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Dentale Follikelzellen (DFCs, engl. Dental follicle cells) sind die endogenen Stamm-/Vorläuferzellen des Zahnhalteapparats und können in alveoläre Osteoblasten, Zementoblasten und Fibroblasten des parodontalen Ligaments differenzieren. DFCs besitzen großes Potential für regenerative Therapien von (dentalem) Knochengewebe, wobei zunächst eine genaue Kenntnis der molekularen Mechanismen während der osteogenen Differenzierung, welche sich in vitro durch BMP2 (engl. Bone morphogenetic protein 2) oder Dexamethason induzieren lässt, erforderlich ist. Nachdem Vorarbeiten zeigten, dass klassische Isoformen der Proteinkinase C (PKC) während der Osteogenese von DFCs herunterreguliert werden und diese hemmen, sollten in der vorliegenden Arbeit die zugrundeliegenden Mechanismen evaluiert werden. Hierfür wurde die Regulierung potentieller Zielproteine und Signalwege nach osteogener Induktion und Hemmung klassischer PKCs untersucht sowie deren Einfluss auf osteogene Marker evaluiert. Dabei wurde festgestellt, dass klassische PKCs die Kinase Akt regulieren und stromabwärts durch Phosphorylierung von GSK3β (Glykogensynthase-Kinase 3β) die Aktivität des Proteins β-Catenin beeinflussen, welches eine wichtige Rolle für die Induktion der Osteogenese spielt. Während Akt zwar die Expression von aktivem β-Catenin unterstützte, führte eine Überaktivierung der Kinase jedoch zur Inhibition der Differenzierung und des Signalwegs stromabwärts von BMP2. Darüber hinaus konnte eine Regulierung des NF-κB (engl. Nuclear factor kappa B)-Signalwegs durch klassische PKCs und Akt nachgewiesen werden, wobei NF-κB die Proliferation und osteogene Differenzierung von DFCs unterdrückte. Dahingegen konnte keine direkte Beteiligung von klassischen PKCs oder Akt an der BMP2-induzierten Aktivierung der Proteinkinase A (PKA), welche die Osteogenese unterstützt, gefunden werden. Stattdessen zeigten die Versuche, dass die PKA-Aktivierung von der intrazellulären Expression des Proteins PTHrP (engl. Parathyroid hormone-related protein) abhängt, und dass PKA den Signalweg stromabwärts von BMP2 durch eine negative Rückkopplung hemmt. Des Weiteren konnte eine Induktion des mitochondrialen Energiemetabolismus und des oxidativen Stresses während der osteogenen Differenzierung und nach Inhibition klassischer PKCs festgestellt werden, während eine Hemmung des mitochondrialen Stoffwechsels die Mineralisierung unterdrückte. Eine Evaluierung von Proteinen, welche oxidativen Stress neutralisieren können, zeigte eine Stimulierung der Catalase-Expression und eine Herunterregulierung der Expression von GPX1 (Glutathionperoxidase 1) während der Differenzierung und nach Inhibition klassischer PKCs. Überdies führte eine Hemmung der Catalase zu einer verringerten Mineralisierung. Stromaufwärts von PKC wurde PTHrP für die Aktivität der Kinase benötigt, während das Protein WNT5A (engl. Wnt family member 5A) diese unterdrückte. Die Ergebnisse legten dar, dass klassische Isoformen von PKC die osteogene Differenzierung von DFCs über verschiedene Mechanismen hemmen, wobei insbesondere biologische Prozesse reguliert werden, die in späteren Differenzierungsphasen wichtig sind., Dental follicle cells (DFCs) are the genuine stem/precursor cells of the periodontium and capable of differentiating into alveolar osteoblasts, cementoblasts and periodontal ligament fibroblasts. DFCs possess great potential for regenerative therapies of (dental) bone tissue, but their usage first requires a profound knowledge of the molecular mechanisms during the osteogenic differentiation, which can be induced in vitro by BMP2 (Bone morphogenetic protein 2) or dexamethasone. After previous experiments showed that classical isoforms of PKC (Protein kinase C) are downregulated during osteogenesis of DFCs and inhibit the differentiation, this thesis aimed to evaluate the underlying mechanisms. For this, regulation of potential target proteins and signaling pathways was analyzed after osteogenic induction and inhibition of classical PKCs, and their impact on osteogenic markers was investigated. The results showed that classical PKCs regulate the kinase Akt, which in turn phosphorylates GSK3β (Glycogen synthase kinase 3β) and consequently affects the stability of β-catenin, which plays an important role for the induction of osteogenesis. While Akt supported the expression of active β-catenin, overactivation of the kinase, however, inhibited the differentiation and the signaling pathway downstream of BMP2. Furthermore, classical PKCs and Akt regulated the NF-κB (Nuclear factor kappa B) signaling pathway, and NF-κB was shown to suppress proliferation and osteogenic differentiation of DFCs. By contrast, classical PKCs and Akt were not directly involved in the BMP2-induced activation of protein kinase A (PKA), which is known to support osteogenesis. Instead, the experiments showed that activation of PKA depends on the intracellular expression of the protein PTHrP (Parathyroid hormone-related protein) and that PKA inhibits the signaling pathway downstream of BMP2 via negative feedback. Moreover, mitochondrial energy metabolism and oxidative stress were induced during the osteogenic differentiation as well as after inhibition of classical PKCs, and inhibition of the mitochondrial metabolism suppressed mineralization. Evaluation of proteins which are capable of neutralizing oxidative stress revealed that expression of catalase was upregulated and expression of GPX1 (Glutathione peroxidase 1) was inhibited during differentiation and after inhibition of classical PKCs. Besides, inhibition of catalase attenuated mineralization. Upstream of PKC, PTHrP was required for kinase activity, while WNT5A (Wnt family member 5A) suppressed it. The results showed that classical isoforms of PKC inhibit the osteogenic differentiation of DFCs via different mechanisms, which especially involve biological processes important for later differentiation periods.

