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Dissertação de Mestrado em Biotecnologia para as Ciências da Saúde A indústria cosmética está em constante crescimento, com produtos aliados a propriedades farmacêuticas, que surgem rapidamente. O Celuvein® é uma loção cosmética com propriedades farmacêuticas (cosmecêutico) para o tratamento e melhoramento da celulite e varizes, dois dos problemas mais preocupantes principalmente para mulheres. Os seus ingredientes incluem o Liporeductyl® (uma formulação com cafeína), Algisium® (silanol, sílica orgânica) e dióxido de titânio (TiO2), um pigmento branco com efeito protetor de raios ultravioleta (UV), sendo um dos mais usados. O objetivo deste estudo foi avaliar os efeitos destes três componentes do Celuvein®, tanto in vivo como in vitro, principalmente o seu potencial citotóxico e genotóxico. Para os estudos in vivo foi usado como modelo animal a Drosophila melanogaster, uma vez que tem várias vantagens para estudos de toxicidade. Foram testados os efeitos na longevidade e prolificidade da Drosophila, bem como o potencial genotóxico, com o teste de mutação e recombinação somática (SMART). Para os estudos in vitro, os efeitos foram estudados em quatro linhas celulares: Caco-2, HaCaT, HepG2 e Raw264.7. A citotoxicidade foi avaliada com base no teste de viabilidade com Alamar Blue, e as células foram expostas durante 24 e 48 h aos compostos. Para determinar a genotoxicidade, foi realizado o ensaio de cometa em ambos os estudos, com neuroblastos de Drosophila nos estudos in vivo, e nas células HepG2 (com e sem FPG) para os estudos in vitro. Os resultados in vivo mostraram que o Liporeductyl® (acima de 1%) é tóxico para as Drosophila, diminuindo o seu tempo de vida e prolificidade, e os resultados do SMART também sugerem que este composto tem efeitos mutagénicos neste modelo animal. No entanto, não foram observados danos no DNA. No geral, o Algisium® e o TiO2 parecem melhorar a longevidade e prolificidade da Drosophila, contudo os resultados da mutagenicidade foram inconclusivos. Os resultados in vitro, semelhante ao observado in vivo, sugerem que o Liporeductyl® é citotóxico em todas as linhas celulares estudadas de um modo dependente da dose, no entanto, nas concentrações testadas no ensaio do cometa em HepG2, não houve qualquer aumento significativo de danos no DNA ou danos oxidativos. O Algisium® foi citotóxico nas células HaCaT, HepG2 e Raw264.7, com recuperação da viabilidade celular quando a exposição por 24 h foi comparada com as 48 h. Os resultados do ensaio do cometa sugerem que a diminuição de viabilidade às 24 h de exposição está relacionada com danos de DNA e danos oxidativos, uma vez que houve um aumento significativo de ambos. O TiO2 foi citotóxico nas células HaCaT e Raw264.7 de um modo dependente da dose. Não houve qualquer dano oxidativo, mas houve um aumento de dano no DNA na concentração mais elevada. Estes resultados demonstram a importância dos testes de cosméticos e cosmecêuticos, não só para comprovar a sua eficácia, mas para o seu potencial citotóxico e genotóxico. É importante considerar que as concentrações testadas não refletem as concentrações dos componentes no Celuvein®, logo não se devem fazer extrapolações diretas. São necessários mais testes para determinar os potenciais efeitos destes componentes no corpo humano. The cosmetic industry is a growing field, with cosmetics starting to emerge with pharmaceutical properties at a fast rate. Celuvein® is a cosmetic lotion with pharmaceutical properties (cosmeceutical) for the treatment and improvement of cellulite and varicose veins, two of the most concerning problems especially for women. Its ingredients include Liporeductyl® (a formulation with caffeine), Algisium® (an organic silicium) and titanium dioxide (TiO2), one of the most vastly used white pigments and UV protectors. The aim of this study was to evaluate the in vivo and in vitro effects of these three components of Celuvein®, especially their cytotoxic and genotoxic potential. For the in vivo studies the Drosophila melanogaster animal model was used, as it has a lot of advantages for toxicity studies. Effects on longevity and prolificacy of Drosophila were tested, as well as the mutagenic potential, with the Somatic Mutation and Recombination Test (SMART). For the in vitro studies, the effects were studied in four different cell lines: Caco-2, HaCaT, HepG2 and Raw264.7. Cytotoxicity was evaluated based on the Alamar Blue viability assay, and cells were exposed to the components for 24 and 48 h. To assess the genotoxic potential of the components, the comet assay was performed in both studies, with Drosophila neuroblasts for the in vivo effects and with HepG2 cells (with and without FPG) for the in vitro effects. The in vivo results showed that Liporeductyl® was toxic for Drosophila, decreasing its lifespan and prolificacy (concentrations above 1%), and the SMART results also suggest that this component has mutagenic effects in this animal model. However, no DNA damage was observed. Algisium® and TiO2, generally, seemed to improve the longevity and prolificacy of Drosophila, and the results of the mutagenicity tested were mainly inconclusive. The in vitro results, similarly to what was observed in vivo, suggest that Liporeductyl® is cytotoxic in all tested cell lines in a dose-dependent mode, though, in the tested concentrations in the HepG2 comet assay, there wasn’t a statistically significant increase in DNA or oxidative damage. Algisium® was cytotoxic in HaCaT, HepG2 and Raw264.7 cells, with a recovery in cell viability when the 24 h of exposure were compared with the 48 h. The comet assay results suggest that the decrease in cell viability at the 24 h of exposure are related to DNA and oxidative damage, being that there was a statistically significant increase in both. TiO2 was cytotoxic to HaCaT and Raw264.7 cells in a dose-dependent way. No significant oxidative damage was present, but there was an increase in DNA damage at the highest tested concentration. These results show the importance of testing cosmetics and cosmeceuticals, not only for their efficacy but also for their cytotoxic and genotoxic potential. It’s important to consider that the tested concentrations don’t reflect the concentrations of the components in Celuvein®, so no direct extrapolation should be done. More tests are necessary to fully assess the potential effects of these components on the human body.

