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Objetivo: Avaliar os efeitos moduladores e antioxidantes da ergotioneína (ERT) sobre vias de sinalização redox em camundongos falcêmicos. Materiais e métodos: Camundongos transgênicos para Anemia Falciforme (AF) foram gerados e mantidos na CEMIB/UNICAMP. Avaliou-se 3 grupos de camundongos humanizados: o controle, constituído de animais transgênicos para S+Fetal (SF); animais transgênicos para AF (SS) e transgênicos tratados com ERT (SS+ERT; VO 35 mg/kg), durante 60 dias. Os animais foram eutanasiados por aprofundamento da anestesia (CEUA 5955-1/2022) e a medula óssea foi utilizada para análise de RT-qPCR, em pseudo quintuplicatas, de membros de vias de sinalização centrais da biologia redox (ATF4, NFE2L2, FoxO3, CAT, SOD1, GPx1, PRDX1, TRX, TXNIP), do transportador específico de ERT (SLC22A4); e de um fator de iniciação da tradução eucariótica (EIF2α). O fold change do nível de mRNA foi calculado usando a fórmula 2-ΔΔCT. Para as análises estatísticas, adotou-se o General Linear Model, no formato one-way ANOVA, seguido pelo teste post hoc de Bonferroni. Resultados: No grupo SS foi observado uma indução dos fatores de transcrição NFE2L2 (̃9 vezes), FoxO3 (̃3 vezes) e das enzimas antioxidantes CAT (̃4 vezes) e GPX1 (̃6 vezes), enquanto para ATF4, TRX, SOD1 e PRDX1 houve uma inibição em relação ao grupo SF. Já no grupo SS+ERT observou-se uma expressão aumentada de ATF4 (̃2 vezes), TXNIP (̃6 vezes), CAT (̃8,5 vezes), SOD1 (̃1,2 vezes) e GPX1 (̃3,5 vezes), enquanto os níveis de NFE2L2, TRX1, PRDX1 se mantiveram similares ao controle. Interessantemente, houve uma indução da expressão do SLC22A4, tanto no grupo SS (̃7 vezes) quanto SS+ERT (̃13 vezes). Em relação ao EIF2α, sua expressão foi inibida nos SS e manteve-se similar ao controle em SS+ERT. Discussão: A AF é caracterizada pela geração incessante de espécies reativas de oxigênio, o que compromete a capacidade antioxidante das células eritroides. Assim, a fim de atenuá-lo, o mecanismo de resposta redox pode ocorrer de duas formas, pelo controle da atividade enzimática ou em nível transcricional, foco deste estudo, ao induzir as vias de sinalização redox e, consequente, aumentando síntese dos antioxidantes em situações de distresse oxidativo. Esta última, observada no grupo SS, como demonstrado pelos transcritos avaliados. No grupo SS+ERT, como esperado, a suplementação com ERT apresentou uma ação citoprotetora in vivo ao modular vias de adaptação redox. Resultados este que corroboram, nosso estudo prévio in vitro, em células K562 induzidas à diferenciação eritroide e submetidas a estresse oxidativo. Ainda, os altos níveis de SLC22A4 tanto nos SS quanto nos SS+ERT, demonstra que esse antioxidante é altamente acumulado em células hematopoiéticas. Ressaltando que a maior expressão desse transportador nos SS tratados sugere uma maior internalização da ERT após sua prolongada administração, reforçando seu papel crítico durante a hematopoiese. Atuação que é corroborada pela elevação de ATF4 e TXNIP que vem sendo propostos como novos reguladores da proliferação e diferenciação eritroide. Por fim, a análise da expressão de EIF2α, possibilita a proposição que os padrões observados em nível gênico se manteriam em nível proteico. Conclusão: ERT é um modulador com espectro ainda mais amplo do que o previamente disposto na literatura, atuando em vias essenciais para homeostasia redox e eritropoiese.

