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BACKGROUND AND OBJECTIVES: Musculoskeletal disorders and acute and chronic pain are the main causes of disability. Acupuncture is a safe and well-tolerated treatment, and the understanding of the physiological basis of its effectiveness in the management of acute and chronic painful conditions is growing. The objective of this study was to describe the main components of the purinergic system involved in the acupuncture-mediated analgesia. CONTENTS: Review the literature relevant to the terms “acupuncture”, “purinergic system”, “purines”, “pain” and “analgesia” found on the Pubmed platform. CONCLUSION: Several previous studies have shown relevant roles of purines and their derivatives on acupuncture-mediated analgesia, displaying promising results in the knowledge of the potential biological benefits of acupuncture. New experimental and clinical studies are warranted to further investigate the purinergic mechanisms involved in the acupuncture-mediated analgesia, addressing potential therapeutic benefits of acupuncture in different clinical settings. RESUMO JUSTIFICATIVA E OBJETIVOS: Os distúrbios musculoesqueléticos e a dor aguda e crônica são as principais causas de incapacidade. A acupuntura é um tratamento seguro e bem tolerado, e o entendimento sobre a base fisiológica de sua eficácia para o tratamento de quadros dolorosos agudos e crônicos está crescendo. O objetivo deste estudo foi descrever os principais componentes do sistema purinérgico envolvidos na analgesia mediada pela acupuntura. CONTEÚDO: Revisar a literatura pertinente aos temas “acupuntura”, “sistema purinérgico”, “purinas”, “dor” e “analgesia” encontrados na plataforma Pubmed. CONCLUSÃO: Diversos estudos prévios têm evidenciado efeitos relevantes das purinas e seus derivados na analgesia mediada pela acupuntura, demonstrando resultados promissores no conhecimento dos potenciais benefícios biológicos da acupuntura. A ampliação da investigação dos mecanismos purinérgicos envolvidos na acupuntura deverá ser garantida por meio de novos estudos experimentais e clínicos, abordando potenciais benefícios terapêuticos da acupuntura em diversos cenários clínicos.

"El cultivo del tomate es uno de los más importantes a nivel mundial y nacional. Sin embargo, su producción es afectada por el marchitamiento vascular causado por el hongo Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici. Para controlarlo se utilizan productos químicos, lo que trae consigo resistencia hacia los ingredientes activos por parte de los microorganismos; debido a esto se buscan alternativas como los extractos vegetales los cuales para mejorar su efectividad se formulan en nano y microencapsulados (NPs) con biopolímeros. En el presente trabajo se identificaron fitoquímicos en extractos de Lippia graveolens y Viscum album, se determinó la actividad antifúngica de estos por el método de medio envenenado, se produjeron NPs cargados con los extractos vegetales, y se estudió su efectividad biológica sobre F. oxysporum f. sp. lycopersici así como su capacidad para inducir la activación de enzimas asociadas a mecanismos de defensa en plantas de tomate. Se identificaron fitoquímicos de familias como los taninos, alcaloides, saponinas, azúcares reductores, purinas, flavonoides, ácidos hidroxicinámicos, estilbenos, catequinas y ácidos metoxicinamicos; en cuanto a la actividad antifúngica ambos extractos presentaron inhibición del 100 % a 200 mg/L; con relación a la concentración inhibitoria al 50 % (CI50) L. graveolens presentó 64. 68 mg/L y V. album 71.61 mg/L; finalmente se observó la capacidad de mejorar el desarrollo morfométrico en las plantas por parte de los NPs de extractos vegetales, así como la capacidad de aumentar la actividad de enzimas asociadas mecanismos de defensa en las plantas como fenilalanina amonio liasa (PAL), peroxidasa (POD) y superóxido dismutasa (SOD), en distintos tiempos." "The tomato crop is one of the most important worldwide and national. Nevertheless, its production is affected by vascular wilt caused by the fungus Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici. Chemical products are used to control it, which provoke resistance to active ingredients by phytopathogenic microorganisms; due to this, have been proposed alternatives as plant extracts, which to improve their effectiveness are formulated in Nano and Micro encapsulates (NPs) with biopolymers. In the present work, phytochemicals were identified in extracts of Lippia graveolens and Viscum album, their antifungal activity was determined by the poisoned medium method, NPs loaded with plant extracts were produced, and their biological effectiveness was studied on F. oxysporum f. sp. lycopersici as well as its ability to induce the activation of enzymes associated with defense mechanisms in tomato plants. Phytochemicals from families such as tannins, alkaloids, saponins, reducing sugars, purines, flavonoids, hydroxycinnamic acids, stilbenes, catechins, and methoxycinnamic acids were identified; regarding antifungal activity, both extracts showed 100% inhibition at 200 mg / L; in relation to the 50% inhibitory concentration (IC50) L. graveolens presented 64. 68 mg / L and V. album 71.61 mg / L; Finally, the ability to improve morphometric development in plants by NPs from plant extracts was observed, as well as the ability to increase the activity of enzymes associated with defense mechanisms in plants such as phenylalanine ammonium lyase (PAL), persoxidase (POD) and superoxide dismutase (SOD), at different times."

Actualizar al lector en los trastornos hereditarios del metabolismo de pirimidinas y las purinas relacionadas con discapacidad intelectual. Materiales y métodos: Se analizó la literatura disponible de los últimos 60 años en las bases de datos BBCS-LILACS, PubMed, IB-PsycINFO, IB-SSCI, IB-SciELO, Scopus y Science Direct. Se seleccionaron 51 referencias, con base en la calidad de la evidencia presentada por las mismas. Resultados: Se obtuvo información pertinente relacionada con los objetivos propuestos en la presente revisión, por lo cual puede clasificarse en dos secciones a saber: alteraciones del metabolismo de las pirimidinas asociadas a retardo mental, alteraciones del metabolismo de las purinas asociadas a retardo mental. Conclusión: Los trastornos hereditarios del metabolismo de las purinas y pirimidinas son un grupo creciente de enfermedades, con las cuales el personal de la salud debe familiarizarse ante la necesidad de un abordaje clínico y de laboratorio específicos. Se hace necesario buscar la posible relación con este tipo de enfermedades en los pacientes que presenten retardo mental, con miras a ofrecer asesoría genética que beneficie a las familias de los pacientes que las sufren. To update the reader on inherited disorders of pyrimidine and purine metabolism related to intellectual disability. Materials and methods: literature available from the past 60 years from BBCs-LILACS, PubMed, IB-PsycINFO, IB-FSS, IB-SciELO, Scopus, and Science Direct databases was analyzed, and 51 references were selected based on the quality of the evidence presented. Results: Relevant information related to the objectives proposed in this review was obtained, and therefore, it can be classified into two sections specifically: alterations in the metabolism of pyrimidines associated with mental retardation, alterations in the metabolism of purines related to mental retardation. Conclusion: Hereditary disorders of purines and pyrimidine metabolism are a growing group of diseases. Health personnel must become familiar to face the need for a specific clinical and laboratory approach. It is necessary to look for the possible relationship of this type of disease in patients with mental retardation, looking to offer genetic counseling that benefits the families of patients who suffer.

With an irregular rainfall, ruminant production in extensive systems based on native pasture in the semi-arid northeastern region is affected by long periods of quantitative feed restriction, which impacts the performance and carcass traits, affecting the commercialization of their products. This study aimed to evaluate the effects of different levels of feed restriction on the performance, nutrient digestibility, purine derivative (PD), physicochemical properties and fatty acid (FA) profile of crossbred lamb meat. Thirty Dorper x Santa Ines intact, male, lambs (31 ± 1.28 kg initial body weight (BW) and 4 months of age) were distributed in a completely randomized design and were subjected to three levels of feed restriction (0, 30 and 60% dry matter (DM)) for 84 days. The DM, organic matter, crude protein, neutral detergent fiber and total carbohydrate digestibility were higher in animals subjected to 60% DM feed restriction. The microbial crude protein (MCP) synthesis efficiency was highest for animals subjected to 60% DM feed restriction. The average daily gain decreased from 192.2 to -31.0 g/day with increasing levels of feed restriction. Meat fat content was lower in animals under 60% feed restriction. The pH decreased from 5.72 to 5.57 with increasing feed restriction. Animals under 60% DM feed restriction had increased concentrations of saturated FA, C14:0, n6:n3 and thrombogenicity index in meat; however, this level of feed restriction resulted in higher levels of monounsaturated and polyunsaturated FA. In conclusion, lambs subjected to feed restriction at 60% DM showed greater DM digestibility and MCP. Meat of lambs subjected to 60% DM feed restriction had higher contents of C12:0, C14:0, and C16:0, which are considered less beneficial for consumers’ health. Com uma irregularidade pluviométrica, a produção de ruminantes em sistemas extensivos baseados em pastagens nativa no semiárido nordestino é afetada por longos períodos de restrição alimentar quantitativa o que impacta no desempenho e características de carcaças, afetando a comercialização dos seus produtos. Objetivou-se com esse estudo avaliar os efeitos de diferentes níveis de restrição alimentar sobre o desempenho, digestibilidade de nutrientes, derivados de purinas (DP), características físico-químicas e perfil de ácidos graxos (AG) da carne de cordeiros Dorper x Santa Inês. Trinta cordeiros machos, inteiros, Dorper x Santa Inês (31 ± 1,28 kg de peso corporal inicial e quatro meses de idade) foram distribuídos em um delineamento inteiramente casualizado em três níveis de restrição alimentar (0, 30 e 60% na matéria seca (MS)) por 84 dias. A digestibilidade da MS, matéria orgânica, proteína bruta, fibra em detergente neutro e carboidratos totais apresentaram maiores valores para os animais em restrição alimentar de 60% MS. A eficiência de síntese de proteína bruta microbiana (ESPBmic) foi maior para os animais em restrição alimentar de 60% MS. Conforme aumentou o nível de restrição alimentar, o ganho médio diário dos cordeiros reduziu de 192,2 para -31,0 g/dia. A gordura da carne apresentou menor concentração nos animais em restrição alimentar de 60% MS. O pH diminuiu de 5,72 para 5,57 conforme houve aumento do nível de restrição alimentar. A carne dos animais alimentados em nível de restrição alimentar de 60% MS apresentaram maiores concentrações de AG saturados, AG monoinsaturados, AG polinsaturados, C14:0, n6:n3 e índice de trombogenicidade. Em conclusão, cordeiros submetidos à restrição alimentar de 60% MS apresentaram maior digestibilidade de nutrientes e ESPBmic, do mesmo modo que a carne desses animais apresentaram maiores teores de C12:0, C14:0 e C16:0, que são AG considerados menos benéficos para a saúde dos consumidores.