Dissertação de Mestrado em Biotecnologia para as Ciências da Saúde A hipertensão arterial pulmonar (HAP) é uma doença progressiva, caraterizada pela elevação da pressão arterial pulmonar e pela remodelação vascular pulmonar, conduzindo à hipertrofia do ventrículo direito (VD), insuficiência cardíaca e morte. Apesar da disfunção do VD estar intimamente relacionada com a sobrevida, pouco se sabe acerca da adaptação e insuficiência do VD no contexto da HAP. A adenosina é um importante modulador da função cardiovascular, atuando através da ativação dos seus recetores, A1, A2A, A2B e A3. Estudos recentes sugerem o envolvimento da adenosina na HAP, devido ao seu papel na regulação do tónus vascular pulmonar. Contudo, desconhece-se o papel que este nucleósido desempenha na disfunção do VD que ocorre nesta doença. Neste contexto, o principal objetivo deste estudo foi investigar o papel da sinalização da adenosina na disfunção ventricular associada à HAP. Para tal, usou-se um modelo animal de HAP induzida pela monocrotalina. Ratazanas Wistar machos receberam aleatoriamente uma injeção subcutânea de monocrotalina (grupo MCT) ou veículo (grupo CTRL). Os estudos hemodinâmicos, miográficos e a colheita de amostras para análise morfométrica, histológica e para os estudos de imunofluorescência e moleculares foram realizados 21 a 25 dias após a indução do modelo. A avaliação hemodinâmica confirmou a presença de HAP nos animais MCT, traduzida no aumento da pressão sistólica do VD. Além disso, a morfometria cardíaca e pulmonar, bem como a presença de hipertrofia dos cardiomiócitos ventriculares e da camada média das arteríolas pulmonares nestes animais permitiram a validação do modelo. Os estudos funcionais in vitro foram realizados em aurículas a contrair espontaneamente e em tiras de ventrículo direito estimuladas eletricamente, de modo a avaliar o papel dos recetores A1 e A2 da adenosina na função cardíaca. Os resultados obtidos com a R-PIA (0,001-1 μM) agonista seletivo dos recetores A1, e com a NECA (0,01-100 μM), agonista não seletivo, mostraram que os recetores A1 diminuem a frequência (cronotropismo negativo) e a força de contração (inotropismo negativo) auricular, tanto em animais CTRL como MCT. Tanto a ativação dos recetores A2A com o CGS 21680 (0,003-1 μM), como dos recetores A2AB com o BAY 60-6583 (0,01-10 μM) não alteraram a função auricular. No tecido ventricular a ativação dos recetores A1 pela R-PIA e pela NECA não modificou a contratilidade ventricular, apesar de se ter comprovado a presença destes recetores no miocárdio ventricular por experiências de imunofluorescência analisadas por microscopia confocal. De igual forma, a ativação dos recetores A2A pelo CGS 21680 também não alterou a contratilidade ventricular. Por outro lado, o bloqueio dos recetores A2B com o PSB 603 (100 nM) evidenciou um efeito inotrópico positivo da NECA nos animais MCT, sugerindo nestes animais o envolvimento destes recetores num efeito inotrópico negativo. As experiências de imunofluorescência analisadas por microscopia confocal permitiram verificar uma presença ligeira dos recetores A2B no miocárdio de animais CTRL e MCT. Contudo, nos animais com HAP, verificou-se uma presença marcada do recetor A2B em agrupamentos de células existentes no espaço intersticial do VD. Em conclusão, a adenosina parece modular a atividade cardíaca na HAP por intermédio dos seus recetores A1 e A2B, sendo que no futuro importa avaliar a relevância funcional das células intersticiais que expressam recetores A2B. Pulmonary arterial hypertension (PAH) is a progressive disease characterized by increases in pulmonary arterial pressure and pulmonary vascular remodelling, leading to right ventricle (RV) hypertrophy, heart failure and death. Despite RV dysfunction is closely tied to survival in PAH, little is known about RV adaptation and failure within the context of PAH. Adenosine is an important modulator of cardiovascular function, via the activation of A1, A2A, A2B and A3 receptors. Recent studies have implicated adenosine in PAH, due to its role on the regulation of pulmonary vascular tonus. Nevertheless, the role of this nucleoside in RV dysfunction secondary to this pathology is still unknown. In this context, our main goal was to study the role of adenosine in ventricular dysfunction associated to PAH. To carry out the study, an animal model of monocrotaline-induced PAH was used. Male Wistar rats randomly received monocrotaline (MCT group) or vehicle (CTRL group). Hemodynamic, myographic and sample collection for morphometric, histological, immunofluorescence, and molecular studies were performed 21 to 25 days after monocrotaline administration. Hemodynamic evaluation confirmed the presence of PAH in MCT animals, as demonstrated by the elevation of systolic pressure of RV. Also, cardiac and pulmonary morphometric, and the presence of cardiomyocytes hypertrophy and pulmonary