Objetivo: Relatar o primeiro caso no Brasil das mutações de beta(β)-talassemia HBB:c.315+1G>C (IVS-II-1) e HBB:c.92+5G>A (IVS-I-5) e o impacto no perfil hematológico e hemoglobínico. Materiais e métodos: Amostra de sangue total de um indivíduo adulto (47 anos), proveniente do Centro de Hematologia e Hemoterapia do Maranhão (HEMOMAR), foi encaminhada ao Laboratório de Genética e Biologia Molecular (UFMS/CPTL) para diagnóstico confirmatório de hemoglobinopatias. O hemograma apresentou Hb (7,60 g/dL), VCM (87,10 fL), HCM (27,40 pg), CHCM (31,50 g/dL) e RDW (27,20%). A amostra foi submetida à Cromatografia Líquida de Alta Performance (HPLC, Premier Resolution, Trinity Biotech) e, para confirmação molecular, o DNA genômico foi extraído (protocolo por fenol-clorofórmio) e foram realizadas as técnicas de PCR-AE, PCR-RE e sequenciamento do gene da β-globina (HBB) pelo método de Sanger (3730xl DNA Analyzer, Thermo Fisher Scientific). Resultados: O perfil cromatográfico do paciente apresentou uma fração globínica compatível com Hb F em alta concentração (88,6%, RRT/F 1.02), e duas frações indicando Hb A e Hb A2, respectivamente, em baixas concentrações (2,6%, RRT/A 0.98 e 2,2%, RRT/S 0.94). Os baixos níveis de Hb apresentados no hemograma, associados à significativa redução das concentrações de Hb A, sugeriram perfil compatível com β-talassemia. As PCR-AE e PCR-RE revelaram ausência de alelos mutantes para as β0-talassemias CD39 e IVS-I-I, respectivamente. O sequenciamento do gene HBB elucidou a presença da mutação HBB:c.315+1G>C (IVS-II-1), correspondente a uma β0-talassemia, acompanhada da mutação HBB:c.92+5G>A (IVS-I-5), uma β+grave-talassemia, ambas em heterozigose. Discussão: Ambas as mutações de β-talassemia relatadas aqui afetam o processamento do RNAm codificado pelo gene HBB, acarretando na redução total (IVS-II-1, β0) ou parcial (IVS-I-5, β+) da síntese de cadeias β-globinas maduras. A mutação IVS-II-1 é caracterizada por uma substituição G>C na posição +1 do íntron II do gene HBB, a qual elimina o sítio doador de splicing 5’do RNAm, enquanto a IVS-I-5 caracteriza-se por uma substituição G>A na posição +5 do íntron I do mesmo gene, comprometendo o reconhecimento correto do local de splicing. A presença simultânea das duas mutações resulta em um déficit quase total na síntese das cadeias β, prejudicando a formação da Hb A e resultando em quadro clínico grave de β-talassemia. Devido os parâmetros hematológicos, hemoglobínicos e histórico transfusional, o paciente apresenta β-talassemia não dependente de transfusão, porém com frequentes necessidades transfusionais. Conclusão: A significativa variabilidade fenotípica observada em pacientes β-talassêmicos torna difícil prever a gravidade do quadro clínico apenas com base nos fatores genéticos, devido à complexidade das interações genéticas subjacentes aos fenótipos da β-talassemia. Assim, a identificação molecular do genótipo dos pacientes β-talassêmicos, associada a análises complementares e ao perfil clínico dos mesmos, são cruciais para fornecer terapia e aconselhamento adequados, dada a diversidade de manifestações clínicas e a necessidade de abordagens individualizadas de tratamento.

