Search

Extracellular vesicles (EVs) are cell-derived multicomponent messengers that participate in diverse intercellular communication processes regulating immune responses, cell survival and proliferation. However, EVs also play a role in disease processes like cancer. Since EVs contain biological information that reflects the status of the cell of origin, they might be used in liquid biopsies as disease biomarkers. The detection and characterization of EVs is a fundamental step towards EV-based biomarker profiling of pathological processes and is complicated due to their small size, heterogeneity and complex composition. Therefore, technological solutions that allow high throughput detection and analysis of single EVs are of utmost importance. Flow cytometry (FCM) is a promising technology for this purpose. However, traditional flow cytometers, designed for cells, lack the sensitivity for the detection of nano-sized EVs, whose signals are typically below or at the detection limit of conventional instruments. In my PhD thesis I explored the limits of flow cytometry of single EVs, provide guidance for reproducible and robust EV FCM and address the challenges of EV analysis in body fluids. First, we developed and characterized a reference material for EV research. Next, we focused on high-sensitivity FCM for the detection of EVs and I present a reporting framework developed by the ISEV-ISAC-ISTH EV Flow cytometry workgroup to increase reproducibility of results. Since fluorescence calibration of EV signals is of importance for inter-instrument and inter-lab comparisons, we provide insights into the utilization of current calibrators and show that intrinsic variations related to these calibrators compromise accurate calibration of EV signals. In addition to the fluorescence, light scatter signals also contain valuable information that it is often lost within the background noise. By using an open-architecture flow cytometer, we optimized the configuration by combining differently sized hardware components to improve light scatter-based EV detection by reducing optical background signals. Lastly, we applied these technological advancements in the field of high-sensitivity FCM to investigate interactions between biological particles, namely EVs and lipoprotein particles (LPPs), which are known to co-isolate. Liquid biopsy EV-based biomarker profiling is complicated because LPPs in blood outnumber EVs by orders of magnitude and have biophysical overlapping properties with EVs, including size and density. We here demonstrate by high-sensitivity FCM, in combination with orthogonal methods; i.e., Rayleigh and Raman scattering and cryo-electron microscopy, that EV-LPP complexes can be formed and can impact EV-analysis in blood. Overall, the findings presented in my thesis can contribute to the development of robust liquid biopsy EV biomarker profiling by FCM and shed light on the complexity of single EV analysis in body fluids, which will ultimately help to a successful clinical translation of EVs as disease biomarkers.

In het kader van de vernieuwing van het Landelijk Meetnet Luchtkwaliteit (LML) zijn per 1 april 2011 oude, uit 1992 daterende, meetopstellingen voor ozon vervangen door nieuwe. Onderdeel van deze vervanging vormt een vergelijking tussen de meetresultaten verkregen met de beide meetopstellingen. Deze is in 2009 en 2010 op 10 locaties uitgevoerd. Uit deze vergelijking blijkt dat met de nieuwe opstelling ca. 13% hogere meetwaarden worden verkregen. Het gevonden verschil zou grotendeels kunnen worden verklaard door keuze van de bij de kalibratie van de oude meetopstelling gebruikte methode (gas-fase titratie). In 1991 is vastgesteld dat bij kalibratie m.b.v. gas-fase titratie een correctie van de meetwaarden diende te worden uitgevoerd door vermenigvuldiging met 0,91. Echter, bovenstaande bevindingen zijn mogelijk slechts representatief voor de periode waarin, de locaties waar en de opstellingen waarmee de vergelijkingen hebben plaatsgevonden. Op basis van nader onderzoek is vastgesteld dat een eventueel verloop in de oude meetopstellingen geen verklaring vormt voor de gevonden verschillen. Wel is op basis van literatuuronderzoek bevestigd dat inderdaad een verschil bestaat in resultaten verkregen bij kalibratie m.b.v. gas-fase titratie en UV-fotometrie. Onderzoek van het BIPM uit 2006 toont aan dat de verhouding tussen de resultaten 0,97 bedraagt. Recent inzicht heeft derhalve geleerd dat de destijds gehanteerde factor voor correctie van resultaten van kalibraties verricht m.b.v. gas-fase titratie en UVfotometrie heeft geleid tot een onderschatting van de gemeten ozonconcentraties. Op basis hiervan is besloten de meetgegevens voor ozon van het LML uit de periode 1992 t/m 2010 te corrigeren door vermenigvuldiging met een factor 0,97 / 0,91.