media hypertrophy allowed the validation of the PAH model. In vitro functional studies were performed in spontaneously beating atria and RV strips electrically stimulated to evaluate the role of adenosine A1 and A2 receptors on cardiac function. The results obtained with R-PIA (0,001-1 μM), a selective A1 receptor agonist, and NECA (0,01-100 μM), a non-selective agonist, demonstrated that A1 receptors decrease auricular frequency (negative chronotropic effect) and force of contraction (negative inotropic effect) in both groups. The activation of A2A receptors with CGS 21680 (0,003-1 μM), and A2AB receptors with BAY 60-6583 (0,01-10 μM) did not change the auricular function. At the ventricular level, the activation of A1 receptors with R-PIA and NECA did not change ventricular contractility, in spite of the presence of these receptors in RV myocardium as demonstrated by confocal microscopy. Likewise, the activation of A2A receptors with CGS 21680 had no effect on ventricular contractility. On the other hand, in MCT animals, A2B receptor blockade with PSB 603 (100 nM) resulted in a positive inotropic effect promoted by NECA, suggesting that these receptors could be involved in a negative inotropic effect. Immunolocalization studies confirmed the presence of small amounts of A2B receptors staining in the RV myocardium of both CTRL and MCT animals. However, we only observed in PAH rats a marked expression of this receptor in cells present in the interstitial spaces of RV. In conclusion, adenosine seems to modulate cardiac function in PAH through the activation of A1 and A2B receptors. The functional significance of A2B positive interstitial cells should be evaluated in the near future. Fundação para a Ciência e Tecnologia, e da Unidade Multidisciplinar de Investigação Biomédica - UMIB

Dissertação de Mestrado em Bioquímica O cancro é uma doença que afeta milhares de pessoas em todo o mundo. O papilomavírus humano (HPV) é uma das etiologias de cancro. Muitos pacientes de cancro apresentam inflamação sistémica para o qual existem reduzidas opções terapêuticas. Os polifenóis da dieta têm sido propostos para o seu tratamento, mas o seu potencial contra inflamação sistémica associada com o HPV é desconhecido. Assim, este trabalho tem como principal objetivo avaliar a eficácia a longo-prazo da suplementação oral da curcumina e da rutina em animais transgénicos para o HPV16 (K14HPV16). Neste estudo foram usados 50 murganhos fêmea, dos quais 38 transgénicos (K14HPV16) e 12 wild-type. Às 6 semanas de idade, iniciou-se a administração oral na comida dos compostos, curcumina e rutina Os animais foram sacrificados às 30 semanas, sendo recolhido o sangue, órgãos, e pele. Foram avaliadas as alterações inflamatórias nas lesões cutâneas induzidas pelos transgenes víricos, no sangue, fígado e baço através de análises hematológicas e histopatológicas. Foi também avaliado o stresse oxidativo a nível hepático. A carcinogénese cutânea induzida pelos transgenes do HPV16 esteve associada a progressiva, severa, inflamação sistémica (leucocitose, hepatite e esplenite) e mortalidade significativa. A administração oral de curcumina e rutina suprimiram totalmente a mortalidade enquanto reduziam os leucócitos e a incidência de esplenite e hepatite. Estes resultados levam-nos a concluir que os animais K14HPV16 são um modelo animal útil para estudar a inflamação sistémica associada a cancros induzidos pelo HPV. A administração de polifenóis na dieta podem ser uteis para o tratamento, com a consequente diminuição da inflamação sistémica. Cancer is a disease that affects millions of people worldwide. Human papillomavirus (HPV) is a possible cause of cancer. Many cancer patients have systemic inflammation for which therapeutic options are reduced. The dietary polyphenols have been proposed for its treatment, but its potential against systemic inflammation associated with HPV is unknown. Curcumin and rutin are compounds that are thought to have therapeutic capabilities against HPV. However, there are few studies where the role of these compounds in HPV-associated tumors is shown. The main objective of this work is to study the human papilloma virus type 16 (HPV16), in transgenic animals (K14HPV16), specifically, a study of systemic inflammation induced by HPV 16, and its effects in the liver, as well as the effects of two compounds with potential therapeutic effects, curcumin and rutin. In this study were used 50 female mice, of which 38 are transgenic (K14HPV16) and 12 wild-type. After 6 weeks, it began the study with the compounds, curcumin and rutin which were added to the food. The animals were sacrificed at 30 weeks, the blood, the organs, and the skin tissue, were collected, to evaluate the activity of the compounds, as well as to proceed to the histopathological and biochemical analysis. The skin carcinogenesis induced by transgenes of HPV16 was associated with progressive, severe, systemic inflammation (leukocytosis, hepatitis and splenitis) and significant mortality. Oral administration of curcumin and rutin totally suppressed while reducing the mortality and incidence of leukocytes splenitis and hepatitis. These results lead us to conclude that the K14HPV16 Animals are a useful animal model to study the systemic inflammation associated with cancers induced by HPV. The administration of polyphenols in the diet may be useful for the treatment, with the consequent reduction of systemic inflammation.

