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Supplementary data associated with this article can be found in the online version at doi:10.1016/j.csbj.2023.04.025., The Aspergillus niger CexA transporter belongs to the DHA1 (Drug-H+ antiporter) family. CexA homologs are exclusively found in eukaryotic genomes, and CexA is the sole citrate exporter to have been functionally characterized in this family so far. In the present work, we expressed CexA in Saccharomyces cerevisiae, demonstrating its ability to bind isocitric acid, and import citrate at pH 5.5 with low affinity. Citrate uptake was independent of the proton motive force and compatible with a facilitated diffusion mechanism. To unravel the structural features of this transporter, we then targeted 21 CexA residues for site-directed mutagenesis. Residues were identified by a combination of amino acid residue conservation among the DHA1 family, 3D structure prediction, and substrate molecular docking analysis. S. cerevisiae cells expressing this library of CexA mutant alleles were evaluated for their capacity to grow on carboxylic acid-containing media and transport of radiolabeled citrate. We also determined protein subcellular localization by GFP tagging, with seven amino acid substitutions affecting CexA protein expression at the plasma membrane. The substitutions P200A, Y307A, S315A, and R461A displayed loss-of-function phenotypes. The majority of the substitutions affected citrate binding and translocation. The S75 residue had no impact on citrate export but affected its import, as the substitution for alanine increased the affinity of the transporter for citrate. Conversely, expression of CexA mutant alleles in the Yarrowia lipolytica cex1Δ strain revealed the involvement of R192 and Q196 residues in citrate export. Globally, we uncovered a set of relevant amino acid residues involved in CexA expression, export capacity and import affinity., This work was supported by the Strategic Programme UID/BIA/04050/2020 and the project LA/P/0069/2020 granted to the Associate Laboratory ARNET, both funded by Portuguese funds through the FCT-IP. J.A. acknowledges the FCT and the Doctoral Program in Applied and Environmental Microbiology for the PD/BD/150584/2020 PhD grant and a COST Action CA18113 Short-Term Scientific Mission grant (EuroMicropH). M.S.S. acknowledges the Norte2020 for the UMINHO/BD/25/2016 PhD grant with the re ference NORTE-08-5369-FSE-000060. I.S-S. was supported by the program contract FCTUMINHO/Norma transitória from the Legal Regime of Scientific Employment (RJEC).

The yeast Cyberlindnera jadinii has great potential in the biotechnology industry due to its ability to produce a variety of compounds of interest, including carboxylic acids. In this work, we identified genes encoding carboxylate transporters from this yeast species. The functional characterization of sixteen plasma membrane carboxylate transporters belonging to the AceTr, SHS, TDT, MCT, SSS, and DASS families was performed by heterologous expression in Saccharomyces cerevisiae. The newly identified C. jadinii transporters present specificity for mono-, di-, and tricarboxylates. The transporters CjAto5, CjJen6, CjSlc5, and CjSlc13-1 display the broadest substrate specificity; CjAto2 accepts mono- and dicarboxylates; and CjAto1,3,4, CjJen1-5, CjSlc16, and CjSlc13-2 are specific for monocarboxylic acids. A detailed characterization of these transporters, including phylogenetic reconstruction, 3D structure prediction, and molecular docking analysis is presented here. The properties presented by these transporters make them interesting targets to be explored as organic acid exporters in microbial cell factories., This study was supported by the strategic program UID/BIA/04050/2019, funded by Portuguese funds through the FCT I.P.; the projects PTDC/BIAMIC/5184/2014, funded by national funds through the FCT I.P.; and the European Regional Development Fund (ERDF) through the COMPETE 2020–Programa Operacional Competitividade e Internacionalização (POCI) and EcoAgriFood: Innovative green products and processes to promote AgriFood BioEconomy (operação NORTE-01–0145-FEDER-000009), supported by Norte Portugal Regional Operational Program (NORTE 2020) under the PORTUGAL 2020 Partnership Agreement through the European Regional Development Fund (ERDF). M.S.S. acknowledges the Norte2020 for the UMINHO/BD/25/2016 PhD grant with the reference NORTE-08–5369-FSE-000060, and J.A. acknowledges the FCT for the PD/BD/150584/2020 PhD grant. PS acknowledges FCT for contract CEECINST/0007772018. I.S-S. was supported by the program contract FCT-UMINHO/Norma transitória from the Legal Regime of Scientific Employment (RJEC).

