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Der Verlauf nach einer Nierentransplantation weist eine große Variabilität auf. Genetische Faktoren scheinen diesen zu beeinflussen. Der nukleäre Transkriptionsfaktor \(\kappa\)B (NF-\(\kappa\)B) stellt einen Schlüsselmechanismus bei der Inflammation, der Immunabwehr und der Zellproliferation dar. So wurde in dieser Studie geprüft, ob der NF\(\kappa\)B1-Promotorpolymorphismus (-94ins/delATTG) mit der Abstoßungsreaktion und der Infektion mit dem Cytomegalievirus nach einer Nierentransplantation assoziiert ist. Die Analysen ergaben, dass der homozygote Insertionsgenotyp ein 1,7-fach höheres Risiko aufwies eine CMV-Infektion zu erlangen. Die Infektionen traten nicht nur häufiger, sondern auch zu einem späteren Zeitpunkt auf, was mit einem schwereren Verlauf verknüpft ist. Der Promotorpolymorphismus war nicht mit der akuten Abstoßungsreaktion assoziiert. Zukünftig könnte so nicht nur der Serostatus beim Prophylaxeschema des CMV berücksichtigt, sondern auch genetische Varianten als Risikofaktoren einbezogen werden.

The HCMV protein hIE1 is a multifunctional regulator that can, on one hand, antagonise the immune system in different ways and, on the other hand, promote lytic replication through interaction and stabilisation of the cellular protein hFEN1 or by transactivation of viral promoters. IE1 antagonises PML-NBs, a part of the intrinsic immune system, through interaction with PML followed by it´s deSUMOylation and disruption. Quantitative analysis, using NanoBRET assays, showed that the interaction of PML with IE1 is species-specific. Using further biological methods, it was shown that the deSUMOylation and disruption of PML is also species-specific. The species specificity, similarity of crystal structures and low sequence identity of hIE1 and rIE1 core were used to search for a possible interaction surface of hIE1 with PML. Stably expressed mutants were generated in which helices (H1, H1/2, H4, H5, H8 or H10/11) of hIE1 were exchanged with helices of rIE1. As none of these mutants were able to interact with PML or disperse it, we assume that the interaction surface consists of several protein helices. Furthermore, the functional integrity of the mutants was investigated by analysing additional hIE1 functions. A possible interaction site of hFEN1 was identified in helix 1 of hIE1, while the other helices have no influence on the interaction. Furthermore, since we found that interaction of hIE1 with hFEN1 is not sufficient for protein stabilisation, we assume that recruitment of an additional cellular factor is required for hFEN1 stabilisation. Transactivation of promoters was investigated by Gaussia luciferase assays and showed that only the mutant carrying helix 1 exhibited activity. In summary, these results indicate that the exchange of protein helices affects different functions of hIE1. However, no interaction surface of IE1 and PML could be identified. In addition, various functions of rIE1 were analysed in comparison to hIE1. It could be shown that while hFEN1 interaction and stabilisation is species-specific, the core domain of rIE1 is sufficient to activate viral promoters and antagonise the innate immune system through STAT2 interaction and relocalisation. Furthermore, since rIE1, unlike hIE1, cannot colocalise with mitotic chromatin, RCMV probably encodes a different protein that ensures genome maintenance. These results suggest that specific functions of IE1 have been conserved during evolution, which are probably crucial for maintaining CMV in different species.

Human cytomegalovirus (HCMV) has been known to be a widespread pathogen in the human population. In most cases an infection remains asymptomatic and without consequences for its host. However, immunocompromised patients are at risk of suffering from severe complications like retinitis, colitis or in case of antenatal infections hearing losses or microcephaly. As treatment options are currently limited and associated with high levels of toxicity, new viral targets are needed to treat this growing group of patients. While the crucial role of glycoprotein UL132 (gpUL132), a viral tegument protein, for replication of HCMV has been known for some time, its underlying mechanisms remain elusive. A pronounced morphological and replicative defect in the cytoplasmic viral assembly complex (cVAC) has been described in the absence of gpUL132. This study aimed at better understanding the role of gpUL132 in cVAC biogenesis and viral replication. The emphasis was placed on the interaction between gpUL132 and cellular microtubules. The phenotype was controlled using a circularity assay. The quantitative role of gpUL132 in cVAC biogenesis was investigated with nocodazole washout assays. To control for protein concentrations as possible qualitative differences, Western blots were performed. In this study, it was shown that the cVAC defect observed with gpUL132-deficient viruses does not depend on noncentrosomal nucleation. Furthermore, an SxIP-motif found in gpUL132 did not exhibit any influence on cVAC morphology or nucleation. The protein concentrations did not indicate differences depending on the presence of gpUL132. A hitherto unknown decrease of intracellular calmodulin-regulated spectrin-associated protein 2 levels during late stage infections with gpUL132 competent mutant viruses was observed. Its role remains unclear. More work is needed to reveal the mechanisms of viral modulation of the cellular cytoskeleton.

Bei Patienten mit Erkrankungen des blutbildenden Systems ist die hämatopoetische Stammzelltransplantation (HSZT) eine häufig eingesetzte kurative Therapie. Im Rahmen dieser Transplantation werden nicht nur vom Spender gewonnene hämatopoetische Stammzellen auf den Empfänger übertragen, sondern immer auch im peripheren Blut vorhandene T-Zellen. Dies kann zum einen einen positiven Effekt zum anderen aber auch negative Folgen für den transplantierten Patienten mit sich bringen. Eine negative Auswirkung wäre die sogenannte Graft-vesus-Host Disease (GvHD), bei der die T-Zellen des Spenders Zellen des Empfängers als fremd erkennen und angreifen. Klinisch manifestiert sich dies vor allem an Leber, Haut und Darm mit Ikterus, Dermatitiden und Diarrhoen. Einen gewünschten Effekt, den die übertragenen T-Zellen vor allem bei Patienten mit akuter myeloischer Leukämie (AML) mit sich bringen können, ist der sogenannte Graft-versus-Leukemia (GvL) Effekt. Dabei richten sich vom Spender stammende Immunzellen gegen die Tumorzellen des Empfängers und senken damit das Rezidivrisiko der Leukämie. In verschiedenen Studien konnte eine positive Korrelation von CMV-Reaktivierung nach HSZT und einem niedrigerem Rezidivrisiko der hämatopoetischen Grunderkrankung gezeigt werden. Diese Doktorarbeit widmet sich auf Grundlage dessen der Frage, ob Cytomegalievirus (CMV)-spezifische cytotoxische T-Zellen (CTL) direkt durch Kreuzreaktivität zum GvL-Effekt beitragen. Zunächst wurden periphere mononukleäre Zellen (PBMC) aus dem Blut neun gesunder Spender isoliert, die als CMV-seropositiv ausgetestet wurden. Diese wurden mit dem CMVpp65-(NLVPMVATV)-Einzelpeptid stimuliert und in Kultur angereichert. Zusätzlich wurden die expandierten CMV-spezifischen CTL durch eine spezifische Selektion über den Aktivierungsmarker CD137 weiter angereichert. Nach Expansion und Anreicherung zeigten jeweils 75% (Spender 1), 67% (Spender 2), 74% (Spender 3), 86% (Spender 4), 81% (Spender5), 80% (Spender 6), 84% (Spender 7), 51% (Spender 8) und 69% (Spender 9) der CD3+/CD8+-T-Zellen eine IFN-γ-Produktion und CD107a-Expression nach Stimulation mit dem CMVpp65-Einzelpeptid. IFN-γ als Effektormolekül der zytotoxischen Granula der CTL und CD107a als Degranulationsmarker beweisen die spezifische Zytotoxizität. Somit konnte die erfolgreiche Anreicherung funktionsfähiger CMVpp65-spezifischer CTL gezeigt werden. Um zu untersuchen, ob diese nun kreuzreaktiv tumorassoziierte Antigene (TAA) erkennen, wurden sie ebenfalls mit folgenden TAA stimuliert: WT1, Proteinase 3, PRAME, NY-ESO, Muc1 und Bcl-2. Die Stimulation erfolgte entweder über die direkte Zugabe von Einzelpeptiden bzw. Peptidpools oder über die Beladung und Präsentation dieser Peptide bzw. Peptidpools über dendritische Zellen (DC). Die DC wurden aus Monozyten des jeweiligen Spenders generiert. Im Falle von drei Spendern zeigt sich ebenfalls eine deutliche zytotoxische Funktion nach Stimulation mit dem WT1-(DFKDCERRF)-Einzelpeptid durch IFN-γ-Produktion und CD107a-Expression bei 75% (Spender 1), 35% (Spender 4) und 33% (Spender 7) der CD3+/CD8+-T-Zellen. Wie zuvor erwähnt lag der Anteil der CD3+/CD8+-T-Zellen mit spezifischer Zytotoxizität nach Stimulation mit dem CMVpp65-(NLVPMVATV)-Einzelpeptid bei diesen drei besagten Spendern bei 74% (Spender1), 86% (Spender 4) und 84% (Spender7). So ergab sich für diese drei Spender eine gemeinsame Schnittmenge von 48,92% (Spender 1), 21,07% (Spender 4) und 17,45% (Spender 7) derjenigen Zellen, die sowohl nach Stimulation mit CMVpp65-(NLVPMVATV)-Einzelpeptid und WT-(DFKDCERRF)-Einzelpeptid eine zytotoxische Funktion zeigten, sodass von einer kreuzreaktiven Erkennung dieser beiden Peptide in diesen drei Spendern ausgegangen werden muss. Die für diese Spender gezeigte kreuzreaktive Erkennung könnte zum GvL-Effekt bei Leukämie/Myelom-Patienten nach HSZT beitragen., Patients who suffer a disease affecting the hematopoietic system can be treated with allogenic hematopoietic stem cell transplantation (HSCT). One positive effect which can go along with the HSCT is the so-called graft versus leukemia (GvL) effect. This phenomenon describes a process where donor immune cells attack tumor cells of the recipient organism an thereby lower the relapse risk of the treated disease. Different studies showed a positive correlation between Cytomegalovirus (CMV) reactivation in patients after HSCT and a lower relapse risk of the treated hematopoietic disease. This thesis is devoted to the question whether CMV-specific T cells cause a GvL effect through their cross reactivity. Therefore, peripheral blood mononuclear cells (PBMC) were isolated from 50 healthy CMV-positive donors. In nine cases CMV-specific T cells were successfully generated and expanded by culturing PBMC in the presence of CMVpp65-( NLVPMVATV)- single peptide to perform the final analysis: testing the cytotoxicity by measuring IFN-ɣ-production and expression of CD107a after presentation of CMVpp65-( NLVPMVATV)- single peptide, CMVpp65 peptide pool and different tumor associated antigens (WT1, Proteinase 3, PRAME, NY-ESO, Muc1 und Bcl-2). As key result in cases of three donors the final analysis demonstrated evidence of cytotoxicity of CMV-specific T cells following presentation of both CMVpp65-(NLVPMVATV)- single peptide and WT1-( (DFKDCERRF)- single peptide. The common intersection of cytotoxic T cells is valued at 74%, 86% and 84%. Thus, we can assume cross reactive recognition of the two peptides in cases of these three donors. This demonstrable cross reactive recognition could possibly have an impact on GvL effect in patients after HSCT who suffered from Leukemia or Myeloma.

