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Orientador: Maria Ligia Rodrigues Macedo Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia Resumo: Os inibidores de proteinases desempenham as mais variadas funções biológicas. Em plantas, eles podem estar envolvidos no mecanismo de defesa vegetal contra predadores e doenças. Devido à habilidade dessas moléculas protéicas bloquearem enzimas, os inibidores também podem ser usados como ferramentas no estudo de processos bioquímicos relacionados a patologias, tais como a inflamação, hemorragia e até mesmo o câncer. Neste trabalho, a caracterização físico-química e o estudo dos papéis biológicos de dois inibidores isolados e purificados de sementes de Dimorphandra mollis, DMTI (Mace do et ai., 2000) e DMTI-II (Mello et aI., 2001) foram realizadas com o objetivo de melhor conhecer essas moléculas. DMTI (20 kDa) e DMTI-II (23kDa) são inibidores de tripsina pertencentes à família de Kunitz. A estabilidade da atividade inibitória de DMTI e DMTI-II foi analisada e comparada. DMTI e DMTI-II perde, respectivamente, cerca de 20% e 40% da atividade quando incubados a 60 °e por 20 minutos. Entretanto, a atividade de ambos não foi afetada por diferentes condições de pH, concentrações crescentes dos agentes redutores DTT e uréia. No entanto, a atividade DMTI-II sofreu um descréscimo de 50% quando incubado com cloreto de guanidina. A diferença da estabilidade dos inibidores levou a investigação da estrutura protéica de ambos; DMTI e DMTI-II foram submetidos a análises de dicroísmo circular e calorimetria. A ação inseticida de DMTI-II e DMTI sobre os lepidópteros Anagasta kuehniella e Corcyra cephalonica, foram analisadas através de ensaios in vitro e in vivo. Tanto DMTI-II quanto DMTI, quando incorporados ao nível de 2% na dieta artificial dos insetos, não se mostraram agentes inseticidas potenciais contra essas duas espécies. Estes resultados não descartam a utilização dos inibi dores de D. mollis na biotecnologia vegetal contra outras espécies de insetos, apenas ajudam a esclarecer as características como agentes inseticidas biológicos. Quando estudado o envolvimento de DMTI-II e DMTI na resposta inflamatória utilizando o edema de pata em ratos como modelo experimental, os resultados mostraram que doses crescentes de DMTI-II geram uma curva dose-dependente sendo que a resposta máxima ocorre 30 minutos após a sua injeção subplantar, o que sugeriu a ação do inibidor na liberação de histamina e serotonina, que são responsáveis pelo aumento da penneabilidade vascular. A elucidação do mecanismo de ação de DMTI-Il foi estudada através da utilização de drogas antiinflamatórias, como a mepiramina e ciproheptadina; sendo esta última a que melhor inibiu a ação de DMTI-Il na indução do edema. Concomitantemente, a sua ação na liberação de bradicinina também pode estar ocorrendo, pois o pré-tratamento com o antagonista de receptores B 2, HOE 140, reduziu cerca de 79% do edema induzido por DMTI-II Abstract: Proteinase inhibitors have a wide range of biological functions. In plants, they¿re part of the defense mechanism against predators and diseases. As they can block enzymes, inhibitors are useful tools in the study of biochemical processes related to pathologies, such as inflammation, hemorrhage and even cancer. This paper aims at assessing the physical-chemical features and the biological functions of two inhibitors isolated and purified trom Dimorphandra mollis seeds, DMTI (Macedo et al., 2000) and DMTI-II (Mello et aI., 2001). DMTI (20 kDa) and DMTI-TI (23 kDa) are trypsin inhibitors ITom the Kunitz family. The stability of the inhibitory activity of DMTI and that ofDMTI-II were analyzed and compared to each other. DMTI and DMTI-II lost 20% and 40%, respectively, oftheir activities when incubated at 60°C for 20 minutes. However, neither inhibitory activity was sensitive to pH above the 2.0-10.0 range, reducing DTT agents and urea. On the other hand, DMTI-II activity was reduced by 50% when incubated with guanidine hydrochloride. The difference of stability between the inhibitors led to further investigation of their protein structure; DMTI and DMTI-II structures were analyzed by circular dichroism (CD) and