La finalidad del presente proyecto de intervención fue la elaboración de una guía alimentaria para personas argentinas que cuenten con factores de riesgo (FR) para el desarrollo de hiperuricemia (HU) y/o que hayan sido diagnosticadas con HU. El propósito de la guía es que adquieran una herramienta comprensible y útil que les permita adoptar hábitos alimentarios adecuados, promoviendo una mejora en la calidad de vida. La guía también servirá como un recurso para que los licenciados en nutrición y médicos nutricionistas puedan realizar educación alimentaria y nutricional. La herramienta se confeccionó a partir de la consulta de bibliografía actualizada que permite abordar los diversos conocimientos científicos, generando así un recurso que cuenta con ilustraciones y textos. La importancia de crear la guía radicó en que la prevalencia de HU se encuentra en aumento a nivel mundial, siendo una de las causas el cambio del patrón alimentario y el consecuente desarrollo de enfermedades crónicas no transmisibles. Además, no se encontró hasta el momento en nuestro país una guía o un consenso para la prevención y el tratamiento nutricional a seguir., Facultad de Ciencias Médicas

La adecuada utilización de purines provenientes de los establecimien¬tos lecheros resulta una fuente de nutrientes con potencial fertilizante (Charlón et al., 2006). Las actuales exigencias de manejo de purines a los productores de la provincia de Buenos Aires llevan a planificar su aplicación en los lotes de producción. El objetivo del siguiente tra¬bajo fue evaluar el rendimiento de la secuencia de cultivos maíz para silo - ryegrass y monitorear las propiedades químicas en el suelo bajo diferentes dosis de purines. Estación Experimental Agropecuaria General Villegas Fil: Lopez Seco, Emilia. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria (INTA). Estación Experimental Agropecuaria General Villegas. Agencia de Extensión Rural Lincoln; Argentina Fil: Otero, Alicia. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria (INTA). Estación Experimental Agropecuaria General Villegas; Argentina Fil: Barraco, Mirian. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria (INTA). Estación Experimental Agropecuaria General Villegas; Argentina Fil: Cañada, Pablo. Asociación Argentina de Consorcios Regionales de Experimentación Agrícola (AACREA). Unidad de Investigación y Desarrollo; Argentina

ANII: POS_NAC_2015_1_109757

Orientador: Fabíola Taufic Mónica Iglesias Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas Resumo: Introdução: O pênis é formado por três cilindros, sendo dois cilindros cavernosos e um esponjoso. O corpo esponjoso circunda a uretra peniana e forma a glande na porção distal, enquanto os corpos cavernosos são formados por múltiplos sinusóides, compostos de endotélio e músculo liso. Com relação à fisiologia da ereção peniana, quando o músculo liso se encontra contraído, o pênis permanece em seu estado flácido. Com o estímulo sexual, o óxido nítrico (NO) é liberado de fibras nervosas não-adrenérgicas não-colinérgicas e da camada endotelial, o que resulta em acúmulo de guanosina monofosfato cíclico (GMPc), com relaxamento da musculatura lisa vascular e sinusoidal levando à ereção. À medida que o GMPc é hidrolisado pelas fosfodiesterases ou bombeado para o meio extracelular este processo é revertido. As purinas derivadas de guanina, dentre elas guanosina trifosfato (GTP), guanosina difosfato (GDP), guanosina monofosfato (GMP) e guanosina demonstraram exercer efeitos extracelulares, embora menos conhecidos quando comparados aos efeitos dos nucleotídeos/nucleosídeos derivados de adenina. Com relação à guanosina, tem sido atribuído a ela efeitos neuroprotetores e antiagregantes. Uma vez que os nucleotídeos GTP e GMPc foram detectados no meio extracelular e sua hidrólise leva à formação de produtos intermediários, dentre eles a guanosina, nosso trabalho tem como objetivo caracterizar farmacologicamente o efeito da guanosina, além de avaliar o efeito dos nucleotídeos derivados de guanina (GTP, GDP, GMPc e GMP) em corpo cavernoso isolado de camundongo. Metodologia: Camundongos machos, da linhagem C57BL6/J foram utilizados. Curvas concentração-resposta aos nucleotídeos e ao nucleosídeo (guanosina) foram realizadas na ausência e na presença de antagonistas de receptores de adenosina, de inibidores da sintase de óxido nítrico, da guanilato ciclase solúvel e da fosfodiesterase tipo 5. A quantificação intracelular dos nucleotídeos cíclicos, AMPc e GMPc foi determinada em corpo cavernoso estimulado com guanosina. Camundongos foram tratados por via intraperitoneal com guanosina (16 mg/kg, 2x dia, 7 dias) e o relaxamento induzido pela acetilcolina e pelo doador de NO, nitroprussiato de sódio foi avaliado. Os dados foram expressos como média ± desvio padrão. Resultados: Os nucleotídeos derivados de guanina produziram relaxamento dependente de concentração (GTP: 52,8 ± 13,4%; GDP: 45,9 ± 15,4; GMPc: 40,1 ± 16,7; GMP: 35,7 ± 19,6). A guanosina relaxou o corpo cavernoso de camundongos, de maneira concentração-dependente, levando a um relaxamento máximo de 89,1 ± 19,7 %, sendo mais eficaz em promover tal relaxamento do que os nucleotídeos GTP, GDP, GMP e GMPc. Os antagonistas A2A (ZM 241385) e A2B (MRS 1754) dos receptores de adenosina não interferiram no relaxamento induzido pela guanosina bem como nenhum aumento intracelular de AMPc foi observado em tecidos estimulados com guanosina. O L-NAME, um inibidor da sintase do óxido nítrico, não interferiu nos parâmetros farmacológicos da guanosina, entretanto, o inibidor da guanilato ciclase solúvel, ODQ, demonstrou reduzi-la significativamente de 89,9 ± 10,1 para 50,7 ± 16,4 %. O inibidor de PDE-5, tadalafil, por sua vez, potencializou o relaxamento induzido pela guanosina de 70,9 ± 30,2 para 91,6 ± 15,2 %. Ainda, foi realizada curva de relaxamento ao tadalafil na ausência e na presença de guanosina e um deslocamento de 6,6 vezes para a esquerda foi observado. Além disso, os níveis de GMPc aumentaram significativamente quando os tecidos foram estimulados com guanosina (1 mM). O oxipurinol, um inibidor da xantina oxidase, não interferiu no relaxamento induzido pela guanosina. O tratamento com guanosina potencializou o relaxamento induzido pela acetilcolina. Conclusão: Este é o primeiro trabalho que mostra o relaxamento induzido pela guanosina em corpo cavernoso de camundongo, mostrando que assim como observado em plaquetas e no sistema nervoso central, a guanosina, possui atividade fisiológica, sendo o relaxamento, no caso do corpo cavernoso, dependente do acúmulo de GMPc Abstract: Introduction: The penis is formed by three cylinders, being two cavernous cylinders and one spongiosum. The corpus spongiosum surrounds the penile urethra and forms the glans in the distal portion, while the corpora cavernosa is formed by multiple sinusoids, composed of endothelium and smooth muscle. Regarding the physiology of penile erection, when the smooth muscle is contracted, the penis remains in its flaccid state. With sexual stimulation, nitric oxide (NO) is released from non-adrenergic non-cholinergic nerve fibers and the endothelial layer, resulting in accumulation of cyclic guanosine monophosphate (cGMP), with relaxation of smooth vascular and sinusoidal muscles leading to erection. As the cGMP is hydrolyzed by the phosphodiesterases or extruded into the extracellular medium this process is reversed. Purines derived from guanine, among them guanosine triphosphate (GTP), guanosine diphosphate (GDP), guanosine monophosphate (GMP) and guanosine have been shown to exert extracellular effects, although less known when compared to the effects of nucleotides/ nucleosides derived from adenine. Regarding guanosine, neuroprotective and antiaggregant effects have been attributed to it. Since the GTP and cGMP nucleotides were detected in the extracellular medium and their hydrolysis leads to the formation of intermediate products, among them guanosine, our work aims to pharmacologically characterize the effect of guanosine, in addition to evaluating the effect of guanine-derived nucleotides (GTP, GDP, cGMP and GMP) on the corpus cavernosum from mice. Methodology: Male mice of the C57BL6/J lineage were used. Nucleotide and nucleoside (guanosine) concentration-response curves were performed in the absence and presence of adenosine receptor antagonists, nitric oxide synthase inhibitors, soluble guanylate cyclase and phosphodiesterase type 5. Intracellular quantification of cyclic nucleotides, cAMP and cGMP were determined in guanosine-stimulated corpus cavernosum. Mice were treated intraperitoneally with guanosine (16 mg/kg, twice a day, 7 days) and the relaxation induced by acetylcholine and the donor of NO, sodium nitroprusside was evaluated. Data were expressed as mean ± standard deviation. Results: The guanine-derived nucleotides produced concentration dependent relaxation (GTP: 52.8 ± 13.4%, GDP: 45.9 ± 15.4, cGMP: 40.1 ± 16.7, GMP: 35.7 ± 19, 6). Guanosine relaxed the corpus cavernosum from mice in a concentration-dependent manner, leading to maximum relaxation of 89.1 ± 19.7 %, being more effective in promoting relaxation than the GTP, GDP, GMP and cGMP nucleotides. Adenosine A2A (ZM 241385) and A2B (MRS 1754) antagonists did not interfere with guanosine-induced relaxation as well as the intracellular increase of cAMP wasn't observed in guanosine-stimulated tissues. L-NAME, a nitric oxide synthase inhibitor, did not interfere with the pharmacological parameters of guanosine, however, the soluble guanylate cyclase inhibitor, ODQ, has been shown to significantly reduce it from 89.9 ± 10.1 to 50.7 ± 16.4 %. The PDE-5 inhibitor, tadalafil, in turn, potentiated the guanosine-induced relaxation from 70.9 ± 30.2 to 91.6 ± 15.2 %. Also, a relaxation curve was performed on tadalafil in the absence and presence of guanosine and a shift of 6.6 times to the left was observed. In addition, cGMP levels increased significantly when tissues were stimulated with guanosine (1 mM). Oxypurinol, a xanthine oxidase inhibitor, did not interfere with guanosine-induced relaxation. Guanosine treatment potentiated the acetylcholine-induced relaxation. Conclusion: This is the first study to show guanosine-induced relaxation in the corpus cavernosum from mice, showing that as observed in platelets and in the central nervous system, guanosine has physiological activity, being the relaxation, in the case of the corpus cavernosum, dependent on the accumulation of cGMP Mestrado Farmacologia Mestra em Farmacologia CAPES 001 CNPQ 167319/2018-3