In een zogeheten equivalentiestudie door het RIVM is de onzekerheidsfactor bepaald tussen de fijnstofmetingen (PM10) in het Landelijk Meetnet Luchtkwaliteit (LML) en de Europese referentiemethode. De in de equivalentiestudie bepaalde meetonzekerheid van de huidige PM10-meetinstrumenten in het meetnet bedraagt circa 17 procent. De in de Europese richtlijn vermelde maximaal toegestane onzekerheid is 25 procent. De equivalentiestudie is uitgevoerd om de kwaliteit van deze fijnstofmetingen in Nederland te waarborgen. Tevens heeft de studie geleid tot verbeteringen in de kwaliteit van de PM10-metingen in het LML. In dit rapport wordt de technische achtergrond van de gevolgde stappen en de bijbehorende resultaten nader beschreven. Het LML meet PM10 op circa veertig locaties met behulp van automatische beta-adsorptiemonitoren. Hoewel deze methode afwijkt van de voorgeschreven referentiemethode, staat de Europese regelgeving deze toe mits gelijkwaardigheid met de referentiemethode wordt aangetoond. Dat is voor de verschillende PM10-meetopstellingen in het meetnet onderzocht en aangetoond. Hierbij is onderscheid gemaakt tussen drie apparaattypen en tussen meetlocaties binnen en buiten het stedelijk gebied. Het equivalentieonderzoek is grotendeels gebaseerd op de guideline die de Europese werkgroep Clean Air For Europe (CAFE) aanbeveelt. Op een onderdeel is daarvan afgeweken. Voor dat onderdeel is een alternatieve wiskundige methode ontwikkeld, die ook in deze studie wordt gepresenteerd.

De gemeente Breda heeft geconstateerd dat de meetwaarden van fijn stof (PM10) bij de Tilburgseweg te Breda hoog zijn in vergelijking met de andere meetpunten van het Landelijk Meetnet Luchtkwaliteit (LML) van het RIVM. Dit is zichtbaar in de lijst met geconstateerde overschrijdingsdagen zoals die continu wordt bijgehouden op de website van het LML. Op verzoek van de gemeente Breda heeft de provincie Noord-Brabant de fijnstofconcentraties in de periode van augustus tot en met oktober 2006 gemeten. In de periode augustus tot en met oktober 2006 heeft het RIVM eveneens fijnstofreferentiemetingen verricht. Uit de referentiemetingen volgt dat de metingen van het RIVM en de provincie Noord-Brabant met elkaar in overeenstemming zijn. De meetresultaten van de automatische metingen zijn in overeenstemming met de in Europa geldende kwaliteitscriteria. Uit het equivalentieonderzoek dat in 2006 door het LML heeft plaatsgevonden, volgt dat het aantal gerapporteerde overschrijdingsdagen van het meetstation aan de Tilburgseweg te Breda is aangepast.

In het Landelijk Meetnet Luchtkwaliteit (LML) wordt op diverse locaties in Nederland fijnstof (PM10) concentraties gemeten. Om de kwaliteit van deze metingen te waarborgen zijn in 2006 een tweetal grote activiteiten ondernomen. Als eerste zijn de procedures, meetconfiguraties en instellingen in het meetnet grondig doorgelicht. De bevindingen van de doorlichting van het meetnet hebben geleid tot een hervalidatie. Het effect van deze hervalidatie op de metingen is gering, maar heeft wel geleid tot een vermindering van de meetonzekerheid. De tweede activiteit is het uitgevoerde equivalentieonderzoek. In dit onderzoek is de gelijkwaardigheid tussen de automatische PM10-metingen in het LML en de door de EU voorgeschreven referentiemethode aangetoond. Aan de hand van dit onderzoek is voor de PM10-metingen een nieuwe en nauwkeurigere kalibratie bepaald zodat niet langer de interim kalibratiefactor van de EU toegepast hoeft te worden. Het aantonen van de equivalentie tussen de automatische meetmethode en de referentiemeetmethode is volledig gebaseerd op de aanbevelingen die de Clean Air For Europe (CAFE) steering group begin 2006 heeft vastgesteld zodat Nederland geheel conform de Europese voorschriften werkt. In het equivalentieonderzoek zijn kalibratiefuncties voor verschillende apparaattypen voor regionale en stedelijke locaties bepaald. De consequentie voor de jaargemiddelden van regionale stations na 2003, die gebruikt zijn voor de Generieke Concentraties voor Nederland (GCN-kaarten) in 2006, is een daling van minder dan 1 mug/m3. Met de hervalidatie van meetdata en de resultaten van het equivalentieonderzoek zijn onzekerheden in de PM10-metingen verkleind en voldoen de metingen aan de gestelde kwaliteitseisen.

