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Resumen del trabajo presentado a la 30th Annual Conference of the European Macrophage and Dentritic Cell Spciety (EMDS), celebrado en Amsterdam del 21 al 23 de septiembre de 2016., In recent years remarkable progress has been made towards the understanding of the basic molecular and cellular functions of FAST and its homologs. The purpose was to further explore the effect of FAST deficiency in innate immune system, particularly in some macrophage functions such as phagocytosis and intracellular killing of gram positive and gram negative bacteria. Compared with wild-type macrophages, FAST-/- macrophages exhibited increased phagocytosis of Escherichia coli both in vitro and in vivo. Evaluation of the expression of the receptors TLR2 and TLR4 and maturation markers revealed no significant differences between wild-type and FAST-/-macrophages. Both cell types also showed a similar ability to kill bacteria and to produce reactive oxygen species. Bacterial counts at the early time points in the gentamicin protection assay correlated well with the phagocytic indexes. Consistent with the findings in FAST-/-macrophages, human THP-1 macrophages with silenced FAST expression showed increased phagocytosis of Escherichia coli compared with control cells. We have demonstrated, that FAST-/- macrophages have a decrease in mitochondrial membrane potential caused by a specific deficiency of complex I of the respiratory chain (40%). In conclusion, our findings reveal a novel role for FAST in the regulation of phagocytosis.

[EN]: [Introduction]: Rapid determination of the antibiotic susceptibility test in bacteria remains a challenge for Clinical Microbiology laboratories. [Methods]: An improvement in the colorimetric antimicrobial susceptibility testing performed with resazurin in enterococci and staphylococci has been carried out. The design of method was performed using two collection strains, which have a known susceptibility. This procedure was then validated against standard commercial methods on 15 strains of staphylococci and 15 strains of enterococci from patients. [Results]: The essential agreement between the colorimetric method and commercial methods (E-test, MicroScan and VITEK2) was 100%. [Conclusion]: Resazurin allows us to obtain a reliable antibiotic susceptibility test in staphylococci and enterococci in less than two hours., [ES]: [Introducción]: La realización de un antibiograma rápido sigue siendo un reto para los laboratorios de Microbiología Clínica. [Métodos]: Se ha realizado una mejora en el antibiograma colorimétrico realizado mediante resazurina en estafilococos y enterococos. El diseño del método se realizó mediante el uso de dos cepas de colección que presentan una sensibilidad conocida. Este procedimiento se validó posteriormente frente a los métodos comerciales mediante el procesamiento de 15 cepas de estafilococos y 15 de enterococos aisladas de pacientes. [Resultados]: Se ha obtenido un 100% de concordancia entre la sensibilidad obtenida mediante resazurina y la obtenida mediante los métodos comerciales (E-test, MicroScan and VITEK2). [Conclusión]: Mediante el uso de resazurina es posible obtener un antibiograma en estafilococos y enterococos en menos de dos horas de forma fiable., This work was supported by a grant from the Fundación Francisco Soria Melguizo, Spain.

Resumen del trabajo presentado al XIX Congreso de la Sociedad Española de Enfermedades Infecciosas y Microbiología Clínica, celebrado en Sevilla del 28 al 30 de mayo de 2015., [Introducción]: Brucella es un patógeno intracelular facultativo capaz de sobrevivir y replicarse dentro de las células del sistema fagocítico mononuclear. Esta capacidad de supervivencia intracelular dificulta su erradicación mediante tratamiento antibiótico y determina la tendencia a la cronificación de la brucelosis. [Objetivos]: El objetivo de este estudio fue generar una nueva vacuna frente a Brucella mediante el uso de antígenos proteicos de la bacteria encapsulados en nanopartículas y evaluar su eficiencia en un modelo murino de enfermedad. [Resultados]: Se obtuvo un extracto proteico a partir del procesamiento en solución salina caliente de Brucella abortus cepa RB51. El extracto de caracterizó mediante LC-MS/MS antes de su encapsulación en hidrogeles (1) mediante nanoprecipitación (NP) o (2) por precipitación por antisolvente supercrítico (SC). Los ratones se inmunizaron vía intraperitoneal con dos dosis diferentes (de 20 μg o 100 μg de proteína) de ambos tipos de nanopartículas. Cuatro semanas después, los ratones fueron infectados con Brucella melitensis 16M (5 × 104 CFU/ratón). Los ratones inmunizados con las nanopartículas SC mostraron una reducción de 1 log (UFC/bazo) en el recuento de bacterias a ambas concentraciones, mientras que los ratones inmunizados con las nanopartículas NP sólo mostraron una reducción de 1 log (UFC/bazo) cuando se usaron 100 μg de proteína encapsulada, y apenas una reducción de 0,5 log cuando se utilizaron 20 μg de proteína encapsulada. Ambas nanopartículas, pero especialmente las obtenidas mediante el método SC, fueron capaces de desencadenar una respuesta pro-Th1 (IL-12) y pro-Th17 (IL-23) así como pro-inflamatoria (IL-6) en macrófagos de ratón, y asimismo una respuesta Th1 (IL-2 e IFN-g) y una respuesta Th17 en esplenocitos de ratón. [Conclusiones]: La administración de nanopartículas de extractos proteicos de la cepa vacunal Brucella abortus RB51, y sobre todo las obtenidas por precipitación por antisolvente supercrítico, demostraron aumentar la capacidad defensiva del sistema inmunitario murino frente a la infección experimental con Brucella melitensis 16M virulenta. La efectividad se correlacionó con las respuestas Th1 y Th17 inducidas por ambas.

