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Targeted therapies against receptor tyrosine kinases improved the prognosis in some patients and provide real therapeutic hope in the fight against cancer. Although the majority of RTK mutations impact the kinase domain and lead to their constitutive activation, those affecting the MET receptor in lung cancer lead to the skipping of exon 14 (MET ex14) encoding the juxtamembrane domain. The lost domain contains at least three negative regulatory sites. Among them, the phosphorylable residues S985 and Y1003 respectively allow the inhibition of kinase activity and the degradation of MET in response to HGF, the ligand of the receptor. The motif ESVD1002, for its part, is a caspase cleavage site allowing the generation of the p40MET fragment involved in apoptosis. In this context, my thesis objective was to characterize the activation mechanisms of the MET ex14 receptor by determining the involvement of HGF and the relative contribution of these regulatory sites in the transforming capacities of MET ex14 cells. To answer these questions, we first established using CRISPR-Cas9 technology a pulmonary epithelial line presenting an exon 14 jump from the 16HBE line. Through collaborative work with a team in London, we have shown that the MET receptor ex14 is dependent of HGF for the establishment of its full transformative capacities. In fact, only 16HBE ex14 cells induce tumor formation and this tumor development is significantly more frequent and presents a higher volume in transgenic mice expressing human HGF. Furthermore, we show that among 18 MET ex14 patients tested, at least a third of them present co-expression of HGF and MET.However, the molecular mechanisms behind this expression and its functional consequences remain to be determined. Secondly, in order to determine the regulatory sites involved in the transforming potential of MET ex14, we established T47D epithelial cell lines expressing wild type MET version, lacking exon 14 or mutated on each or all of the regulatory sites described. Our results show that in response to HGF, the mutation of the Y1003residue induces a stronger and prolonged activation of downstream signaling pathways associated with greatermigratory capacities similar to the MET receptor ex14. Furthermore, the transcriptional program of MET ex14and Y1003F in response to HGF shows similarities, notably including genes associated with invasion. On the otherhand, the mutation of the cleavage site by the caspases induces the loss of the pro-apoptotic capacities of MET, thus promoting the survival of the MET ex14 cells. As T47D MET cells are not able to induce tumor development in vivo, we have also developed a 16HBE Y1003F line mutated by CRISPR technology. Interestingly, the loss of the Y1003 site alone does not confer the same tumorigenic capacities as the MET ex14 mutation in murine xenografts by allowing the development of few tumors compared to MET ex14 cells. Taken together, these results reveal that the loss of exon 14 leads to a novel mode of activation that is different from other kinase activating MET mutations. We show in particular that the MET ex14 receptor is dependent on HGF for the development of a full transforming potential and that these capacities are the consequence of the combined loss of at least two regulatory mechanisms of the receptor impacting migration but also cell survival. These elements support the use of kinase inhibitors targeting MET and could allow HGF to be considered as a potential biomarker of tumor aggressiveness and / or responses to MET inhibitors., Les thérapies ciblant les récepteurs tyrosine kinase ont contribué à améliorer le pronostic de certains patients et apportent un véritable espoir thérapeutique dans la lutte contre les cancers. Bien que la majorité des mutations des RTK impactent le domaine kinase et conduisent à leur activation constitutive, celles touchant le récepteur MET dans le cancer du poumon conduisent au saut de l’exon 14 (MET ex14) codant le domaine juxtamembranaire. Le domaine perdu comporte au moins trois sites de régulation négative. Parmi eux, les résidus phosphorylables S985 et Y1003 permettent respectivement l’inhibition de l’activité kinase et la dégradation de MET en réponse à l’HGF, le ligand du récepteur. Le motif ESVD1002, quant à lui, est un site de clivage par les caspases permettant la génération du fragment p40MET impliqué dans l’apoptose.Dans ce contexte, mon objectif de thèse a été de mieux caractériser les mécanismes d’activation du récepteur MET ex14 en déterminant l’implication de l’HGF et la contribution relative de ces sites de régulation dans les capacités transformantes des cellules MET ex14. Pour répondre à ces questions, dans un premier temps nous avons établi par technologie CRISPR-Cas9 une lignée épithéliale pulmonaire présentant un saut de l’exon 14 à partir de la lignée 16HBE. Au travers d’un travail collaboratif avec une équipe londonienne, nous avons montré que le récepteur MET ex14 est dépendant de l’HGF pour l’établissement de ses capacités transformantes complètes. En effet, seules les cellules 16HBE ex14 induisent la formation de tumeurs et ce développement tumoral est significativement plus fréquent et de volume supérieur dans des souris transgéniques exprimant l’HGF humain. Par ailleurs, nous montrons que parmi 18patients MET ex14 testés, au moins un tiers d’entre eux présentent une co-expression d’HGF et MET. Néanmoins, les mécanismes moléculaires à l’origine de cette expression ainsi que ses conséquences fonctionnelles restent à déterminer. Dans