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It has been reported that patients with rheumatoid arthritis (RA), Crohn's disease (CD) and spondyloarthritis (SpA) treated with selective tumor necrosis factor-alpha (TNF-?) inhibitors develop autoantibodies such as antinuclear antibodies (ANA) and anti-double stranded DNA (anti-dsDNA) antibodies. TNF-? is a pro-inflammatory cytokine that is produced by multiple cell types, including blood monocytes, macrophages, mast cells and endothelial cells, and plays multiple complex functional roles within the immune system, including the stimulation of inflammation, cytotoxicity, the regulation cell adhesion and the induction of cachexia. There are therefore a number of potential mechanisms by means of which anti-TNF-? treatment could be beneficial in RA, CD and other diseases. RA is a chronic inflammatory disease that primarily affects the peripheral joints and often leads to tissue degradation and the destruction of bone and cartilage. As organic joint damage is irreversible, it is important to recognise and treat RA early with the aim of halting its progression. Clinical trials have demonstrated that TNF-? blocking agents are highly beneficial for most patients with RA refractory to classic treatment with disease-modifying antirheumatic drugs (DMARDs), but a significant number also fail to respond to anti-TNF-? therapy. No reliable predictive markers of a clinical response have been identified, although a recent report suggests that reduced rheumatoid factor (RF) and anti-cyclic citrullinated peptide (anti-CCP) antibody levels may be useful adjuncts when assessing treatment efficacy. A reduction in IgM-RF titres was initially described by Charles et al. in a small series of patients receiving infliximab, but the subsequent findings were inconsistent. Two recent studies have found decreased RF and anti-CCP antibody titres in RA patients treated with infliximab. In both cases, decrease paralleled the improvements in the disease activity scores, but one group reported a return to baseline levels when the follow-up was extended to 54 and 78 weeks. However, De Rycke et al. showed that RF, but not anti-CCP antibodies, is modulated by infliximab in RA and our findings support the existing evidence that RF and anti-CCP antibodies are independent autoantibody systems in RA. CD is a chronic inflammatory disease of the gastrointestinal tract whose variable clinical course is characterised by segmental transmural inflammation and granulomatous changes of unknown origin. Infliximab is a chimeric IgG1 monoclonal anti-TNF-? antibody that represents a significant advance in the treatment of CD. Controlled clinical trials have demonstrated its effectiveness in rapidly induces and maintains remission in patients with moderate/severe refractory CD, healing endoscopic lesions, and treating draining perianal (PA) fistulae in the short and long term. Moreover, audit data from North America and Europe have shown that its efficacy in clinical practice is comparable with that observed in clinical trials. Trials have shown that CD and RA patients develop ANAs and anti-dsDNA antibodies: according to the reported safety data, respectively 63.8% and 49.1% of patients develop newly positive ANAs during infliximab treatment, and respectively 13% and 21.5% develop newly positive anti-dsDNA antibodies. Two important papers have described the risk of immunogenicity induced by infliximab treatment in CD patients: Baert et al. showed that the development of antibodies against infliximab leads to infusion reactions and a shorter treatment response to treatment and, as concomitant immunosuppressive therapy reduces the magnitude of the immunogenic response, concluded that it is necessary to combine methotrexate (MTX) and infliximab in order to reduce the risk of the appearance of anti-idiotypic autoantibodies; and Vermeire et al. found a cumulative 24-month incidence of ANAs in 71/125 patients (56.8%), almost half of whom developed ANAs after the first infusion and >75% became ANApositive after fewer than three infusions. However, lower percentages have been reported in patients treated with etanercept. Interestingly, these autoantibodies have been only anecdotally associated with clinical manifestations suggesting drug-induced systemic lupus erythematosus (SLE). It was thought that the absence of such an association was related to the IgM or IgA isotypes of anti-dsDNA antibodies, as well as low antibody affinity (in contrast with the widely accepted relationship between SLE and the high affinity IgG isotype). However, the occurrence of these autoantibodies is now considered a drug class-related side effect, despite the higher prevalence of ANAs and anti-dsDNA antibodies in patients treated with infliximab than in those treated with etanercept, and the absence of a flare when etanercept therapy was started in a patient with previous infliximab-induced SLE. Finally, anti-phospholipid antibodies (aPL), which are mainly detectable by means of anti-cardiolipin assay (aCL), have also been reported in RA patients receiving TNF-? blockers. In some cases, their appearance was related to concomitant infectious processes, but no clear correlation was found with the specific clinical manifestations of anti-phospholipid syndrome, although one paper suggests that they may predict a poor clinical outcome. The aim of this thesis is to evaluate prospectively the auto-antibody profiles of CD and RA patients treated with infliximab and adalimumab, and their relationships to clinical outcomes. In particular, the aim of the first one-year prospective study was planned to evaluated: a) the clinical efficacy of adalimumab; b) whether the prevalence and titres of RAassociated auto-antibodies, such as RF and anti-CCP antibodies correlate with treatment effect; and c) whether non organ-specific auto-antibodies are induced by adalimumab like other TNF-? blocking agents. The aim of the second study was evaluated: the frequency and correlation of autoantibody development at standardised timepoints in refractory/inflammatory and fistulising CD patients in a routine clinical setting. Finally, the findings were related to disease status before the start of infliximab treatment, the response to infliximab treatment and the onset of adverse clinical events. The first part of this thesis considers the role of TNF-? in RA and CD, and the efficacy of anti-TNF-? agents in inducing auto-antibodies (including two recent reviews by our group and a recently published case report); the second evaluates the mechanisms involved in auto-antibody development in CD and RA patients receiving anti-TNF-? treatment; and the third briefly summarises two original studies, together with their discussion and conclusions.