PML nuclear bodies (PML-NBs) are dynamic macromolecular complexes that mediate intrinsic immunity against viruses of different families, including human cytomegalovirus (HCMV). Upon HCMV infection, PML-NBs target viral genomes entering the nucleus and restrict viral immediate–early gene expression by epigenetic silencing. Studies from several groups performed in human fibroblast cells have shown that the major PML-NB components PML, Daxx, Sp100 and ATRX contribute to this repression in a cooperative manner. Their role for HCMV restriction in endothelial cells, however, has not yet been characterized although infected endothelium is thought to play a crucial role for HCMV dissemination and development of vascular disease in vivo. Here, we use conditionally immortalized umbilical vein endothelial cells (HEC-LTT) as a cell culture model to elucidate the impact of PML-NB proteins on lytic HCMV infection. Depletion of individual PML-NB proteins by lentiviral transduction showed a particularly strong antiviral effect of PML in HEC-LTT, compared to human fibroblasts. A closer characterization of this antiviral function revealed that PML may not only effectively inhibit HCMV immediate-early gene expression but also act at later steps of the viral replication cycle. At contrast, we surprisingly noted an antiviral behavior of Daxx in complementary approaches: Depletion of Daxx resulted in decreased viral gene expression, while overexpression of Daxx promoted HCMV infection. In summary, our data demonstrate a cell type-specific effect of PML-NB components on lytic HCMV infection and suggest an important role of PML in the inhibition of HCMV dissemination through infected endothelial cells., publishedVersion

Polymorphonuclear leukocytes (PMNs) presumably transmit human cytomegalovirus (HCMV) between endothelial cells in blood vessels and thereby facilitate spread to peripheral organs. We aimed to identify viral components that contribute to PMN-mediated transmission and test the hypothesis that cellular adhesion molecules shield transmission sites from entry inhibitors. Stop codons were introduced into the genome of HCMV strain Merlin to delete pUL74 of the trimeric and pUL128 of the pentameric glycoprotein complex and the tegument proteins pp65 and pp71. Mutants were analyzed regarding virus uptake by PMNs and transfer of infection to endothelial cells. Cellular adhesion molecules were evaluated for their contribution to virus transmission using function-blocking antibodies, and hits were further analyzed regarding shielding against inhibitors of virus entry. The viral proteins pUL128, pp65, and pp71 were required for efficient PMN-mediated transmission, whereas pUL74 was dispensable. On the cellular side, the blocking of the αLβ2-integrin LFA-1 reduced virus transfer by 50% and allowed entry inhibitors to reduce it further by 30%. In conclusion, these data show that PMN-mediated transmission depends on the pentameric complex and an intact tegument and supports the idea of a virological synapse that promotes this dissemination mode both directly and via immune evasion., publishedVersion

In dieser Promotionsarbeit wurde Live Cell Imaging am Institut für Virologie der Universität Ulm etabliert. Ziel der Forschung war ein besseres Verständnis für die dynamischen Vorgänge bei der Bildung des cytoplasmic viral Assembly Compartment (cVAC) in HCMV-infizierten Fibroblasten. Das cVAC ist Schauplatz des "secondary envelopment", eines wichtigen Schrittes bei der Generierung infektiöser Viruspartikel. Nach erfolgreicher Etablierungsphase wurde mittels Live Cell Imaging untersucht, wie sich die Abwesenheit des viralen HCMV-Glykoproteins gpUL132 auf die Dynamik des Infektionsgeschehens in HCMV- infizierten humanen Fibroblasten auswirkt. Es konnte gezeigt werden, dass bei Abwesenheit von gpUL132 eine Bildung des cVAC zwar möglich ist, die cVAC-Phänotypen stellen sich jedoch beeinträchtigt dar. Darüber hinaus scheint sich die Abwesenheit von gpUL132 negativ auf die Stabilisierung des cVAC auszuwirken.

Nach einer meist subklinischen Prim��rinfektion persistiert das humane Cytomegalovirus (HCMV) lebenslang im K��rper und kann unter Immunsuppression reaktiviert werden und schwerwiegende Krankheitsverl��ufe verursachen. In der H��lle von HCMV kommen unterschiedliche Glykoproteine vor, zu denen auch pUL74 z��hlt, das in einem trimeren Komplex zusammen mit gH und gL wichtig f��r den Eintritt in Zielzellen ist. Dieses hochpolymorphe Protein weist bei einem 54 kDa umfassenden Peptidger��st etwa 65 kDa an N-Glykosylierung auf. Neben gro��em Einfluss auf Faltung und Stabilit��t von Proteinen ist f��r N-Glykosylierung viraler Proteine auch eine immunevasive Funktion bekannt. Die Funktion der Glykane an pUL74 war bislang unbekannt. Daher sollte in dieser Arbeit ��berpr��ft werden, ob die Glykane essentiell f��r die Integrit��t von pUL74 und dessen Funktion bei der Virusreplikation sind. Sollten sich die Glykane an pUL74 als nicht essentiell erweisen, k��nnte dieses mutierte Virus in der Impfstoffentwicklung eine Rolle spielen. Zun��chst wurde eine Virusmutante generiert, in deren offenem Leserahmen UL74 alle vorhergesagten N- und O-Glykosylierungsstellen durch konservativen Austausch von Aminos��uren entfernt wurden. Diese Virusmutante (pUL74deglyc) wurde dann bez��glich Ausbreitung in der Zellkultur, zellfreier Infektiosit��t und Komplexbildung untersucht. Sowohl die Ausbreitungskapazit��t dieses pUL74deglyc-Virus in Fibroblasten, als auch die zellfreie Infektiosit��t von Fibroblasten war auf das Level einer pUL74stop-Mutante reduziert. Trotz entfernter Glykosylierungsstellen konnte pUL74 im Western Blot als einzelnes Protein auf der H��he von ca. 60 kDa nachgewiesen werden, allerdings in deutlich reduzierter Menge. Ein trimerer Komplex mit gH und gL war jedoch bei der Mutante im Western Blot nicht nachweisbar. Glykosylierungsstellen in der N��he von konservierten Cysteinen scheinen Einfluss auf die Ausbildung von Disulfidbr��cken zu habe. Daher wurden in einem zweiten Ansatz alle O-Glykosylierungsstellen und vier N-Glykosylierungsstellen in der N��he von Cysteinen, die bei der Bildung des trimeren Komplexes wichtig sind, wieder eingef��gt. Mit zunehmender Glykosylierung war pUL74 im reduzierenden Western Blot wieder in h��herer Menge nachweisbar. Der trimere Komplex konnte allerdings weiterhin nicht nachgewiesen werden, und entsprechend war die Infektiosit��t dieser Viren ebenso stark reduziert wie die des pUL74deglyc-Virus. Diese Ergebnisse zeigen, dass die Glykosylierungsstellen an pUL74 wichtig f��r die Integrit��t des Proteins und die Ausbildung des trimeren Komplexes und damit auch f��r die Virusreplikation sind. In zuk��nftigen Studien k��nnten weitere Glykosylierungsstellen wieder eingef��gt werden, bis auch der trimere Komplex wieder gebildet werden kann, um dann die Auswirkung der noch fehlenden Glykane auf die Immunogenit��t untersuchen zu k��nnen.