Resumen del póster presentado al XIX Congreso de la Sociedad Española de Enfermedades Infecciosas y Microbiología Clínica, celebrado en Sevilla del 28 al 30 de mayo de 2015., [Introducción]: La rapidez en la emisión del antibiograma es una de las prioridades del laboratorio de Microbiología Clínica. La resazurina es un indicador REDOX cuya la forma oxidada es de color azul. Cuando se incuban células no viables en presencia de resazurina, ésta no se reduce y mantiene su color azul; en cambio, las células viables la reducen a resorufina, que es de color rojo. Este cambio de color puede ser detectado a simple vista o mediante espectrofotometría. [Objetivos]: Realizar un antibiograma en enterobacterias mediante el uso de resazurina. [Material y métodos]: Se prepararon suspensiones de Escherichia coli ATCC 35218 a concentraciones de 106, 107 and 108 UFC/ml en 3 ml de caldo Mueller Hinton con los cationes ajustados. La ampicilina se ensayó a las concentraciones críticas de sensibilidad y resistencia propuestos por el EUCAST. Del mismo modo, Escherichia coli ATCC 25922 se testó frente a amicacina, cefotaxima y ciprofloxacino. En todos los casos, se preparó un tubo sin antibiótico como control positivo y otro sin inóculo bacteriano como control negativo. Se observó el color del medio cada 15 minutos de incubación. El cambio de color del medio de azul a rojo indicó crecimiento bacteriano. Además, se calculó el porcentaje de la forma reducida de resazurina a partir de las absorbancias a 570 y 600 nm (Smart Spec™ Plus, Bio‑Rad). [Resultados]: Inóculos de 106, 107 y 108 UFC/ml de Escherichia coli ATCC 35218, resistente a ampicilina, viraron el color del medio, indicando crecimiento bacteriano, durante la tercera, segunda y primera hora de incubación respectivamente, tanto incubados en presencia del antibiótico como sin él. Inóculos 106 UFC/ml de Escherichia coli ATCC 25922, sensible a los antibióticos estudiados, viraron el color del medio durante la tercera hora de incubación sin antibiótico y las cepas incubadas con antibiótico no lo viraron. Del mismo modo, inóculos de 107 UFC/ml viraron el color del medio durante la segunda hora de incubación sin antibiótico y las cepas incubadas con antibiótico no. Finalmente, inóculos de 108 UFC/ml viraron el indicador durante la primera hora de incubación tanto en presencia del antibiótico como sin él. En todos los casos, cuando se observó el viraje del indicador, el porcentaje de reducción de la resazurina, calculado mediante las lecturas espectrofotométricas, fue superior al 17%. [Conclusiones]: En dos horas se puede determinar la sensibilidad de las enterobacterias a los antibióticos mediante el uso de resazurina., Este trabajo ha sido financiado por una subvención de la Fundación Francisco Soria Melguizo.

Tesis Doctoral presentada por Lisbeth Gonçalves De Freitas para optar al grado de Doctora por la Universidad de Valladolid, Facultad de Medicina: Departamento de Anatomía Patológica, Microbiología, Medicina Preventiva y Salud Pública y Medicina Legal y Forense., Esta Tesis Doctoral estudia los efectos de la ausencia de FAST (Fas-activated serine threonine phosphoprotein) en la capacidad fagocítica de los macrófagos en ratones y humanos. Nuestros resultados muestran que los macrófagos deficientes en FAST (knockout, KO) tienen una capacidad aumentada de fagocitar bacterias Escherichia coli en ensayos in vitro e in vivo. Los macrófagos KO también presentaron un ligero aumento de la fagocitosis de Staphylococcus aureus pero no resultó ser significativo. La evaluación de los receptores TLR2 y TLR4 y de diferentes marcadores de maduración no reveló diferencias entre macrófagos de ratones silvestres y KO. Ambos grupos de macrófagos presentaron similar capacidad bactericida y de producción de radicales de oxígeno. Los conteos bacterianos a tiempos iniciales en el ensayo de protección con gentamicina se correlacionaron con los índices fagocíticos. También demostramos que el aumento de la capacidad fagocítica esta presente en macrófagos humanos derivados de la línea celular THP-1 cuando se silencia la expresión de FAST mediante RNA de interferencia. En conclusión, nuestros resultados revelan un nuevo papel de FAST en la regulación de la fagocitosis y contribuye en la compresión de las bases moleculares y funciones celulares de FAST y sus homólogos.