[ES] La presente tesis "Vías de inmovilización de biomoléculas sobre SU-8 y otras superficies poliméricas para su utilización en biosensado óptico sin marcaje" tiene como objetivo el diseño, desarrollo y evaluación de diferentes métodos de anclaje de biorreceptores en distintos materiales, en formato de micromatriz, con aplicación en biosensado. En la actualidad sigue siendo un área de creciente interés desarrollar nuevos sistemas de análisis para la detección de analitos, más sensibles y selectivos, con tiempos de análisis reducidos, miniaturizables y automatizables. Estos desarrollos pueden aplicarse en dispositivos biosensores que encuentran su aplicación en campos tan diversos como diagnóstico clínico, medicina forense y medio ambiente. Con el objetivo de desarrollar biosensores con prestaciones mejoradas se estudiaron estrategias de inmovilización de sondas sobre el soporte de ensayo basadas en el empleo de hidrogeles. En una primera fase, los desarrollos se realizaron usando tecnología de micromatrices de fluorescencia, que permite utilizar una menor cantidad de muestra y analizar múltiples analitos y muestras a la vez, reduciendo el tiempo de análisis y el coste Posteriormente, los desarrollos ya optimizados se emplearon para la puesta a punto de un biosensor óptico sin marcaje de tipo BICELL (Biophotonic Sensing Cells) en colaboración con la UPM (Universidad Politecnica de Madrid), que se aplicaron a sistemas modelo y a problemas reales. Asimismo, y en colaboración con el Centro de Tecnología Nanofotónica de la UPV, se implementó la estrategia de inmovilización a través del uso de hidrogeles, en biosensores ópticos sin marcaje constituidos por guías de ondas corrugadas. En este caso, además de la inmovilización a través de hidrogeles, se estudió un método de inmovilización covalente de fragmentos de anticuerpos que permitió su fijación orientada y muy próxima a la superficie del sensor. La tesis se estructura en seis capítulos. En el Capítulo 1 se da una visión general del concepto de biosensado, atendiendo a las distintas clasificaciones y los diferentes aspectos que hay que considerar en su diseño. En el Capítulo 2 se plantean los objetivos generales y particulares de la tesis. El Capítulo 3 plantea la aplicación de dos hidrogeles fotoinducidos derivados de fosforicolina y dextrano para mejorar la inmovilización de biomoléculas en formato micromatriz, sobre superficies planas y usando el formato de micromatriz de fluorescencia para realizar ensayos de detección con proteínas y oligonucleótidos. La polimerización del gel y el anclaje de las sondas se lleva a cabo simultáneamente mediante la utilización de reacciones fotoinducidas empleando la química click de acoplamiento tiol-eno. En el Capítulo 4 se implementa el método desarrollado en micromatriz con uno de los hidrogeles en dos tipos de biosensores interferométricos sin marcaje fabricados en SU-8. Con ambos sensores se detecta CRP en suero con muy buena sensibilidad (, LOD de 21 pg/mL). Por otro lado, esta estrategia se ensaya también en sensores nanofotónicos basados en guías de ondas corrugadas con resultados prometedores. En este capítulo también se pone a punto y se evalúa en tiempo real la inmovilización de fragmentos de anticuerpo sobre la superficie del sensor nanofotónico, mediante la reacción de acoplamiento tiol-eno inducida por luz UV. La monitorización en tiempo real permite demostrar el papel indispensable de la luz en el proceso de inmovilización. Utilizando esta aproximación se ensaya la detección sin marcaje de tres biomarcadores cardíacos de interés (CRP, cTnI/T y Mioglobina). El quinto capítulo se dedica a la descripción detallada de todos los procedimientos experimentales que se llevan a cabo en los Capítulos 3 y 4. Finalmente, el Capítulo 6 recoge las conclusiones alcanzadas a partir de los resultados obtenidos en el desarrollo de la tesis doctoral., [EN] This thesis "Biomolecule immobilization approaches on SU-8 and other polymer surfaces for label-free optical biosensing" aims to design, develop and evaluate different methods for anchoring bioreceptors in different materials, in a microarray format, with application in biosensing. Currently, it is still an area of growing interest to develop new analysis systems for the detection of biomolecules, being more sensitive and selective, with reduced analysis time, miniaturizable and automatable. These developments can be applied in biosensing devices that find utility in fields as diverse as clinical diagnosis, forensic medicine and environmental monitoring. To develop biosensors with improved performance, here strategies for immobilization of probes on the test support based on the use of hydrogels were studied. In a first phase, the developments were carried out using microarray technology, which uses lower amount of sample and can analyze multiple targets and samples at the same time, reducing tests time and cost. Subsequently, the optimized developments were used to develop, in collaboration with UPM (Polytechnic University of Madrid), a label-free optical biosensor based onBICELLs (Biophotonic Sensing Cells), which were applied to model systems and real samples. Likewise, and in collaboration with the Nanophotonic Technology Center at UPV, the hydrogel-based immobilization strategy was implemented in other label-free nanophotonic biosensors consisting of corrugated waveguides. In this case, in addition to immobilization through hydrogels, we studied a method of covalent immobilization of antibody fragments that allowed them to be oriented and very close to the sensor surface. Thus the thesis is organized into six chapters. Chapter 1 gives an overview of the concept of biosensing, and takes into account the different classifications and different items that must be considered in its design. Chapter 2 sets out the general and particular objectives of the thesis. Chapter 3 discusses the application of two photoinduced hydrogels, derived from phosphoricoline and dextran, respectively, to improve the immobilization of biomolecules in microarray format, on planar surfaces and using the fluorescence microarray format to perform detection assays with proteins and oligonucleotides. The polymerization of the gel and the anchoring of the probes are carried out using photoinduced reactions using the thiol-ene coupling click chemistry, and derivatives, performing both steps simultaneously. In Chapter 4 the method developed with one of the hydrogels in microarray format is transferred to two types of SU-8 based interferometric label-free biosensors. Both biosensors detected CRP in blood serum with very good sensitivity (LOD de 21 pg/mL). Besides, this strategy is also tested on nanophotonic sensors based on corrugated waveguides with promising results. In this chapter, immobilization of antibody fragments on the surface of the nanophotonic sensor is also performed and assessed in real time by the UV light-induced thiol-ene coupling reaction. Real-time monitoring shows the essential role of light in the immobilization process. Using this approach, the label-free detection of three cardiac biomarkers of interest (CRP, cTnI / T and Myoglobin) is tested. The fifth chapter is devoted to the detailed description of all the experimental procedures that are carried out in chapters 3 and 4. Finally, Chapter 6 collects the conclusions reached from the results obtained in the development of the doctoral thesis., [CA] La present tesi "Vies d'immobilització de biomolècules sobre SU-8 i altres superfícies polimèriques per a la seva utilització en biosensado òptic sense marcatge" té com a objectiu el disseny, desenvolupament i avaluació de diferents mètodes d'ancoratge de bioreceptors en diferents materials, en format de micromatriu , amb aplicació en biosensat. En l'actualitat segueix sent una àrea de creixent interès desenvolupar nous sistemes d'anàlisi per a la detecció de biomolècules, que siguen més sensibles i selectius, amb temps d'anàlisi reduïts, miniaturizables i automatitzables. Aquests desenvolupaments poden aplicar-se en dispositius biosensors que troben la seva utilitat en camps tan diversos com diagnòstic clínic, medicina forense i medi ambient. Amb l'objectiu de desenvolupar biosensors amb prestacions millorades es van estudiar estratègies d'immobilització de sondes sobre el suport d'assaig basades en l'ús de hidrogels. En una primera fase, els desenvolupaments es van realitzar usant tecnologia de micromatrius, que permet utilitzar una menor quantitat de mostra i analitzar múltiples dianes i mostres alhora, reduint el temps d'anàlisi i el cost Posteriorment, els desenvolupaments ja optimitzats es van emprar per a la posada a punt d'un biosensor òptic sense marcatge de tipus BICELL (Biophotonic Sensing Cells) en col·laboració amb la UPM (Universitat Politècnica de Madrid), que es van aplicar a sistemes model i als problemes reals. Així mateix, i en col·laboració amb el Centre de Tecnologia Nanofotònica de la UPV, es va implementar l'estratègia d'immobilització a través de l'ús de hidrogels, en biosensors òptics sense marcatge constituïts per guies d'ones corrugades. En aquest cas, a més de la immobilització mitjançant hidrogels es va estudiar un mètode d'immobilització covalent de fragments d'anticossos que va permetre la seva unió orientada i molt propera a la superfície del sensor. Així donç, la tesi s'estructura en sis capítols. En el capítol 1 es dóna una visió general delconcepte de biosensat, atenent les diferents classificacions i els diferents aspectes que cal considerar en el seu disseny. En el capítol 2 es plantegen els objectius generals i particulars de la tesi. El Capítol 3 planteja l'aplicació de dos hidrogels fotoinduïts derivats de fosforicolina i dextrà respectivament per millorar la immobilització de biomolècules en format micromatriu, sobre superfícies planes i usant el format de micromatriu de fluorescència per a realitzar assajos de detecció amb proteïnes i oligonucleòtids. La polimerització dell gel i l'ancoratge de les sondes es porta a terme simultàniament mitjançant la utilització de reaccions fotoinducides emprant la química click d'acoblament tiol-eno, i derivades. En el capítol 4 s'implementa el mètode desenvolupat en micromatriu amb un dels hidrogels en dos tipus de biosensors interferométricos sense marcatge basats en SU-8. Amb tots dos sensors es detecta CRP en sèrum sanguini amb molt bona sensibilitat (LOD de 21 pg/mL). D'altra banda, aquesta estratègia s'assaja també en sensors nanofotònics basats en guies d'ones corrugades amb resultats prometedors. En aquest capítol també es posa a punt i s'avalua en temps real la immobilització de fragments d'anticòs sobre la superfície del sensor nanofotònic, mitjançant la reacció d'acoblament tiol-eno induïda per llum UV. El monitoratge en temps real permet demostrar el paper indispensable de la llum en el procés d'immobilització. Utilitzant aquesta aproximació s'assaja la detecció sense marcatge de tres biomarcadors cardíacs d'interès (CRP, cTnI / T i Mioglobina). El cinquè capítol es dedica a la descripció detallada de tots els procediments experimentals que es duen a terme en els capítols 3 i 4. Finalment, el Capítol 6 recull les conclusions assolides a partir dels resultats obtinguts en el desenvolupament de la tesi doctoral., Agradecer a la financiación de esta investigación por Garantía Juvenil, FEDER y los proyectos del MINECO CTQ / 2016/75749‐R y TEC / 2017/84846‐R. Además, fue apoyado por el Programa Horizonte 2020 de la Unión Europea en el marco del proyecto H2020‐PHC‐634013 (PHOCNOSIS).

