Boyacense. Incluye referencias bibliográficas

234 p. Los objetivos de esta tesis son: - Establecer la prevalencia de las principales bacterias patógenas (géneros Salmonella, Campylobacter, Aeromonas, Yersinia, así como Escherichia coli verotoxigénico) en los productos alimenticios de origen cárnico en el momento de su comercialización en los centros de venta en la ciudad de León. - Establecer la correlación entre la prevalencia [en los productos alimenticios de origen cárnico en el momento de su comercialización] de dichas bacterias patógenas y la de los principales genes marcadores de virulencia asociados a cada una de ellas. - Evaluar la similitud genética entre las cepas (de los grupos patógenos antes indicados) aisladas de los productos alimenticios antes mencionados y las aisladas de casos de gastroenteritis en hospitales de la misma localidad de venta de los alimentos. - Realizar una evaluación de la exposición, por el consumo de productos cárnicos, a las bacterias patógenas anteriormente indicadas por determinadas carnes frescas y ciertos consumidores de la ciudad de León

[Resumen]Las bacterias de las familias Enterobacteriaceae y Vibrionaceae son responsables de grandes pérdidas económicas en todo el mundo. En este sentido las investigaciones para encontrar un mecanismo de control de estas son pertinentes. En este trabajo de fin de grado se ha demostrado que la síntesis de sideróforos tipo vancrobactina es recurrente en la especie Vibrio. Además hemos comprobado que la movilización por conjugación de plásmidos involucrados en la biosíntesis de sideróforos entre bacterias patógenas puede proveer de nuevas funciones a la bacteria receptora. También hemos comprobado la existencia del sideróforo vibrioferrina, propuesto por previamente por análisis genómicos, en la bacteria patógena Edwardsiella tarda. Finalmente se encontró una combinación funcional y conjunto base adecuada para la determinación desplazamientos químicos de carbono-13 mediante cálculos DFT en modelos sencillos con átomos de azufre. [Abstract]Enterobacteriaceae and Vibrionaceae bacteria are responsible for considerable economic losses worldwide. In order to find a control mechanism of this fact makes any research related very relevant. In this memory we found that the synthesis of vancrobactin-type siderophores is recurrent in all Vibrio species. Also we have demonstrated that the mobilization by plasmid conjugation involved in the biosynthesis of siderophores in pathogenic bacteria may provide new functions to a recipient bacterium. Furthermore we have detected the siderophore vibrioferrina in a pathogenic bacteria Edwardsiella tarda, prevously proposed by genomic analysis. Finally we found a suitable pair functional/basis set for determine 13C chemical shifts on simple models containing sulfur atoms. [Resumo]As bacterias da familia Enterobacteriaceae e Vibrionaceae son responsables de grandes perdas económicas en todo o mundo. E por iso moi importante todas as investigacións posibles co fin de atopar os mecanismos de control destas bacterias. Iste traballo de fin de grado mostra que a síntese de sideróforos tipo vancrobactina é recorrente en especies de Vibrio. Asemade vimos de demostrar que a mobilización por conxugación dun plasmídeo responsable na biossíntese de sideróforos en bacterias patóxenas, poden proporcionar novas funcións a bacteria receptora. Tamén determinanos que o sideróforo vibrioferrina está presente na bacteria patóxenas Edwardsiella tarda, composto proposto con 13 anterioridade pola análise xenómica. Finalmente, atopamos un funcional e un conxunto base adecuado para determinar os desplazamentos químicos de carbono-13 en modelos simples con átomos de xofre. Xunta de Galicia; 110PXIB235157PR Ministerio de Ciencia e Innovación; AGL2009-12266-C02-022009-1226 Traballo fin de mestrado (UDC.CIE). Ciencias, tecnoloxía e xestión ambiental