Dissertação de mestrado em Molecular Genetics, In recent decades, fungal pathogens have become a global health problem. Candida albicans, a common opportunistic commensal microorganism, is the most frequent cause of systemic candidiasis and nosocomial bloodstream fungal infections. C. albicans can colonize various parts of the host under abnormal conditions, especially in immunocompromised patients. The main feature of C. albicans that has made it a serious pathogen is its ability to adapt to different host niches and utilize alternative carbon sources, like carboxylic acids, in glucose-poor settings, such as the colon and vagina. Yeast plasma membrane carboxylate transporters belonging to the AceTr Transporter family, known as Atos (Acetate Transporter Orthologs), seem to play a crucial role in the uptake of these substrates in C. albicans. Previous work identified the orthologs of the Saccharomyces cerevisiae Ato1 (Ady2) monocarboxylate transporter in several Candida species. In C. albicans, eight Ato orthologs were detected, whose functions are still unknown. The purpose of this thesis was to characterize the function and structure of selected Ato family members and Jen transporters in C. albicans by heterologous expression in S. cerevisiae. We constructed 5 plasmids by Gap repair containing selected ATO genes under the control of the GPD promoter. Additionally, using the CRISPR-Cas9 method, we generated C. albicans strains with GFP fusions at the 3’ terminal of ATO and JEN genes to investigate the expression and subcellular localization of the selected transporters. Fluorescence microscopy analyses revealed that CaAto1- GFP and CaAto2-GFP were localized at the plasma membrane in the presence of lactate and acetate, suggesting these transporters play an important role in the utilization of these substrates. Moreover, an in-silico analysis of Ato proteins was performed to determine their three dimensional structure and docking with substrates. We found that the NPAPLGL(M/S), and FLY regions are conserved in selected Atos. Additionally, molecular docking showed that all selected C. albicans Ato proteins have four acetate-binding sites. Also, a comparison of the predicted pore radius and 3D structure of CaAto proteins with ScAto1 suggests that CaAto1 and CaAto2 have the same pore size and structure as ScAto1, which may indicate their identical roles, whereas CaAto3, CaAto4, and CaAto5 were dissimilar and thus might present a different specificity., Nas últimas décadas, as infeções fúngicas tornaram-se um problema de saúde global. Candida albicans, um microrganismo comensal, mas também oportunista, é o agente infecioso responsável pela maioria das candidíases sistémicas e infeções fúngicas da corrente sanguínea. Esta levedura pode colonizar várias partes do corpo, especialmente em doentes imunocomprometidos. A levedura C. albicans adapta-se aos diferentes nichos existentes no hospedeiro e utiliza fontes de carbono alternativas, como ácidos carboxílicos, em ambientes escassos em glucose, como o cólon e a vagina. Os transportadores de carboxilatos da membrana plasmática de levedura pertencentes à família AceTr, conhecidos como Atos (Acetate Transporter Orthologs), parecem desempenhar um papel crucial na absorção destes substratos em C. albicans. Estudos prévios identificaram os ortólogos do transportador de acetato Ato1 (Ady2) de Saccharomyces cerevisiae em várias espécies do género Candida. Em C. albicans, foram detetados oito ortólogos, cujas funções ainda são desconhecidas. O objetivo desta tese foi a determinação da função e estrutura de transportadores de C. albicans pertencentes à família Ato e Jen, por expressão heteróloga em S. cerevisiae. Para o efeito, construímos 5 plasmídeos contendo os genes ATO selecionados sob o controlo do promotor GPD, usando a metodologia de Gap Repair. Adicionalmente, usando o método CRISPR-Cas9, gerámos estirpes de C. albicans contendo fusões GFP no terminal 3' dos genes ATO e JEN para determinar a expressão e a localização subcelular dos transportadores selecionados. Ensaios de microscopia de fluorescência revelaram que na presença de lactato e acetato, as proteínas CaAto1-GFP e CaAto2-GFP se localizaram na membrana plasmática, sugerindo que estes transportadores desempenham um papel importante na utilização desses substratos. Foi também realizada uma análise in-silico das proteínas Ato para determinar a sua estrutura tridimensional e a interação com substratos. Verificámos que os domínios NPAPLGL(M/S) e FLY são conservados nestas proteínas. As proteínas Ato de C. albicans aqui estudadas apresentam quatro locais putativos de ligação acetato. A previsão da estrutura 3D e do raio do poro da proteína evidenciaram que a CaAto1 e a CaAto2 têm o mesmo tamanho e estrutura de poros que a ScAto1, o que pode indicar que terão funções idênticas, enquanto que CaAto3, CaAto4 e CaAto5 ao terem estruturas distintas podem possuir uma especificidade diferente.