Genetische Faktoren scheinen den Verlauf nach einer Nierentransplantation zu beeinflussen. In dem Gen des Wasserkanals Aquaporin 5 wurde der SNP beschrieben, der mit Schl��sselmechanismen der Inflammation wie der Immunzellmigration assoziiert ist. Da nach einer Nierentransplantation Absto��ungsreaktionen und Infektionen mit dem Cytomegalievirus auftreten k��nnen, wurde getestet, ob der SNP mit diesen Komplikationen assoziiert ist. In unserer Studie wurden Speichelproben entnommen. Mittels Polymerase-Kettenreaktion wurde die Position -1364 des SNP analysiert. Die Analysen ergaben, dass das C-Allel des SNP ein Risikofaktor f��r eine CMV-Infektion darstellt. Der \(\it AC/CC\)-Genotyp wies ein mehr als doppelt so hohes Risiko f��r eine CMV-Infektion nach Transplantation auf. Der SNP ist in unserem Kollektiv nicht mit der Absto��ungsreaktion assoziiert.

Die durch eine Infektion mit dem Humanen Cytomegalievirus gesteigerte Morbidit��t und Mortalit��t, insbesondere in den klinischen Bereichen P��diatrie und H��matoonkologie, zu verringern, stellt die virologische Forschung noch immer vor eine gro��e Herausforderung. Die Entwicklung antiviraler Therapeutika ist von gro��er Wichtigkeit f��r die Reduzierung HCMV-assoziierter Erkrankungsf��lle und daraus resultierenden Folgesch��den. In der vorliegenden Arbeit wurden potentielle antivirale Zielstrukturen im Hintergrund des klinischen Isolats Merlin auf Ihre Bedeutung f��r das Wachstum dieses Virusstammes hin untersucht. Es wurden hierf��r durch markerlose BAC-Mutagenese gezielt genetische Bereiche modifiziert, die f��r die bereits zuvor im Labor untersuchten Proteine pUL71, pUL103 und gpUL132 kodieren. Die Viren mit Ver��nderungen in diesen Genbereichen wurden dann in Wachstumsanalysen untersucht. Hierbei konnte f��r den pUL71/pUL103-Proteinkomplex gezeigt werden, dass ein Fehlen dieses viralen Genproduktes im klinischen Isolat zu deutlichen Wachstumsdefekten f��hrt. F��r das ebenfalls untersuchte virale Glykoprotein gpUL132 war hingegen in einer gpUL132-defizienten Merlin Virus-Mutante kein eindeutiger ��ber die gesamte Dauer der Analyse bestehender Wachstumsdefekt festzustellen. Zu finden waren im Hintergrund dieses Virus jedoch ein im Durchschnitt weniger rundes vAC, was vermuten l��sst, dass dieses Glykoprotein f��r die korrekte vAC-Biogenese, Bedeutung besitzt. Die genaue Funktion von gpUL132 bleibt jedoch weiterhin unklar und sollte deshalb Gegenstand weiterer Untersuchungen sein.

Das humane Cytomegalovirus (HCMV) kann sich zwischen Zellen zellfrei oder zellassoziiert ausbreiten. Beim Eintritt zellfreier Virionen in Fibroblasten benötigt HCMV den Glykoprotein-Trimer aus den Glykoproteinen H, L und O (gH/gL/gO), um an den zellulären Rezeptor platelet-derived-growth-factor-receptor-alpha (PDGFRα) zu binden und das virale Fusionsprotein Glykoprotein B zu aktivieren. Über die molekularen Grundlagen der zellassoziierten Ausbreitung ist weniger bekannt. In dieser Arbeit sollte der Beitrag des viralen Proteins gO bzw. seines zellulären Rezeptors PDGFRα zum zellassoziierten Wachstum untersucht und die Wirkweise von PDGFRα-Peptiden bei der Hemmung dieser Ausbreitung analysiert werden. In Fibroblastenkulturen, die mit klinischen HCMV-Isolaten infiziert waren, wurde die Expression der Proteine durch Knockdown mittels siRNA vermindert und mit quantitativen Immunoblotting-Analysen gemessen. Der Effekt auf die Virusausbreitung wurde durch Immunfluoreszenz-Nachweis infizierter Zellen in den Isolat-Kulturen erfasst. Um den Wirkmechanismus der inhibitorischen PDGFRα-Peptide GT40 und IK40 zu analysieren, wurden Dosis-Wirkungs-Kurven erstellt und der Transfer einzelner Viruspartikel in den Infektionsherden durch Immunfluoreszenz visualisiert. Die Verwendung eines doppelt-fluoreszierenden Modellvirus erlaubte dabei, Effekte auf Adsorption und Penetration zu differenzieren. Mit einer gO-Deletionsmutante wurde schließlich geprüft, ob die Hemmwirkung der Peptide von gO abhängt. Sowohl der Knockdown von gO als auch von PDGFRα reduzierte die zellassoziierte Virusausbreitung der klinischen HCMV-Isolate, was die Bedeutung der beiden Proteine für die zellassoziierte Ausbreitung von HCMV belegt. Die Immunfluoreszenz-Färbung der Viruspartikel zeigte, dass die PDGFRα-Peptide GT40 und IK40 den Partikeltransfer von infizierten Zellen auf neue Zielzellen hemmen, indem sie die Zahl der adsorbierten und den Anteil der penetrierten Viruspartikel vermindern, und zwar mit einer halbmaximalen Hemmkonzentration von 6-7,5 bzw. 13-15 µmol/l. Auch die gO-Deletionsmutante wurde in gleichem Maße gehemmt, was bedeutet, dass eine Bindung an gO für die Hemmwirkung nicht nötig ist. Insgesamt zeigt diese Arbeit, dass gO und sein zellulärer Rezeptor auch für das zellassoziierte Wachstum von HCMV wichtig sind und damit potenzielle Ziele für eine antivirale Strategie zur Hemmung dieser Ausbreitungsform darstellen. Die PDGFRα-Peptide GT40 und IK40 wirken zwar offensichtlich nicht über eine Störung dieser Interaktion, ihr Wirkmechanismus macht sie aber zu wertvollen Werkzeugen, um die Partikelübertragung bei der zellassoziierten Ausbreitung im Detail zu analysieren.