Submitted by Milca Rachel da Costa Ribeiro Lins (milca.biomed@gmail.com) on 2019-08-21T12:57:19Z No. of bitstreams: 2 TESE corrigida - MILCA RACHEL COSTA RIBEIRO LINS CORRIGIDA 20 agosto 2019-1.pdf: 6454312 bytes, checksum: b84f4bea64ff004b9ebee688ebe8763f (MD5) TESE corrigida PARCIAL- MILCA.pdf: 1190674 bytes, checksum: 95e65a46456942c530e25252a843bb81 (MD5) Approved for entry into archive by Maria Irani Coito (irani@fcfar.unesp.br) on 2019-08-21T13:38:40Z (GMT) No. of bitstreams: 1 lins_mrcr_dr_arafcf_par.pdf: 1571807 bytes, checksum: a638dbb10c4e63e0a7150406a8dd4940 (MD5) Made available in DSpace on 2019-08-21T13:38:40Z (GMT). No. of bitstreams: 1 lins_mrcr_dr_arafcf_par.pdf: 1571807 bytes, checksum: a638dbb10c4e63e0a7150406a8dd4940 (MD5) Previous issue date: 2019-07-25 Deutscher Akademischer Austauschdienst (DAAD) Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) As técnicas mais usadas atualmente para alterar o fluxo metabólico por uma determinada via são a deleção e/ou inserção de sequências regulatórias ou genes no cromossomo bacteriano. Estes são métodos que alteram permanentemente a via metabólica em questão, perturbando o balanço metabólico durante a fase lag de crescimento, o que muitas vezes leva a um excessivo prolongamento desta fase além de diminuir a viabilidade celular. O metabolismo de purinas em Bacillus subtilis tem grande potencial para manipulação genética e produz metabólitos com valor biotecnológico. Cinco riboswitches (purE, xpt, nupG, pbuE e pbuG) controlam o metabolismo de purina em B. subtilis promovendo a terminação precoce da transcrição em ligação com guanina ou adenina. O GTP gerado nesta via é utilizado na biossíntese da vitamina B2 (riboflavina), apresentando o mesmo mecanismo de regulação com riboswitch de flavina-monofosfato (ribDG). Neste estudo, um novo modelo de controle de metabolismo de purina foi construído visando o aumento reversível do fluxo de carbono pela via em B. subtilis utilizando pequenos RNAs não-codificadores sintéticos (sRNAs). Estes foram desenhados e sintetizados para interferir na regulação da expressão gênica realizada pelos riboswitches, mantendo assim a via biossintética ativa. Os riboswitches foram caracterizados por uma nova metodologia in vitro na presença dos ligantes guanina, adenina ou FMN, e nas células de B. subtilis, sendo possível constatar o papel regulador sobre o operon da bioluminescência luxABCDE. Os sRNAs sintéticos foram desenhados no software Ribomaker para interferir na estrutura secundária dos riboswitches e, após simulações in silico da interação intermolecular riboswitch-sRNA, a funcionalidade dos sRNAs também foi ensaiada in vitro. B. subtilis reprogramado com os sRNAs desenhados contra os riboswitches purE, pbuE e ridDG foram capazes de neutralizar o efeito riborregulador comparado aos controles, após análises de bioluminescência e fluorescência em leitor de microplacas. A inserção da sequência RiboJ à extremidade 5’ UTR do sRNA(purE) proporcionou ótimas características a B. subtilis para ser utilizada como uma linhagem industrial, por exemplo, fase lag diminuída e crescimento populacional maior. Foi possível modelar exemplarmente o bem estudado metabolismo de purinas nesta bactéria amplamente utilizada pela indústria biotecnológica, e demonstrar que a tecnologia sRNA é realmente adequada para a engenharia metabólica de cepas microbianas produtoras de produtos biotecnológicos. A vantagem deste conceito inovador de controle é que a expressão do gene pode ser tanto ligada como desligada conforme necessário. O novo conceito é amplamente aplicável e pode ser um elemento inovador no portfólio da moderna biologia sintética. The currently employed tools to redirect metabolic flux through a specific pathway are deletion and/or insertion of regulatory sequences or genes in the bacterial chromosome. These methods permanently modify the pathway perturbing the metabolic balance during the lag growth phase, which generally extends this process and also decreases cell viability. The purine metabolism in Bacillus subtilis has great potential for genetic manipulation and produces value-added biotechnological products. Five riboswitches (purE, xpt, nupG, pbuE and pbuG) control the purine metabolism in B. subtilis by promoting the premature transcription termination guided by guanine or adenine levels in the cell. The GTP generated in this pathway is used in the biosynthesis of vitamin B2 (riboflavin), which is regulated by a flavin-monophosphate riboswitch (ribDG). In this study, a new metabolism control model was developed aiming to reversibly increase the carbon flux through selected pathways employing small synthetic non-coding RNAs (sRNAs). These sRNAs were designed and synthesized to interfere with the regulation of gene expression performed by the riboswitches, thus maintaining the biosynthetic pathways active. The riboswitches were characterized by a new in vitro methodology in the presence of the ligands: guanine, adenine or FMN. The riboswitches were characterized in B. subtilis cells using the luxABCDE bioluminescence operon as reporter. Synthetic sRNAs were designed in the Ribomaker software to interfere with the secondary structure of the riboswitches and, following in silico simulations of the intermolecular riboswitch-sRNA interaction, sRNA functionality was also assayed in vitro. B. subtilis reprogrammed with the sRNAs designed against the purE, pbuE and ridDG riboswitches were able to neutralize the riboregulatory effect comparing to the controls. Insertion of the RiboJ sequence to the 5' UTR site of the sRNA(purE) provided excellent features to B. subtilis as an industrial strain, as shorter growth lag phase and increased population density. It was possible to exemplarily model the well-studied purine metabolism in this bacteria which is widely used by the biotechnology industry and to demonstrate that sRNA technology is actually suitable for the metabolic engineering of producing strains. The advantage of this novel control concept is that gene expression can be either turned ON or OFF as needed. The new concept is widely applicable and may be an innovative element in the portfolio of modern synthetic biology. FAPESP: 2014/17564-7 CNPq e DAAD: 290110/2017-3 CAPES: não consta