Dissertação de mestrado em Bioquímica Aplicada, Os polímeros de plástico são muito resistentes, têm baixa necessidade de manutenção e um baixo custo, o que os torna preferíveis a outros materiais tais como vidro, madeira e metais. Hoje em dia, os plásticos são essenciais e estão amplamente difundidos na sociedade moderna, tendo aplicações variadas que vão desde o embalamento, construção civil, indústria automóvel, eletrónica, habitação, desporto, agricultura, entre outros. O aumento da utilização e produção de plásticos nos últimos anos, aliado à sua elevada estabilidade e baixa biodegradabilidade, faz com que milhões de toneladas de plástico se acumulem anualmente, ameaçando tanto os ecossistemas como a saúde pública. Os resíduos de plástico são tratados principalmente por 3 métodos: aterro sanitário, incineração e reciclagem. No entanto, estes métodos têm custos enormes, são insustentáveis e têm várias consequências negativas, pelo que há uma necessidade urgente de novas tecnologias para a eliminação destes resíduos. Nos últimos anos, foi reportada a biodegradação de plásticos por microrganismos, o que poderá potenciar o desenvolvimento destas novas tecnologias. Os microrganismos conseguem converter os polímeros de plástico em compostos assimiláveis, fornecendo assim um ponto de partida para a economia global circular destes materiais. Neste trabalho, quatro microrganismos distintos, leveduras e bactérias, foram avaliados pelo seu potencial de biodegradação do polietileno (PE). Este polímero foi selecionado, dada a sua reduzida biodegradabilidade e enorme impacto poluente. O processo de rastreio envolveu a utilização de vários meios seletivos/diferenciais, para a determinação da capacidade de utilização de fontes de carbono específicas. O crescimento nestes meios será indicativo da produção de enzimas extracelulares envolvidas na biodegradação do PE e.g. oxidase, protease, lacase, cutinase, lipase e esterase. Apenas a Yarrowia lipolytica e Pseudomonas aeruginosa apresentaram crescimento nestes meios, não tendo sido detetado em Debaryomyces hansenii e Alcanivorax borkumensis. A capacidade de biodegradação de PE pela Y. lipolytica e P. aeruginosa foi avaliada durante 90 dias em meio líquido suplementado com o filme, tendo sido consideradosvários parâmetros: crescimento microbiano, formação de biofilme, perfil proteico extracelular; enquanto os filmes de PE foram caracterizados por ATR-FTIR, SEM e perda de peso. Os resultados indicam a capacidade dos microrganismos para se fixarem à superfície do plástico, formando biofilmes e produzindo enzimas com atividade catalítica do PE. Além disso, as análises por ATR-FTIR e SEM revelaram alterações significativas nos filmes após o período de incubação. Este trabalho evidenciou o potencial da P. aeruginosa e Y. lipolytica na biodegradação de plásticos recalcitrantes como o PE., Plastic polymers are very resistant and have low maintenance and cost, which makes them preferable to other materials such as glass, wood and metals. Nowadays, plastics are essential and ubiquitous in modern society, having varied applications, ranging from packaging, construction, automobiles, electronics, household, sports, agriculture, among others. The increased use and production of plastics in recent years, combined with their high stability and low biodegradability, causes millions of tons of plastic to accumulate annually, threatening ecosystems and public health, while posing a real and growing environmental problem. The plastic waste produced is mainly eliminated by 3 different methods: landfill, incineration, and recycling. These plastic waste treatment methods have enormous costs, are unsustainable and have several negative consequences. Thus, there is an urgent need for new technologies for the disposal of plastic waste. In recent years, there have been several reports on the biodegradation of plastics by microorganisms which could promote the development of these new technologies. Microorganims can convert plastic polymers into assimilable compounds, providing a starting point for a global circular economy of plastics. In this work, four different microorganisms, yeasts and bacteria, were evaluated for their potential to biodegrade polyethylene (PE), which was selected for its very low biodegradability, and huge impact as pollutant. To do this, a screening process involving the use of several different selective/diferential media was performed to assess the potential of the microorganisms to use specific carbon sources, indicative of the ability to produce extracellular enzymes, e.g. oxidase, proteases, laccase, cutinases, lipases and esterases, involved in polyethylene biodegradation. While Debaryomyces hansenii and Alcanivorax borkumensis were unable to utilize the substrates, Yarrowia lipolytica and Pseudomonas aeruginosa used them as carbon and energy source. The potential plastic biodegradation capacity of Y. lipolytica and P. aeruginosa was then evaluated for 90 days in liquid media supplemented with PE film. During this period, several parameters were investigated namely, microbial growth, biofilm formation and extracellular protein profile, whereas the PE films were characterized by ATR-FTIR, SEM and weight loss. Results indicate the ability of the microorganisms to attach and adhere to the surface of the plastic materials, forming biofilms and producing enzymes with PE catalytic activity. Moreover, ATR-FTIR and SEM analyses revealed significant changes in the PE films after the incubation period. Thus, this work demonstrates the potential of using P. aeruginosa and Y. lipolytica for the biodegradation of recalcitrant plastics such as PE., Projeto ECOBiB (ref. POCI-01-0247-FEDER-033997) cofinanciado pelo Programa Operacional Competitividade e Internacionalização (POCI), através do Portugal2020 e do Fundo Europeu de Desenvolvimento Regional (FEDER) Projeto River2OCean (ref. NORTE-01-0145-FEDER-000068) cofinanciado pelo NORTE2020 através do Fundo Europeu de Desenvolvimento Regional (FEDER).