Das humane Cytomegalovirus (HCMV) breitet sich in vivo vermutlich sowohl zellfrei als auch zellassoziiert aus. Während die zellfreie Infektion mit Laborstämmen gut untersucht wurde, ist zum zellassoziierten Modus wenig bekannt. Als Modellvirus hierfür wurde kürzlich der HCMV-Stamm Merlin-pAL1502 entwickelt. Er unterscheidet sich von zellfrei wachsenden Stämmen durch ein niedriges Verhältnis von gO zu pUL128, die als alternative Komplexpartner von gH/gL die Virusausbreitung beeinflussen. Ob die niedrige gO-Expression repräsentativ für zellassoziierte Patienten-Isolate ist, war unklar. In dieser Arbeit sollte ein fluoreszierendes Derivat von Merlin-pAL1502 generiert werden, um Viruspartikel bei der zellassoziierten Ausbreitung zu visualisieren. Im zweiten Teil sollte überprüft werden, ob Merlin-pAL1502 klinische HCMV-Isolate nicht nur bezüglich des Ausbreitungsmodus, sondern auch hinsichtlich der Expression von gO repräsentiert. Das Genom von Merlin-pAL1502 lag als bakterielles artifizielles Chromosom vor. Mittels markerloser Mutagenese wurden das Kapsid-assoziierte pp150 (UL32) und das Hüllglykoprotein M (UL100) mit grün bzw. rot fluoreszierenden Proteinen fusioniert. Das resultierende Virus Merlin-pAL1502-UL32EGFP-UL100mCherry erlaubte es, nackte von umhüllten Viruspartikeln zu unterscheiden. In Anwesenheit eines Hemmstoffes akkumulierten umhüllte Viruspartikel, was für den Transfer umhüllter Viruspartikel bei der zellassoziierten Ausbreitung spricht. Im zweiten Teil wurden mittels quantitativem Westernblot acht klinische HCMV-Isolate und Merlin-pAL1502 bezüglich der Expression der von gO und pUL128 verglichen. Ein Zusammenhang mit dem Wachstum der Isolate und dem Genotyp der polymorphen gO-Proteins wurde durch Herdausbreitungsversuche und Sequenzierung untersucht. Die Expression von gO korrelierte positiv mit der Expression von pUL128, und war bei der Mehrzahl der Isolate signifikant höher als bei Merlin-pAL1502. Unterschiede in der Proteinsequenz von gO konnten die gO-Expressionslevel allein nicht erklären. gO korrelierte nicht mit der Herdgröße, und zellassoziierte Isolate exprimierten gO ähnlich stark wie ein zellfrei wachsender Stamm, was daraufhin deutet, dass eher pUL128 den Ausbreitungsmodus determiniert. Die Ergebnisse dieser Arbeit belegen erstmals einen Transfer kompletter Virionen bei der zellassoziierten Ausbreitung von HCMV, zeigen aber auch, dass es hinsichtlich der gO-Expression lohnend wäre, ein noch besser geeignetes zellassoziiertes Modellvirus auf der Basis der hier analysierten klinischen Isolate zu generieren.

Cell-free human cytomegalovirus (HCMV) can be inhibited by a soluble form of the cellular HCMV-receptor PDGFR��, resembling neutralization by antibodies. The cell-associated growth of recent HCMV isolates, however, is resistant against antibodies. We investigated whether PDGFR��-derivatives can inhibit this transmission mode. A protein containing the extracellular PDGFR��-domain and 40-mer peptides derived therefrom were tested regarding the inhibition of the cell-associated HCMV strain Merlin-pAL1502, hits were validated with recent isolates, and the most effective peptide was modified to increase its potency. The modified peptide was further analyzed regarding its mode of action on the virion level. While full-length PDGFR�� failed to inhibit HCMV isolates, three peptides significantly reduced virus growth. A 30-mer version of the lead peptide (GD30) proved even more effective against the cell-free virus, and this effect was HCMV-specific and depended on the viral glycoprotein O. In cell-associated spread, GD30 reduced both the number of transferred particles and their penetration. This effect was reversible after peptide removal, which allowed the synchronized analysis of particle transfer, showing that two virions per hour were transferred to neighboring cells and one virion was sufficient for infection. In conclusion, PDGFR��-derived peptides are novel inhibitors of the cell-associated spread of HCMV and facilitate the investigation of this transmission mode., publishedVersion

Human cytomegalovirus (HCMV) uses two major ways for virus dissemination: infection by cell-free virus and direct cell-to-cell spread. Neutralizing antibodies can efficiently inhibit infection by cell-free virus but mostly fail to prevent cell-to-cell transmission. Here, we show that the ���molecular tweezer��� CLR01, a broad-spectrum antiviral agent, is not only highly active against infection with cell-free virus but most remarkably inhibits antibody-resistant direct cell-to-cell spread of HCMV. The inhibition of cell-to-cell spread by CLR01 was not limited to HCMV but was also shown for the alphaherpesviruses herpes simplex viruses 1 and 2 (HSV-1, -2). CLR01 is a rapid acting small molecule that inhibits HCMV entry at the attachment and penetration steps. Electron microscopy of extracellular virus particles indicated damage of the viral envelope by CLR01, which likely impairs the infectivity of virus particles. The rapid inactivation of viral particles by CLR01, the viral envelope as the main target, and the inhibition of virus entry at different stages are presumably the key to inhibition of cell-free virus infection and cell-to-cell spread by CLR01. Importance: While cell-free spread enables the human cytomegalovirus (HCMV) and other herpesviruses to transmit between hosts, direct cell-to-cell spread is thought to be more relevant for in vivo dissemination within infected tissues. Cell-to-cell spread is resistant to neutralizing antibodies, thus contributing to the maintenance of virus infection and virus dissemination in the presence of an intact immune system. Therefore, it would be therapeutically interesting to target this mode of spread in order to treat severe HCMV infections and to prevent dissemination of virus within the infected host. The molecular tweezer CLR01 exhibits broad-spectrum antiviral activity against a number of enveloped viruses and efficiently blocks antibody-resistant cell-to-cell spread of HCMV, thus representing a novel class of small molecules with promising antiviral activity., publishedVersion

The human cytomegalovirus (HCMV) infects fibroblasts via an interaction of its envelope glycoprotein gO with the cellular platelet-derived growth factor receptor alpha (PDGFRα), and soluble derivatives of this receptor can inhibit viral entry. We aimed to select mutants with resistance against PDGFRα-Fc and the PDGFRα-derived peptides GT40 and IK40 to gain insight into the underlying mechanisms and determine the genetic barrier to resistance. An error-prone variant of strain AD169 was propagated in the presence of inhibitors, cell cultures were monitored weekly for signs of increased viral growth, and selected viruses were tested regarding their sensitivity to the inhibitor. Resistant virus was analyzed by DNA sequencing, candidate mutations were transferred into AD169 clone pHB5 by seamless mutagenesis, and reconstituted virus was again tested for loss of sensitivity by dose-response analyses. An S48Y mutation in gO was identified that conferred a three-fold loss of sensitivity against PDGFRα-Fc, a combination of mutations in gO, gH, gB and gN reduced sensitivity to GT40 by factor 4, and no loss of sensitivity occurred with IK40. The resistance-conferring mutations support the notion that PDGFRα-Fc and GT40 perturb the interaction of gO with its receptor, but the relatively weak effect indicates a high genetic barrier to resistance., publishedVersion

The role of viral envelope glycoproteins, particularly the accessory proteins of trimeric and pentameric gH/gL-complexes, in cell-associated spread of human cytomegalovirus (HCMV) is unclear. We aimed to investigate their contribution in the context of HCMV variants that grow in a strictly cell-associated manner. In the genome of Merlin pAL1502, the glycoproteins gB, gH, gL, gM, and gN were deleted by introducing stop codons, and the mutants were analyzed for viral growth. Merlin and recent HCMV isolates were compared by quantitative immunoblotting for expression of accessory proteins of the trimeric and pentameric gH/gL-complexes, gO and pUL128. Isolates were treated with siRNAs against gO and pUL128 and analyzed regarding focal growth and release of infectious virus. All five tested glycoproteins were essential for growth of Merlin pAL1502. Compared with this model virus, higher gO levels were measured in recent isolates of HCMV, and its knockdown decreased viral growth. Knockdown of pUL128 abrogated the strict cell-association and led to release of infectivity, which allowed cell-free transfer to epithelial cells where the virus grew again strictly cell-associated. We conclude that both trimer and pentamer contribute to cell-associated spread of recent clinical HCMV isolates and downregulation of pentamer can release infectious virus into the supernatant., publishedVersion

Human cytomegalovirus (HCMV) is a human pathogenic herpesvirus associated with a variety of clinical symptoms. Current antiviral therapy is not always effective, so that improved drug classes and drug-targeting strategies are needed. Particularly host-directed antivirals, including pharmaceutical kinase inhibitors (PKIs), may help to overcome problems of drug resistance. Here, we focused on utilizing a selection of clinically relevant PKIs and determined their anticytomegaloviral efficacies. Particularly, PKIs directed to host or viral cyclin-dependent kinases, i.e., abemaciclib, LDC4297 and maribavir, exerted promising profiles against human and murine cytomegaloviruses. The anti-HCMV in vitro activity of the approved anti-cancer drug abemaciclib was confirmed in vivo using our luciferase-based murine cytomegalovirus (MCMV) animal model in immunocompetent mice. To assess drug combinations, we applied the Bliss independence checkerboard and Loewe additivity fixed-dose assays in parallel. Results revealed that (i) both affirmative approaches provided valuable information on anti-CMV drug efficacies and interactions, (ii) the analyzed combinations comprised additive, synergistic or antagonistic drug interactions consistent with the drugs&rsquo, antiviral mode-of-action, (iii) the selected PKIs, especially LDC4297, showed promising inhibitory profiles, not only against HCMV but also other &alpha, &beta, and &gamma, herpesviruses, and specifically, (iv) the combination treatment with LDC4297 and maribavir revealed a strong synergism against HCMV, which might open doors towards novel clinical options in the near future. Taken together, this study highlights the potential of therapeutic drug combinations of current developmental/preclinical PKIs.