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES Mitochondrial dysfunction is associated with a wide variety of degenerative and metabolic diseases, cancer and aging. All these clinical manifestations result from problems in the mitochondria in playing their central role of bioenergetics in cellular biology. Mitochondrial bioenergetics and redox status are also determined by intracellular levels of calcium (Ca 2+ ). The Ca 2+ mitochondrial regulates the energy metabolism, however in high concentrations, stimulates the cell death pathways through the mitochondria. Mitochondria are sensitive to changes in the physiological state of the cells and appear to play a critical role in secondary injury that occurs after traumatic brain injury (TBI). Therapeutic agents with neuroprotective properties may help in the understanding of disorders related to mitochondrial dysfunctions and allow new perspectives for their application. In this context, the nucleoside guanosine, an endogenous molecule member of the purinergic system, has been studied in different experimental models, since it demonstrates a neuroprotective effect due to modulation of the glutamatergic system and maintenance of the redox system. Thus, the present thesis aimed to evaluate guanosine effects on changes in mitochondrial bioenergetic functionality in rats, through an in vitro study against calcium-induced damage, and in vivo, against damage caused by mild TBI. The results presented in the in vitro study showed that guanosine presented a protective effect against mitochondrial dysfunction induced by Ca 2+ imbalance, since it reduced mitochondrial swelling in the presence of Ca 2+ , decreased levels of reactive oxygen species (ROS), hydrogen peroxide (H2O2), increased the activity of the enzyme Mn- superoxide dismutase, oxidative phosphorylation and tricarboxylic acid cycle activity. Our findings from in vivo study showed that a single dose of guanosine injected intraperitoneally 2 hours after a mild TBI in rats increased oxidative phosphorylation, the electron transport system in the presence of a uncoupler and the ratio of respiratory control in the cortex and hippocampus, evaluated through high-resolution respirometry. Guanosine also protected against locomotor, exploratory and short-term memory deficits induced by the TBI 24 hours after the injury. Thus, we demonstrate that guanosine has a protective effect in reducing Ca 2+ - induced mitochondrial damage and that these effects were not associated with its direct antioxidant properties per se or stabilization of the mitochondrial membrane potential. It can be considered as a strategy to protect against neurological damage in pathologies associated with the central nervous system as well as in mitochondrial disorders, making this molecule a therapeutic attraction for the treatment of TBI. A disfunção mitocondrial é associada a uma grande variedade de doenças degenerativas e metabólicas, câncer e envelhecimento. Todas essas manifestações clínicas resultam de problemas na mitocôndria em desempenhar seu papel central da bioenergética na biologia celular. A bioenergética mitocondrial e o estado redox também são determinados pelos níveis intracelulares de cálcio (Ca 2+ ). O Ca 2+ mitocondrial regula o metabolismo energético, entretanto em altas concentrações, estimula as vias de morte celular através das mitocôndrias. As mitocôndrias são sensíveis a alterações no estado fisiológico das células e parecem desempenhar um papel crítico na lesão secundária que ocorre após o traumatismo crânio encefálico (TCE). O estudo de agentes terapêuticos, com propriedades neuroprotetoras podem auxiliar na compreensão de desordens relacionadas a disfunções mitocondriais e permitir novas perspectivas para sua aplicação. Nesse contexto, o nucleosídeo guanosina, uma molécula endógena membro do sistema purinérgico, têm sido estudada em diferentes modelos experimentais, por demonstrar um efeito neuroprotetor devido à modulação do sistema glutamatérgico e manutenção do sistema redox. Sendo assim, a presente tese teve como objetivos avaliar os efeitos da guanosina sobre alterações na funcionalidade e bioenergética mitocondrial em ratos, através de um estudo in vitro frente a um dano induzido pelo cálcio, e in vivo, frente a um dano causado pelo TCE leve. Os resultados aqui apresentados do estudo in vitro, mostraram que a guanosina apresentou um efeito protetor contra a disfunção mitocondrial induzida pelo desequilíbrio de Ca 2+ , uma vez que ela reduziu o inchaço mitocondrial na presença de Ca 2+ , diminuiu os níveis de espécies reativas de oxigênio (EROs), peróxido de hidrogênio (H2O2), aumentou a atividade da enzima superóxido dismutase-Mn, fosforilação oxidativa e a atividade do ciclo do ácido tricarboxílico. Nossos achados do estudo in vivo, mostraram que uma única dose de guanosina injetada via intraperitoneal, 2 horas após um TCE leve em ratos, aumentou a fosforilação oxidativa, o sistema de transporte de elétrons na presença de um desacoplador e a razão do controle respiratório em córtex e hipocampo, avaliados através de respirometria de alta resolução. A guanosina também protegeu contra alterações locomotoras, exploratórias e déficits de memória em curto prazo induzidos pelo TCE 24 horas após a lesão. Dessa forma demonstramos aqui que a guanosina apresenta um efeito protetor em reduzir o dano mitocondrial induzido pelo Ca 2+ e que esses efeitos não foram associados com suas propriedades antioxidantes diretas per se ou estabilização do potencial de membrana mitocondrial. Podendo ser considerada como uma estratégia para proteger contra danos neurológicos em patologias associadas ao sistema nervoso central bem como em perturbações a função mitocondrial, tornando essa molécula um atrativo terapêutico para o tratamento do TCE.

Durante la última década, se han logrado avances significativos en relación a la patogénesis, implicaciones clínicas y tratamiento de la hiperuricemia. Mientras que desde el punto de vista clínico o médico, hemos interpretado durante al menos un siglo que el ácido úrico causa gota; en la actualidad, estamos comenzando a abordar la pregunta de por qué existe hiperuricemia y algunos de los mecanismos metabólicos por los cuales el ácido úrico actúa para estimular la inflamación. Esta revisión se centra en alguno de los papeles biológicos del ácido úrico; por qué la pérdida genética de la uricasa y la hiperuricemia resultante pueden haber supuesto una ventaja evolutiva para los primates y, en particular, para humanos; y por último recoger algunos de los efectos moleculares del ácido úrico en las células inflamatorias y en la placentación El ácido úrico (C3H4N4O3)(AU) proviene del metabolismo de las bases purínicas; adenina y guanina. Su papel principal es la formación de nucleótidos esenciales en la génesis de ácidos nucleicos y demás productos de gran interés biológico. Su concentración en la sangre puede elevarse produciendo inflamación del endotelio arterial, gota, tofos y cálculos renales. Actualmente existe evidencia de que su nivel elevado durante tiempo prolongado puede llegar a desencadenar cuadros sintomáticos como el metabólico cardiovascular o preeclampsia en el caso de embarazadas. Niveles altos de ácido úrico durante la gestación han demostrado evidencia de inhibir el proceso invasivo del trofoblasto en la placenta con potenciales repercusiones sobre el futuro neonato. Conocemos algunos de los efectos antioxidantes del ácido úrico en el cuerpo humano, y que tanto su defecto como su exceso pueden producir anomalías dentro de los sistemas orgánicos. Esta revisión pretende poner en valor la herramienta de la intervención dietética en la prevención del aumento del nivel de ácido úrico provocado por los condicionantes que han sido destacados en esta revisión. Máster en Condicionantes Genéticos, Nutricionales y Ambientales del Crecimiento y el Desarrollo

Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Físicas e Matemáticas, Programa de Pós-Graduação em Química, 2019. A importância do estudo do comportamento de compostos que mimetizam a ação de enzimas quando submetidos a alterações estruturais como o aumento do tamanho do anel do ligante e a inserção de compostos que simulam a segunda esfera de coordenação é indiscutível, trazendo importantes informações mecanisticas e estruturais. Neste trabalho, os efeitos catalíticos dos grupos aminoguanidina e aminopurina na segunda esfera de um complexo FeIIIZnII que mimetiza o sítio ativo da metalo-hidrolase fosfatase ácida púrpura (PAP) são investigados e os resultados obtidos foram extremamente relevantes para essa área da ciência. O ligante 3-(((3-((bis(2-(piridin-2-il)etil)amino)metil)-2-hidroxi-5-metilbenzil)(piridin-2 ilmetil)amino)metil-il)-2-hidroxi-5-metilbenzaldeído-(H2L1bpea) foi sintetizado e o complexo [(OH)FeIII(µ-OH)ZnII(H2O)(L1bpea)](ClO4) foi usado como base para comparação com complexos similares, previamente reportados na literatura. Modificações subsequentes foram conduzidas no grupo aldeído, onde aminoguanidina (amig) e aminopurina (apur) foram usadas como derivados da cadeia lateral. Os complexos [(OH)FeIII(µ-OH)ZnII(H2O)(L1bpea)](ClO4) (1), [(OH)FeIII(µ-OH)ZnII(H2O)(L1bpea-amig)](ClO4) (2) e [(OH)FeIII(µ-OH)ZnII(H2O)(L1bpea-apur)](ClO4) (3) foram caracterizados por métodos espectrocópicos (infravermelho, UV-Vis) e espectrometria de massa ESI-MS. A teoria funcional da densidade (DFT) também foi utilizada para compreender melhor a estrutura dos complexos. A atividade hidrolítica dos complexos 1, 2 e 3 foi analisada usando tanto o substrato modelo 2,4-BDNPP (bis- (2,4-dinitrofenil) fosfato) quanto o DNA. Os complexos 2 e 3, contendo os ligantes derivatizados, apresentaram uma constante de associação significativamente maior (Kassoc ?1/KM) para o substrato ativado 2,4-BDNPP em relação ao complexo 1. A eficiência catalítica (kcat/KM) também é maior devido a ligações de hidrogênio e/ou interações ?-stacking entre o substrato e os grupos aminoguanidina e aminopurina presentes em 2 e 3, respectivamente. Cada um dos complexos também é capaz de hidrolisar o DNA, embora com taxa reduzida. Enquanto o complexo 3 é mais eficaz contra o 2,4-BDNPP, é o catalisador menos ativo na hidrólise do DNA. No geral, os resultados aqui relatados demonstram o significativo efeito de segunda esfera na catálise de substratos diéster com a elucidação de um mecanismo inédito observado para esses tipos de compostos. Abstract: The importance of studying the behavior of compounds that mimic the action of enzymes when subjected to structural changes such as increasing the size of the ligand ring and the insertion of compounds that simulate the second sphere coordination is unquestionable, providing important mechanistic and structural information.In this work, the catalytic effects of aminoguanidine and aminopurine groups in the second sphere of a FeIIIZnII complex that mimics the active site of the metallohydrolase purple acid phosphatase (PAP) are investigated, with a particular view on DNA as substrate. The ligand 3-(((3-((bis(2-(pyridin-2-yl)ethyl)amino)methyl)-2-hydroxy-5-methylbenzyl)(pyridin-2-ylmethyl)amino)meth-yl)-2-hydroxy-5methylbenzaldehyde (H2L1bpea) was synthesized and its complex [(OH)FeIII(µ-OH)ZnII(H2O)(L1bpea)](ClO4) used as a base for comparison with similar complexes previously published in the literature. Subsequent modifications were conducted in the aldehyde group, where aminoguanidine (amig) and aminopurine (apur) were used as side chain derivatives. The complexes [(OH)FeIII(µ-OH)ZnII(H2O)(L1bpea)](ClO4) (1), [(OH)FeIII(µ-OH)ZnII(H2O)(L1bpea?amig)](ClO4) (2) and [(OH)FeIII(µ-OH)ZnII(H2O)(L1bpea?apur)](ClO4) (3) were characterized by spectroscopic methods (infrared, UV-Vis) and ESI-MS spectrometry. Density functional theory (DFT) was also used to better understand the structure of the complexes. The hydrolytic activity of complexes 1, 2 and 3 was analyzed using both the model substrate 2,4-BDNPP (bis-(2,4-dinitrophenyl)phosphate) and DNA. Complexes 2 and 3, containing the derivatized ligands, have a significantly higher association constant (Kassoc?1/KM) for the activated substrate 2,4-BDNPP compared to complex 1. The catalytic efficiency (kcat/KM) is also higher due to hydrogen bonds and/or ?-stacking interactions between the substrate and the aminoguanidine and aminopurine groups present in 2 and 3, respectively. Each of the complexes is also capable of hydrolyzing DNA, albeit with reduced rate. While complex 3 is most effective against 2,4-BDNPP it is the least active catalyst against DNA. Overall, the results reported herein demonstrate the significance of second-sphere effects in the catalysis of diester substrates with the elucidation of an unprecedented mechanism observed for these types of compounds.