Dissertação de Mestrado em Bioquímica A diabetes mellitus é uma doença complexa e potencialmente debilitante, que afeta milhões de indivíduos em todo o mundo e é já considerada um problema de saúde pública pela Organização Mundial de Saúde (OMS). A diabetes tipo 1 é caraterizada pela destruição autoimune das células β pancreáticas dos ilhéus de Langerhans e a diabetes tipo 2 pela resistência periférica à insulina levando ao desenvolvimento da hiperglicemia. A hiperglicemia crónica afeta negativamente a regeneração e remodelação óssea, atrasando assim, a cicatrização óssea e aumentando a suscetibilidade de doenças periodontais. Deste modo, na regeneração guiada de tecidos, é necessária a utilização de um biomaterial adequado que promova a regeneração tecidular em condições diabéticas. Neste estudo, avaliou-se a biocompatibilidade in vivo de uma membrana de colagénio num modelo animal diabético, particularmente, a reação inflamatória aguda (48 h) e crónica (3 semanas) após implantação subcutânea. Neste trabalho foram utilizados 14 ratos machos da estirpe Wistar, divididos em 4 grupos: Controlo (n=3) e Diabetes (n=3) 48h e Controlo (n=3) e Diabetes (n=5) 3 semanas. A condição diabética foi introduzida através da administração intraperitoneal de 50 mg/kg de estreptozotocina (STZ). Foi realizada uma cirurgia no dorso dos animais onde foi efetuada a implantação subcutânea de membranas de colagénio. Um grupo controlo e um grupo com animais diabéticos foram sacrificados 48 horas após a implantação do biomaterial, e os animais dos restantes grupos foram sacrificados 3 semanas após a implantação. Foram recolhidas amostras de pele dos locais de implantação que foram avaliadas por histopatologia, com contagem total e diferencial das células inflamatórias, através da coloração de hematoxilina e eosina (H&E). Para caracterizar o infiltrado inflamatório linfocitário, foi efetuada a técnica de imunohistoquímica (IHQ) com os anticorpos CD3, BLA e CD79. Observamos que o número total de células inflamatórias foi superior nos animais controlo, sendo esta diferença mais acentuada às 48h após implantação. Relativamente à contagem diferencial, verificou-se que às 48h se observa uma maior percentagem de neutrófilos, enquanto nos grupos sacrificados às 3 semanas se obteve uma percentagem superior de linfócitos e macrófagos. Relativamente aos resultados obtidos na IHQ, os animais controlo apresentaram maior percentagem de linfócitos marcados com CD3 (linfócitos T) e menor percentagem de linfócitos marcados com BLA e CD79 (linfócitos B), do que os animais diabéticos. A membrana de colagénio demonstrou ser bastante biocompatível, apresentando uma resposta inflamatória moderada às 3 semanas. Os grupos diabéticos (48h e 3 semanas) apresentaram diferenças na resposta inflamatória em relação aos grupos controlo, nomeadamente no que se refere ao número de células e à sua tipologia. O STZ administrado para induzir a diabetes possui um efeito imunossupressor que pode estar na origem do menor número de células inflamatórias nos animais diabéticos. Ainda não são claros os mecanismos subjacentes ao tipo celular presente no infiltrado inflamatório após implantação da membrana de colagénio em condições diabéticas. No entanto, é possível que a hiperglicemia possa estar na origem do menor número de linfócitos T observado na condição diabética, não afetando a presença de linfócitos B. Deste modo, a diminuição da resposta imune em condições diabéticas pode estar associada fundamentalmente a uma diminuição dos linfócitos T. Diabetes mellitus is a complex and potentially debilitating disease that affects millions of individuals worldwide and it is considered a public health problem by the World Health Organization (WHO). Type 1 diabetes is characterized by autoimmune destruction of pancreatic β cells of the islets of Langerhans, and type 2 diabetes by peripheral insulin resistance leading to the development of hyperglycemia. Chronic hyperglycemia negatively affects bone remodeling and regeneration, delaying bone healing and increasing the susceptibility of periodontal diseases. Therefore, in guided tissue regeneration, the use of a suitable material that promotes tissue regeneration in diabetic conditions is required. In this study, we evaluated the in vivo biocompatibility of a collagen membrane in a diabetic animal model, particularly