Se presenta la experiencia clínica con el uso de Omalizumab en 8 pacientes pediátricos en nuestro país. Todos los pacientes presentaban asma sin control a pesar de recibir terapia de alta intensidad, asociado a una muy deficiente calidad de vida. La totalidad de los pacientes fueron sometidos en cada centro a un estudio exhaustivo para poder descartar error en el diagnóstico y se evaluó la adherencia y la técnica inhalada. Al comprobarse que estos pacientes tenían asma severo resistente a tratamiento se indicó Omalizumab, el cual produjo una mejoría clínica significativa. Se observó una reducción de las exacerbaciones y de los síntomas de asma acompañado de una mejoría de la calidad de vida, asociado a un buen perfil de seguridad. Se observaron reacciones adversas leves y transitorias en 6 administraciones de un total de 122. This paper presents clinical experience with Omalizumab treatment in 8 pediatric patients in Chile. All children presented difficult to control asthma despite receiving high intensity treatment, with low quality of life. All patients were studied in order to discard errors in asthma diagnosis and to evaluate asthma treatment adherence and inhalation technique. After evaluation, patients proven to have severe therapy resistant asthma were indicated treatment with Omalizumab. Significant clinical improvement was observed, with reduced asthma symptoms and number of exacerbations, as well as an improved quality of life. Omalizumab showed a good safety profile with mild and transient adverse reactions in 6 administrations of a total of 122.

La generació d’anticossos àmpliament neutralitzants contra el VIH-1 es el principal objectiu d’una vacuna que sigui capaç de controlar l’epidèmia causada per aquest virus. La glicoproteïna de l’embolcall del VIH-1 es l’únic antigen viral exposat a la membrana del virus y la principal diana de respostes humorals protectores. Dins d’aquesta proteïna han sigut identificades regions funcionals reconegudes per anticossos àmpliament neutralitzants, fent possible la definició de punts de vulnerabilitat del virus, cap als que una vacuna hauria de dirigir-se. En aquest context, la regió externa pròxima a la membrana (MPER) de la gp41 es un dels llocs de vulnerabilitat més representatius del virus, ja que està altament conservat, té un paper crucial per a la infectivitat del virus i es reconegut per anticossos protectors àmpliament neutralitzants. Tot i així, la seva situació, prop a la membrana, fa que el MPER sigui un domini poc accessible, exposat de manera transitòria, hidrofòbic i altament influenciat pels lípids de la membrana. Per tant, la seva immunogenicitat presenta una alta complexitat que ha de ser explorada en major profunditat. En aquesta tesi, aportem nou coneixement sobre l’immunogenicitat del MPER durant l´infecció natural i en models animals d’immunització. S’han avaluat miniproteïnes derivades de la gp41 que sobreexposen el MPER, per ser utilitzades com 1) nous plataformes per a la detecció d’anticossos anti-MPER i 2) prototipus d’immunògens presentats en proteoliposomes de diversa composició. Els resultats van revelar una alta immunogenicitat del MPER en humans, que correlaciona amb la resposta global contra la proteïna de l’embolcall, suggerint que el sistema immune no té cap restricció per a la generació d’aquest tipus d’anticossos. Tot i així, els anticossos detectats van mostrar una funcionalitat heterogènia, tant pel que fa a la capacitat neutralitzant com a la competició per diferents epítops, independentment de l’especificitat per MPER. A més, aquest resultats van ser reproduïts en animals immunitzats. En aquest últims, s’ha aconseguit generar un alt títol d’anticossos específics, que van ser potenciats per la incorporació als proteoliposomes de lípids complexes que mimetitzaven als de la partícula viral. Sorprenentment, es va generar una resposta immunodominant no neutralitzant contra un epítop solapant amb el de l’anticòs neutralitzant 2F5. En resum, la resposta humoral contra el MPER a humans i animals immunitzats no va correlacionar amb la capacitat neutralizant d’aquests i els anticossos generats són principalment no neutralitzants. Aquests resultats suggereixen que el balanç de la resposta neutralitzant i no neutralitzant té una important rellevància en la resposta global contra el MPER. Conseqüentment, sembla necessari un major refinament d’immunògens capaços d’evitar respostes no neutralitzants. Aquest redisseny es veurà altament beneficiat pel coneixement generat a partir de nous anticossos monoclonals contra el MPER que recullin l’heterogeneïtat funcional observada als nostres estudis., La generación de anticuerpos ampliamente neutralizantes contra el VIH-1 es el principal objetivo de una vacuna que sea capaz de controlar la epidemia causada por el virus. La glicoproteína de la envuelta del VIH-1 es el único antígeno viral expuesto en la membrana del virus y la principal diana de respuestas humorales protectoras. Dentro de esta proteína se han identificado regiones funcionales que son reconocidas por anticuerpos ampliamente neutralizantes, lo cual ha permitido establecer puntos de vulnerabilidad del virus hacia los que una vacuna debería dirigirse. En este contexto, la región externa próxima a la membrana (MPER) de gp41 es uno de los sitios de vulnerabilidad del virus más representativos, ya que está altamente conservado, juega un papel crucial en la infectividad del virus y es reconocido por anticuerpos protectores ampliamente neutralizantes. Sin embargo, su localización, contigua a la membrana, hace del MPER un dominio poco accesible, expuesto de forma transitoria, hidrofóbico y altamente influenciado por lípidos de membrana. En consecuencia, su inmunogenicidad presenta una alta complejidad que debe ser explorada en mayor profundidad. En esta tesis, aportamos nuevo conocimiento sobre la inmunogenicidad del MPER a nivel de la infección natural y en modelos animales de inmunización. Hemos evaluado miniproteínas basadas en gp41 que sobreexponen el MPER, para ser utilizadas como 1) nuevas plataformas para la detección de anticuerpos anti-MPER y 2) prototipos de inmunógenos presentados en proteoliposomas de diversa composición. Los resultados han revelado una alta inmunogenicidad del MPER en humanos, que correlaciona con la respuesta global contra la proteína de la envuelta. Esto sugiere que el sistema inmune no tiene una especial restricción para la generación de este tipo de anticuerpos. Sin embargo, los anticuerpos detectados mostraron una funcionalidad heterogénea, en términos de capacidad neutralizante y competición por diferentes epítopos, independientemente de la especificidad por el MPER. Además, los resultados fueron reproducidos en animales inmunizados. En estos últimos, conseguimos generar un alto título de anticuerpos específicos, potenciados por la incorporación en los proteoliposomas de mezclas lipídicas complejas que mimetizaban las de la partícula viral. Sorprendentemente, se generó una respuesta inmunodominante no neutralizante que solapaba con un epítopo reconocido por el anticuerpo neutralizante 2F5. En resumen, la repuesta humoral natural contra el MPER en pacientes infectados por el VIH-1 y la generada en modelos animales mediante inmunización comparten ciertas características como son la especificidad y la escasa capacidad neutralizante. Estos resultados sugieren que el balance entre la respuesta neutralizante y no neutralizante podría tener una importante relevancia en la respuesta global contra el MPER. De este modo, es necesario un mayor refinamiento de inmunógenos que sean capaces de sortear respuestas no neutralizantes. Este rediseño se verá altamente beneficiado del conocimiento generado a partir de nuevos anticuerpos monoclonales contra el MPER que reflejen la heterogeneidad funcional observada en nuestros estudios., The elicitation of broadly neutralizing antibodies (bNAbs) against HIV-1 constitutes the major goal of an effective vaccine able to control the epidemic caused by this virus. The HIV-1 envelope glycoprotein is the only viral antigen exposed on the surface of the virus and the main target of protective humoral responses. The identification within this protein of functional regions recognized by bNAbs has delineated an HIV-1 vulnerability map that has guided efforts for rational immunogen design. In this regard, the gp41 Membrane Proximal External Region (MPER) is a major HIV-1 vulnerability site because is highly conserved, plays a major role in viral infectivity and is targeted by protective bNAbs. However, its localization, next to the viral membrane, results in a hardly accessible, transiently exposed and hydrophobic domain, strongly influenced by membrane lipids. Therefore, the immunogenicity of the MPER offers a high level of complexity that needs to be further explored. In this thesis we provide new knowledge on the MPER immunogenicity in both natural HIV-1 infection and immunization in animal models. We generated gp41-based miniproteins which properly exposed the MPER region that have been used 1) as novel platforms for MPER antibody detection and 2) as immunogen candidates presented in different proteoliposome compositions. In humans, the results revealed a strong immunogenicity of the MPER that correlated with a global response against the envelope glycoprotein suggesting no special constraints for the immune system to target this region. However, the antibodies elicited showed heterogeneous functionality in terms of neutralizing capacity and epitope competition, regardless MPER specificity. Interestingly, these results were reproduced by immunization in animal models. High antibody titers were achieved that were specially enhanced by the addition of lipid mixtures mimicking the viral membrane. Interestingly, a non-neutralizing immunodominant response against an epitope that overlapped the 2F5 neutralizing antibody binding motif was identified. Overall, the anti-MPER response in both humans and animal model settings was not correlated with the neutralizing capacity and antibodies detected or induced by immunization were preferentially non-neutralizing. Our results suggest that the balance between neutralizing and non neutralizing responses may represent an important issue in the global response against MPER. Therefore, further redesign of immunogens able to skip non-neutralizing determinants will benefit from the knowledge derived from new anti-MPER antibodies that reflect the functional heterogeneous profile observed in our studies.

