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CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior CNPq - Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico FAPEMIG - Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado de Minas Gerais FAPESP - Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado de São Paulo O vírus Chikungunya (CHIKV), agente causador da febre Chikungunya, é transmitido principalmente pela picada de mosquitos hematófagos do gênero Aedes. A doença é caracterizada por sintomas como artralgias e poliartralgias debilitantes, as quais podem permanecer por meses ou anos. Até o momento, não existem medicamentos antivirais disponíveis para tratar as manifestações do CHIKV. Neste contexto, a Imidazolnaftiridina (RO8191) é um composto sintético com atividade antiviral previamente documentada contra o Hepacivirus C (HCV) e o Zika vírus (ZIKV), porém, a atividade anti-CHIKV do RO8191 ainda não foi elucidada. Portanto, este trabalho teve como objetivo avaliar os efeitos do RO8191 na infecção por CHIKV in vitro, utilizando o CHIKV-nanoluc, uma construção viral inserida de um gene reporter (-nanoluc), para infectar células de rim de hamster bebê (BHK-21). A análise de viabilidade celular foi avaliada por meio de ensaios de MTT e a taxa de infectividade pela quantificação de luminescência. Ensaios de adição do composto em diferentes estágios do ciclo replicativo do CHIKV foram realizados, bem como células BHK-CHIKV-NCT, que expressam proteínas não estruturais do CHIKV e os genes Renilla luciferase e EGFP, também foram utilizadas para avaliar o efeito do RO8191 na replicação viral. O RO8191 inibiu fortemente a replicação do CHIKV com um índice de seletividade (SI) de 12,3 e 18,7 em células BHK-21 e BHK-CHIKV-NCT, respetivamente. Além disso, o composto inibiu todos os estágios virais avaliados, com maiores taxas de inibição nas etapas viricida (75,4%) e pós-tratamento (87%). RO8191 é um agonista do IFN-α, e para avaliar o efeito independente dessa via, os ensaios também foram realizados em células VERO-E6, que não expressam os genes que codificam interferons tipo I (IFN-I-/-). Como resultado, RO8191 demonstrou um SI de 37,3 apresentando efeito em todas as etapas, principalmente na virucida (70,5%) e pós-tratamento (91,6%). Ensaios de espectroscopia de infravermelho (ATR-FTIR) e experimentos de ancoragem molecular foram realizados e demonstraram interações de RO8191 principalmente com as glicoproteínas do CHIKV. Os resultados aqui apresentados enfatizam o potencial anti-CHIKV do RO8191, o qual pode ser futuramente capitalizado como uma alternativa terapêutica para o tratamento da febre Chikungunya. The Chikungunya virus (CHIKV), the causative agent of Chikungunya fever, is transmitted mainly by the bite of hematophagous mosquitoes of the Aedes genus. The disease is characterized by symptoms such as disabling arthralgias and polyarthralgia, which can persistent for months or years. Up to date, there are no antiviral drugs available to treat CHIKV manifestations. In this context, Imidazolnaphtyridine (RO8191) is a compound with antiviral activity previously reported against the Hepacivirus C (HCV) and Zika virus (ZIKV), however, the anti-CHIKV activity of RO8191 has not yet been elucidated. Therefore, this work aimed to evaluate the effects of RO8191 on CHIKV infection in vitro, employing CHIKV-nanoluc, a viral construct inserted of a reporter gene (-nanoluc), to infect baby hamster kidney cells (BHK-21). Cell viability analysis was evaluated through MTT assays and infectivity rates through luminescence assays. We developed time of drug-addition assays in different stages of the CHIKV replicative cycle, as well as BHK-CHIKV-NCT cells, that express CHIKV non-structural proteins and Renilla luciferase and EGFP reporters, were also used to analyze the effects of RO8191 on viral replication. RO8191 strongly inhibits the CHIKV replication with a selectivity index (SI) of 12.3 and 18.7 in BHK-21 and BHK-CHIKV-NCT cells, respectively. Additionally, the compound inhibited all viral stages evaluated, with higher rates of inhibition in viricidal (75.4%) and post-treatment (87%). Due to the IFN-α agonism by RO8191, and to analyze an independent of this pathway effect, assays were also developed all employing VERO-E6 cells, which do not encode type I interferons (IFN-I-/-). As a result, RO8191 presented SI of 37.3 and had effects in all viral replication steps, but mainly in viricidal (70.5%) and post-treatment (91.6%) assays. Infrared spectroscopy assays (ATR-FTIR) and molecular docking experiments were carried out and demonstrated interactions mainly between RO8191 and CHIKV glycoproteins. Our data highlights the anti-CHIKV potential exerted by RO8191, that could be future capitalized as an alternative treatment against Chikungunya fever. Dissertação (Mestrado) 2024-10-10

CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior O tratamento convencional da toxoplasmose congênita tem poucas opções eficazes, mas os mais usados são drogas baseia-se principalmente na combinação de sulfadiazina e pirimetamina. No entanto, a terapia com esses medicamentos está associada a efeitos colaterais graves e resistência, exigindo o estudo de novas estratégias terapêuticas. Atualmente, existem muitos estudos com produtos naturais, incluindo o óleo de Copaifera, mostrando ação contra alguns patógenos como Trypanosoma cruzi e Leishmania. No presente estudo, investigamos os efeitos do extrato etanólico das folhas e da oleorresina de Copaifera multijuga contra Toxoplasma gondii em células trofoblásticas vilosas humanas (BeWo) e extravilosas (HTR8/SVneo), bem como em explantes de vilosidades humanas de terceiro trimestre gestacional. Com este propósito, ambas as células e explantes vilosos foram infectados ou não com T. gondii, tratados com extrato etanólico ou oleorresina de C. multijuga e analisadas quanto à toxicidade celular, proliferação parasitária, produção de citocinas e ROS. Paralelamente, ambas as células foram infectadas por taquizoítos pré-tratados com extrato etanólico ou oleorresina, e observou-se adesão, invasão e replicação do parasito. Nossos resultados mostraram que o extrato e a oleorresina não desencadearam toxicidade em pequenas concentrações e foram capazes de reduzir a proliferação intracelular de T. gondii em células previamente infectadas. Além disso, extrato etanólico e oleorresina demonstraram ação antiparasitária irreversível em células BeWo e HTR8/SVneo. Em seguida, a adesão, invasão e replicação de T. gondii foram atenuadas quando células BeWo ou HTR8/SVneo foram infectadas com taquizoítos pré-tratados. Finalmente, células BeWo infectadas e tratadas regularam positivamente a IL-6 e modularam negativamente a IL-8, enquanto as células HTR8/SVneo não alteraram significativamente essas citocinas quando infectadas pelo parasito. Finalmente, o extrato etanólico e a oleorresina reduziram a proliferação de T. gondii em explantes de vilosidades humanas, e provavelmente esse efeito é um mecanismo de ação direta sobre os parasitos. Assim, compostos de C. multijuga apresentaram diferentes atividades antiparasitárias de forma dependente da população trofoblástica, sendo a ação direta sobre os taquizoítos um mecanismo comum operando em ambas as células. Considerando todos esses parâmetros, o extrato etanólico e a oleorresina de C. multijuga podem ser alvos para o estabelecimento de uma nova estratégia terapêutica para a toxoplasmose congênita. Conventional treatment of congenital toxoplasmosis has few effective options, but the most used are drugs based mainly on the combination of sulfadiazine and pyrimethamine. However, therapy with these drugs is associated with severe side effects and resistance, requiring the study of new therapeutic strategies. Currently, there are many studies with natural products, including Copaifera oil, showing action against some pathogens such as Trypanosoma cruzi and Leishmania. In the present study, we investigated the effects of ethanol extract from leaves and oleoresin of Copaifera multijuga against Toxoplasma gondii in human villous (BeWo) and extravillous (HTR8/SVneo) trophoblastic cells, as well as in third trimester human villous explants. For this purpose, both cells and villous explants were infected or not with T. gondii, treated with ethanol extract or oleoresin from C. multijuga and analyzed for cellular toxicity, parasite proliferation, cytokine and ROS production. In parallel, both cells were infected by tachyzoites pre-treated with ethanol extract or oleoresin, and adhesion, invasion and parasite replication were observed. Our results showed that the extract and oleoresin did not trigger toxicity at low concentrations and were able to reduce intracellular proliferation of T. gondii in previously infected cells. In addition, ethanol extract and oleoresin demonstrated irreversible antiparasitic action on BeWo and HTR8/SVneo cells. Then, T. gondii adhesion, invasion and replication were attenuated when BeWo or HTR8/SVneo cells were infected with pre-treated tachyzoites. Finally, infected and treated BeWo cells up-regulated IL-6 and down-modulated IL-8, while HTR8/SVneo cells did not significantly alter these cytokines when infected by the parasite. Finally, the ethanol extract and oleoresin reduced the proliferation of T. gondii in human villi explants, and this effect is probably a direct mechanism of action on the parasites. Thus, compounds from C. multijuga showed different antiparasitic activities in a trophoblastic population-dependent manner, with the direct action on tachyzoites being a common mechanism operating in both cells. Considering all these parameters, the ethanolic extract and the oleoresin from C. multijuga can be targets for the establishment of a new therapeutic strategy for congenital toxoplasmosis. Dissertação (Mestrado)