the acute (48 hours) and chronic (3 weeks) inflammatory reaction after subcutaneous implantation. In this study, 14 male Wistar rats were used, divided into four groups: Control (n=3) and Diabetes (n=3) 48h and Control (n=3) and Diabetes (n=5) 3 weeks. The diabetic condition was introduced via intraperitoneal administration of 50 mg/kg of streptozotocin (STZ). A surgery was performed on the back of the animals, where the implantation of collagen membranes was subcutaneously performed. A control group and one group of diabetic animals were sacrificed 48 hours after the implantation of the biomaterial and the other two groups were sacrificed 3 weeks after implantation. Skin samples of the implantation sites were collected and evaluated by histopathology, with total and differential counts of inflammatory cells, after staining with hematoxylin and eosin (H&E). To characterize the lymphocytic inflammatory infiltrate, immunohistochemistry (IHC) was performed with CD3, CD79 and BLA antibodies. The total number of inflammatory cells was higher in the control animals, with a more evident difference at 48h after implantation. Regarding the differential counts, it was found that at 48h a higher percentage of neutrophils was present, while in the animals sacrificed at 3 weeks, a higher percentage of lymphocytes and macrophages was observed. Regarding the results obtained in IHC, control animals showed a higher percentage of CD3-positive lymphocytes (T lymphocytes) and a lower percentage of BLA and CD79-positive lymphocytes (B lymphocytes) than diabetic animals. The collagen membrane was shown to be highly biocompatible, having a moderate inflammatory response at 3 weeks post implantation. The diabetic groups (48 hours and 3 weeks) showed differences in the inflammatory response compared to control groups, in particular regarding the number of inflammatory cells and their type. STZ has an immunosuppressive effect that may be associated with fewer inflammatory cells in the diabetic animals. The mechanisms underlying cell type presence in the inflammatory infiltrate in diabetic conditions are not yet clear. However, it is possible that hyperglycemia can cause the smaller number of T lymphocytes observed in the diabetic condition, without affecting the presence of B lymphocytes. Therefore, the decrease of the immune response in diabetic conditions might be mainly associated with a decrease in T lymphocytes.

Tese de Doutoramento em Ciências Veterinárias O periodonto é o órgão que envolve e sustenta o dente, sendo constituído pelo osso alveolar que forma o alvéolo dentário, o cemento que envolve a raiz do dente, o ligamento periodontal que estabelece a ligação entre os dois tecidos anteriores formando uma articulação e a gengiva. A periodontite é uma doença inflamatória de elevada prevalência em cães e seres humanos e que, quando não tratada, pode conduzir à esfoliação dentária e colocar em risco a vida do doente devido às manifestações sistémicas decorrentes pela dispersão sanguínea de mediadores inflamatórios e microrganismos patogénicos. Os tratamentos que atualmente se usam para tratar esta patologia revelam-se muitas vezes ineficazes. A Engenharia de Tecidos emergiu, recentemente, como uma potencial terapia alternativa. Esta abordagem consiste no fornecimento de um biomaterial de suporte semeado com células estaminais que visa a regeneração ad integrum da arquitetura e da função biológica do tecido afetado. As células estaminais mesenquimatosas de origem oral e dentária têm a capacidade de regenerar os tecidos periodontais. No entanto, as células provenientes destes locais pressupõem uma morbilidade significativa associada ao local da colheita e possuem um baixo rendimento celular em comparação com fontes não-orais, como por exemplo o tecido adiposo. As células estaminais derivadas do tecido adiposo (ASCs) possuem um grande potencial de aplicação em terapias celulares devido à sua facilidade de colheita e baixa morbidade associada, ao alto rendimento de células isoladas e à capacidade demonstrada para se diferenciarem em inúmeras linhagens celulares. O principal objetivo da presente Tese consistiu no desenvolvimento de uma nova abordagem de Engenharia de Tecidos para o tratamento de defeitos periodontais com base numa matriz biodegradável combinada com ASCs. Partindo do conhecimento de que o cão é o modelo animal mais relevante para estudar a doença periodontal em humanos, pretende validar-se esta estratégia de Engenharia de Tecidos em modelo canino antes da aplicação translacional para a Medicina Humana, sem descuidar nunca que esta doença assume também grande importância na Medicina Veterinária. Tendo isto em consideração, o trabalho desenvolvido nesta Tese teve como principais objetivos:  Otimizar a colheita e o isolamento de ASCs caninas (cASCs) provenientes de diferentes regiões anatómicas e caracterizar a sua estaminalidade