En el presente trabajo se estudió de forma retrospectiva una cohorte de 303 pacientes con positividad confirmada de anticuerpos antifosfolípido (aPL), de acuerdo con los criterios diagnósticos de síndrome antifosfolípido (SAF). Los pacientes fueron clasificados en tres grupos: SAF trombótico puro (n=80), SAF obstétrico puro (n=138) y serología aPL (n=138), siendo el primero nuestro grupo principal a estudio. Después de 144,13 ± 48,44 meses de seguimiento, dentro del grupo trombótico un 41,2% mostró serología persistentemente positiva, frente al 46,3% que permanecieron negativos. El perfil clínico de alto riesgo trombótico resultó determinado por la edad, el sexo femenino, la dislipemia y la hipertensión; el inmunológico por el anticoagulante lúpico. Mientras que en el análisis multivariante, la edad y el LES son considerados factores de riesgo independientes para la persistencia de positividad de aPLs, la dislipemia resulta un factor protector para ello mismo, debido probablemente a un efecto indirecto de la terapia con estatinas. A pesar de que un 72,8% y en un 72,5% de los pacientes se instauró terapia anticoagulante y antiagregante respectivamente, el 43,75% de los pacientes son SAF trombótico presentó durante el seguimiento una trombosis. Los pacientes con serología persistenetemente positiva fueron tratados con más frecuencia con antipalúdicos. In the current paper a cohort of 303 patients with confirmed positivity of antiphospholipid antibodies (aPL), according to diagnostic criteria for antiphospholipid syndrome (APS), was retrospectively studied. Patients were classified into 3 groups: thrombotic APS (n=80), obstetric APS (n=75) and positive aPL without meeting the clinical SAF criteria (n=138), being the first one the main group of our cohort. After 144,13 ± 48,44 months follow-up, 41,2% of the patients showed persistent positivity of aPL, while 46,3% of them aPL remained persistently negative. The clinical thrombotic high risk profile was defined by age, female condition, dislipemia and hypertension; the immunological high risk profile was defined basically by lupus anticoagulant. While the multivariate analysis proved age and LES as independent risk factors for persistent aPL positivity, dislipemia was shown as a protective one, probably because of an indirect effect of statin treatment. Although anticoagulant and antiaggregant therapy was started in 72,8% and 72,5% of the patients respectively, in 43,75% of the thrombotic APS a thrombotic event took place. Pacients with persistence of aPL were given more antimalarials drugs. Grado en Medicina

RESUMEN Introducción: Las técnicas de Inmunohistoquímica son hoy en día una de las herramientas más importantes en el diagnostico histopatológico, sin embargo la manipulación de las muestras y el método de procesamiento puede llevar a cambios en la estructura de las proteínas que llevan a enmascaramiento de antígenos, dificultando la identificación con anticuerpos. Entre los diferentes métodos de recuperación antigénico propuestos en la literatura, el de calor húmedo con Vaporera ha tenido gran aceptación por su simplicidad, control y bajo costo. Objetivo: En el presente trabajo se propone un protocolo de recuperación antigénica con calor húmedo, en muestras de tejido óseo que ya habían sido previamente fijadas en formaldehido, decalcificadas con etilendiaminotetraacético (EDTA), e incluidas en parafina. Materiales y método: Se utilizaron muestras de tejido óseo de cerdo que habían sido preparadas con técnicas convencionales, pertenecientes a la colección del laboratorio de patología de la Universidad del Valle. Se realizó refijacion en glutaraldehido y se empleó una vaporera para intensificar la exposición de antígenos. Se utilizó como anticuerpo primario el anti TRAP de DEKO®, monoclonal, originado en ratón, y como secundario el KIT UltraVision LP Large Volume Detection System HRP Polymer ®. Resultados: En todas las muestras expuestas al anticuerpo primario en diluciones 1:20 y 1:40 se observó inmunotinción de células mononucleares compatibles con pre osteoclastos, y células gigantes multinucleadas compatibles con osteoclastos. Conclusiones: La recuperación antigénica con calor húmedo es un método confiable en la recuperación antigénica de muestras óseas fijadas con formaldehido. SUMMARY Introduction: Nowadays, Immunohistochemistry are one of the most important techniques in the histopathological diagnosis. Despite of handling and processing cautions, both of them may generate changes in the protein structure, masking antigens, preventing antibody identification. Among different antigen retrieval methods proposed by the literature, the humid heat with Steamer has been widely accepted for its simplicity, control and low cost. Objective: In this paper a protocol for humid heat antigen retrieval use in bone tissue samples that had been previously fixed in formaldehyde, decalcified with ethylenediaminetetraacetic (EDTA ), and embedded in paraffin is proposed. Materials and methods: Samples of pig’s bone that had been prepared with conventional techniques, from the collection of the pathology laboratory of the University of Valle were used. New fixed process was performed in glutaraldehyde and a steamer was used to enhance antigen exposure. The anti-TRAP DEKOs ®, mouse monoclonal antibody was used as primary antibody, and the KIT UltraVision LP Large Volume Detection System HRP Polymer ® was used as a secondary antibody. Results: In all samples exposed to primary antibody in 1:20 and 1:40 dilutions immunostaining mononuclear cells compatible with preosteoclasts were observed; immunostaining multinucleated giant cells consistent with osteoclasts were described. Conclusions: Humid heat for antigenic recovery is a reliable method for the recovery of bone antigen samples fixed with formaldehyde.