232 p. En esta Tesis Doctoral se investigaron diferentes aspectos de la calidad microbiológica de la carne de conejo procedente de diferentes establecimientos (mataderos y establecimientos de venta). También se determinó la vida útil de muestras de esta carne almacenada en tres tipos de atmósferas modificadas (vacío, 100% CO2 y mezcla comercial compuesta por 35% CO2:35% O2:30% N2) y cuando se almacenaba a refrigeración en condiciones de aerobiosis. Por otro lado, se investigó la prevalencia de diferentes bacterias patógenas (Salmonella spp., Escherichia coli O157:H7, Yersinia enterocolitica, Listeria monocytogenes, Aeromonas móviles y Staphylococcus aureus) en carne de conejo. Finalmente, se estudió el efecto de diferentes tecnologías de conservación de alimentos sobre microorganismos de interés en la carne de conejo: (1) tratamientos mediante radiaciones ionizantes aplicados sobre carne estéril de conejo inoculada con Psychrobacter y varios cultivos de bacterias alterantes, y (2) tres tratamientos diferentes (térmicos, mediante ultrasonidos con presiones hidrostáticas y mediante pulsos eléctricos de alto voltaje) aplicados sobre cepas de Staphylococcus aureus. Las muestras de carne de conejo poseían bajos niveles de microorganismos indicadores pero números relativamente altos de recuentos totales. El envasado en 100 % CO2, empleando una mezcla 35:35:30 (CO2:O2:N2) y a vacío incrementó la vida útil de la carne de conejo almacenada a refrigeración (31 ºC), no apreciándose cambios organolépticos significativos hasta las 5, 2-2.5 y 2-3 semanas, respectivamente. Esta vida útil es considerablemente superior a los 6.8 días que presentaba la carne mantenida en aerobiosis a la misma temperatura. Como ocurre con otras carnes DFD, las canales de conejo DFD estudiadas se alteraron más rápidamente que las canales normales. Nuestros resultados, y también los de otros investigadores, sugieren que ni las canales ni los cortes de carne de conejo parecen ser un vehículo importante de agentes zoonóticos como Salmonella, E. coli verotoxigénico o Y. enterocolitica. Sin embargo, la prevalencia de bacterias patógenas de diversos orígenes como S. aureus, Aeromonas móviles y L. monocytogenes es similar e incluso superior a la observada en otras carnes. Empleando diversos procedimientos genéticos y fenotípicos de tipificación, se estableció que las cepas de S. aureus aisladas de carne de conejo presentaban una gran diseminación y pertenecían, la mayoría, al pulsotipo A (según el método de electroforesis en gel de campo pulsado [PFGE]) y al fenotipo “biotipo NHS CV:C-fagotipo 3A/3C/55/71”, este último relacionado con conejos afectados de estafilococosis crónica en granjas europeas. En las condiciones en las que se realizaron los estudios, S. aureus es una de las bacterias más resistente a los tratamientos por ultrasonidos con presión pero es muy sensible a los tratamientos con pulsos eléctricos de alto voltaje. Por otra lado, las cepas de Psychrobacter estudiadas mostraron más resistencia a los tratamientos con radiación ionizante que la mayoría de las células vegetativas predominantes en alimentos proteicos frescos, y una limitada capacidad de competencia con otras bacterias alterantes acompañantes.

Continuamente se cambian los nombres de las bacterias para describir más adecuadamente los grupos naturales (unidades de diversidad microbiana) y sus relaciones. Los problemas en la taxonomía de Klebsiella son ilustrativos y comunes a otros géneros bacterianos. Al igual que otras bacterias, las especies de Klebsiella fueron descritas hace mucho tiempo, cuando los métodos para identificar y clasificar bacterias eran limitados. Diferentes enfoques moleculares, desarrollados sólo recientemente, han conducido en muchos casos a revisiones taxonómicas o a propuestas sólidas de nuevas especies.

Objetivos: Demostrar que la mosca doméstica (Musca domestica) es un vector mecánico de bacterias enteropatógenas en distritos de Lima y Callao. Materiales y Métodos: Estudio de tipo descriptivo transversal. Unidad de estudio: Musca domestica. Entre mayo de 2004 y julio de 2005 se realizó un muestreo en diferentes distritos de las provincias de Lima y el Callao teniendo en cuenta el índice de infestación de cada zona elegida. Se recolectaron moscas de mercados, periferia y basurales aledaños. En el laboratorio fueron procesadas en medios de cultivo para aislamiento de enterobacterias y su identificación. Resultados: De un total de 780 moscas domésticas se aisló Escherichia coli enteropatógena, Salmonella typhi, Shigella flexneri y Yersinia enterocolitica. Se estableció una relación directa entre el hallazgo de bacterias enteropatógenas y las zonas de mayor grado de infestación (20 moscas/hora de observación). Conclusión: El aislamiento de bacterias enteropatógenas en Musca domestica permitió demostrar su papel vector. Objectives: To prove that domestic fly (Musca domestica) is a mechanic vector for enteropathogenic bacteria in Lima and Callao districts. Materials and methods: Cross sectional descriptive study. Between May 2004 and July 2005 a sampling was performed in different districts in Lima and Callao, considering the infestation index in each selected area. Flies from markets, peripheral areas and surrounding junkyards were collected. The insects were later processed in the laboratory for isolation and identification of enterobacteria. Results: Out of 780 flies, enteropathogenic Escherichia coli, Salmonella typhi, Shigella flexneri, and Yersinia enterocolitica were isolated. A direct relationship between finding enteropathogenic bacteria and the areas with greatest infestation indexes (20 flies/hour in observation). Conclusion: The isolation of enteropathogenic bacteria in Musca domestica allowed us to prove its role as a vector.