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Objetivos. En este estudio se evaluarán los niveles de estrés oxidativo, y daño en el ADN en un modelo celular de carcinogénesis oral temprano, sometido a un microambiente hipóxico. Métodos. Utilizamos queratinocitos humanos (HaCaT) transducidos con oncogenes de VPH-18 (E5/E6/E7) sometidos a un microambiente hipóxico mediante el método del cubreobjeto, Se estudió mediante microscopía confocal la detección de especies reactivas de oxigeno (ROS) utilizando una sonda fluorescente. Además, se midieron los niveles de producción de óxido nítrico (NO), mediante el ensayo de Griess. Se evaluó el daño al ADN generado en las líneas celulares HaCaT parental, y HaCaT E5/E6/E7-VPH18, en normoxia, y en hipoxia mediante inmunocitoquímica de γH2AX, y ensayo cometa. Finalmente, se evaluaron diferencias morfológicas celulares y nucleares en ambas líneas celulares, en normoxia e hipoxia, utilizando el microscopio Nanolive 3D Cell Explorer-Fluo. Resultados. Observamos niveles de ROS intracelular significativamente más altos en células HaCaT E5/E6/E7-VPH-18 encomparación con las células HaCaT parentales. En cuanto al contenido de NO, fue significativamente mayor en HaCaT E5/E6/E7-VPH18 cultivadas en hipoxia en comparación con las células HaCaT en hipoxia. Además, las células HaCaT E5/E6/E7-VPH18 presentaron mayor daño genético medido por la intensidad de fluorescencia γH2Ax, y por el ensayo cometa, en hipoxia en comparación con normoxia. Finalmente, observamos diferencias morfológicas nucleares, y una mayor compactación de la cromatina en ambas líneas celulares, en hipoxia, en relación a normoxia. Conclusiones. Nuestros resultados sugieren que los oncogenes E5/E6/E7 del VPH-18 cooperan con un microambiente alterado, promoviendo estrés oxidativo, daño genético y alteraciones morfológicas que podrían facilitar la transformación maligna.

Abstract Hypoxia is a condition frequently encountered by cells in tissues, whether as a normal feature of their microenvironment or subsequent to deregulated growth. Hypoxia can lead to acidification and increased oxidative stress, with profound consequences for cell physiology and tumorigenesis. Therefore, the interplay between hypoxia and oxidative stress is an important aspect for understanding the effects of hypoxic microenvironments on cells. We have used a previously developed variant of the method of coverslip-induced hypoxia to study the process of acidification in a hypoxic microenvironment and to simultaneously visualize intracellular levels of hypoxia and oxidative stress. We observed high accumulation of CO2 in hypoxic conditions, which we show is the main contributor to acidification in our model. Also, increased levels of oxidative stress were observed in moderately hypoxic cells close to the oxygen source, where the mitochondrial membrane potential was preserved. Conversely, cells at large distances from the oxygen source showed higher levels of hypoxia, milder oxidative stress and reduced mitochondrial membrane potential. Our results contribute to characterize the interplay between reduced oxygen levels, acidification and oxidative stress in a simple in vitro setting, which can be used to model cell responses to an altered environment, such as the early tumor microenvironment.