Objectives. To estimate the prevalence of antibodies against measles, rubella and hepatitis B in children aged between 1 and 4 years in Peru. Materials and methods. A national survey was conducted based on a questionnaire and capillary blood sample taken on filter paper in order to study antibodies against measles, rubella and hepatitis B in children from 1 to 4 years of age. A stratified, multistage, probability sampling design was used to be representative at the national level and at level of seven ambits, including the Metropolitan Lima Area, the rest of the urban coast, the rural coast, the urban highlands, the rural highlands, the urban jungle and the rural jungle. The capillary blood samples were processed according to the standardized protocols for detection of antibodies using the ELISA technique and commercial reagents. Results. The survey showed a national prevalence of antibodies against measles, rubella and hepatitis B of 91.6% (CI 95%: 90.6%; 92.7%), 91.3% (CI 95%: 90.3%; 92.4%) and 95.9% (CI 95%: 95.0%; 96.8%) respectively. There was no evidence of significant differences in the prevalence among the ambits of study or among the socioeconomic strata of the conglomerates for any of the three types of antibodies. Conclusions. In children from 1 to 4 years of age, the national prevalence of antibodies against measles and Rubella was between 90-93%, while the prevalence of antibodies against Hepatitis B (anti-HBsAg) was between 95-97%. Objetivos. Estimar la prevalencia de anticuerpos contra sarampión, rubéola y hepatitis B en niños de 1 a 4 años del Perú. Materiales y métodos. Se realizó una encuesta nacional basada en la aplicación de un cuestionario y obtención de muestra de sangre capilar en papel de filtro para el estudio de anticuerpos contra sarampión, rubéola y hepatitis B en niños de 1 a 4 años. Se utilizó un muestreo probabilístico, estratificado y multietápico con inferencia a nivel nacional y siete ámbitos de estudio: Lima metropolitana, resto de costa urbana, costa rural, sierra urbana, sierra rural, selva urbana y selva rural. Las muestras de sangre capilar fueron procesadas siguiendo protocolos estandarizados para la determinación de anticuerpos mediante técnica de ELISA utilizando reactivos comerciales. Resultados. Se encontró una prevalencia nacional de 91,6% (IC95%: 90,6-92,7%), 91,3% (IC 95%: 90,3-92,4%) y 95,9% (IC 95%: 95,0-96,8%) para anticuerpos contra sarampión, rubéola y hepatitis B respectivamente. No se evidenció diferencias significativas de las prevalencias entre los diferentes ámbitos de estudio y en los diferentes estratos socioeconómicos de los conglomerados. Conclusiones. En niños de 1 a 4 años se ha estimado una prevalencia nacional de anticuerpos contra sarampión y rubéola entre 90-93%, mientras que para anticuerpos contra hepatitis B (anti-HBsAg) entre 95-97%.

Objetivos. Estimar la prevalencia de anticuerpos contra sarampión, rubéola y hepatitis B en niños de 1 a 4 años del Perú. Materiales y métodos. Se realizó una encuesta nacional basada en la aplicación de un cuestionario y obtención de muestra de sangre capilar en papel de filtro para el estudio de anticuerpos contra sarampión, rubéola y hepatitis B en niños de 1 a 4 años. Se utilizó un muestreo probabilístico, estratificado y multietápico con inferencia a nivel nacional y siete ámbitos de estudio: Lima metropolitana, resto de costa urbana, costa rural, sierra urbana, sierra rural, selva urbana y selva rural. Las muestras de sangre capilar fueron procesadas siguiendo protocolos estandarizados para la determinación de anticuerpos mediante técnica de ELISA utilizando reactivos comerciales. Resultados. Se encontró una prevalencia nacional de 91,6% (IC95%: 90,6-92,7%), 91,3% (IC 95%: 90,3-92,4%) y 95,9% (IC 95%: 95,0-96,8%) para anticuerpos contra sarampión, rubéola y hepatitis B respectivamente. No se evidenció diferencias significativas de las prevalencias entre los diferentes ámbitos de estudio y en los diferentes estratos socioeconómicos de los conglomerados. Conclusiones. En niños de 1 a 4 años se ha estimado una prevalencia nacional de anticuerpos contra sarampión y rubéola entre 90-93%, mientras que para anticuerpos contra hepatitis B (anti-HBsAg) entre 95-97% Objectives. To estimate the prevalence of antibodies against measles, rubella and hepatitis B in children aged between 1 and 4 years in Peru. Materials and methods. A national survey was conducted based on a questionnaire and capillary blood sample taken on filter paper in order to study antibodies against measles, rubella and hepatitis B in children from 1 to 4 years of age. A stratified, multistage, probability sampling design was used to be representative at the national level and at level of seven ambits, including the Metropolitan Lima Area, the rest of the urban coast, the rural coast, the urban highlands, the rural highlands, the urban jungle and the rural jungle. The capillary blood samples were processed according to the standardized protocols for detection of antibodies using the ELISA technique and commercial reagents. Results. The survey showed a national prevalence of antibodies against measles, rubella and hepatitis B of 91.6% (CI 95%: 90.6%; 92.7%), 91.3% (CI 95%: 90.3%; 92.4%) and 95.9% (CI 95%: 95.0%; 96.8%) respectively. There was no evidence of significant differences in the prevalence among the ambits of study or among the socioeconomic strata of the conglomerates for any of the three types of antibodies. Conclusions. In children from 1 to 4 years of age, the national prevalence of antibodies against measles and Rubella was between 90-93%, while the prevalence of antibodies against Hepatitis B (anti-HBsAg) was between 95-97%.

Debido al desconocimiento sobre la exportación, leyes sanitarias, registros para exportar cachorros hacia los Estados Unidos, nuestro trabajo consiste en realizar un estudio sobre la factibilidad de exportar cachorros, en el país no existen protocolos , guías o manuales que orienten a las personasen cuanto a los pasos que deben seguirse para poder ser exportador de caninos y conocer además , todos los valores y derechos que se tiene tanto con los cachorros como con los pasos del proceso de exportación. El presente trabajo se justifica debido a que nuestro país cuenta con 134 criaderos de excelente calidad los cuales están asociados a la Federación Cinológica Internacional para el Ecuador , demás cuenta con cachorros de gran calidad y de acuerdo con registros de agrocalidad, las exportaciones a través del Aeropuerto ”MARISCAL SUCRE”, asciende a 791 caninos en el año 2010, cifra que es demasiado baja considerando la calidad y numero de criaderos existentes en el país , por lo que nos hemos visto en la obligación de realizar el presente trabajo , en el que demostramos que es un negocio con una buena rentabilidad por lo que se recomienda ponerla en práctica. En el presente trabajo se plantean los siguientes objetivos: Establecer la demanda interna de los criaderos de cachorros en el Ecuador, establecer la demanda externa y razas de cachorros preferidos en los Estados Unidos, requisitos para la exportación y arribo de de animales desde el Ecuador hacia Estados Unidos. Plan estratégico hacia la comercialización y exportación de cachorros. La investigación se llevó a cabo en la ciudad de Machala, se realiza un análisis del número de cachorros caninos existentes en el país, se averigua los permisos necesarios para la exportación de cachorros, requisitos y trámites aduaneros, así como las principales leyes de exportadores e importadores de cachorros. El tipo de investigación que se lleva a cabo fue una investigación de campo, debido a que la información utilizada fue recogida en el mismo lugar en donde se llevo a cabro el proyecto; fue de intervención social debido a que al final del presente trabajo se entrega los requisitos y pasos a seguir para poder exportar caninos, los mismo que va a ser de mucha utilidad para las personas dedicadas a las crías y en un futuro a la exportación de mascotas Due to ignorance on the export, sanitary laws, records to export puppies to the United States, our job is to conduct a study on the feasibility of exporting puppies in the country there are no protocols, guidelines or manuals to guide the terms personal in the steps to be exporter of dogs and to know all the values and rights that we have both puppies and with the steps of the export process. The present work is justified because our country has 134 breeding quality which are associated with the FCI for Ecuador, other puppies has high quality and according to records A quality agricultural, exports through Airport "Mariscal Sucre", amounts to 791 dogs in 2010, a figure that is too low considering the quality and number of farms in the country, so we have been obliged to make this work, which show that it is a business with a good return so we recommend putting it into practice. This paper establishes the following objectives: To establish the domestic demand for the breeding of puppies in Ecuador, setting external demand and preferred breed puppies in the United States, requirements for export and arrival of animals from Ecuador to USA. Strategic Plan to the marketing and export of puppiese research was conducted in the city of Machala, an analysis of the number of puppies dogs in the country, you find out the necessary permits for the export of puppies, requirements and customs formalities as well as major exporters and laws importing of puppies. The type of research carried out was a field investigation, because the information used was collected in the same place where I take goat the project was social intervention because the end of this work is delivered the requirements and steps to export dogs, the same is going to be very useful for people dedicated

This paper presents a dynamical model of avian immune response, for antibody production purposes. Antibodies are fundamental tools for research, diagnosis, and the treatment of several diseases. It has been recognized for some time that antibodies obtained from poultry are an efficient alternative for applications in medicine and biology. Therefore, a dynamical model for this process might be very useful. The model being proposed consists of seven non-linear ordinary differential equations with constant coefficients that represent the main cellular and molecular populations in avian immune response. Values for the parameters were obtained from avian and mammalian literature. In silico-generated responses in terms of antibody concentrations are presented and compared to reported kinetics. En este artículo se presenta un modelo dinámico de la respuesta inmune humoral de aves para la producción de anticuerpos específicos. Los anticuerpos son fundamentales para la investigación, diagnóstico y tratamiento de diversas enfermedades. Se ha reconocido que los anticuerpos obtenidos de aves de corral son una opción eficiente para aplicaciones en medicina y biología. Por tanto, un modelo que represente la dinámica de este proceso resulta de gran utilidad. El modelo está compuesto de siete ecuaciones diferenciales ordinarias, no lineales, con coeficientes constantes y representa las principales poblaciones celulares y moleculares de la respuesta inmune de las aves. Los parámetros se obtuvieron a partir de datos reportados en el área de inmunología aviar y mamífera. Las respuestas obtenidas "in silico" en términos de la concentración de anticuerpos se presentan y se comparan contra la cinética reportada.