un second temps, afin de mieux caractériser les sites de régulations impliqués dans le potentiel transformant de MET ex14, nous avons établi des lignées cellulaires épithéliales T47D exprimant des versions de MET sauvage, dépourvu de l’exon 14 ou muté sur chacun ou la totalité des sites de régulation décrits. Nos résultats montrent qu’en réponse à l’HGF, la mutation du résidu Y1003 induit une activation des voies de signalisation en aval plus forte et prolongée associée à des capacités migratoires plus importantes similaires au récepteur MET ex14. Par ailleurs, le programme transcriptionnel de MET ex14 et Y1003F en réponse à l’HGF présente des similitudes en incluant notamment des gènes associés à l’invasion. En revanche, la mutation du site de clivage par les caspases induit la perte des capacités pro-apoptotiques de MET favorisant ainsi la survie des cellules MET ex14. Les cellules T47D MET n’induisant pas le développement de tumeurs in vivo, nous avons développé également une lignée 16HBE mutée Y1003F par technologie CRISPR. De manière intéressante, la perte du siteY1003 seule ne confère pas les mêmes capacités tumorigéniques que la mutation MET ex14 en xénogreffes murines en permettant le développement de peu de tumeurs par rapports aux cellules MET ex14. L’ensemble de ces résultats révèle que la perte de l’exon 14 conduit à un mode d’activation original et différent d’autres mutations de MET activatrices de la kinase. Nous montrons notamment que le récepteur MET ex14 est dépendant de l’HGF pour le développement d’un potentiel transformant complet et que ces capacités sont la conséquence de la perte combinée d’au moins deux mécanismes de régulation du récepteur impactant la migration mais également la survie cellulaire. Ces éléments confortent l’utilisation des inhibiteurs kinase ciblant MET et pourraient permettre d’envisager l’HGF comme un potentiel biomarqueur d’agressivité tumoral et/ou de réponses aux inhibiteurs de MET.

Targeted therapies against receptor tyrosine kinases improved the prognosis in some patients and provide real therapeutic hope in the fight against cancer. Although the majority of RTK mutations impact the kinase domain and lead to their constitutive activation, those affecting the MET receptor in lung cancer lead to the skipping of exon 14 (MET ex14) encoding the juxtamembrane domain. The lost domain contains at least three negative regulatory sites. Among them, the phosphorylable residues S985 and Y1003 respectively allow the inhibition of kinase activity and the degradation of MET in response to HGF, the ligand of the receptor. The motif ESVD1002, for its part, is a caspase cleavage site allowing the generation of the p40MET fragment involved in apoptosis. In this context, my thesis objective was to characterize the activation mechanisms of the MET ex14 receptor by determining the involvement of HGF and the relative contribution of these regulatory sites in the transforming capacities of MET ex14 cells. To answer these questions, we first established using CRISPR-Cas9 technology a pulmonary epithelial line presenting an exon 14 jump from the 16HBE line. Through collaborative work with a team in London, we have shown that the MET receptor ex14 is dependent of HGF for the establishment of its full transformative capacities. In fact, only 16HBE ex14 cells induce tumor formation and this tumor development is significantly more frequent and presents a higher volume in transgenic mice expressing human HGF. Furthermore, we show that among 18 MET ex14 patients tested, at least a third of them present co-expression of HGF and MET.However, the molecular mechanisms behind this expression and its functional consequences remain to be determined. Secondly, in order to determine the regulatory sites involved in the transforming potential of MET ex14, we established T47D epithelial cell lines expressing wild type MET version, lacking exon 14 or mutated on each or all of the regulatory sites described. Our results show that in response to HGF, the mutation of the Y1003residue induces a stronger and prolonged activation of downstream signaling pathways associated with greatermigratory capacities similar to the MET receptor ex14. Furthermore, the transcriptional program of MET ex14and Y1003F in response to HGF shows similarities, notably including genes associated with invasion. On the otherhand, the mutation of the cleavage site by the caspases induces the loss of the pro-apoptotic capacities of MET, thus promoting the survival of the MET ex14 cells. As T47D MET cells are not able to induce tumor development in vivo, we have also developed a 16HBE Y1003F line mutated by CRISPR technology. Interestingly, the loss of the Y1003 site alone does not confer the same tumorigenic capacities as the MET ex14 mutation in murine xenografts by allowing the development of few tumors compared to MET ex14 cells. Taken together, these results reveal that the loss of exon 14 leads to a novel mode of activation that is different from other kinase activating MET mutations. We show in particular that the MET ex14 receptor is dependent on HGF for the development of a full transforming potential and that these capacities are the consequence of the combined loss of at least two regulatory mechanisms of the receptor impacting migration but also cell survival. These elements support the use of kinase inhibitors targeting MET and could allow HGF to be considered as a potential biomarker of tumor aggressiveness and / or responses to MET inhibitors., Les thérapies ciblant les récepteurs tyrosine kinase ont contribué à