Background Measurement error in exposure variables is an important issue in epidemiological studies that relate exposures to health outcomes. Such studies, however, usually pay limited attention to the quantitative effects of exposure measurement error on estimated exposure-outcome associations. Therefore, the estimators for exposure-outcome associations are prone to bias. Existing methods to adjust for the bias in the associations require a validation study with multiple replicates of a reference measurement. Validation studies with multiple replicates are quite costly and therefore, in some cases only a single–replicate validation study is conducted besides the main study. For a study that does not include an internal validation study, the challenge in dealing with exposure measurement error is even bigger. The challenge is how to use external data from other similar validation studies to adjust for the bias in the exposure-outcome association. In accelerometry research, various accelerometer models have currently been developed. However, some of these new accelerometer models have not been properly validated in field situations. Despite the widely recognized measurement error in the accelerometer, some accelerometers have been used to validate other instruments, such as physical activity questionnaires, in measuring physical activity. Consequently, if an instrument is validated against the accelerometer, and the accelerometer itself has considerable measurement error, the observed validity in the instrument being validated will misrepresent the true validity. Methodology In this thesis, we adapted regression calibration to adjust for exposure measurement error for a single-replicate validation study with zero-inflated reference measurements and assessed the adequacy of the adapted method in a simulation study. For the case where there is no internal validation study, we showed how to combine external data on validity for self-report instruments with the observed questionnaire data to adjust for the bias in the associations caused by measurement error in correlated exposures. In the last part, we applied a measurement error model to assess the measurement error in physical activity as measured by an accelerometer in free-living individuals in a recently concluded validation study. Results The performance of the proposed two-part model was sensitive to the form of continuous independent variables and was minimally influenced by the correlation between the probability of a non-zero response and the actual non-zero response values. Reducing the number of covariates in the model seemed beneficial, but was not critical in large-sample studies. We showed that if the confounder is strongly linked with the outcome, measurement error in the confounder can be more influential than measurement error in the exposure in causing the bias in the exposure-outcome association, and that the bias can be in any direction. We further showed that when accelerometers are used to monitor the level of physical activity in free-living individuals, the mean level of physical activity would be underestimated, the associations between physical activity and health outcomes would be biased, and there would be loss of statistical power to detect associations. Conclusion The following remarks were made from the work in this thesis. First, when only a single-replicate validation study with zero-inflated reference measurements is available, a correctly specified regression calibration can be used to adjust for the bias in the exposure-outcome associations. The performance of the proposed calibration model is influenced more by the assumption made on the form of the continuous covariates than the form of the response distribution. Second, in the absence of an internal validation study, carefully extracted validation data that is transportable to the main study can be used to adjust for the bias in the associations. The proposed method is also useful in conducting sensitivity analyses on the effect of measurement errors. Lastly, when “reference” instruments are themselves marred by substantial bias, the effect of measurement error in an instrument being validated can be seriously underestimated.