Microorganisms are present in a variety of sources, including food, water, animals, environment as well as the human body. They can be harmless or harmful. The latter is also called pathogenic and their detection is extremely important due to health and safety reasons. It is well known that food contaminated with bacteria can produce a number of foodborne diseases. As a consequence, thousands of euros are invested each year in medical treatments trying to keep the population healthy. There are more than 250 known foodborne diseases. For example, outbreaks of salmonellosis have increased in many countries in the last decades being Salmonella Infantis one of the most important etiological agents associated with this enteric disease. Moreover, due to the wide distribution of the microorganisms, they can also contaminate foods in the field as well as during the storage stage. In that sense, filamentous fungi are one of the etiological agents responsible for most post-harvest food spoilage producing quality losses and economic devaluation. On the other hand, the invasive fungal infections due to yeast have risen considerably in recent years. Candidiasis is the so-called disease produced by Candida albicans. This is an opportunistic infection that affects immunocompromised patients requiring costly treatment with advanced medicine. Several methods have been proposed so far to detect pathogenic microorganisms. Conventional culture is highly selective and sensitive but they also require several days to yield the results. To simplify and automate the identification of both bacteria and fungi rapid biochemical kits have been developed. Although the results obtained with these kits are comparable to the traditional biochemical tests they also need 1 or 2 days to obtain results. Enzyme-linked immunosorbent assays (ELISA) can be applied for the direct identification of pathogenic microorganisms in real samples. This immuno-based method has been widely used in both food and the medical sector with high sensitivity. Nevertheless, the main disadvantage of this method is that it can also be time-consuming because a pre-enrichment of the sample is often required in order to achieve low limits of detection. As a consequence, many researchers have addressed their efforts towards the development of alternative methods to allow the rapid detection of pathogens. Molecular biology-based methods, specifically polymerase chain reaction (PCR) and real-time PCR are nowadays the most common tools used for pathogen detection. They are highly sensitive and allow the quantification of the target. In addition, microarray platforms of DNA have been developed in order to analyse hundreds of targets simultaneously. However, this technique is costly and reagent-consuming. The introduction of biosensors has brought new alternatives in pathogenic detection. Biosensors are the most used tools in pathogenic detection after PCR, culture methods and ELISA. They provide rapid results after the sample has been taken. However, their real application lies in achieving selectivities and sensitivities comparable to the established methods and at low cost. Since carbon nanotubes (CNTs) were discovered by Iijima, many papers have reported their unique electronic and optical properties which, together with their size, make these nanostructures interesting materials in the development of biosensing platforms. Their very high capacity for charge transfer between heterogeneous phases makes them suitable as components in electrochemical sensors. The electrical conductivity of the CNTs is highly sensitive to changes in their chemical environment and, as a result, they have been successfully applied in the study of molecular recognition processes. An approach for the direct electrical detection of biomolecules integrates CNTs as transducer elements within a field-effect transistor (FET) configuration. The main advantages of this kind of configuration lies in that the conducting channel is usually located on the surface of the substrate and as a result, they are extremely sensitive to any change in the surrounding environment. Moreover, CNTFET devices can operate at room temperature and in ambient conditions. At the beginning of this research (2006) electrochemical CNTFETs based on single walled carbon nanotubes had not been applied to detect bacteria or fungi. Only the interaction between CNTs and bacteria had been explored, but without sensing purposes. Therefore, this thesis reports the first CNTFET devices applied to the detection of pathogenic microorganisms. First, the background and the introduction containing the state of the art are presented covering relevant investigations made in the last years. Next, the main analytical methods are described. These descriptions involve detailed information of all procedures, analytical tools and materials used throughout this research work. In the following chapters, the application of the CNTFETs for the determination of bacteria, yeast and moulds is presented throughout the scientific articles published along the development of the thesis. Briefly, the first device developed was applied to the detection of Salmonella Infantis in a simple matrix (0.85 % saline solution) and it was proven for first time, that this kind of sensor was able to detect, at least, 100 cfu/mL of the bacteria in just one hour with high selectivity. Subsequently, we enlarged the application field to other types of microorganisms: Candida albicans. In this study we improved not only the detection limit of the devices to 50 cfu/mL but also we proved the selectivity of the CNTFETs against possible interference that can be present in real samples like serum proteins. Finally, the devices were applied to the detection of the mould Aspegillus flavus in real samples. In this assay the response time was 30 minutes and a high sensitivity (10 µg of A. flavus / 25 g of rice) was obtained. As the final chapters, general conclusions extracted from the overall work and annexes are reported. It can be stated that nanomaterials displaying extraordinary properties like carbon nanotubes can be combined with biological entities to obtain highly sensitive and selective biosensors able to detect bacteria, yeasts and moulds in a very short time. In future work, other performance parameters such as, long term stability, robustness and reusability must be studied further and contrasted with standard methods before thinking of the commercialization of the devices., Los microorganismos están presentes en una gran variedad de orígenes, incluyendo alimentos, agua, animales, medio ambiente también como en el propio cuerpo humano. Estos pueden ser beneficiosos o perjudiciales. Los microorganismos perjudiciales reciben el nombre de patógenos y su detección es de gran importancia por razones de salud y seguridad. Es bien conocido que los alimentos contaminados con bacterias pueden producir cierto número de enfermedades. Como consecuencia de esto, miles de euros se invierten cada año en tratamientos médicos para mantener la salud de la población. Existen más de 250 enfermedades transmitidas por alimentos. En las últimas décadas se ha incrementado por ejemplo, la incidencia de brotes de salmonelosis en muchos países, siendo Salmonella Infantis uno de los agentes etiológicos más importantes asociados con la producción de esta enfermedad entérica. Debido a la amplia distribución de los microorganismos, estos pueden llegar también a contaminar alimentos durante su cultivo como durante la fase de almacenamiento. En este sentido, los hongos filamentosos son en gran parte los agentes etiológicos responsables del deterioro de alimentos después de la cosecha produciendo pérdidas en la calidad y devaluación económica. Por otra parte, las infecciones fúngicas invasivas producidas por levaduras han aumentado considerablemente en los últimos años. Candidiasis, es la enfermedad producida por Candida albicans. Esta es una de las infecciones más comunes que afectan pacientes inmunocomprometidos requiriendo tratamientos de elevado coste. Se han propuesto varios métodos hasta la fecha para la detección de microorganismos patógenos. El cultivo es el método de referencia utilizado para la detección y cuantificación de bacterias. Tiene la ventaja de ser altamente selectivo y sensible pero tiene el inconveniente de requerir varios días para obtener un resultado. Para simplificar y automatizar la identificación de bacterias y hongos se han desarrollado kits bioquímicos rápidos. Aunque los resultados obtenidos