differential scanning calorimetry (DSC). The effectiveness of DMTI-II and DMTI as insecticide in Lepidoptera insects, Anagasta kuehniella and Corcyra cephalonica, was analyzed in vitro and in vivo assays. Neither DMTI-II nor DMTI, when incorporated into artificial diet at 2%, were active as insecticide agents against these two species. Nevertheless, these results do not discard the use of inhibitors trom D. mollis in plant biotechnology against other species of insects; they just help us to understand how they work as biological agents. When studying DMTI and DMTI-II participation in inflammatory response in the rat paw edema experimental model, the results showed that increased doses of DMTI-II induced a dose dependent curve, and maximum response occurred 30 min after sub-plantar injection, which indicated that the inhibitor is active in the release of histamine and serotonin, which are responsible for the increase of vascular permeability. The elucidation of DMTI-II action mechanism was studied by using anti-inflammatory drugs, such as mepyramine and cyproheptadine, the latter the most effective against DMTI-II effects in edema induction. At the same time, it may also be active in bradykinin release as the pretreatment with B2 receptor antagonist HOE 140 reduced the DMTI-II induced edema by near1y 79% Doutorado Bioquímica Doutor em Biologia Funcional e Molecular

Orientador: Maria Ligia Rodrigues Macedo Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia Resumo: Algumas espécies vegetais podem apresentar em suas sementes, agentes bioquímicos que atuam no mecanismo de defesa da planta. Uma grande variedade destes são, na maioria, constituídos de proteínas e carboidratos. Dentre os agentes de origem protéica estão os inibidores de proteinases, que além da sua atuação em plantas, podem ter aplicações no tratamento de patologias, como inflamações, hemorragia e até mesmo o câncer. Neste trabalho, um inibidor de tripsina presente nas sementes de Dimorphandra mollis (Leguminosae-Mimosoideae), conhecida comumente por Faveiro-Doce, foi isolado e purificado a partir de precipitação com sulfato de amônio (30-60%), cromatografias em coluna de exclusão molecular (Sephadex G-75), troca iônica (DEAE-Sepharose) e de afinidade (Sepharose- Tripsina). A pureza do inibidor de D. mollis (DMTI-II) foi verificada por eletroforese em gel de poliacrilamida, que revelou uma única banda de proteína, mesmo em condições redutoras (O,IM DTT), indicando que DMTI-II é constituído por uma única cadeia polipeptídica. A massa molecular relativa de 25 kDa foi estimada por gel filtração em coluna de Superdex-75, em sistema FPLC. Uma constate de inibição de Ki de 1,7 x IO-IOM foi obtida para DMTI-II com a enzima tripsina bovina, mostrando portanto uma alta afinidade entre enzima e inibidor. Estudos estequiométricos revelaram que DMTI-II inibiu a tripsina na razão molar de 1:1, sendo a massa molecular do complexo formado de 46 kDa, determinada por cromatografia de filtração em gel, em coluna Superdex-75 (sistema FPLC). A atividade inibitória de DMTI-II mostrou ser altamente estável para diferentes condições de pH e concentrações do agente redutor DTT. A determinação da sequência N-terminal do inibidor que apresentou alto grau de homologia com outros inibi dores da família Kunitz, permitiu confnmar as características e propriedades mostradas durante o decorrer do trabalho. DMTI-II foi também submetido a ensaios de digestibilidade in vitro por pepsina e papaína e por enzimas presentes no intestino médio de larvas de Callosobruchus macu/atus com o intuito de verificar sua provável ação contra esta espécie de inseto. Os resultados mostraram que DMTI-II foi refratário à ação dessas enzimas, sugerindo uma possível aplicação na biotecnologia vegetal Abstract: Some plants species can have in their seeds biochemical agents that act on their defense mechanism. A great number of them are of proteins or carbohydrates nature. Among the ones with protein origin are the proteinase inhibitors, that can also have a role on the treatment of pathologies, such as inflammation, hemorrhage and even on cancer. In this work, a trypsin inhibitor from Dimorphandra mol/is (Leguminosae Mimosoideae) seeds, commonly