Cellular restriction factors (RFs) act as important constitutive innate immune barriers against viruses. In 2006, the promyelocytic leukemia protein was described as the first RF against human cytomegalovirus (HCMV) infection which is antagonized by the viral immediate early protein IE1. Since then, at least 15 additional RFs against HCMV have been identified, including the chromatin regulatory protein SPOC1, the cytidine deaminase APOBEC3A and the dNTP triphosphohydrolase SAMHD1. These RFs affect distinct steps of the viral replication cycle such as viral entry, gene expression, the synthesis of progeny DNA or egress. This review summarizes our current knowledge on intrinsic immune mechanisms restricting HCMV replication as well as on the viral strategies to counteract the inhibitory effects of RFs. Detailed knowledge on the interplay between host RFs and antagonizing viral factors will be fundamental to develop new approaches to combat HCMV infection., publishedVersion

Das humane Cytomegalovirus erhöht die Morbidität und Mortalität von Menschen mit beeinträchtigtem Immunsystem und kann zu schwerwiegenden neurologischen Erkrankungen im Kindesalter führen, wenn es intrauterin übertragen wird. Das Virus wächst sowohl zellgebunden als auch zellfrei, wobei es sich in vivo wahrscheinlich vorwiegend zellgebunden verbreitet. Es ist wünschenswert, den Mechanismus dieses Ausbreitungsmodus genauer zu verstehen, um neue Therapieansätze zu entwickeln. Die Glykoproteine B (gB), H (gH), L (gL), M (gM) und N (gN) sind essenziell für das Wachstum zellfreier Stämme. Diese Arbeit untersucht, ob sie auch für die Ausbreitung eines rein zellgebundenen Stamms unentbehrlich sind. Um mögliche Unterschiede zwischen den beiden Ausbreitungsarten zu identifizieren, wurden in einem rein zellgebundenen und einem zellfreien Virusstamm alle genannten Glykoproteine einzeln eliminiert. Zunächst wurden durch markerlose Mutagenese Stopp-Codons in die jeweiligen Leserahmen der Virusgenome eingefügt, die als bakterielle artifizielle Chromosomen in E. coli vorlagen. Aus den mutierten Genomen wurden dann durch Transfektion in Fibroblasten die entsprechenden Viren rekonstituiert. Das Wachstumsverhalten der Virusmutanten nach Transfektion konnte auf einfache Weise gemessen werden, da die Virusstämme jeweils Gaussia Luciferase in das Kulturmedium abgaben und die Expression dieses Reporterenzyms an die Virusreplikation gekoppelt ist. Folglich konnte über den Verlauf der Enzymexpression auf den Phänotyp der Mutanten geschlossen werden. Die Elimination von gB, gH, gL und gM war in beiden genetischen Hintergründen jeweils letal für das Virus. Für gN zeigte sich, dass der zellfreie Stamm trotz der Stopp-Mutationen unvermindert wuchs, wohingegen der zellgebundene Stamm in seinem Wachstum weitgehend reduziert war. Die Lokalisation von gM wies indirekt darauf hin, dass trotz der Stopp-Mutationen – vermutlich aminoterminal trunkierte – gN-Proteine gebildet wurden, die das zellfreie und das zellgebundene Wachstum in unterschiedlichem Ausmaß ermöglichten. Um die Expression von gN vollständig zu verhindern, wurden weitere Stopp-Codons in den Leserahmen eingefügt und diese Mutationen waren im zellfreien und im zellgebundenen Stamm letal. Diese Ergebnisse lassen darauf schließen, dass gB, gH, gL, gM und gN, die essenziell für die zellfreie Ausbreitung sind, auch unentbehrlich für das Wachstum eines rein zellgebundenen Stamms sind. Vermutlich liegen also beiden Ausbreitungsarten die gleichen Mechanismen zugrunde. Der Aminoterminus von gN scheint jedoch insbesondere an der zellgebundenen Ausbreitung beteiligt zu sein. Dies könnte ein Ansatzpunkt sein, um neue antivirale Interventionsstrategien speziell für das zellgebundene Wachstum zu entwickeln.

Die ��tiologie und Pathogenese der Nekrotisierenden Enterokolitis (NEK) ist bis heute nicht ausreichend gekl��rt. Die Literatur beschreibt zahlreiche Risikofaktoren und Krankheitsmodelle. Diese Arbeit vermutet eine Entstehung einer NEK nach dem ���Triple-Risk���-Modell. Demnach f��hren das gleichzeitige Vorliegen von Vulnerabilit��t des S��uglings, das Auftreten einer kritischen Periode in der postnatalen Reifung, sowie exogene Faktoren zu einem Ausbruch der Krankheit. Ein exogener Faktor k��nnte das Zytomegalievirus (CMV) darstellen. Die hier vorliegende retrospektive und experimentelle Studie untersuchte FFPW-Gewebe aus kindlichem Darm mittels Immunhistochemie auf das Vorkommen und Expression des CMV-Antigens pp65. Untersucht wurden 58 chirurgisch entnommene Darmpr��parate, welche in 4 Gruppen eingeteilt wurden: Gewebe aus Gruppe 1 stammt von NEK-Patienten (n=24), entnommen in der akuten Krankheitsphase, Gewebe aus Gruppe 2 stammt von FIP-Patienten (n=6), Gewebe aus Gruppe 3 (n=17) stammt von Kontroll- Patienten, also Kindern, welche aus anderen Gr��nden (keine NEK, keine FIP) operiert wurden und Gewebe aus Gruppe 4 (N=11) stammt ebenfalls von NEKPatienten, entnommen in Folgeoperationen nach ausgeheilter NEK. Die immunhistochemische F��rbung erfolgte nach einem etablierten Protokoll. Die Expression des Antigens wurde in jeder einzelnen Darmschicht und pro Gruppe quantitativ untersucht. Jedes untersuchte Pr��parat zeigte sich CMV-positiv. Ziel der Arbeit war die folgenden Hypothesen zu ��berpr��fen: 1. NEK ist mit einer h��heren CMV-Expression assoziiert. (NEK vs. FIP) 2. FIP ist mit einer niedrigeren CMV-Expression assoziiert (FIP vs. NEK) Beide Hypothesen konnten best��tigt werden. Es zeigte sich eine signifikant st��rkere Expression des CMV bei NEK-Patienten im Vergleich zu FIP-Patienten. 3. NEK-Kinder sind besonders anf��llig f��r eine erh��hte CMV-Expression aufgrund der Fr��hgeburtlichkeit und ihrer Vulnerabilit��t (NEK vs. Kontrolle). Auch diese Hypothese gilt als best��tigt durch die tendenziell vermehrte Expression des CMV in Darmmukosa. 4. CMV-Expression in einer kritischen Periode in der Entwicklung des S��uglings hat Einfluss auf das Auftreten einer NEK (NEK vs. FIP, NEK vs. Interne Kontrolle) In dieser Arbeit zeigte sich eine Abnahme der CMV-Expression bei NEK-Patienten (Interne Kontrolle) im Verlauf. Damit konnte auch Hypothese 4 best��tigt werden. Das zeitliche Auftreten einer CMV-Infektion scheint einen Einfluss auf das Auftreten einer NEK zu haben und es liegt eine kritische Periode in der postnatalen Reifung vor. 5. CMV hat Einfluss auf das Auftreten einer NEK bei gleichzeitigem Vorliegen der Faktoren eNOS, iNOS, Nitrotyrosin, HIF-1-alpha, Nrf-2 und SOD. Diese stehen repr��sentativ f��r die Vulnerabilit��t der Kinder. Diese Hypothese konnte nicht best��tigt werden. Zusammenfassend hat diese experimentelle Untersuchung eine hohe Pr��valenz des CMV-Antigens pp65 bei chirurgisch entnommenen Darmpr��paraten von NEKund FIP-Patienten ergeben. Gleichzeitig konnte gezeigt werden, dass eine erh��hte CMV-Expression tendenziell mit einer NEK und eine signifikant geringere CMVExpression mit einer FIP assoziiert ist. CMV scheint eine NEK-beg��nstigende und verst��rkende Rolle zu spielen und sollte als Risikofaktor f��r das Auftreten einer NEK ber��cksichtigt werden. Auch scheint das Vorliegen einer kritischen Periode in der Entwicklung des S��uglings vorzuliegen. Diese Erkenntnisse bilden einen wichtigen Ansatz f��r zuk��nftige Ma��nahmen in der Diagnostik, Therapie und Pr��vention der NEK. Weitere Studien scheinen notwendig, um zu pr��fen, wie CMV in der akuten Krankheitsphase idealerweise nicht-invasiv nachzuweisen ist und inwiefern Kinder mit einer NEK bei gleichzeitig positivem CMV-Nachweis von einer gezielten CMV-Therapie profitieren k��nnten.

