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La leucemia linfatica cronica (CLL), è una patologia incurabile caratterizzata da un intenso traffico di cellule leucemiche tra il sangue periferico e gli organi linfatici. Durante questo ricircolo le cellule di CLL si adattano alle condizioni ambientali riarrangiando il loro citoscheletro, tuttavia, le differenze fra le cellule di CLL e quelle sane non sono note. La nostra ipotesi prevede che il citoscheletro potrebbe essere coinvolto nell’adattamento meccanico delle cellule. In questo contesto abbiamo identificato la proteina HS1 come candidato. HS1 è l’omologo ematopoietico di cortactin, interagisce con il citoscheletro e inoltre nei pazienti di CLL è identificato come un fattore prognostico. Per studiarla abbiamo introdotto un’analisi basata su una tecnica di super risoluzione confocale (STED), ottimizzata allo scopo di visualizzare e quantificare la distribuzione di HS1 in cellule primarie di pazienti con la CLL e donatori sani (HD-B). Dalle analisi abbiamo rilevato che HS1 è organizzato in nanocluster in tutto il volume extra-nucleare della cellula, inoltre la sua organizzazione correla con la prognosi dei pazienti con CLL. Attraverso ricostruzioni 3D dell’intera cellula, abbiamo rilevato la presenza di grossi assembramenti di HS1 nella regione di adesione, condizione particolarmente evidente nelle cellule di pazienti con cattiva prognosi. Questa organizzazione suggerisce la necessità di reclutare HS1 nelle adesioni focali. A questo scopo abbiamo quantificato il livello di interazione tra HS1 e la vimentina, un filamento intermedio coinvolto nella formazione di queste strutture sfruttando la STED e la phasor-FLIM-FRET. Questi approcci ci hanno consentito di identificare un aumento nell’interazione delle due proteine nella regione basale, a conferma della nostra ipotesi. Nel loro insieme, questo studio ci ha consentito di dimostrare che i pazienti con CLL possono essere classificati in base all’organizzazione di una singola proteina e inoltre ci suggerisce, Chronic lymphocytic leukemia (CLL) is an incurable disease characterized by an intense trafficking of leukemic cells between the peripheral blood and lymphoid tissues. CLL cells’ ability to adapt to external cues and reorganize their cytoskeleton enables them to recirculate between tissues, however little is known about the differences between CLL and healthy B cells (HD-BD) during these processes. Our study started from the unexplored hypothesis that the cytoskeleton might be a key actor possibly involved in CLL cells' mechanical adaptation. In this context we identify the hematopoietic lineage cell-specific protein 1 (HS1) as a perfect candidate for our studies. HS1 is the hematopoietic homologous of cortactin and is a central cytoskeletal interactor. In CLL patients its phosphorylation, and expression are putative prognostic factors. We here introduce a super-resolution approach based on single-cell 3D-STED microscopy optimized to reveal the distribution of endogenous HS1 in HD-B and CLL primary cells. Our study shows that endogenous HS1 in primary cells and in MEC1 cells (CLL cell line), is organized in a nanocluster-like structure all over the extranuclear body, with a correlation between HS1 clustering and CLL patients’ prognosis. Using 3D reconstruction, we observed that HS1 nanoclusters form bulky assemblies at the bottom of the cell (adhesive side), especially in those with adverse outcomes, suggesting the need for its recruitment for cell adhesion. This observation agrees with a phasor-FLIM-FRET, and STED colocalization analysis of HS1 and vimentin, an intermediate filament involved in focal adhesion assembly, which showed an increased interaction at the basal site of the cells. Altogether these results enable for the first time the discrimination of CLL patients based on a single protein organization and suggest the presence of an altered cytoskeleton in CLL cells as compared to HD-B cells. Based on this evidence, we questioned if the organization of CLL