known as "Faveiro-Doce", was isolated and purified by ammnium sulfate precipitation (30-60%), gel filtration chromatography (Sephadex G-75), ionexchange chromatography (DEAE-Sepharose) and affinity chromatography (SepharoseTrypsin). D. mollis inhibitor's (DMTI-II) was assayed by polyacrylamide gel electrophoresis, yielding a single protein band, indicating that DMTI-II is constituted by one polypeptide chain. A molecular weight of25 kDa was estimated by gel filtration on Superdex G-75 column (FPLC system). An inhibition constant value of 1.7 x IO-IOM was obtained for DMTI-II with bovine trypsin, showing a high affmity between enzyme and inhibitor. Stoichiometric studies showed that DMTI-II inhibited trypsin in a I: I molar ratio. The molecular weight of the complex was determined as 46 kDa, by gel filtration chromatography in the Superdex G75 column. DMTI-II inhibitory activity was stable in the different pH conditions and reducing agent (DTT) concentration. Determination ofthe inhibitor N-terminal sequence showed a high degree of homology in relation to other inhibitors from the Kunitz fami1y, reinforcing the characteristics and properties found during this work. DMTI-II inhibitor was submitted to digestion assays in vitro by pepsin and papain and by enzymes present in the larvae midgut from Callosobruchus maculatus, to verify its probable _on against this insect specie. The results showed that DMTI-II was refractory to the action of those enzymes, suggesting a possible application on plant biotechnology Mestrado Bioquímica Mestre em Biologia Funcional e Molecular

Orientadores: Sergio Marangoni, Luís Alberto Ponce Soto Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia Resumo: Uma nova miotoxina fosfolipase A2 (BtTX-II) foi purificada a partir do veneno total de Bothriopsis taeniata através de dois passos cromatográficos, envolvendo inicialmente cromatografia de exclusão molecular, seguida de HPLC de fase reversa. BtTX-II foi caracterizada bioquimicamente através de eletroforese em gel de poliacrilamida (SDS-PAGE) mostrando uma única banda eletroforética com massa relativa (Mr) de 14000 Da, em condições não reduzidas e reduzidas (DTT 1M). A pureza e massa molecular foram confirmadas por espectrometria de massa (MALDI-Tof MS), a qual determinou uma massa molecular de 13889,98 Da. BtTX-II apresentou atividade catalítica de 12,075 ± 0,138 nmoles/mg/min em presença do substrato cromogênico específico ácido 4-nitro-3-(octanoyloxy) benzoico. Análise de composição de aminoácidos da PLA2 (BtTX-II) corroborou seu caráter básico. A análise dos peptídeos trípticos foi determinada por ESI-QTof-MS/MS espectrometria de massa e as regiões contendo peptídeos internos mostraram semelhança com outras PLA2s miotóxicas botrópicas cataliticamente ativas. BtTX-II, pertencente à classe PLA2 D49, exibiu atividade ótima a pH 8,0 e temperatura de 37 ºC. Na ausência de Ca2+ e na presença de alguns íons divalentes, tais como Mg2+, Mn2+, Zn2+ e Cd2+ (10mM), a atividade fosfolipásica foi significativamente diminuída. Também foi demonstrado o efeito inibitório de crotapotinas crotálicas sobre a atividade PLA2 da BtTX-II. O efeito neurotóxico da BtTX-II foi analisado através de estudos miográficos em preparações neuromusculares "ex vivo", mostrando que BtTX-II induz um leve bloqueio na junção neuromuscular em preparações Biventer cervicis de pintainho. Tais preparações foram utilizadas para o estudo morfológico quantitativo da BtTX-II, o que mostrou uma leve atividade miotóxica "in vitro" com a concentração de 50?g de BtTX-II. O efeito miotóxico também foi avaliado através de ensaios de liberação de creatina kinase plasmática e análise histopatológica do músculo gastrocnêmio de camundongo "in vivo", com estes últimos testes foram observandos maiores mudanças morfológicas quando comparadas aos estudos "in vitro", mostrando estar diretamente relacionada com a liberação de CK. BtTX-II induz miotoxicidade local após injeção intramuscular, mas não produz miotoxicidade sistêmica após injeções intravenosa. O efeito edematogênico foi estudado através do modelo coxim plantar de camundongo e mostrou ser elevado nas primeiras horas após injeções subcutâneas, em todas as