e o seu potencial osteogénico em diferentes passagens;  Avaliar a resposta à implantação de cASCs em modelo subcutâneo de murganho saudável;  Desenvolver e caracterizar um material de suporte (scaffold) biodegradável de dupla camada que vise a regeneração de defeitos periodontais;  Avaliar o potencial in vitro do scaffold de dupla camada desenvolvido para uso em Engenharia de Tecidos através da sua cultura com cASCs;  Avaliar a funcionalidade in vivo do scaffold para a regeneração óssea, utilizando um modelo de defeito mandibular em rato. A fim de alcançar os objetivos propostos, numa primeira etapa, as amostras de tecido adiposo canino foram colhidas a partir de duas localizações anatómicas diferentes, a saber, tecido subcutâneo e tecido omental, e o isolamento das cASCs foi posteriormente otimizado. A estaminalidade destas células e o potencial de diferenciação osteogénica foram analisadas ao longo das diferentes passagens através de RT-PCR em tempo real e histologia. Posteriormente, as mesmas cASCs foram xenotransplantadas em murganho, a fim de avaliar a resposta xenogénica do hospedeiro contra as mesmas. Concomitantemente, desenvolveu-se um scaffold composto por uma mistura de amido e poli-ε-caprolactona e compreendendo duas camadas: uma malha tridimensional de fibras (“fiber mesh”) funcionalizadas com grupos silanol para promover a osteogénese ao nível do osso alveolar, e uma membrana obtida por evaporação de solvente com o intuito de atuar como barreira contra a migração de epitélio gengival para o interior do defeito periodontal. Os scaffolds obtidos foram extensivamente caracterizados quanto às suas propriedades mecânicas, ao comportamento de degradação e à eficácia da técnica de funcionalização. De seguida, os scaffolds foram semeados com cASCs a fim de avaliar a funcionalidade in vitro das construções obtidas. Como forma de avaliar a capacidade dos scaffolds desenvolvidos para promover a regeneração óssea, estes foram implantados num defeito circular de tamanho crítico induzido na mandíbula do rato, e a formação de novo osso foi determinada após oito semanas de implantação. Em geral, a estaminalidade e o potencial de diferenciação osteogénica das cASCs decresceu ao longo de passagens. Além disso, demonstrou-se também que a origem anatómica do tecido adiposo tem um efeito significativo nas duas características analisadas. Após a injeção de cASCs num hospedeiro xenogénico (murganho), não foi observada nenhuma resposta inflamatória local exuberante contra as mesmas. A caracterização físico-química do scaffold desenvolvido demostrou que esta matriz apresenta uma morfologia, composição da superfície, comportamento de degradação e propriedades mecânicas adequadas para auxiliar a regeneração periodontal. Os estudos biológicos com cASCs revelaram o potencial que ambas as camadas têm de permitir a adesão e proliferação celular, bem como de promover a diferenciação osteogénica na malha funcionalizada. Nos defeitos mandibulares experimentais, o scaffold funcionalizado com grupos silanol induziu uma maior formação de osso novo em comparação com a membrana comercial de colagénio e com os defeitos vazios. Além disso, a face composta pela membrana evitou o crescimento do tecido epitelial e conjuntivo para o interior do defeito, o qual é um dos requisitos para o sucesso da regeneração guiada de tecidos. Em resumo, este trabalho demonstrou que o tecido adiposo canino fornece uma fonte alternativa de células estaminais com capacidade de diferenciação osteogénica e que estas não induzem uma resposta inflamatória exuberante no hospedeiro xenogénico. Estes resultados, juntamente com o potencial observado do scaffold desenvolvido para acomodar a proliferação e diferenciação das cASCs cultivadas e para promover a regeneração de osso in vivo, permite propor esta construção como uma alternativa às técnicas atualmente utilizadas na regeneração periodontal, tanto no homem como no cão. Periodontium is the organ which involves and sustains the tooth and it is constituted by the alveolar bone which forms the dental alveolus, the cementum which surrounds the tooth root, the periodontal ligament, which connects them and form a joint, and the gingiva. Periodontitis is an inflammatory pathology highly prevalent in both dogs and humans that, when not treated, can lead to tooth exfoliation and also to life threatening systemic implications due to the blood dispersion of inflammatory mediators and pathogenic microorganisms. The routine clinical therapies currently used to treat periodontal defects are often ineffective. Tissue Engineering has emerged as a valuable alternative approach aiming to regenerate ad integrum the architecture and the biological function of the damaged tissue by providing the repair site with a suitable supportive biomaterial seeded with stem cells. Mesenchymal stem cells from oral and dental origin have the ability to regenerate