Tesis (Doctor en Ciencias Químicas) - - Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas, 2019 Las plantas han podido conquistar la tierra gracias a su plasticidad fenotípica. Parte de esta capacidad se explica por la posibilidad de generar nuevas estructuras a lo largo de la vida. En el presente trabajo se abordo la importancia de dos genes de la familia AZG (AtAzg1 y AtAzg2 ) en el desarrollo radical. Los antecedentes mostraban que estos genes codifica para potenciales transportadores de purinas y de algunos de sus derivados como las citoquininas. Ademas, experimentos realizados en Arabidopsis thaliana, señalaron que podrian estar relacionados con la regulacion de la arquitectura radical en estrecha relacion con los sistemas hormonales de plantas. Partiendo de esta base, nos propusimos en primer lugar comprender el origen de la familia genica especialmente en relacion con los sistemas de señalizacion hormonal. Mediante la busqueda de secuencias relacionadas en el grupo de Viridiplantae, se pudo obtener el primer arbol logenetico con los potenciales homologos de los genes de A. thaliana. La posibilidad de contar con un arbol permitido avanzar sustancialmente en el conocimiento acerca de la evolucion de esta familia genica. Se pudo relacionar la diversi cacion de la familia con eventos especificos como la conquista de la tierra y la aparicion de la raiz, asi como tambien se observo que los origenes de algunos sistemas de señalizacion coinciden con los de la familia genica AZG. Por otro lado, contar con gran numero de genes homologos de la familia, nos permite poner en relevancia secuencias altamente conservadas, asi como señalar regiones que expliquen las diferencias entre las variantes de los distintos genes de la familia AZGs. En el presente trabajo se continuo con la caracterizacion de los miembros de AZG de A. thaliana, AtAZG1 y AtAZG2, al estudiar la capacidad de ambos transportadores de interactuar con otras proteinas en el sistema de expresion heterologo de levaduras. Para ello, se realizaron ensayos de interaccion usando la tecnica de Split Ubiquitin System. En primer lugar, se pudo establecer que los transportadores son capaces de interactuar tanto consigo mismos como con el otro miembro de la familia. Es decir, se observaron asociaciones del tipo AZG1-AZG1, AZG2-AZG2 y AZG1-AZG2. Por otro lado, result o de inter es conocer la capacidad de estos transportadores de interactuar con algunos miembros de la cascada de senalizacion por citoquininas, por lo que se seleccionaron como candidatos los receptores y las fosfotransferasas. Si bien la interaccion de estas proteinas con AZGs habria resultado un interesante mecanismo de respuesta rapida para la regulacion del transporte de la hormona, no se observo interaccion entre AZGs con receptores de citoquininas y la interaccion con las fosfotransferasas no fue concluyente. A continuacion, se estudio el rol de estos transportadores en plantas. En primer lugar, se avanzo en la caracterizacion de la expresion de AZG1. Se pudo determinar que este gen se expresa en diversos organos y tejidos y que es inducible por exposicion a citoquininas. El estudio de distintas lineas mutantes del gen AtAzg1, mostraron que no existen diferencias evidentes en sus fenotipos al crecer en condiciones estandar. Sin embargo, motivados por observaciones hechas durante la descripcion de la expresion, se estudio la importancia del gen en la dominancia apical radical. Gracias a esto, se determino que AZG1 es importante para regular la regeneracion del sistema radical tras la escision del meristema apical radial. Para continuar el estudio de la relacion de este gen con citoquininas, se estudio como se desarrollan los mutantes del gen en presencia de la hormona. Se pudo determinar que la arquitectura radical era distinta en lineas carentes del gen, asi como en lineas que lo sobreexpresan, especialmente en el largo de la raiz principal. Para asegurar que esta diferencia se debe a la actividad de transportador se complementaron lineas deficientes en el transportador (knock-out), las cuales recobraron el fenotipo salvaje. Por otro lado se continuo con la caracterizacion de AZG2 en plantas. Si bien existian estudios previos sobre la expresion del gen, en el presente trabajo se pudieron profundizar y determinar que su expresion esta limitada solamente en un pequeño grupo de celulas rodeando los primordios de raiz lateral, correspondientes a la corteza y la epidermis. Ademas, se determino que existe otro dominio de expresion del gen en semillas en proceso de germinacion . Retomando su relacion con hormonas, se observo que en lineas knock-out mediante el reportero de citoquininas ARR5pro:GUS existan diferencias en la señalizacion, especialmente tras la aplicacion de la hormona. Esta diferencia en la señalizacion pudo ser cuantificada mediante el reportero de citoquininas TCSnpro:GFP. Este reportero mostro que lineas que no tienen AZG2 presentan menor actividad de citoquininas, relacionando asi los fenotipos descritos previamente para estas lineas al deficit en la señalizacion. Finalmente, se abordo el estudio de la localizacion subcelular de los transportadores mediante el uso de proteinas AZG fusionadas a proteinas uorescentes. AZG1 present o una clara localizacion en la membrana plasmatica en las distintas fusiones con proteinas uorescentes evaluadas. Por otro lado, la fusion con AZG2 fue localizada en la membrana plasmatica, aunque tambien se observo señal en el citosol. Mediante el uso de distintas construcciones y observando distintos tejidos, se pudo estimar que se tratara de reticulo endoplasm atico. Los resultados obtenidos en el presente trabajo permiten profundizar el conocimiento sobre el vinculo entre estos transportadores y la señalizacion hormonal en plantas. Se lograron establecer modelos que nos permiten explicar la actividad de ambos transportadores, contemplando su posicion en el contexto de señalizacion, su dominio de expresion asi como su localizacion y su relacion con otras vias de señalizaci on. Como perspectivas, el estudio permitio abrir nuevas puertas a proyectos de investigacion en curso que apuntan hacia el mejor entendimiento de la regulacion de la arquitectura radical. 2022

