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Peroxidases (EC 1.11.1.7) are a large group of enzymes widely distributed in the plant kingdom. The present work describes a study on the isolation, purification and some features of a novel peroxidase from white Spanish broom (Cytisus multiflorus), a tree legume very abundant in the northern half of Spain and Portugal. Optimal conditions are proposed for enzyme extraction, removal of phenolic compounds and enzyme purification by consecutive hydrophobic, ion-exchange and size-exclusion chromatographies. Peroxidase from Cytisus multiflorus (CMP) was found to have a molecular weight of 49 kDa. The spectrum of CMP showed a Soret band at 403 nm with a Rz factor of 3.3. Substrate specificity and the effect of some variables on the activity of CMP with guaiacol as cosubstrate have also been investigated., This work was partially supported by project SA052A10-2, funded by Consejería de Educación de la Junta de Castilla y León (Spain).

[ES] El objetivo final de este trabajo es definir una enzima con unas características espectrales mucho mejores que las de la peroxidasa de rábano picante, capaz de sustituirla en la mayor parte de sus aplicaciones biotecnológicas. Una enzima más estable permitiría realizar los procesos más eficazmente y en mejores condiciones de pH y temperatura, lo que sería rentable y, además, beneficiosa para el Medio Ambiente., [EN] The ultimate goal of this work is to define an enzyme with spectral characteristics much better than horseradish peroxidase, capable of replacing it in most of their biotechnological applications. A more stable enzyme would make the process more efficient and better conditions of pH and temperature, which would be economical, and beneficial to the environment.

[ES] Esta tesis se plantea definir una enzima con unas características mucho mejores que las de la peroxidasa de rábano picante, capaz de sustituirla en la mayor parte de sus aplicaciones biotecnológicas. Una enzima más estable permitiría realizar los procesos más eficazmente y en mejores condiciones de pH y temperatura, lo que sería rentable y, además, beneficioso para el Medio Ambiente., [EN] This thesis to define an enzyme with characteristics far superior to those of horseradish peroxidase, capable of replacing the bulk of their biotechnological applications. A more stable enzyme would allow for more efficient processes and better conditions of pH and temperature, which would be profitable and also benefit the environment.

[ES] En el trabajo realizado se estudian diferentes aspectos de la peroxidasa de la planta de lenteja (Lens culinaris), LPP, y de la peroxidasa de escoba blanca (Cytisus multiflorus), CMP, dos de las peroxidasas más activas y estables encontradas en la búsqueda sistemática de actividad peroxidasa entre residuos agrícolas abundantes en la comunidad autónoma de Castilla y León. En el Capítulo I se ha demostrado la aplicabilidad analítica de los extractos vegetales con actividad peroxidasa, sin necesidad de aislar ni purificar la enzima. Este hecho repercute de forma drástica en la simplicidad y en el coste de las aplicaciones analíticas. En este sentido se ha utilizado el extracto crudo de la planta de lenteja para la determinación del nivel de sarcosina en orina, parámetro éste que en los últimos cinco años ha generado un cierto interés, no exento de polémica, por su aparente relación con el diagnóstico precoz del cáncer de próstata. La reacción de la peroxidasa se ha llevado a cabo utilizando como sustrato una mezcla de 4-aminoantipirina (4-AAP) y ácido 2,4,6-tribromo-3-hidroxibenzoico (TBHBA) con medida espectrofotométrica de la quinonaimina producida. Esta reacción se ha acoplado a la oxidación de sarcosina con oxígeno en presencia de sarcosina oxidasa. Como resultado de la optimización de la reacción global resultante del acoplamiento, se ha propuesto un procedimiento para la determinación de sarcosina, en concentraciones adecuadas para el diagnóstico de individuos enfermos (valores típicos entre 2x10-6 y 3x10-5 M en orina de 24 h). El procedimiento propuesto se ha aplicado satisfactoriamente al análisis de muestras de orina dopadas. Dado que la mayoría de las aplicaciones conocidas de las peroxidasas se llevan a cabo con enzimas puras, en el Capítulo II se estudia y optimiza el proceso de extracción y purificación de peroxidasas vegetales, concretamente de la peroxidasa de la planta de escoba blanca. El procedimiento propuesto consta de una primera etapa de aislamiento y concentración. A continuación se separan los compuestos fenólicos (inhibidores de la actividad peroxidasa) presentes en el extracto y finalmente se lleva a cabo un procedimiento de purificación consistente en consecutivas etapas cromatográficas de interacción hidrofóbica, intercambio iónico y exclusión molecular, obteniéndose un rendimiento final del 38%. Finalmente, puesto que la estabilidad y características cinéticas de las peroxidasas pueden ser determinantes de sus potenciales aplicaciones biotecnológicas, en el Capítulo III se lleva a cabo la caracterización de la peroxidasa de escoba blanca (CMP) obtenida y purificada según el procedimiento del capítulo precedente. Se ha encontrado que dicha peroxidasa es monomérica en disolución, con una masa molecular de 55  3 kDa, que coincide con la encontrada para otras peroxidasas vegetales. Su estructura secundaria se encuentra dominada por α-hélices. Su desnaturalización térmica, estudiada por dicroísmo circular y fluorescencia intrínseca, se ajusta al modelo de dos estados y resulta ser un proceso irreversible controlado cinéticamente con una temperatura de transición de 55±2 ºC. Al igual que otras muchas peroxidasas vegetales descritas, el ciclo catalítico de CMP sigue un mecanismo de tipo ping-pong Bi Bi y presenta inactivación por sustrato suicida. Los valores de las constantes cinéticas del proceso de inactivación, así como los números de recambio calculados sugieren que CMP presenta una mayor resistencia a la inactivación por peróxido de hidrógeno que otras peroxidasas descritas, siendo por ello una potencial alternativa comercial a la peroxidasa de rábano picante (HRP) en diferentes aplicaciones biotecnológicas.