Background Measurement error in exposure variables is an important issue in epidemiological studies that relate exposures to health outcomes. Such studies, however, usually pay limited attention to the quantitative effects of exposure measurement error on estimated exposure-outcome associations. Therefore, the estimators for exposure-outcome associations are prone to bias. Existing methods to adjust for the bias in the associations require a validation study with multiple replicates of a reference measurement. Validation studies with multiple replicates are quite costly and therefore, in some cases only a single–replicate validation study is conducted besides the main study. For a study that does not include an internal validation study, the challenge in dealing with exposure measurement error is even bigger. The challenge is how to use external data from other similar validation studies to adjust for the bias in the exposure-outcome association. In accelerometry research, various accelerometer models have currently been developed. However, some of these new accelerometer models have not been properly validated in field situations. Despite the widely recognized measurement error in the accelerometer, some accelerometers have been used to validate other instruments, such as physical activity questionnaires, in measuring physical activity. Consequently, if an instrument is validated against the accelerometer, and the accelerometer itself has considerable measurement error, the observed validity in the instrument being validated will misrepresent the true validity. Methodology In this thesis, we adapted regression calibration to adjust for exposure measurement error for a single-replicate validation study with zero-inflated reference measurements and assessed the adequacy of the adapted method in a simulation study. For the case where there is no internal validation study, we showed how to combine external data on validity for self-report instruments with the observed questionnaire data to adjust for the bias in the associations caused by measurement error in correlated exposures. In the last part, we applied a measurement error model to assess the measurement error in physical activity as measured by an accelerometer in free-living individuals in a recently concluded validation study. Results The performance of the proposed two-part model was sensitive to the form of continuous independent variables and was minimally influenced by the correlation between the probability of a non-zero response and the actual non-zero response values. Reducing the number of covariates in the model seemed beneficial, but was not critical in large-sample studies. We showed that if the confounder is strongly linked with the outcome, measurement error in the confounder can be more influential than measurement error in the exposure in causing the bias in the exposure-outcome association, and that the bias can be in any direction. We further showed that when accelerometers are used to monitor the level of physical activity in free-living individuals, the mean level of physical activity would be underestimated, the associations between physical activity and health outcomes would be biased, and there would be loss of statistical power to detect associations. Conclusion The following remarks were made from the work in this thesis. First, when only a single-replicate validation study with zero-inflated reference measurements is available, a correctly specified regression calibration can be used to adjust for the bias in the exposure-outcome associations. The performance of the proposed calibration model is influenced more by the assumption made on the form of the continuous covariates than the form of the response distribution. Second, in the absence of an internal validation study, carefully extracted validation data that is transportable to the main study can be used to adjust for the bias in the associations. The proposed method is also useful in conducting sensitivity analyses on the effect of measurement errors. Lastly, when “reference” instruments are themselves marred by substantial bias, the effect of measurement error in an instrument being validated can be seriously underestimated.

Bij de laatste validatie van het Landelijk KRW-Verkenner Model (Cleij et al. 2014) is gebleken dat de concentraties voor N-totaal en P-totaal vaak matig tot slecht voorspeld worden. Eén van de manieren om de voorspellende waarde van een model te verhogen is kalibratie. Het LKM is echter modelparameter-arm, en de enige 'knoppen', waaraan wat betreft modelparameters gedraaid kan worden zijn de parameters van het eerste-orde afbraak proces voor -totaal en -totaal de a raakconstante ij en de temperatuurco ici nt De tot nu toe gebruikte retentieparameters zijn afkomstig van een vertaling van de retentieparameters van het KRW-ECHO systeem naar de retentieparameters voor de KRWVerkenner (Roovaart et al. 2012). Het in dit rapport beschreven onderzoek is via kalibratie gezocht naar een nieuwe set retentieparameters voor N-totaal en P-totaal, uitgaande van de tot nu toe gehanteerde parameterwaarden met als doel het voorspellend vermogen van het LKM op dit punt te verbeteren.

Bij de laatste validatie van het Landelijk KRW-Verkenner Model (Cleij et al. 2014) is gebleken dat de concentraties voor N-totaal en P-totaal vaak matig tot slecht voorspeld worden. Eén van de manieren om de voorspellende waarde van een model te verhogen is kalibratie. Het LKM is echter modelparameter-arm, en de enige 'knoppen', waaraan wat betreft modelparameters gedraaid kan worden zijn de parameters van het eerste-orde afbraak proces voor -totaal en -totaal de a raakconstante ij en de temperatuurco ici nt De tot nu toe gebruikte retentieparameters zijn afkomstig van een vertaling van de retentieparameters van het KRW-ECHO systeem naar de retentieparameters voor de KRWVerkenner (Roovaart et al. 2012). Het in dit rapport beschreven onderzoek is via kalibratie gezocht naar een nieuwe set retentieparameters voor N-totaal en P-totaal, uitgaande van de tot nu toe gehanteerde parameterwaarden met als doel het voorspellend vermogen van het LKM op dit punt te verbeteren.