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior O presente trabalho foi desenvolvido com os objetivos de avaliar a excreção de creatinina para validação da coleta spot de urina, bem como as excreções de derivados de purinas (DP) e compostos nitrogenados (CN) e suas relações com a creatinina em novilhas Nelore suplementadas a pasto (Capítulo 1); objetivou-se também avaliar a recuperação da creatinina em função do tempo e de diferentes temperaturas de armazenamento (Capítulo 2). O experimento referente ao Capítulo 1, foi conduzido no setor de gado de corte da Universidade Federal de Viçosa/MG, utilizando-se cinco novilhas Nelore com peso corporal (PC) médio de 400 ± 15kg, distribuídas em quadrado latino 5x5. Os cinco tratamentos experimentais se basearam na suplementação proteico-energética (concentrado com 22% de proteína bruta na matéria seca (MS), fornecido às12h), baseada no PC (0, 3, 6, 9 e 12 g/kg PC (PC0, PC3, PC6, PC9 e PC12, respectivamente)). Os animais receberam sal mineral ad libitum. Cada período experimental teve duração de 16 dias, sendo 12 de adaptação à dieta e quatro de coleta. A coleta total de urina e amostral de fezes, foi realizada em três dias, nos horários das 0h00-4h00, 4h00-8h00, 8h00-12h00, 12h00-16h00, 16h00-20h00 e 20h00-24h00. A coleta de spot de urina, foi realizada a cada 4 horas, assim como as coletas de líquido ruminal e sangue nos horários das 0, 4, 8, 12, 16, 20 horas. Para a coleta total de urina, utilizou-se sonda de Folley no26, acoplada a mangueira de polietileno que conduziu a urina até uma bolsa coletora de urina por sistema fechado, que foi esvaziada a cada quatro horas. A amostragem da urina coletada foi realizada a cada 4 horas, nos mesmos horários descritos para a coleta de sangue, medindo- se o volume e retirando-se duas amostras, uma diluída com solução H2SO4 0,036N e outra não diluída. Para determinação da excreção fecal, utilizou-se o dióxido de titânio, fornecido na quantidade total diária de 15g, entre os dias 8o e 16o de cada período. Para estimativa do consumo de pasto, utilizou-se a fibra indigestível em detergente neutro (FDNi) como indicador interno. Realizou-se coleta de pasto pela técnica do quadrado para determinação da MS potencialmente digestível (MSpd) no terceiro dia de cada período experimental. Nos dias 13o e 16o de cada período, realizou-se simulação de pastejo para estimar a composição do pasto ingerido. Nas amostras de urina foram determinadas as concentrações de creatinina, nitrogênio total urinário (NU), ureia (NUreia), ácido úrico (AU) e alantoína (AL). Para análise estatística utilizou-se o programa estatístico Proc Mixed do SAS 9.4. A avaliação da adequação da melhor forma de coleta de urina foi realizada utilizando a raiz quadrada do quadrado médio do erro da predição (QMEP) entre as amostras de urina obtidas por meio da coleta spot. O experimento, referente ao Capítulo 2, foi realizado no Departamento de Zootecnia da UFV. Foram utilizadas urina de vinte e cinco animais, dez provenientes da raça Nelore e quinze da raça Holandesa. As urinas (10 de Nelore e 10 de Holandês) foram diluídas em solução de H2SO4 0,036N, fracionadas e conservadas em temperatura ambiente, resfriadas (4oC) e congeladas (-20oC e a -40oC), analisadas em diferentes dias após a coleta (1, 3, 7, 10, 15, 30, 45, 60, 90, 120, 150 dias). Imediatamente após a coleta, a urina foi diluída e seu pH corrigido para valor inferior a 3, e a urina foi analisada, dando origem ao valor de creatinina, resultado utilizado como valor de referência da concentração de creatinina na amostra. Este valor referência, foi utilizado como divisor dos valores de creatinina obtidos nos dias da análise, por amostra, obtendo-se o valor de creatinina relativa, o que permite a observação do aumento ou diminuição da concentração de creatinina ao longo do tempo. Para avaliar a conversão de creatina em creatinina na urina de bovinos, utilizou-se urina proveniente de cinco bovinos da raça Holandesa. Estas urinas também foram diluídas e tiveram seu pH corrigido para valor inferior a 3. Para avaliar o efeito da adição de creatina na urina, adicionou-se solução de creatina (concentrações de 20, 40 e 60 mg/dL) nos eppendorf contendo urina diluída. Estas urinas foram analisadas em diferentes dias após a coleta (1, 3, 7, 15, 30 e 45 dias), sendo armazenadas nas mesmas temperaturas descritas anteriormente. No capítulo 1 observou-se efeito linear positivo (P=0,001) sobre o consumo de MS total devido ao aumento nas quantidades de suplemento fornecido aos animais, porém observou-se efeito quadrático (P=0,018) sobre a ingestão de MS proveniente do pasto. A ingestão de N diferiu entre os tratamentos (P0,05), em função da ausência de suplementação. A excreção de creatinina diária foi de 23,01 ± 0,19 (22,82 – 23,2) mg/kgPC. As excreções de AL, AU e DP, em mmol, foram influenciadas linearmente pelos tratamentos (P=0,002; P=0,004; P=0,003, respectivamente). A síntese de nitrogênio microbiano (NM) foi influenciada, assim como as excreções de DP, linearmente (P=0,001) pelos tratamentos. As relações entre AL, AU e DP com a creatinina, não foram influenciadas pelos dias de coleta, períodos de coleta, tratamentos e suas interações (P>0,05), apresentando média de relações de 1,36 para AL:creatinina, 0,121 para AU:creatinina e 1,48 para PD:creatinina. Além do efeito de tratamento sobre a excreção de NU e NUrea, a excreção de CN na urina foi influenciada (P0,05) de tratamento, dias e períodos de coleta. A avaliação comparativa da excreção de creatinina observada nas amostras obtidas a partir da coleta total de urina, a cada 4 horas por 3 dias, com as amostras spot de urina obtidas em momentos pontuais (às 12, 16, 20, 0, 4 e 8 horas), demonstrou não haver diferença (P>0,05) entre as duas formas de coleta estudadas. A observação das relações AL:creatinina e AU:creatinina, nos métodos de coleta avaliados neste estudo, possibilitou a observação de que não houve variação (P>0,05) entre as amostras obtidas na forma de coleta total ou spot de urina. Na análise das relações NU:creatinina e NUreia:creatinina, observou-se que os horários das amostras obtidas às 4, 8, 12, 16 e 20 horas, foram similares (P>0,05) independentemente do método de amostragem. Entretanto, no horário da meia noite (amostragem 20h00-24h00, coleta total/0 hora, coleta spot de urina), observou-se variação na excreção de NU (inclinação, P=0,03) e de NUreia (inclinação, P=0,01; e intercepto, P=0,03), indicando que coletas spot de urina realizadas neste horário, não representariam a excreção de CN ao longo do período de 24 horas. Conclui- se que a excreção de creatinina é constante em 24h e estima adequadamente o volume urinário em bovinos mantidos em pastejo; e que uma única amostra spot de urina obtida no pasto, em qualquer horário do dia, pode ser usada para estimar a excreção de derivados de purinas. Para a estimativa da excreção de CN na urina são necessárias duas amostras spot de urina, uma quatro horas antes e outra quatro após a suplementação, em bovinos em pastejo. Os principais resultados do capítulo 2 foram que, a recuperação da creatinina foi constante (P>0,05) até o décimo quinto dia de armazenamento, independente da temperatura utilizada. A partir do 30o dia de armazenamento houve efeito de tempo e/ou temperatura (P0,05). A adição de creatina na urina causou aumento (P0,05). Amostras de urina podem ser armazenadas em qualquer temperatura estudada até quinze dias após a coleta para determinação da concentração de creatinina. Amostras que necessitem tempos de armazenamentos superiores a quinze dias devem ser congeladas a -20oC ou -40oC. Aimed to evaluate the creatinine excretion to validate the urine spot sampling technique, as well as the excretions of purine derivatives (PD) and nitrogen compounds (NC) and their relationship with creatinine in Nelore heifers supplemented on pasture (Chapter 1); Were also aimed evaluate the recovery of creatinine as a function of time and different storage temperatures (Chapter 2). The experiment related to Chapter 1 were conducted in the beef cattle department of the Federal University of Viçosa/MG, using five Nelore heifers with mean body weight (BW) of 400 ± 15 kg, distributed in 5x5 Latin square. The five experimental treatments were based on protein-energy supplementation (concentrate with 22% crude protein in dry matter (DM) bases) offered based on BW (0, 3, 6, 9 and 12 g/kg BW (BW0, BW3, BW6, BW9 and BW12, respectively)). Each experimental period had a duration of 16 days, 12d to diet adaptation and four to sampling of urine, feces, blood and ruminal fluid. The total collection of urine and spot of feces sample was performed in three days, from 0:00-4:00, 4:00-8:00, 8:00-12:00, 12:00-16:00, 16:00- 20:00 and 20:00-24:00. Sampling spot of urine was performed for 24 hours, as well as the collection of ruminal fluid and blood at the times of 0, 4, 8, 12, 16, 20 hours. For total urine collection, a Folley no26 probe was used, coupled with a polyethylene hose that carried the urine to a closed urine collection bag, which was emptied every four hours. Sampling of the urine was performed every 4 hours, at the same times as described for blood sampling, by measuring the volume and taking two samples, one diluted with 0.036N H2SO4 and one undiluted. To determine fecal excretion, titanium dioxide, supplied in the total daily amount of 15 g, was used between days 8th and 16th of each period. In order to estimate pasture consumption, indigestible neutral detergent fiber (iNDF) was used as the internal marker. Pasture was collected by the square technique to determine the potentially digestible DM (pdDM) on the third day of each experimental period. On the 13th and 16th days of each period, manual grazing simulation was performed to estimate the composition of the pasture. In the urine samples, the concentrations of creatinine, total urinary nitrogen (UN), urea (UreaN), uric acid (UA) and allantoin (AL) were determined. Statistical analysis was performed using SAS's 9.4 Proc Mixed statistical software. The evaluation of the adequacy of the best form of urine collection was performed using the square root of the mean square of the prediction error (MSPE) among the urine samples obtained through spot sampling. The experiment, referring to Chapter 2, was carried out at the Animal Science Department of the UFV. Urine of twenty-five animals, ten from the Nelore and fifteen from the Holstein, were used. Urine samples (10 from Nelore and 10 from Holstein) were diluted in 0.036N H2SO4, fractionated and stored at room temperature, cooled (4°C) and frozen (-20°C and -40°C), being analyzed different days after sampling (1, 3, 7, 10, 15, 30, 45, 60, 90, 120, 150 days). Immediately after sampling, the urine was diluted, and its pH corrected to less than 3, and the urine was analyzed, giving a result used as a reference value of the creatinine concentration in the sample. This reference value was used as a divider of the creatinine values obtained on the days of the analysis, per sample, obtaining the relative creatinine value, which allows the observation of increase or decrease in creatinine concentration over time. To evaluate the conversion of creatine to creatinine in the urine of cattle, urine from five Holstein cows was used. These urines were also diluted and had their pH corrected below 3. To evaluate the effect of adding creatine to the urine, creatine solution (concentrations of 20, 40 and 60 mg/dL) was added to eppendorf containing diluted urine. These urines were analyzed on different days after sampling (1, 3, 7, 15, 30 and 45 days), being stored at the same temperatures described previously. In Chapter 1, a positive linear effect (P=0.001) was observed on the total DM intake due to the increase in the amount of supplementation provided to the animals. However, a quadratic effect (P=0.018) was observed on DM intake from pasture. Intake of N differed among treatments (P0.05), as a function absence of supplementation. The creatinine excretion daily was 23.01 ± 0.19 (22.82 - 23.2) mg/kgBW. Excretions of AL, UA and PD, in mmol, were influenced by treatments (P=0.002, P=0.004, P=0.003, respectively). Microbial N synthesis (NM) was influenced, as well as the excretions of PD (P=0.001) by the treatments. The ratios between AL, UA and PD with creatinine were not influenced by collection days, collection periods, treatments and their interactions (P>0.05), with an average ratios of 1.36 for AL:creatinine, 0.121 for UA:creatinine and 1.48 for PD:creatinine. In addition to the treatment effect on UN and UreaN excretion, urine excretion of NC was also influenced (P0.05), days and collection periods. The comparative evaluation of creatinine excretion observed in the samples obtained from the total collection of urine, sampling every 4 hours per 3 days, with the urine spot samples obtained at punctual moments (at 12, 16, 20, 0, 4 and 8 hours), showed no difference (P>0.05) between the two techniques of sampling. The observation of AL:creatinine and UA:creatinine of the two methods evaluated in this study allowed the observation that there was no variation (P>0.05) between the samples obtained in the form of total collection or urine spot. The analysis of the UN:creatinine and UreaN:creatinine ratios, it was observed that the sample times obtained at 4, 8, 12, 16 and 20 hours were similar (P>0.05) regardless of the sampling method. However, at midnight (sampling 20h00-24h00, total collection/0h, urine spot collection), there was variation in the excretion of UN (slope, P=0.03) and UreiaN (slope, P=0.01, and intercept, P=0.03), indicating that urine spot collections performed at this time would not represent NC excretion over the 24-hour period. Concluded that creatinine excretion is constant in 24 hours and adequately estimates the urinary volume in beef cattle kept in pasture; and that a single urine spot sample obtained in the pasture, at any time of the day, can be used to estimate the purine derivatives excretion. However, two urine spot samples, one obtained four hours before and other four hours after supplementation, are required for the estimation of excretion of CN in urine in grazing cattle. The main results of Chapter 2 were that the creatinine recovery was constant (P>0.05) until the 15th day of storage, regardless of the temperature used. From the 30th day of storage there was a time and/or temperature effect (P0.05). The addition of creatine in the urine caused an increase (P0.05). Urine samples can be stored at any temperature evaluated to 15 days after collection for determination of creatinine concentration. Samples requiring storage times greater than 15 days should be frozen at - 20°C or -40°C.