the periodontium; however, harvesting cells from these sites implies significant local tissue morbidity and low cell yield, as compared to non-oral sources, such as the adipose tissue. Adipose-derived stem cells (ASCs) hold a great potential in cell based therapies for their easiness of harvesting with low morbidity, generating high yields of cells with capacity to differentiate into several lineages. The main goal of this Thesis was to develop a new Tissue Engineering approach for the treatment of periodontal defects, based on an innovative biodegradable supportive matrix combined with ASCs. As the dog is the most relevant animal model to study human periodontal disease and, simultaneously, an important subject in Veterinary Medicine, we envisioned to validate this Tissue Engineering strategy in a canine model prior to the translation of this strategy for human application. With this in mind, the work aimed to achieve the following distinct objectives:  Optimize harvesting and isolation of canine ASCs (cASCs) from different anatomical regions and characterize their stemness and osteogenic potential at different passages;  Evaluate the response to the implantation of cASCs in a healthy mice subcutaneous model;  Develop and characterize a double layer biodegradable scaffold meeting the requirements to achieve different functionalities, targeting regeneration of periodontal defects;  Evaluate the potential of the developed double layer scaffold for Tissue Engineering by culturing it with cASCs,  Assess the in vivo functionality of the scaffold for bone regeneration, using a rat mandibular defect model. In order to achieve the proposed objectives, in a first stage, canine adipose tissue samples were harvested from two different anatomical sites, namely subcutaneous and omental adipose tissue, and the isolation of cASCs was optimized. The stemness and the osteogenic differentiation potential of these cells were analyzed along passages using real time RT-PCR and staining procedures. Subsequently, the same stem cells were xenotransplanted (into a mouse model) in order to evaluate the response of the xenogenic host against the cASCs. Concomitantly, a double layer scaffold made of a blend of starch and poly (ε-caprolactone) was designed, comprising a 3D fiber mesh functionalized with silanol groups to promote osteogenesis and a solvent casting membrane aiming to act as a barrier against the migration of gingival epithelium into the periodontal defect. The obtained scaffolds were extensively characterized regarding their mechanical properties, degradation behaviour and effectiveness of the functionalization. Ultimately, the scaffolds were seeded/cultured with cASCs to assess the in vitro functionality of the obtained constructs. Finally, to assess the ability of the developed scaffold to promote bone regeneration, these were implanted in a circular critical size defected induced in rat mandible, and the formation of new bone was quantified after 8 weeks of implantation. In general, the stemness and osteogenic differentiation potential of the cASCs was found to decrease along increasing passages. Additionally, it was shown that the anatomical origin of the adipose tissue has a significant effect in the osteogenic differentiation ability of these cells. After the injection of cASCs in a xenogenic host (mouse), it was proved that no significant local immunogenic response was detected against them. The physicochemical characterization of the newly developed double layer scaffold showed that this matrix presents a morphology, surface composition, degradation behaviour and mechanical properties suitable for assisting periodontal regeneration. The biological studies with cASCs revealed the potential of both layers to allow cellular adhesion and proliferation, and also to promote the osteogenic differentiation on the functionalized fiber mesh. In the induced mandibular defect, the functionalized scaffold with silanol groups was shown to enhance higher new bone formation in comparison to a collagen commercial membrane and to empty defects. Moreover, the membrane layer was observed to avoid the epithelial and connective tissue ingrowth, which is one of the main requirements for guided tissue regeneration. In summary, this work demonstrated that the canine adipose tissue provides an alternative source of stem cells with the ability to differentiate into different cellular lineages and which do not induce an in vivo inflammatory response in the xenogeneic host. These findings together with the observed potential of the developed scaffold to accommodate the proliferation and differentiation of the cultured cASCs and to enhance in vivo bone regeneration allows to propose this tissue-engineered matrix for periodontal regeneration as an alternative to the techniques currently used in the dentistry field, both in human and in veterinary medical practice.