Based on cell culture data, MHC class I downregulation by HCMV on infected cells has been suggested as a means of immune evasion by this virus. In order to address this issue in vivo, an immunohistochemical analysis of tissue sections from biopsy and autopsy materials of HCMV infected organs was performed. HCMV antigens from the immediate early, early, and late phase of viral replication, and cellular MHC class I molecules were detected simultaneously or in serial sections by immuno-peroxidase and immuno-alkaline phosphatase techniques. Investigated organs included lung, gastrointestinal tract, and placenta. Colocalization of MHC molecules with sites of viral replication as well as MHC expression in individual infected cells were analyzed. To detect immune effector cells at sites of viral replication, leukocytes, CD8+ lymphocytes, and HCMV antigens were stained in serial sections. While strong MHC class I expression was detected in the cells surrounding infected cells, it appeared downregulated in the majority of infected cells themselves, particularly in the late replication phase. Despite significantly reduced MHC class I signals on infected cells, sites of infection were infiltrated by inflammatory cells that consisted predominantly of CD8+ lymphocytes. The extent of inflammatory infiltrates was negatively correlated with the extent of HCMV infected cells. Taken together, our findings indicate that HCMV can downmodulate MHC class I expression in vivo, whereas cytokines originating from infiltrating immune effector cells probably up regulates MHC class I expression in noninfected bystander cells. The presence of cytotoxic lymphocytes in close contact to infected cells may reflect control of viral spread by these cells despite MHC class I downmodulation.

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Obwohl das Phosphoprotein pp65 ein Hauptbestandteil von humanen Cytomegaloviren (HCMV) und der codierende Leserahmen UL83 zwischen verschiedenen Virusstämmen hochkonserviert ist, ist das Protein für das Wachstum in Fibroblasten verzichtbar. Um pp65 zu untersuchen, wurden bisher Virusstämme verwendet, die teilweise genetische Veränderungen tragen, welche dazu führen, dass sich die Viren im Gegensatz zu klinischen Isolaten unter anderem zellfrei ausbreiten. Möglicherweise verdeckte dies eine Funktion von pp65, da angenommen wird, dass sich frische klinische Isolate zellassoziiert ausbreiten. In dieser Arbeit soll die Hypothese geprüft werden, dass pp65 dazu beiträgt, wie effizient sich HCMV ausbreitet. Es wurde der reparierte Virusstamm Merlin-RL13tetOUL128LtetO als Modell für klinische Isolate verwendet, da gezielt zwei Genregionen reguliert werden können, die für die zellassoziierte Virusausbreitung verantwortlich sind. Eine UL83-Stopmutante wurde durch „en passant“-Mutagenese hergestellt, sodass das Protein pp65 nicht exprimiert wurde. Wildtyp und UL83-Stopmutante wurden in den Versuchen jeweils miteinander verglichen, während die UL83-Revertante als Kontrolle diente. Um festzustellen, wie stark sich Wildtyp und UL83-Stopmutante zellassoziiert ausbreiten, wurde die Herdgröße in Fibroblasten und in Endothelzellen einige Tage nach der Infektion betrachtet. Die UL83-Stopmutante bildete um ein Fünftel kleinere Herde in Fibroblasten und um mehr als ein Drittel kleinere Herde in Endothelzellen. Um einen möglichen Beitrag von pp65 zur zellfreien Virusausbreitung näher zu beleuchten, wurde aus infizierten speziellen Fibroblastenkulturen (HFFFtet-Zellen) zu verschiedenen Zeitpunkten der Virustiter von Wildtyp und UL83-Stopmutante untersucht. Die UL83-Stopmutante setzte aus HFFFtet-Zellen nur halb so viel Virus frei wie der Wildtyp. Da sich die UL83-Revertante nicht wie die UL83-Stopmutante verhielt, sondern wie der Wildtyp, sind die UL83-Stopmutationen für den Wachstumsdefekt der Mutante verantwortlich zu machen. Dass pp65 zur Virusausbreitung in Fibroblasten und in Endothelzellen beiträgt, wurde hier erstmals als statistisch signifikant nachgewiesen. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass das virale Protein pp65 die Ausbreitung eines Isolat-ähnlichen HCMV-Stamms unabhängig vom Ausbreitungsmodus und vom Zelltyp fördert und demzufolge bedeutender für das Viruswachstum ist, als bisher angenommen.

The thrombopoietin receptor agonist eltrombopag was successfully used against human cytomegalovirus (HCMV)-associated thrombocytopenia refractory to immunomodulatory and antiviral drugs. These effects were ascribed to the effects of eltrombopag on megakaryocytes. Here, we tested whether eltrombopag may also exert direct antiviral effects. Therapeutic eltrombopag concentrations inhibited HCMV replication in human fibroblasts and adult mesenchymal stem cells infected with six different virus strains and drug-resistant clinical isolates. Eltrombopag also synergistically increased the anti-HCMV activity of the mainstay drug ganciclovir. Time-of-addition experiments suggested that eltrombopag interfered with HCMV replication after virus entry. Eltrombopag was effective in thrombopoietin receptor-negative cells, and the addition of Fe3+ prevented the anti-HCMV effects, indicating that it inhibits HCMV replication via iron chelation. This may be of particular interest for the treatment of cytopenias after hematopoietic stem cell transplantation, as HCMV reactivation is a major reason for transplantation failure. Since therapeutic eltrombopag concentrations are effective against drug-resistant viruses, and synergistically increase the effects of ganciclovir, eltrombopag is also a drug-repurposing candidate for the treatment of therapy-refractory HCMV disease., publishedVersion