A hipoxantina, principal oxipurina envolvida na via de salvação das purinas no cérebro, acumula-se na doença de Lesch-Nyhan, um erro inato do metabolismo das purinas. Os sintomas clínicos manifestam-se precocemente na vida dos pacientes, incluindo alterações motoras e cognitivas, retardo mental e automutilação. Embora os mecanismos subjacentes da disfunção cerebral na doença de Lesch-Nyhan sejam pouco compreendidos, o acúmulo de hipoxantina parece contribuir para os danos neurológicos. O objetivo deste estudo foi investigar os efeitos da administração intraestriatal de hipoxantina em ratos infantis e adultos jovens submetidos à cirurgia estereotáxica. Neste estudo, analisamos primeiramente o efeito da hipoxantina sobre os parâmetros neuroinflamatórios e oxidativos em estriados de ratos infantis e adultos jovens. Foram avaliados também alguns parâmetros neuroenergéticos. Ratos Wistar de 21 e 60 dias de vida foram submetidos à cirurgia estereotáxica e foram divididos em dois grupos: controle (infusão de solução salina 0,9%) e hipoxantina (10 IJM). A administração intraestriatal de hipoxantina aumentou os níveis de IL-6 e TNF-a e o imunoconteúdo da subunidade NF-kB I p65 nuclear em estriado de ambas as idades de ratos. A ativação microglial e astrocitária foram observadas pelo aumento do imunoconteúdo de lba1 e GFAP, respectivamente, no estriado de ratos de 21 dias. Todos os parâmetros oxidativos foram alterados, sugerindo uma forte relação neurotóxica de hipoxantina e estresse oxidativo. Em ratos de 60 dias de vida, a hipoxantina aumentou a atividade da succinato desidrogenase e do complexo 11 e diminuiu a atividade da citocromo c oxidase e seu imunoconteúdo. A injeção de hipoxantina diminuiu a porcentagem marcação de membrana mitocondrial e aumentou marcação de potencial mitocondrial. A hipoxantina também diminuiu o número de células vivas e aumentou o número de células apoptóticas. Em ratos de 21 dias de vida, a hipoxantina alterou alguns parâmetros do metabolismo energético e diminui a atividade de Na+,K+-ATPase, provavelmente por danos às proteínas, visto pela redução de conteúdo de sulfidrilas. Nossos achados mostram que a administração de hipoxantina alterou parâmetros neuroinflamatórios e neuroenergéticos, possivelmente por meio de desequilíbrio oxidativo, sugerindo que esses processos podem estar envolvidos, pelo menos em parte, com os distúrbios neurológicos encontrados em pacientes com doença de Lesch-Nyhan. Hypoxanthine, the major oxypurine metabolite involved in purine's salvage pathway in the brain, is accumulated in Lesch-Nyhan disease, an in bom errar of metabolism of purine. The clinicai symptoms manifest early in the patients' lives, including motor and cognitiva alterations, mental retardation and self-mutilation. Although the underlying mechanisms of brain dysfunction in Lesch-Nyhan disease are poorly understood, the accumulation of hypoxanthine appears to contribute to neurological damage. The purpose of this study was to investigate the effects of hypoxanthine intrastriatal administration in infant and young adult rats submitted to stereotactic surgery. We firstly analyzed the effect of hypoxanthine on neuroinflammatory and oxidative parameters in striatum of infant and young adult rats. We also evaluated some neuroenergetic parameters. Wistar rats of 21 and 60 days of life underwent stereotactic surgery and were divided into two groups: contrai (infusion of saline 0.9%) and hypoxanthine (10 IJM). lntrastriatal administration of hypoxanthine increased IL- 6 and TNF-a leveis and nuclear immunocontent of NF-KB/p65 subunit in striatum of rats of both ages. Microglial and astrocyte activation was seen by the increase in lba1 and GFAP immunocontent, respectively, in striatum of infant rats. Ali oxidative parameters were altered, suggesting a strong neurotoxic hypoxanthine role on oxidative stress. In 60-day-old rats hypoxanthine increased succinate dehydrogenase and complex 11 activities and diminished cytochrome c oxidase activity and immunocontent. Hypoxanthine injection decreased the percentage of cells with mitochondrial membrana label and increased mitochondrial mass potential labeling. Hypoxanthine also diminished the number of live cells and increased the number of apoptotic cells. In 21-days-old rats hypoxanthine altered some energy metabolism parameters and decreased Na•,K•-ATPase activity probably by protein damage, seen in the reduction of sulfhydryl content. Our findings show that the administration of hypoxanthine altered neuroinflammatory and neuroenergetic parameters, possibly through oxidative imbalance, suggesting that these processes may be involved, at least in part, with the neurological disorders found in patients with Lesch-Nyhan disease.

El objetivo general es seleccionar y/o dimensionar los elementos principales de un sistema de generación de biogás mediante codigestión anaerobia que sea capaz de tratar de manera centralizada los purines de la comarca agraria de la Sierra de Cádiz. Con el fin de aumentar la producción de biogás los purines son codigeridos con glicerina, por lo tanto, será necesario definir el porcentaje de glicerina óptimo a usar en la mezcla.

Número de publicación: ES2548927 B1. Número de solicitud: 201400229., Derivados de purina como inhibidores de Dapk-1. La presente invención describe una nueva familia de derivados de purina que actúan como inhibidores selectivos de Dapk1. Se describe también el proceso para la obtención de los compuestos farmacéuticos y su uso como medicamento para el tratamiento o la profilaxis de enfermedades que precisan la inhibición de Dapk1, especialmente para el tratamiento del cáncer., Universidad de Granada

Os Transtornos psiquiátricos acompanham a história da humanidade. Classificados em categorias distintas podemos observar que dentre todas as patologias que constituem os transtornos mentais e de comportamento, as doenças mais prevalentes são as doenças de Ansiedade e de Transtorno Depressivo Maior (TDM). Mesmo com muitos avanços nas neurociências, assim como na terapêutica (psicofarmacologia), ainda hoje a fisiopatologia e o desenvolvimento farmacológico são áreas que necessitam intenso estudo. Avanços recentes tem sugerido que drogas capazes de modular os sistemas glutamatérgico e purinérgico possuem potencial efeito neuromodulador, sendo promissores candidatos para o desenvolvimento de novas drogas com ação ansiolítica e/ou antidepressiva. Dessa maneira, o objetivo desta tese foi investigar o potencial efeito ansiolítico da guanosina (GUO) em modelos animais preditivos para o estudo da potencial atividade ansiolítica de novos compostos, assim como seu potencial efeito antidepressivo no modelo animal de depressão da Bulbectomia Olfatória Bilateral (OBX). Inicialmente, nossos resultados demonstram que a administração de GUO foi capaz de produzir um consistente efeito ansiolítico modulando os níveis de adenosina (ADO) e glutamato cerebral. Ainda, pela primeira vez, foi observado que a GUO per se promoveu uma diminuição da liberação de glutamato em preparações de sinaptosomas de hipocampo, um efeito dependente da ativação dos receptores A1 de ADO. Após a caracterização do potencial efeito ansiolítico da GUO, nosso objetivo foi avaliar o potencial efeito antidepressivo da GUO em um modelo animal com validade de face e de constructo, como o modelo da OBX. Contudo, após revisão da literatura em estudos que utilizaram o modelo da OBX, observou-se a necessidade de uma investigação a longo prazo, das principais alterações comportamentais e neuroquímicas induzidas pela OBX. Nossos resultados, mostram pela primeira vez, que camundongos submetidos a OBX apresentaram simultaneamente alterações comportamentais e neuroquímicas transitórias e de longa duração. Ademais, as evidências indicam que o hipocampo possui alta susceptibilidade aos danos induzidos pela OBX, visto que uma sinaptotoxicidade transitória, acompanhada de um duradouro desequilíbrio redox e aumento da resposta inflamatória foram observados. Por fim, o tratamento crônico com GUO foi capaz de reverter a maioria das alterações identificadas previamente como duradouras nos parâmetros comportamentais e neuroquímicos no modelo da OBX. Considerando os resultados neuroquímicos obtidos pelos diferentes protocolos de tratamento realizados neste estudo, novas hipóteses de mecanismos de ação exercidos pela GUO foram apresentadas, e mecanismos já estabelecidos foram reproduzidos. Por fim, de uma maneira geral os dados apresentados nesta tese reforçam a hipótese do envolvimento do sistema purinérgico nos transtornos psiquiátricos, e sugerem que a GUO apresenta uma potencial ação terapêutica para o tratamento destas doenças, abrindo assim novas perspectivas para elucidação dos mecanismos envolvidos na fisiopatologia da ansiedade e TDM. Psychiatric disorder had accompanied the course of human history. Mental and behavioral disorders are classified in different categories and among all different psychiatric disorders; anxiety and major depressive disorder (MDD) are the most prevalents. Despite the substantial advances in our knowledge on the neurobiological bases of both anxiety and MDD, as well as in the therapeutic area (psychopharmacology), even today, the pathophysiology of these disorders as well as pharmacological development are still under investigation. Recent advances have suggested that drugs able to modulate glutamatergic and purinergic systems present a potential neuromodulatory effect, and are promising candidates for the development of new drugs with both anxiolytic and antidepressant effects. Thus, the aim of this work was to investigate the potential guanosine (GUO) anxiolytic-like effects in predictive animal models largely used to elucidate anxiolytic properties of new compounds, as well as investigate the potential GUO antidepressant effect in Olfactory Bulbectomy (OBX) model of depression. Initially, our results demonstrate that acute GUO administration was able to induce a consistent anxiolytic-like effect, by modulating the adenosine and glutamate cerebrospinal levels. Here, for the first time, it was observed that GUO per se was able to decrease the glutamate release in hippocampal synaptosome. After characterizing the potential anxiolytic-like effect promoted by GUO, our second goal was to evaluate the potential GUO antidepressant-like effect in an animal model with recognized face and construct validity as the OBX model of depression. However, given the lack of studies in the literature considering the time course of the behavioral and neurochemical changes after the depressive-like behavior onset induced by OBX we firstly characterize some important features regarding the OBX model. Collectively, mice submitted to the OBX model of depression and followed up to 8 weeks simultaneously presented transient and long-lasting deleterious effects in behavioral and neurochemical parameters. The evidences pointed that hippocampus was the most affected brain structure, since a transient hippocampal-related synaptotoxicity, accompanied by a long-lasting hippocampal imbalance in redox and inflammatory homeostasis were observed. Additionally, the neurochemical effects seem to strengthen our behavioral findings. Finally, chronic GUO treatment, similarly to the classical tricyclic antidepressant imipramine, was able to improve the long-term behavioral phenotype impairment induced by OBX, specifically improving behavioral performances that require cognitive functions, accompanied by reversion of hippocampal redox imbalance parameters, as well as in peripheral and central anti-inflammatory IL-10 release. Thus, in present study, the pre-clinical evaluation of GUO as a potential drug for treatment of the most prevalent psychiatric disorders (anxiety and MDD) presented promising results. Furthermore, additional GUO mechanisms of action were evidenced and new perspectives were established. Thus, the data presented in this thesis support the hypothesis of the involvement of the purinergic system in mood disorders, and suggest that GUO has a potential therapeutic activity for the treatment of psychiatric disorders.