My work examines functional aspects of the structural plasticity of parvalbumin-positive interneurons in the mouse dentate gyrus. It has been recently shown in Prof. Wulff lab that this type of interneurons carry a considerable number of dendritic spines. Here I describe how the inhibition of protein kinase C, enzyme of a signaling cascade activated during neural plasticity, affects dendritic spine and synapsis density.

G-Protein gekoppelte einwärtsgleichrichtende Kaliumkanäle (GIRK-Kanäle) sind im Herzen an der Ausbildung des Ruhepotentials beteiligt. Sie werden über M\(_2\)R aktiviert und über G\(_q\)PCRs durch PIP\(_2\)-Depletion und/oder Kanalphosphorylierung durch PKCs inhibiert. Der exakte Mechanismus der Inhibition der GIRK-Kanäle ist bisher nicht bekannt. Deshalb wurde in der folgenden Arbeit die Inhibition der GIRK-Kanäle während der Aktivierung von \(\alpha\)1-AR bzw. ET-R mithilfe verschiedener Methoden (FRET, Patch-Clamp) analysiert. Dabei zeigte sich, dass die Rezeptor-spezifische Aktivierung der Ca\(^{2+}\)-abhängigen PKC-Isoformen \(\alpha\) und \(\beta\) zur Inhibition des GIRK beiträgt. Außerdem regulieren cPKCs Rezeptor-spezifisch Dauer und Stärke des Signals von G\(_q\)PCRs. Die Rezeptor-spezifischen Unterschiede in der Aktivierung der cPKCs stellen somit einen neuen Signalweg dar, bei dem die Aktivität des GIRK-Kanals und die Stärke des Rezeptor-Signals über einen negativen Feedback-Mechanismus reguliert werden.

Im Verlauf der Wirtsreaktion auf eine schwere Infektion kommt es früh zu einer exkretorischen Dysfunktion der Leber. Das Auftreten der septischen Cholestase ist mit einem ungünstigen klinischen Verlauf assoziiert. Die, dem Defekt der hepato- und cholangiozellulären Transportsysteme zu Grunde liegenden, pathophysiologischen Mechanismen sind noch nicht vollständig entschlüsselt und Gegenstand aktueller Forschung. Rückschlüsse über beteiligte Komponenten sind anhand der besser charakterisierten Signalkaskade der physiologischen Gallesekretion möglich und weisen der Proteinkinase-C-Familie eine entscheidende Rolle in der Regulation der Signalverarbeitung zu. Ein Grund für die anhaltend hohe Mortalität und Zunahme der Inzidenz der Sepsis ist das Fehlen von adjunktiven, immunmodulatorischen Sepsistherapeutika zur Behandlung des konsekutiven Organversagens. Die Inhibition der Proteinkinase-C wird aktuell als therapeutische Option zur kausalen Behandlung der septischen Cholestase diskutiert. Die Wiederherstellung der hepatischen Exkretionsleistung könnte das Ausmaß des Organversagens verhindern und dazu beitragen, die anhaltend hohe Mortalität der Sepsis zu senken. Zur Entwicklung neuer therapeutische Ansätze, die in die Signalverarbeitung von Zellen eingreifen, ist ein genaues Verständnis für die, der septischen Cholestase zugrundeliegenden Mechanismen notwendig. Vor diesem Hintergrund stellt sich die Frage, inwiefern die Proteinkinase-C die frühe inflammatorische Signalkaskade mitgestaltet, die zu einer Abnahme der Exkretionsleistung führt. Auch soll unter Kontrolle der Werte für die hepatozelluläre Integrität geklärt werden, ob die gezielte Inhibition einzelner Isoformen der Proteinkinase-C positiven Einfluss auf die Sepsis-assoziierte, exkretorische Dysfunktion ausübt. ...