usando esta clase de kits son comparables a las pruebas bioquímicas tradicionales, también 1 o 2 días son requeridos para la obtención de resultados. El enzimoinmunoensayo ("Enzyme Linked Immunosorbent Assay", ELISA) es un método immunológico de gran sensibilidad que se utiliza ampliamente para detectar y cuantificar microorganismos patógenos, tanto en el sector médico como en el alimentario. Sin embargo, su principal desventaja es que a veces el tiempo de análisis puede aumentar considerablemente, específicamente cuando se realizan etapas de pre-enriquecimiento de la muestra para disminuir el límite de detección. Como consecuencia, muchos investigadores han dirigido sus esfuerzos hacia el desarrollo de métodos más rápidos. Los métodos basados en el uso de la biología molecular, específicamente la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y la PCR en tiempo real, son hoy en día las herramientas más comúnmente usadas para la detección de patógenos. Estas técnicas son altamente sensibles y permiten la cuantificación del patógeno. Adicionalmente, se han desarrollado chips con plataformas de DNA para analizar cientos de patógenos simultáneamente. Sin embargo, esta técnica es costosa y requiere el uso de muchos reactivos. La introducción de los biosensores ha contribuído a generar nuevas alternativas para la detección de patógenos. Los biosensores son las herramientas más usadas en la detección de patógenos después de la PCR, los métodos convencionales y el ELISA. Tienen la ventaja de proporcionar respuestas rápidas entre la toma de muestra y la obtención de los resultados. No obstante, el reto para su aplicación en muestras reales radica en alcanzar selectividades y sensibilidades comparables a los métodos convencionales ya establecidos y a un costo económico reducido. Desde que Iijima descubrió los nanotubos de carbono (CNTs) se han publicado numerosos trabajos sobre sus excelentes propiedades electrónicas y ópticas, las cuales, en conjunción con su tamaño, hacen de estas nanoestructuras materiales interesantes en el desarrollo de plataformas de biodetección. Los CNTs presentan una gran capacidad de transferencia de carga entre estructuras heterogéneas. Ello les confiere una gran utilidad en la elaboración de sensores de tipo electroquímico. Su conductividad eléctrica varía de forma muy acusada con cambios en su ambiente químico y, como resultado, se han aplicado con éxito en el estudio de procesos de reconocimiento molecular. Una metodología para la detección directa de biomoléculas integra los CNTs como elementos transductores dentro de una configuración de transistor de efecto campo (FET). Las principales ventajas de esta clase de configuraciones radican en que el canal conductor se localiza sobre la superficie del substrato y, como resultado, es altamente sensible a cualquier cambio en el medio ambiente. Además, los CNTFETs pueden operar a temperatura y, humedad ambientales. Al inicio de esta tesis (2006), todavía no se habían aplicado los CNTFETs basados en nanotubos de carbono monocapa a la detección de bacterias y hongos. Sólo se había estudiado la interacción entre los CNTs y bacterias, pero sin el objetivo de detección. Por tanto, esta tesis aporta los primeros CNTFETs aplicados a la detección de microorganismos patógenos. En primer lugar, se presentan los antecedentes y la introducción, donde se realiza una revisión crítica y actualizada de los métodos e investigaciones más relevantes para detectar microorganismos patógenos. Posteriormente, se incluye un capítulo con la información detallada de todos los procedimientos experimentales, herramientas analíticas y materiales utilizados a lo largo del trabajo de investigación. En los siguientes capítulos, se presenta la aplicación de CNTFETs en la determinación de bacterias, mohos y levaduras mediante artículos científicos publicados a lo largo del desarrollo de la tesis. Brevemente, el primer dispositivo desarrollado se aplicó a la detección de Salmonella Infantis en una matriz simple (solución salina 0.85 %) y se comprobó por primera vez que esta clase de sensores eran capaces de detectar al menos 100 ufc/mL de la bacteria en tan solo una hora con alta selectividad. Seguidamente, se amplió el campo de aplicación a otro tipo de microorganismo, Candida albicans. En este estudio, se mejoró no sólo el límite de detección de los dispositivos a 50 ufc/mL sino que también se mejoró la selectividad de los CNTFETs frente a posibles interferentes que pueden estar presentes en muestras reales, tales como proteínas séricas. Finalmente, se aplicaron los dispositivos a la detección del moho Aspergillus flavus en muestras reales. En este ensayo, el tiempo de respuesta fue de 30 minutos y se obtuvo una buena sensiblidad (10 µg de A. flavus / 25 g de arroz). Como parte final de la tesis, se presentan las conclusiones generales extraídas a lo largo del trabajo completo junto con los anexos. Puede concluirse que, gracias a las propiedades únicas de los nanotubos de carbono, dichos nanomateriales pueden combinarse con entidades biológicas (como los anticuerpos) para obtener biosensores altamente sensibles y selectivos capaces de detectar bacterias, levaduras y mohos en un tiempo de análisis muy reducido. Como trabajo futuro, se deberán estudiar otros parámetros de calidad de los dispositivos tales como la estabilidad a lo largo del tiempo, la robustez o su reutilización con el fin de contrastarlos con los métodos estándar antes de poder iniciar la comercialización de este tipo de sensores.

La influenza porcina (IP) es una de las enfermedades respiratorias de mayor prevalencia en los cerdos en el ámbito mundial, causa brotes de gripe en los rebaños y usualmente pocos cerdos mueren. La mortalidad se incrementa si la influenza se presenta como parte del síndrome del complejo respiratorio porcino (CRP). En Venezuela, se ha demostrado la presencia de infecciones tales como el síndrome respiratorio y reproductivo porcino (SRRP), coronavirus respiratorio porcino (CRP), virus de Aujeszky y síndrome multisitémico de emaciación post-destete; no existiendo reportes de infección por el virus de influenza porcina. El objetivo de este trabajo fue demostrar la presencia de anticuerpos contra el virus de influenza porcina (VIP) subtipos H1N1 y H3N2 en granjas de cerdos de Venezuela, mediante la prueba de inhibición de la hemoaglutinación (IH). Se evaluaron 305 muestras de suero de cerdos provenientes de 10 granjas ubicadas en diferentes estados de Venezuela: Anzoátegui, Aragua, Carabobo, Cojedes, Guárico, Miranda y Zulia. Las muestras de sangre fueron tomadas a185 lechones en fase de crecimiento - finalización y 120 muestras de madres. Los anticuerpos específicos para el subtipo H1N1 (3/10) y H3N2 (4/10) fueron detectados en 7 de las 10 granjas. El subtipo H1N1 fue detectado en 7,9% (24/305) de los sueros y el subtipo H3N2 fue positivo en 8,2% (25/305) de los sueros. El análisis serológico evidenció anticuerpos contra el VIP, subtipos H1N1 y H3N2, pudiéndose inferir que la presencia de los animales positivos es producto de una infección natural ya que, para el momento del ensayo, no existen vacunas autógenas ni comerciales contra la enfermedad en Venezuela. Swine influenza is one of the most prevalent respiratory diseases in swine throughout the world. Swine influenza causes coughing outbreaks in the herds. Few swine usually die, but deaths increase if the influenza occurs as part of the porcine respiratory disease complex (PRDC) syndrome. In Venezuelan has been demonstrated the presence of porcine reproductive respiratory syndrome (PRRS) infection, porcine respiratory coronavirus and Aujeszky’s disease infection; there is not report of the presence of swine influenza virus (SIV) infection. The aim of this paper was to demonstrate the presence of H1N1 and H3N2 SIV antibodies in Venezuelan pig farms using hemagglutination inhibition test (HI). A total of 305 serum samples from 10 farms of 7 different states throughout Venezuela: Anzoátegui, Aragua, Carabobo, Cojedes, Guárico, Miranda and Zulia. Blood samples were colleted from 185 growing to finished piglets and 120 sows. Antibodies specific to subtype H1N1 (3/10) and H3N2 (4/10) were detected in 7 out of 10 farms. The H1N1 was detected in 7.9 % of the sera (24/305) and the H3N2 was positive in 8.2 % of the sera (25/305). Results indicate the presence of SIV infection. All seropositive herds are probably due to natural infection because neither commercial nor autogenous vaccine was available at the time of the survey in Venezuela.