améliorer le pronostic de certains patients et apportent un véritable espoir thérapeutique dans la lutte contre les cancers. Bien que la majorité des mutations des RTK impactent le domaine kinase et conduisent à leur activation constitutive, celles touchant le récepteur MET dans le cancer du poumon conduisent au saut de l’exon 14 (MET ex14) codant le domaine juxtamembranaire. Le domaine perdu comporte au moins trois sites de régulation négative. Parmi eux, les résidus phosphorylables S985 et Y1003 permettent respectivement l’inhibition de l’activité kinase et la dégradation de MET en réponse à l’HGF, le ligand du récepteur. Le motif ESVD1002, quant à lui, est un site de clivage par les caspases permettant la génération du fragment p40MET impliqué dans l’apoptose.Dans ce contexte, mon objectif de thèse a été de mieux caractériser les mécanismes d’activation du récepteur MET ex14 en déterminant l’implication de l’HGF et la contribution relative de ces sites de régulation dans les capacités transformantes des cellules MET ex14. Pour répondre à ces questions, dans un premier temps nous avons établi par technologie CRISPR-Cas9 une lignée épithéliale pulmonaire présentant un saut de l’exon 14 à partir de la lignée 16HBE. Au travers d’un travail collaboratif avec une équipe londonienne, nous avons montré que le récepteur MET ex14 est dépendant de l’HGF pour l’établissement de ses capacités transformantes complètes. En effet, seules les cellules 16HBE ex14 induisent la formation de tumeurs et ce développement tumoral est significativement plus fréquent et de volume supérieur dans des souris transgéniques exprimant l’HGF humain. Par ailleurs, nous montrons que parmi 18patients MET ex14 testés, au moins un tiers d’entre eux présentent une co-expression d’HGF et MET. Néanmoins, les mécanismes moléculaires à l’origine de cette expression ainsi que ses conséquences fonctionnelles restent à déterminer. Dans un second temps, afin de mieux caractériser les sites de régulations impliqués dans le potentiel transformant de MET ex14, nous avons établi des lignées cellulaires épithéliales T47D exprimant des versions de MET sauvage, dépourvu de l’exon 14 ou muté sur chacun ou la totalité des sites de régulation décrits. Nos résultats montrent qu’en réponse à l’HGF, la mutation du résidu Y1003 induit une activation des voies de signalisation en aval plus forte et prolongée associée à des capacités migratoires plus importantes similaires au récepteur MET ex14. Par ailleurs, le programme transcriptionnel de MET ex14 et Y1003F en réponse à l’HGF présente des similitudes en incluant notamment des gènes associés à l’invasion. En revanche, la mutation du site de clivage par les caspases induit la perte des capacités pro-apoptotiques de MET favorisant ainsi la survie des cellules MET ex14. Les cellules T47D MET n’induisant pas le développement de tumeurs in vivo, nous avons développé également une lignée 16HBE mutée Y1003F par technologie CRISPR. De manière intéressante, la perte du siteY1003 seule ne confère pas les mêmes capacités tumorigéniques que la mutation MET ex14 en xénogreffes murines en permettant le développement de peu de tumeurs par rapports aux cellules MET ex14. L’ensemble de ces résultats révèle que la perte de l’exon 14 conduit à un mode d’activation original et différent d’autres mutations de MET activatrices de la kinase. Nous montrons notamment que le récepteur MET ex14 est dépendant de l’HGF pour le développement d’un potentiel transformant complet et que ces capacités sont la conséquence de la perte combinée d’au moins deux mécanismes de régulation du récepteur impactant la migration mais également la survie cellulaire. Ces éléments confortent l’utilisation des inhibiteurs kinase ciblant MET et pourraient permettre d’envisager l’HGF comme un potentiel biomarqueur d’agressivité tumoral et/ou de réponses aux inhibiteurs de MET.

In hereditary papillary renal cell carcinoma (HPRCC), the MET receptor tyrosine kinase (RTK) mutations recorded to date are located in the kinase domain and lead to constitutive MET activation. This contrasts with MET mutations recently identified in non-small cell lung cancer (NSCLC), which lead to exon 14 skipping and deletion of a regulatory domain: in this latter case, the mutated receptor still requires ligand stimulation. Sequencing of MET in samples from 158 HPRCC and 2808 NSCLC patients revealed ten uncharacterized mutations. Four of these, all found in HPRCC and leading to amino acid substitutions in the N-lobe of the MET kinase, proved able to induce cell transformation, further enhanced by HGF stimulation: His1086Leu, Ile1102Thr, Leu1130Ser, and Cis1125Gly. Similar to the variant resulting in MET exon14 skipping, the two N-lobe MET variants His1086Leu, Ile1102Thr further characterized were found to require stimulation by HGF in order to strongly activate downstream signaling pathways and epithelial cell motility. The Ile1102Thr mutation displayed also transforming potential, promoting tumor growth in a xenograft model. In addition, the N-lobe-mutated MET variants were found to trigger a common HGF-stimulation-dependent transcriptional program, consistent with an observed increase in cell motility and invasion. Altogether, this functional characterization revealed that N-lobe variants still require ligand stimulation, in contrast to other RTK variants. This suggests that HGF expression in the tumor microenvironment is important for tumor growth. The sensitivity of these variants to MET TKIs opens the way for use of targeted therapies for patients harboring the corresponding mutations.