Die intrauterine CMV-Infektion ist die häufigste aller viralen Infektionen in der Schwangerschaft. Etwa 0,5% - 4% der Schwangeren durchlaufen eine Primärinfektion (PI) mit dem Zytomegalievirus, der Großteil dieser bleibt jedoch aufgrund eines symptomlosen Verlaufs unerkannt. Wird das Virus auf den Feten übertragen, kann es zu diversen Symptomen kommen, welche sowohl das Zentralnervensystem betreffen, als auch extrazerebral, im retikuloendothelialen System (RES) nachweisbar sein können. Ein CMV Antikörperscreening in der Schwangerschaft ist trotz der Möglichkeit zur frühen Identifizierung von Risikoschwangeren nach aktueller Konsensus-Leitlinie nicht empfohlen (Rawlinson et al. 2017), weshalb in Deutschland die Identifizierung schwangerer Frauen mit einer CMV PI rein zufällig ist und das Risiko für ZNS- Schädigungen bei Neugeborenen erhöht ist. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde das CMV-Monitoring von insgesamt 90 Schwangeren mit CMV-PI hinsichtlich ihres Serostatus bei der Erstdiagnose ausgewertet. 40 dieser Frauen wurden zusätzlich als Studienkollektiv gesondert mit CMV-spezifischem HIG behandelt. Kriterien dieser Auswahl war ein GA ≤ 14,857 Wochen bei der Erstdiagnose und das Einverständnis zur Durchführung einer Amniozentese in der 21. SSW zum Ausschluss einer maternofetalen CMV-Transmission. Kohorte I umfasst neben den 40 Patientinnen des HIG-Studienkollektivs 27 weitere Frauen mit GA ≤ 14,857 Wochen. 33 Frauen mit GA ≥ 15 Wochen wurden als Kohorte II zusammengefasst. Zur Bestimmung des CMV IgG/IgM und der IgG Avidität dienten die Enzymimmunoassays (EIAs) ECLIA und CMIA. Der rekombinante Immunblot wurde zur Bestätigung der Primärinfektion durchgeführt. Um die Ergebnisse von ECLIA und CMIA bezüglich der CMV Avidität als richtig oder falsch einordnen zu können, wurde der rekombinante Aviditätsimmunblot als Referenzstandard herangezogen. Die Datenevaluierung zeigt signifikante Unterschiede zwischen den EIAs ECLIA und CMIA für alle drei Studienkohorten für das CMV IgG und zusätzlich beim HIG Studienkollektiv und der Kohorte I für die IgG Avidität. Die Ermittlung der CMV IgG Antikörperkonzentrationen zeigte sich signifikant different zwischen ECLIA und CMIA (p < 0,0001 für alle drei Studienkollektive). Deren Mediane für ECLIA-IgG liegen bei 6,6 U/ml, 5,95 U/ml und 4,74 U/ml, während deren Mittelwerte bei 11,98 Uml, 12, 65 U/ml und 13,83 U/ml bestimmt wurden. Mit CMIA ergeben sich signifikant höhere Mediane von 102 AU/ml, 98,95 AU/ml und 82,6 AU/ml mit Mittelwerten von 129,22 AU/ml, 117,26 AU/ml und 88,69 AU/ml. Jedoch gibt es für das CMV IgG noch keinen WHO - Standard, was dazu führt, dass verschiedene Einheiten für ECLIA und CMIA vorliegen und diese nicht direkt miteinander vergleichbar sind. Virologisches Einschlusskriterium für die HIG-Studienkohorte war das Fehlen der anti-gB2-IgG-Serokonversion sowie niedrige IgG Aviditäten im Immunblot und ECLIA, was das Vorliegen einer CMV Primärinfektion bestätigt. Erwähnenswert ist die Reaktivität aller Sera der Kohorte I und des HIG Studienkollektivs gegen das p65 Tegumentprotein im recomLine IgG Test neben dem konstitutiven Nachweis von anti-CMV pp150 IgG. Die Gegenüberstellung des CMV IgG und der CMV IgG Avidität in Streudiagrammen zeigt, dass ECLIA bei niedrigem CMV IgG auch niedere Aviditäten und bei hohem CMV IgG hohe Aviditäten ermittelt. Hohe IgG Konzentrationen korrelieren bei CMIA mit niederen und hohen IgG Aviditäten sowie hohe IgG Aviditäten mit niedrigen und hohen IgG Konzentrationen. CMIA ermittelt in 7/40 Fällen (17,5%) des HIG-Studienkollektivs, in 8/53 Fällen (15,1%) der Kohorte I (4/57 nicht auswertbar) und in 3/33 Fällen (9,1%) der Kohorte II falsch hohe IgG Aviditäten, was einer latenten CMV-Infektion und nicht einer CMV Primärinfektion entspricht und damit zu Fehldiagnosen führen kann. Es zeigt sich, dass die EIAs ECLIA und CMIA nicht isoliert zur Diagnostik einer CMV PI in der Schwangerschaft genutzt werden können. Es ist notwendig verschiedene Testsysteme in Kombination zu verwenden, um eine sichere Diagnose zu stellen. Diese Untersuchungen bieten Evidenz dafür, dass sowohl der quantitative CMIA IgG Test als auch der CMV IgG Aviditätstest im Kontext der CMV-Primärinfektion in der Schwangerschaft im Vergleich zum ECLIA Test signifikante Divergenzen aufweist, was dazu führen kann eine CMV PI zu übersehen.

The recombination-activating genes (RAGs) and the DNA cross-link repair 1C gene (DCLRE1C) encode the enzymes RAG1, RAG2 and Artemis. They are critical components of the V(D)J recombination machinery. V(D)J recombination is well known as a prerequisite for the development and antigen diversity of T and B cells. New findings suggested that RAG deficiency impacts the cellular fitness and function of murine NK cells. It is not known whether NK cells from severe combined immunodeficiency (SCID) patients with defective RAGs or DCLRE1C (RAGs&minus, /DCLRE1C&minus, NK) are active against virus infections. Here, we evaluated the anti-HCMV activity of RAGs&minus, NK cells. NK cells from six SCID patients were functional in inhibiting HCMV transmission between cells in vitro. We also investigated the expansion of HCMV-induced NK cell subset in the RAG- or DCLRE1C-deficient patients. A dynamic expansion of NKG2C+ NK cells in one RAG-2-deficient patient was observed post HCMV acute infection. Our study firstly reveals the antiviral activity of human RAGs&minus, / DCLRE1C&minus, NK cells.

HCMV is still a clinical problem with serious consequences. It is the leading cause of disabilities in children due to congenital infection and also the reason for morbidity and mortality in immunocompromised patients. To improve existing passive immunization strategies, we investigated the human antibody response against HCMV regarding exceptionally effective antibodies that cover the main aspects of HCMV dissemination. For this purpose, a systematic screening algorithm was designed that was used to screen plasma samples from a large blood donor population. Since HCMV dissemination can occur via the cell-free and the cell-associated mode, both spread routes were addressed separately in two different approaches. Human antibodies that are exceptionally effective in neutralizing free viral particles were identified by a two-step high-throughput screening. As a screening tool, an endotheliotropic HCMV strain with a secreted luciferase was generated. It facilitates simple and rapid detection of infection levels. A neutralization assay based on this reporter virus was used to investigate the neutralizing activity for infection of the two model cell-types for HCMV. In a first set of 1000 plasmas, the neutralizing capacities against fibroblast infection were compared to that in endothelial cells. We observed that plasma is in general more effective in neutralizing endothelial cell infection. Assuming that good neutralization in fibroblasts would include good neutralization of endothelial cell infection as well, the high-throughput screening was performed on fibroblasts. Consequently, the next 9000 plasma samples were tested on fibroblasts at a suitable dilution that would separate the plasmas with common neutralization from those with exceptionally potent neutralization. According to our cut-off, 2.6% of plasma samples were potently neutralizing. 80 of those potent plasma samples were then further investigated in a second screening step according to their efficacy against different HCMV strains. Plasmas that can be 100-fold diluted and still neutralized 50% infection (NT50 = 100) of all seven strains, were regarded as broad and potent. The screening algorithm identified ���elite��� neutralizing plasma samples that are exceptionally potently neutralizing with cell-type and strain-independent efficacy. Furthermore, it was shown that the elite plasmas are superior to conventional hyperimmunoglobulin preparations, hence potentially improving the passive immunization strategies against HCMV. The fact plasma samples with elite neutralizing capability can be traced back to the corresponding blood donors who can be revisited, could facilitate the usage of their plasma for direct application or the generation of monoclonal antibodies from their B-cells. The finding that neutralizing capacities of human blood donors against HCMV were stable over several years greatly facilitates this purpose. Besides spreading via free viral particles, HCMV also spreads via a cell-associated mode. Recent HCMV clinical isolates, are restricted to cell-associated growth whereas they lose this ability by passaging in cell culture. Since both transmission routes might play an important role in vivo, we investigated human plasma also regarding this transmission route. A suitable reporter virus was generated that grows strictly cell-associated like a clinical isolate. It facilitated the screening of 8400 plasma samples according to their inhibiting effect on HCMV cell-associated spread. Remarkably, this screening did not reveal a plasma that strikingly inhibited focal growth in fibroblasts. As we wanted to assure no false-negative results due to our test system, a second validation of this result was done. By usage of recent clinical isolates instead of the laboratory model strains for cell-associated spread, we excluded strain specific effects. Since we assume that the same glycoproteins that are involved in entry of free viral particles, also mediate cell-associated spread, we rechecked this issue with the previously identified elite neutralizing plasmas. But even the elite neutralizers did not inhibit cell-associated focal growth of clinical-isolates on fibroblasts. In contrast, focal spread of clinical isolates between endothelial cells, can be partially inhibited by elite neutralizers while small foci remain. This reveals that there is a cell type dependent difference in inhibition not only regarding entry of free viral particles but also regarding cell-to-cell transmission of viral particles. This study was designed to find individuals with exceptionally potent activity against HCMV. While we found that a quality of plasma with effective cell-to-cell spread inhibiting activity is nonexistent or extremely rare, we succeeded in identifying individuals with exceptional neutralizing activity against cell-free dissemination. This analysis could be the basis towards an improved passive immunization strategy against HCMV, relying on elite neutralizing antibodies that were potently and broadly effective and superior to conventional immunoglobulins.