The prevalence of Trypanosoma cruzi in domestic and wild reseroirs in nine localities of the Amalfi town, (Antioquia, Colombia), was determined. Blood samples were tested by hemoculture, xenodiagnosis, and thick smears to determine the percentage of Trypanosoma infection and to evaluate the presence of antibodies against the parasite in these species. Vector activity was previusly reported in households of this minicipality in 1994, followed by the confirmation of presence of the parasite in the vectors. Sixty-three samples from canines and 33 of several other wild animal species like Didelphis marsupialis, Proechymis semiespinosus, Phylander spp., Among other ere collected. The percentage of animals with antibodies against the parasite, measured by ELISA, was 47.6% for dogs and 20% for other wild animals. The parasite was isolated once from a canine blood simple and the identification confirmed by morphology and IFI. In this paper we discuss the results and we suggest the realization of additional studies regarding these aspects. RESUMEN: Se realizó un muestreo mensual durante un año, en nueve veredas del Municipio de Amalfi, Antioquia en reservorios domésticos y silvestres de Trypanosoma cruzi (T. cruzi), con el fin de determinar el porcentaje de infección natural por los métodos de hemocultivo, xenodiagnóstico y gota gruesa; y la presencia de anticuerpos contra el parasito mediante pruebas serológicas en cada una de las especies evaluadas. En este Municipio ya se había reportado, desde 1994, la presencia de vectores llegando a las casas, los cuales fueron encontrados infectados con T. cruzi. Para el presente trabajo se procesaron 63 muestras de perros y 33 de varias especies de animales silvestres como Didelphis marsupialis, Proechymis semiespinosus, Phylander spp., entre otros. El porcentaje de animales con anticuerpos para el parasito, medidos por la técnica de ELISA, fue de 47,6% y 20% para animales domésticos y silvestres respectivamente. De las pruebas parasitológicas realizadas se obtuvo solamente la muestra de un perro positiva por hemocultivo, de la cual se aislaron parásitos que se determinaron por morfología y se probó la presencia de anticuerpos en el suero por las técnicas de ELISA e IFI. Se discuten los resultados y se proponen nuevos estudios. COL0001262

This paper discribes the results of the protection status of cattle against Foot-and- Mouth Disease (FMD) found during the 1978 to 1985 period. One of the vaccination cycles was considered for each year, and a statistical representative random sample was calculated for both, young and adult cattle. Animals were bled at day 90 postvaccination and neutralizing antibody titers against FMD types A and 0 were assayed by neutralization test in microtiter plates, using BHK21 cells. The value of 1.5 log was considered to discriminate protected from unprotected cattle. During the analyzed period, in young cattle, the percentages of protection against the virus type A ranged from 25.6 to 64.4%, and against the type 0 from 27.9 to 74.2%. The estimated percentages of protection in adult cattle, ranged from 23.1 to 87.7% against the virus type A and from 42.8 to 88.8% against the type 0. The estimated percentages of protection found in adult cattle were, in most of the years, higher (P < 0.05) than those found in young cattle. In the latter category, the inmune response against the virus type 0 was higher than that against the type A. These differences were statistically significant (P < 0.05) in 1979, 1980, 1981 and 1982. From the above results a satisfactory protection status against FMD was deduced, specially since 1980 which has been reflected in a remarkable reduction of FMD outbreaks in this region. Besides, it was confirmed the efficacy of massive and systematic vaccination procedures, complemented by other actions such as control of cattle movement and severe epidemiologic surveillance. Se describen los resultados de la evaluación continuada del estado de protección contra fiebre aftosa (F.A.) en la población bovina del Urabá antioqueño, durante 1978 a 1985. Para cada año se consideró uno de los ciclos de vacunación y se determinó una muestra estadísticamente representativa de bovinos jóvenes y adultos. Estos fueron sangrados a los 90 días post-vacunación y sus títulos de anticuerpos contra los virus tipos A y O evaluados mediante la técnica de seroneutralización en placa, utilizando células BHK sub 21. Se consideró el valor 1.5 log como título discriminante entre protección y no protección. Durante el período analizado, en los bovinos jóvenes los valores estimados de protección contra el virus tipo A oscilaron entre 25.6 y 64.4 por ciento y contra el tipo O, entre 27.9 y 74.2 por ciento. En los adultos, los valores estimados de protección fluctuaron entre 23.1 y 87.7 por ciento para el virus tipo A y entre 42.8 y 88.8 por ciento para el virus tipo O. El procentaje estimado de bovinos adultos protegidos contra F.A. fue en la mayoría de los años superior (P menor que 0.05) al encontrado en los jóvenes, en los cuales la respuesta inmune fue mayor para el virus tipo O que para el tipo A, siendo la diferencia estadísticamente significativa (P menor que 0.05) en los años 1979, 1980, 1981 y 1982. De los resultados se dedujo que la protección contra F.A. fue satisfactoria, especialmente a partir de 1980, reflejada en una disminución notoria del número de focos en la región, lo cual confirma la eficacia de los programas masivos y sistemáticos de vacunación, complementados con medidas de control de movilización de animales y una drástica vigilancia epidemiológica. Ganado de leche-Ganadería leche

We are grateful with Ileana Salazar for growing the hybridoma lines, Carolina Arevalo, Alberto Alape and Sergio Lizano for their technical assistance and Kirsten Visona for advice and support during this investigation. Edgardo Moreno is a research fellow of the Consejo Nacional de Investigaciones Cientificas y Tecnologicas (CONICIT) de Costa Rica. This research was supported by Grant no. 801- 86-067 from the Vicerrectoria de Investigacion, Universidad de Costa Rica, and partly by Grant AI 12910 from the NIAJB, Bethesda, MD. Human α-fetoprotein (AFP) variants from cord sera were separated by isoelectric focusing in agarose gels under native conditions, transferred to nitrocellulose paper and detected with polyclonal and monoclonal antibodies (Moabs). Rabbit anti-AFP recognized up to 9 individual electrophoretic variants in the range of pH 4.5 to pH 5.2. The reactivity of 8 Moabs ranged from weak to strong and showed variability in the pattern of AFP bands recognized. Moabs were separated into 3 groups according to the number of bands detected: group 1 detected 6 to 7 bands; group 2 recognized only one band; and group 3 recognized 4 bands. The sensitivity of the system with polyclonal antibodies was 0.15 ng of AFP in complete cord serum and varied between 300 and 0.2 ng with Moabs. Las variantes de la α-fetoproteína (AFP) humana de los sueros del cordón umbilical se separaron mediante enfoque isoeléctrico en geles de agarosa en condiciones nativas, se transfirieron a papel de nitrocelulosa y se detectaron con anticuerpos policlonales y monoclonales (Moabs). Los anti-AFP de conejo reconocieron hasta 9 variantes electroforéticas individuales en el rango de pH 4,5 a pH 5,2. La reactividad de 8 Moabs varió de débil a fuerte y mostró variabilidad en el patrón de bandas de AFP reconocidas. Los Moabs se separaron en 3 grupos según el número de bandas detectadas: el grupo 1 detectó de 6 a 7 bandas; el grupo 2 reconoció sólo una banda; y el grupo 3 reconoció 4 bandas. La sensibilidad del sistema con anticuerpos policlonales fue de 0,15 ng de AFP en el suero completo del cordón umbilical y varió entre 300 y 0,2 ng con los Moabs. Universidad Nacional, Costa Rica Escuela de Medicina Veterinaria