Os objetivos da presente tese de doutorado foram os de investigar o papel das purinas, em especial da guanina, da inosina e da guanosina, na nocicepção e compreender os mecanismos responsáveis pelos efeitos extracelulares desses compostos. Os resultados estão divididos em três partes, de acordo com sua natureza, em revisão da literatura (parte um), experimental, em animais e em humanos (parte dois) e discussão (parte três). Para o desenvolvimento da primeira parte, uma extensa revisão da literatura em relação ao papel extracelular das purinas na nocicepção foi realizada. Na segunda parte desta tese, procedimentos experimentais em animais demonstraram que a guanina e a inosina administradas por via intratecal, são antinociceptivas em diversos modelos de dor, além da guanosina administrada via intraperitoneal com seu efeito antinociceptivo em modelo de dor neuropática em camundongos. A administração intratecal de guanina e inosina causou um aumento significativo nos níveis de inosina e oxipurinas no líquido cefalorraquiano (LCR). Os níveis de guanina no LCR não foram detectados de forma acurada através da presente metodologia cromatográfica. Diversos testes comportamentais demonstraram o baixo potencial de toxicidade apresentado pelas purinas administradas por via intratecal. A seguir, os mecanismos de ação envolvidos nos efeitos antinociceptivos da guanina e da inosina foram investigados através de métodos farmacológicos, demonstrando que ambos parecem compartilhar mecanismos semelhantes, envolvendo a ativação de receptores adenosinérgicos Também demonstramos que o alopurinol, um derivado das purinas e inibidor da xantina oxidase normalmente utilizado para o tratamento de hiperuricemia, também produziu efeito analgésico em pacientes em pós-operatório imediato de histerectomia abdominal, além de apresentarem aumento de xantina e diminuição de ácido úrico no LCR. Apesar da utilização clínica das purinas ser demasiadamente precoce, podemos inferir que a utilização de alopurinol poderia ser uma excelente estratégia para testar nossas hipóteses, pois demonstra a vantagem de estar aprovado para uso comercial, apresentar boa tolerabilidade e baixo custo. Os resultados apresentados nesta tese ratificam o papel das purinas nos mecanismos de transmissão da dor e um novo papel para a guanina, a inosina e a guanosina é proposto: a modulação da dor. Diversos derivados purinérgicos são alvos para desenvolvimento de novos fármacos e podem ser úteis no tratamento de dor relacionada a hiperestimulação do sistema adenosinérgico e glutamatérgico. The aim of this thesis was to investigate the role of purines, especially guanine, inosine and guanosine, against the nociception and to understand the mechanisms responsible for the extracellular effects of these compounds. The results are divided into three parts, according to their nature, in review of the literature (part one), experimental, in animals and humans (part two) and discussion (part three). For the development of the first part, an extensive review of the literature regarding the extracellular role of purines in the nociception was performed. In the second part of this thesis, experimental procedures in animals demonstrated that guanine and inosine administered intrathecally are antinociceptive in several models of pain. Additionally, guanosine, administered intraperitoneally, produced antinociceptive effects in a model of neuropathic pain in mice. Intrathecal administration of guanine and inosine caused a significant increase in inosine and oxypurine levels in the cerebrospinal fluid (CSF). The levels of guanine in the CSF were not accurately detected by the present chromatographic methodology. Several behavioral tests have demonstrated the low toxicity potential of intrathecal purines. Furthermore, the mechanisms of action involved in the antinociceptive effects of guanine and inosine have been investigated through pharmacological methods, demonstrating that both seem to share similar mechanisms, involving the activation of adenosinergic receptors We also demonstrated that allopurinol, a purine derivative and xanthine oxidase inhibitor commonly used for the treatment of hyperuricemia, also produced an analgesic effect in patients in the immediate postoperative period of abdominal hysterectomy, in addition to increased xanthine and decreased uric acid in the CSF. Although the clinical use of purines is too premature, we can infer that the use of allopurinol could be an excellent strategy to test our hypotheses, since it demonstrates the advantage of being approved for commercial use, presenting good tolerability and low cost. The results presented in this thesis confirm the role of purines in pain transmission mechanisms and a new role for guanine, inosine and guanosine is proposed: pain modulation. A number of purinergic derivatives are targets for the development of novel drugs and may be useful in the treatment of pain related to hyperstimulation of the adenosinergic and glutamatergic system.

Anovel one-pot synthesis of tri-substituted purines and the discovery of purine analogues with trypanocidal activity are reported. The reaction is initiated by a metal-free oxidative coupling of primary alkoxides and diaminopyrimidines with Schiff base formation and subsequent annulation in the presence of large N,N-dimethylamides (e.g.N,N-dimethylpropanamide or larger). This synthetic route is in competition with a reaction previously-reported by our group1, allowing the generation of a combinatorial library of tri-substituted purines by the simple modification of the amide and the alkoxide employed. Among the variety of structures generated, two purine analogues displayed trypanocidal activity against the protozoan parasite Trypanosoma brucei with IC50 , 5 mM, being each of those compounds obtained through each of the synthetic pathways., J.J.D.M. thanks Spanish Ministerio de Economı´a y Competitividad for a Ramon y Cajal Fellowship. A.U.B. thanks MRC IGMM for an academic fellowship. This work was partially supported by Grant SAF2011-30528 to J.A.G.S..

In this paper we propose a new methodology for the analysis of metabolic networks. We use the notion of strongly connected components of a graph, called in this context metabolic building blocks. Every strongly connected component is contracted to a single node in such a way that the resulting graph is a directed acyclic graph, called a metabolic DAG, with a considerably reduced number of nodes. The property of being a directed acyclic graph brings out a background graph topology that reveals the connectivity of the metabolic network, as well as bridges, isolated nodes and cut nodes. Altogether, it becomes a key information for the discovery of functional metabolic relations. Our methodology has been applied to the glycolysis and the purine metabolic pathways for all organisms in the KEGG database, although it is general enough to work on any database. As expected, using the metabolic DAGs formalism, a considerable reduction on the size of the metabolic networks has been obtained, specially in the case of the purine pathway due to its relative larger size. As a proof of concept, from the information captured by a metabolic DAG and its corresponding metabolic building blocks, we obtain the core of the glycolysis pathway and the core of the purine metabolism pathway and detect some essential metabolic building blocks that reveal the key reactions in both pathways. Finally, the application of our methodology to the glycolysis pathway and the purine metabolism pathway reproduce the tree of life for the whole set of the organisms represented in the KEGG database which supports the utility of this research., This work was partially supported by the Spanish Government, through project DPI2015-67082-P, and the Programa Pont La Caixa per a grups de recerca de la UIB. The funders had no role in study design, data collection and analysis, decision to publish, or preparation of the manuscript.; The research reported in this paper has been partially supported by the Spanish Government, through project DPI2015-67082-P, and the Programa Pont La Caixa per a grups de recerca de la UIB. We thank F. Rossello A and G. Valiente for several comments on previous versions of this work.