Die Arteriosklerose und ihre Folgeerkrankungen sind für über 50% aller Todesfälle weltweit verantwortlich. Erkrankungen wie z.B. arterielle Hypertonie, Hyperlipidämie und Diabetes mellitus sind als Risikofaktoren eindeutig belegt und etabliert. Seit Jahrzehnten bestehen kontroverse Meinungen bezüglich der Beteiligung des CRP an der Arteriosklerose. Ist es ein reiner Risikomarker ohne direkten Einfluss oder doch ein kausaler Spieler, d.h. ein Risikofaktor. Mehrere Studien bestätigten einen hohen prädiktiven Wert für zukünftige kardiovaskuläre Ereignisse bei erhöhten hsCRP-Werten im oberen Drittel des Normbereichs. Trotz Indizien konnte eine kausale Beteiligung bisher aber nicht zweifelsfrei nachgewiesen werden. So konnte CRP gemeinsam mit Komplement in den Wänden arteriosklerotischer Läsionen nachgewiesen werden. CRP ist weiterhin in der Lage Komplement zu aktivieren welches wiederum durch Freisetzung von Chemokinen zur Proliferation von SMC führen kann. Ein weiterer Hinweis für eine mögliche kausale Beteiligung des CRP an der Arteriosklerose ist seine Eigenschaft, die Schaumzellbildung aus Monozyten, durch Opsonierung des LDLs zur besseren Aufnahme, zu fördern. In dieser Arbeit wurde versucht, eine hepatische CRP-Synthese-Hemmung über den Knockdown der Proteinkinase C zu erreichen. Aufgrund der vielfältigen und noch nicht vollständig bekannten Wirkungen bzw. Interaktionen des CRPs erschien eine Hemmung der Synthese in der Leber am sinnvollsten und einfachsten durchführbar. Die Beteiligung der Proteinkinase C an der Synthese des C-reaktiven Proteins ist bekannt. Mit Hilfe der Methode der RNA-Interferenz zum Knockdown der PKC-Isoformen δ und ε sollte ihre Beteiligung am Syntheseweg eruiert und ein möglicher medikamentöser Ansatzpunkt untersucht werden. Als Zellreihe dienten HepG2-ABEK14-Zellen. Sie sind eine stabil mit einem 1kbp CRP Promotorkonstrukt und dem Luciferase Gen transfizierte Hepatoma-Zelllinie. Es zeigte sich in den Versuchen eine signifikant verminderte Aktivität der CRP-Promoter-Aktivität in HepG2-ABEK14-Zellen nach Gen-silencing der Proteinkinasen δ und ε. Dieser vielversprechende medikamentöse Ansatz muss weiter untersucht werden. Es ist bekannt, dass Thrombin in der akuten Phase vermehrt gebildet wird und evtl. eine stimulierende Wirkung auf die CRP-Synthese hat. Durch die bereits kommerziell verfügbaren Thrombininhibitoren wäre hier ein interessanter Ansatzpunkt gegeben. Nach Stimulation mit Thrombin wurde in den HepG2-ABEK14-Zellen keine signifikante Steigerung der CRP-Promoteraktivität erreicht. Eine medikamentöse Hemmung von Thrombin zur Senkung der CRP-Spiegel erscheint damit nicht sinnvoll zu sein. Es ist jedoch zu beachten, dass die Versuche an einer mit CRP-Luziferase stabil transifizierte Hepatom-Zelllinie durchgeführt wurden. Diese sind PHH in Struktur, Form, Syntheseapparat und Eigenschaften sehr ähnlich, jedoch nicht identisch. Auch bestehen Unterschiede der HepG2-ABEK14-Zellen und PHH gegenüber den Leberzellen in vivo. Es müssen weitere Studien erfolgen, die diese Unterschiede berücksichtigen.

Pannexinkanäle sind an interzellulärer Kommunikation und zellspezifischen Eigenschaften beteiligt. Die Membraninsertion artverwandter Kanäle wie der Connexine wird durch Phosphorylierung vermittelt. In der vorliegenden Arbeit wurden die für den Membraneinbau von Panx1 erforderlichen Mechanismen untersucht. Dafür wurden prospektive Stellen für Phosphorylierung und MAPK-Bindung mutiert. Mittels Patch-Clamp-Technik wurden an Wildtypzellen, N2a-Kontrollzellen und verschiedenen Transfektanen Transmembranstromdichten gemessen, um Rückschlüsse auf die Aktivität der Pannexinkanäle ziehen zu können. Die Mutationen führten zur fehlenden Expression einzelner Glykosylierungsformen sowie zu Veränderungen spannungssensitiver Domänen des Panx1-Proteins. Durch Zugabe PKA-modulierender Pharmaka waren zudem Modulationen der Membranstromdichten möglich. Für eine intakte Kanalfunktion sind vermutlich alle drei Glykosylierungsformen unverzichtbar, die Funktion scheint nicht vollkommen PKA-abhängig zu sein.