Dissertação de mestrado em Bioinformática, Por definição, o genoma de um indivíduo é todo o seu ácido desoxirribonucléico (DNA), podendo-se inferir o proteoma a partir do mesmo, uma vez que corresponde à porção de DNA que dá origem ao ácido ribonucleico mensageiro (mRNA). Sabe-se que, em todos os genomas analisados, cerca de 30% do DNA que é transcrito para mRNA codifica para proteínas transportadoras - transportoma. Este, por sua vez, refere-se ao conjunto das proteínas transportadoras de membrana, que apresentam um papel fundamental a nível biológico, tal como transporte de fármacos, e que constituem importantes alvos terapêuticos. Atualmente existe a necessidade de criar ferramentas automáticas que a partir de um proteoma completo permitam inferir quais prováveis proteínas transportadoras membranares. Devido a falta de ferramentas bioinformáticas integradas que auxiliem o estudo dos transportadores, surge a necessidade de criar novas ferramentas, como as apresentadas neste projeto. Para desenvolver estas tecnologias, usou-se por base três diferentes metodologias: i) plataformas disponíveis online, TMHMM, Pred-TMBB, Prosite e CDD, acedidas por meio de API’s e bibliotecas - TransPredict; ii) bibliotecas e ferramentas online usadas para gerar features para criar os datasets e os modelos de Machine Learning; iii) modelos de Deep Learning. Ao longo das etapas de desenvolvimento das diversas metodologias foram extraídas matrizes de confusão de todas as abordagens, de modo a simplicar a análise dos resultados obtidos. No caso dos modelos de ML e DL, fez-se, ainda, a avaliação dos modelos com os dados de teste, antes de serem aplicados nos genomas da Escherichia coli e da Saccharomyces cerevisiae, bem como uma análise exploratória para caracterizar a composição do dataset utilizado para treinar os modelos, principalmente de ML. De todas as abordagens testadas, as que obteveram melhores resultados foi a ferramenta TransPredict e os modelos de DL, com resultados próximos. Verificou-se que os modelos de ML ficaram aquém do esperado. Apesar de se ter detetado algumas limitações e havendo melhorias a implementar, a tarefa foi terminada com sucesso, e este projeto tem potencial para ser mais explorado e desenvolvido, uma vez que constitui um marco importante na investigação dos transportadores, nas diversas áreas de aplicação dos mesmos., By definition, the genome of an individual it’s its entire deoxyribonucleic acid (DNA), and the proteome can be inferred from it, since it corresponds to the portion of DNA that gives rise to messenger ribonucleic acid (mRNA). It is known that, in all the analyzed genomes, about 30% of the DNA that is transcribed to mRNA encodes a transporter protein - transportome. This, in turn, refers to the set of membrane transport proteins, which play a fundamental role at the biological level, such as drug transport, and which constitute important therapeutic targets. Currently there is a need to create automatic tools that, from a complete proteome, allow inferring which likely membrane transport proteins are. These integrated bioinformatics tools will allow the study of transporter proteins at a large scale. To develop these technologies, three different methodologies used in this work: i) available online platforms, TMHMM, Pred-TMBB, Prosite and CDD, accessed through API’s and libraries - TransPredict; ii) libraries and online tools used to generate features to create datasets and Machine Learning models; iii) Deep Learning models. Throughout the development stages of the various methodologies, confusion matrices were extracted from all approaches, in order to simplify the analysis of the results obtained. In the case of the ML and DL models, the models were also evaluated with the test data, before being applied to the genomes of Escherichia coli and Saccharomyces cerevisiae, as well as an exploratory analysis to characterize the composition of the dataset used to train the models, mainly ML. Of all the approaches tested, the tool TransPredict and the DL models presented the best results, with similar results. It was found that the ML models were below expectations. Although some limitations were detected and are still improvements to be implemented, the task was successfully completed. Nevertheless this project has the potential to be further explored and developed, since it constitutes an important milestone in the investigation of transporters, in the different areas of application of the same.