Dissertação de Mestrado em Biologia Clínica Laboratorial Patologias do tecido ósseo, originárias de várias causas, nomeadamente traumas, infeções ou doenças ósseas, são muito comuns na nossa sociedade. Na situação de diabetes mellitus, estes defeitos ósseo estão agravados e o seu tratamento apresenta uma maior dificuldade para os clínicos. Nos últimos anos a nanotecnologia tem fornecido variadíssimos benefícios no campo da engenharia do tecido ósseo, no entanto nenhuma das soluções tem resolvido totalmente os diversos desafios que pressupõem a reparação óssea. Desta forma, têm sido estudadas novas soluções terapêuticas para resolver este problema, e o desenvolvimento de novos biomateriais fabricados com nanopartículas que simulem a estrutura e composição do osso, favorecendo a sua regeneração, têm sido equacionados. Assim este trabalho tem como principal objetivo o estudo da biocompatibilidade de uma preparação de nanopartículas de hidroxiapatite (NanoXIM•HAp102®) na condição de diabetes, usando para tal um modelo de implante subcutâneo em ratos Wistar. Neste estudo foram usados 16 ratos machos da estirpe Wistar, dos quais 10 foram submetidos à indução da diabetes, por via intraperitonial, com uma única administração de 55 mg/Kg de estreptozotocina (STZ), sendo os restantes injetados com soro tampão citrato (grupo controlo). Duas semanas após a indução da diabetes, implantou-se subcutaneamente em todos os animais 0,5 ml de suspensão de nanopartículas de hidroxiapatite (nano-HAp). Os animais foram sacrificados às 48h e 3 semanas, sendo recolhido o sangue, órgãos, e tecido subcutâneo com a nano-HAp, para avaliar a atividade e expressão de variados marcadores séricos, assim como proceder à análise histopatológica. Os animais diabéticos apresentaram uma diminuição do peso corporal e um aumento do peso relativo dos rins e do fígado quando comparado com os respetivos grupos controlo. Os valores dos marcadores de função renal, ureia e creatinina, e das enzimas hepáticas ALT e FA, encontraram-se elevados nos animais diabéticos comparativamente com os controlos. Às 48h, verificou-se a existência de uma resposta inflamatória aguda, com presença de neutrófilos e linfócitos, e uma resposta inflamatória crónica caracterizada pela presença de macrófagos e células gigantes, às 3 semanas. Tanto a resposta inflamatória, como a reabsorção das nanopartículas encontraram-se diminuídas nos grupos diabéticos comparativamente com o respetivo grupo controlo. Constatou-se a presença de uma cápsula fibrosa nos grupos experimentais das 3 semanas, sendo que esta foi menor no grupo diabético comparativamente com o respetivo grupo controlo. Observou-se ainda alguma agregação de nano-HAp, tendo esta sido mais intensa em ambos os grupos diabéticos, e dentro destes maior às 3 semanas. Uma vez que não se verificou uma reação exacerbada e que ocorreu reabsorção do biomaterial, sem sinal de toxicidade hepática ou renal, na quantidade testada, podemos concluir que as nano-HAp não apresentam toxicidade. Embora se tenha observado reabsorção das nano-HAp ao longo do período experimental, constatou-se que este processo era bastante mais lento nas condições diabéticas. Pathologies of bone tissue, that are provided from different causes, including trauma, infections or bone diseases, are very common in our society. In the specific case of diabetes mellitus, the bone defects are intensified and its treatment presents a major difficulty for clinicians. Actually, nanotechnology provides many different benefits in the field of bone tissue engineering, however, any solutions have completely solved the challenges that require bone repair. In this way, it has been studied new therapeutic solutions to solve this problem, the development of new biomaterials made from nanoparticles that acquire a similar structure and composition of the original bone, promoting regeneration, have been solved. The main objective of this work is the study of the biocompatibility, of hydroxyapatite nanoparticles (NanoXIM • HAp102 ®) in diabetic conditions, using for such a model of subcutaneous implantation in Wistar rats. This study used 16 male rats of the Wistar strain, 10 of which were subjected to induction of diabetes with single intraperitoneally administration of 55 mg / kg streptozotocin (STZ), and the remaining were injected with physiological serum (the control group). After the induction of diabetes, was subcutaneously implanted 0,5 ml hydroxyapatite nanoparticles (nano-HAp). The animals were sacrificed at 48 hours and 3 weeks, being collected the blood, organs, and subcutaneous tissue, with nano-Hap, to evaluate the expression and the activity of various serum markers, as well as the histopathology. Diabetic animals showed a decrease in body weight and an increase in the relative weight of the liver and kidneys when compared with the respective control groups. The values of markers of renal function, urea and creatinine, and liver enzymes ALT and FA, were also higher in diabetic animals compared with control. At 48 h, it was found a several inflammatory response with neutrophils and lymphocytes, and a chronic inflammatory response characterized by the presence of macrophages and giant cells, at 3 weeks. The inflammatory response and the reabsorption of the nanoparticles were found decreased in diabetic group compared with the respective control group. It was observed the presence of a fibrous capsule in the experimental groups of the 3 weeks, but it was lower in the diabetic group as compared to the respective control group. There was also some aggregation of nano-Hap, that was more intense in both diabetic groups, and within these higher at 3 weeks. With the quantity tested, there has not been observed an overreaction and the biomaterial reabsorption occurred without signs of hepatic or renal toxicity. Although we observed a progressive reabsorption of nano-HAp throughout the experimental period, this process was significantly slower in diabetic conditions.