concentrações aplicadas (1- 20 ?g). O efeito citotóxico "in vitro" foi caracterizado utilizando uma cultura celular da linhagem de mioblastos/miotubos de músculo esquelético de camundongo. BtTX-II não induz citotoxicidade em mioblastos; mas BtTX-II evidenciou atividade citotóxica em miotubos, em uma concentração padrão de 20 ?g. Nossos resultados sugerem que BtTX-II atua no processo de regeneração muscular em baixas concentrações (10 ?g) durante o período de 28 dias após as injeções intramusculares no gastrocnêmio de camundongo, demonstrando ser apropriado para a análise na regeneração muscular, pois induz necrose e não acarreta lesão do tecido vascular nem nervoso, o que é de suma importância para o processo de regeneração muscular. Isto foi possível pela presença de células satélite envolvidas neste processo junto com o infiltrado inflamatório notório em todos os períodos da regeneração Abstract: A new miotoxin phospholipase A2 (BtTX-II) was purified from Bothriopsis taeniata crude venom through two steps cromatográficos, involving molecular exclusion chromatography, as first step, and followed by RP-HPLC. BtTX-II, was characterized biochemically through electrophoresis in polyacrylamide gel (SDS-PAGE) showing a single eletrophoretic band, in reduced and not reduced conditions, with relative mass (Mr) of 14000 Da. The purity and molecular mass was confirmed by mass spectrometry mass (Maldi-Tof SM), showed a molecular mass of 13889.98 Da. BtTX-II showed catalytic activity of 12.075 ± 0.138 nmoles/mg/min upon of the specific chromogenic substrate acid 4-nitro-3-(octanoyloxy) benzoic. Analysis of aminoacid composition of PLA2 (BtTX-II) corroborated its basic character. Tryptic peptide analyse were determined for ESI-QTof-MS/MS mass spectrometry and the regions containing internal peptides showed similarity with other miotoxic botropics PLA2s. BtTX-II belonging to the class PLA2 D49 exhibited an optimal activity in pH 8.0 and at 37 ºC. In the absence of Ca2+ and in presence of some divalent íons such Mg2+, Mn2+, Zn2+ and Cd2+ (10mM), the phospholipasic activity was significantly decreased. Also, it was demonstrated the inhibitory effect of crotalics crotapotins upon activity PLA2 of the BtTX-II. The neurotoxic effect of the BtTX-II was analized through myographic studies in neuromuscular preparations "ex vivo", showing that BtTX-II induce a light blockade at the neuromuscular junction on chicken Biventer cervicis preparations. Such preparations were used for quantitatives morphologic studies, were shown a light myotoxic activity "in vitro" at higher concentration. On the other hand, the myotoxic effect was evaluated through release of plasmatic creatine kinase "in vivo" and was carry out histophatologic analyzes mouse gastrocnemius muscle, with these last tests were observed larger morphologic changes when compared to studies "in vitro", showing directly related with the CK liberation. BtTX-II induces local miotoxicity after intramuscular injection, but it did not produce systemic miotoxicity after intravenous injections. The edematogenic effect was studied through the model mouse paw edema and showed to be high in the first hours after subcutaneous injections, in all applied concentrations (1-20 ?g). The cytotoxic effect "in vitro" was characterized using a cell culture of the rodent lineage of myoblasts/myotubes cells. BtTX-II did not induce citotoxicity in skeletal muscle myoblasts; however, BtTX-II showed cytotoxic activity in myotubes, both with a standard concentration of 20 ?g. Our results suggest that BtTX-II act in the process of muscular regeneration in low concentrations (10 ?g) during a period of 28 days after intramuscular injections in the mouse gastrocnemius muscle, This effect was to be appropriate for muscular regeneration analyzes because it induces necroses and it did not carry out lesion of the vascular nor nervous tissue, thus, it is of supreme importance for the process of muscular regeneration. Those results were possible by the presence of satellite cells involved in these processes together with notorious inflammatory infiltrate in every periods of the regeneration Doutorado Bioquímica Doutor em Biologia Funcional e Molecular