Tetraspanins are suggested to regulate the composition of cell membrane components and control intracellular transport, which leaves them vulnerable to utilization by pathogens such as human papillomaviruses (HPV) and cytomegaloviruses (HCMV) to facilitate host cell entry and subsequent infection. In this study, by means of cellular depletion, the cluster of differentiation (CD) tetraspanins CD9, CD63, and CD151 were found to reduce HPV16 infection in HeLa cells by 50 to 80%. Moreover, we tested recombinant proteins or peptides of specific tetraspanin domains on their effect on the most oncogenic HPV type, HPV16, and HCMV. We found that the C-terminal tails of CD63 and CD151 significantly inhibited infections of both HPV16 and HCMV. Although CD9 was newly identified as a key cellular factor for HPV16 infection, the recombinant CD9 C-terminal peptide had no effect on infection. Based on the determined half-maximal inhibitory concentration (IC), we classified CD63 and CD151 C-terminal peptides as moderate to potent inhibitors of HPV16 infection in HeLa and HaCaT cells, and in EA.hy926, HFF (human foreskin fibroblast) cells, and HEC-LTT (human endothelial cell-large T antigen and telomerase) cells for HCMV, respectively. These results indicate that HPV16 and HCMV share similar cellular requirements for their entry into host cells and reveal the necessity of the cytoplasmic CD151 and CD63 C-termini in virus infections. Furthermore, this highlights the suitability of these peptides for functional investigation of tetraspanin domains and as inhibitors of pathogen infections., German Academic Exchange Service (Deutscher Akademischer Austauschdienst, DAAD) to Snježana Mikulicic, by the Ministerio de Economía y Competitividad (BFU2014-55478-R and BIO2017-86500-R) to María Yáñez-Mó, and by the Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG; FL 696/2-1, FL 696/3-1)

In einer retrospektiven Datenerhebung wurden die Daten von 96 Patienten mit Herztransplantation untersucht, die bei nachgewiesener CMV-Infektion entweder mit Valganciclovir (n=55) oder CMV-Hyperimmunglobuline (CMVIG) (Cytotect®) (n=41) behandelt wurden. Primärer Endpunkt ist das Überleben nach einem Jahr. Sekundäre Endpunkte sind die Virusfreiheit vier Wochen nach Therapiebeginn sowie der Verlauf der laborchemischen Parameter. Es wurde eine 1-Jahresüberlebensrate von 87,3% und 80,5% in der Valganciclovir-Gruppe und CMVIG-Gruppe erreicht. Innerhalb eines Monats wurde eine Virusfreiheit von 74,5% in der Valganciclovir-Gruppe, beziehungsweise 66,0% in der CMVIG-Gruppe erreicht. Während des Beobachtungszeitraums ist kein signifikanter Unterschied bei den laborchemischen Parametern feststellbar. Die vorliegenden Daten lassen eine vergleichbare Sicherheit von Valganciclovir und CMV-Hyperimmunglobulin bei der Therapie von CMV-Infektionen bei herztransplantierten Patienten vermuten.

Die Morphogenese von infektiösen Viruspartikeln des humanen Zytomegalievirus (HCMV) findet in zwei unterschiedlichen Zellkompartimenten statt, dem Zellkern und dem Zytoplasma. Die Tegumentierung ist essentieller Bestandteil bei der Morphogenese, bei welcher zahlreiche virale Proteine in das sich bildende Virion eingebaut werden und die Verbindung zwischen dem Kapsid und der Hüllmembran herstellen. Die Initiierung der Tegumentierung, die daran beteiligten Proteine und deren intrazelluläre Lokalisation sind allerdings noch weitgehend unklar. Das Tegumentprotein pUL48 ist eines der größten viralen Proteine, welches innerhalb der Herpesviren hochkonserviert ist und bei der Tegumentierung eine entscheidende Rolle spielt. Dabei scheint es so zu sein, dass der C-Terminus dieses Proteins für dessen Funktion im viralen Replikationszyklus essentiell ist. In dieser Arbeit konnten die Bedeutung des C-Terminus von pUL48 bestätigt und darüber hinaus zwei funktionelle Domänen identifizieren werden. Zum einen ist im C-Terminus eine nukleäre Exportfunktion determiniert und zum anderen befinden sich dort auch wichtige Bereiche für die Assoziation von pUL48 mit dem Kapsid. Für diese Untersuchungen wurden vier Viren mit verschiedenen Mutationen des pUL48-C-Terminus charakterisiert. Durch Wachstumskinetiken und den Fokus-Expansion-Assay konnten gezeigt werden, dass der C-Terminus des pUL48 für die Virusausbreitung und Morphogenese infektiöser Partikel essentiell ist. Mit Hilfe der indirekten Immunfluoreszenz und der Elektronenmikroskopie konnte für Mutationen im C-Terminus von pUL48 eine beeinträchtigte Interaktion zwischen pUL48 und dem Kapsid festgestellt werden, was vermutlich zu einer Akkumulation von nur teilweise tegumentierten Kapsiden in der Zellperipherie führt. Lokalisationsstudien mit pUL48 konnten außerdem eine verstärkte nukleäre Akkumulation des Proteins, bei Deletion der C-terminalen 80 und 28 Aminosäuren, feststellen. Allerdings konnte eine zu diesen Beobachtungen passende nukleäre Exportsequenz in pUL48, welche durch Analysetools vorhergesagt war, mittels Immunfluoreszenzmikroskopie nur partiell bestätigt werden. Somit führte diese Arbeit durch die Entdeckung neuer essentieller Domänen nicht nur zu einem Erkenntnisgewinn bezüglich der Tegumentierung und der Bedeutung des Tegumentproteins pUL48 für den viralen Replikationszyklus, sondern identifizierte außerdem eventuelle zukünftige Targets für eine antivirale HCMV-Therapie

Human cytomegalovirus (HCMV) latency is typically harmless but reactivation can be largely detrimental to immune compromised hosts. We modeled latency and reactivation using a traceable HCMV laboratory strain expressing the Gaussia luciferase reporter gene (HCMV/GLuc) in order to interrogate the viral modulatory effects on the human adaptive immunity. Humanized mice with long-term (more than 17 weeks) steady human T and B cell immune reconstitutions were infected with HCMV/GLuc and 7 weeks later were further treated with granulocyte-colony stimulating factor (G-CSF) to induce viral reactivations. Whole body bio-luminescence imaging analyses clearly differentiated mice with latent viral infections vs. reactivations. Foci of vigorous viral reactivations were detectable in liver, lymph nodes and salivary glands. The number of viral genome copies in various tissues increased upon reactivations and were detectable in sorted human CD14(+), CD169(+), and CD34(+) cells. Compared with non-infected controls, mice after infections and reactivations showed higher thymopoiesis, systemic expansion of Th, CTL, Treg, and Tfh cells and functional antiviral T cell responses. Latent infections promoted vast development of memory CD4(+) T cells while reactivations triggered a shift toward effector T cells expressing PD-1. Further, reactivations prompted a marked development of B cells, maturation of IgG(+) plasma cells, and HCMV-specific antibody responses. Multivariate statistical methods were employed using T and B cell immune phenotypic profiles obtained with cells from several tissues of individual mice. The data was used to identify combinations of markers that could predict an HCMV infection vs. reactivation status. In spleen, but not in lymph nodes, higher frequencies of effector CD4(+) T cells expressing PD-1 were among the factors most suited to distinguish HCMV reactivations from infections. These results suggest a shift from a T cell dominated immune response during latent infections toward an exhausted T cell phenotype and active humoral immune response upon reactivations. In sum, this novel in vivo humanized model combined with advanced analyses highlights a dynamic system clearly specifying the immunological spatial signatures of HCMV latency and reactivations. These signatures can be merged as predictive biomarker clusters that can be applied in the clinical translation of new therapies for the control of HCMV reactivation.

Human Cytomegalovirus (HCMV) is a ubiquitous herpesvirus causing high morbidity in individuals with an impaired immune defense. The two major types of monocyte-derived macrophages in vitro (MΦ), M1-MΦ and M2-MΦ, are unequally susceptible to infection by HCMV. Anti-inflammatory, anti-immunogenic M2-MΦ get infected about twofold compared to pro-inflammatory, immunogenic M1-MΦ. In this study differences between the two cell subsets regarding early HCMV infection were examined. The hypothesis in this study was particularly, that dissimilar expression of possible entry receptors or intrinsic restriction factors of viral infection define the different susceptibility.