Objetivo: Avaliar a associação de polimorfismos de base única (SNPs) do sistema endocanabinoide (ECS) com o subfenótipo de acidente vascular encefálico (AVE) em pacientes com anemia falciforme (AF). Materiais e métodos: O grupo amostral foi composto por 217 pacientes com AF, provenientes da Fundação de Hematologia e Hemoterapia de Pernambuco (Hemope, PE), subdivididos em: (1) 73 com AVE (mediana do desenvolvimento de AVE de 8 anos [1-58 anos]) e (2) 144 pacientes como grupo controle, sem AVE (mediana de 29 anos [18-65 anos]). O fenótipo da AF foi diagnosticado por HPLC e confirmado por PCR-RE, e mutação da -α3,7kb talassemia foi detectada por GAP-PCR. Com base no impacto funcional e nas frequências alélicas mínimas (MAF) > 10%, selecionamos quatro SNPs do ECS que poderiam estar relacionados com o AVE na AF (FAAH rs324420, MAGL rs604300, CNR1 rs7766029 e CNR2 rs35761398) e a genotipagem foi realizada com ensaios TaqMan no PCR em Tempo Real, QuantStudio 5 (Thermo Fisher Scientific). Resultados: Os dados de gênero, hemoglobina total (Hb), contagem de reticulócitos, bilirrubina indireta, desidrogenase láctica, quantidade de crise vaso oclusivas (VOCs)/ano e o genótipo para -α3,7kb-talassemia não foram associados ao AVE, enquanto níveis mais baixos de Hb F (%) foram associados ao desenvolvimento de AVE (AVE, Hb F 5 ± 3,3 vs. grupo de controle, Hb F 9,6 ± 5,6, p < 0,0001). Em relação aos SNPs, todos encontraram-se dentro do Equilíbrio de Hardy Weinberg (p > 0,05), e o modelo de herança adotado foi o de dominância para o MAGL rs604300 e sobredominância para os demais. As frequências alélicas e genotípicas não diferiram estatisticamente entre os grupos, bem como a distribuição dos alelos não diferiu do MAF para a população adotada (NCBI's ALFA dataset, Latin America 1). Os modelos de regressão logística binária, ajustados para a Hb F como covariável, não demonstraram associação entre os SNPs e o desenvolvimento de AVE. Discussão: O AVE é um subfenótipo da AF relacionado à hemólise, à disfunção endotelial e à lesão vascular. No âmbito do ECS, estudos com modelos animais de AVE isquêmico já demonstraram a ação neuroprotetora do antagonismo de receptores CB1, codificados pelo gene CNR1, e do agonismo de receptores CB2 (CNR2), estes últimos ainda relacionados à neurogênese pós AVE. Portanto, ainda que nossos dados tenham revelado que os SNPs analisados não são bons preditores para o AVE, existem evidências crescentes para considerar estes genes como candidatos na modulação desse e de outros subfenótipos da AF. Além disso, nosso estudo fornece pela primeira vez um modelo de herança para os SNPs do ECS na AF e sua caraterização em uma coorte brasileira. O modelo de herança de um SNP pode ser vital para desvendar as características genéticas de doenças complexas, como a AF, e associar fenótipos da doença a genótipos específicos. Conclusão: Fornecemos aqui a primeira associação de SNPs do ECS com o subfenótipo da AVE na AF. Considerando os recentes avanços no sentido da utilização de canabinoides nessa e em diversas outras doenças, nossos resultados também abrem caminho para futuros estudos de caraterização dos polimorfismos genéticos do ECS nesta população.

Objetivo: Demonstrar os efeitos protetores da melatonina (MEL) no controle do estresse oxidativo em modelo de camundongos transgênicos para anemia falciforme (AF). Materiais e métodos: Os camundongos foram gerados e mantidos no CEMIB/UNICAMP e divididos em três grupos: grupo controle constituído pelos animais S+Fetal (SF); animais transgênicos não tratados (SS); e animais transgênicos tratados com MEL (SS+MEL; VO 10 mg/kg) por 60 dias. Os animais foram eutanasiados por aprofundamento da anestesia (CEUA 5955-1/2022) e a medula óssea foi utilizada para análise de RT-qPCR, em pseudo quintuplicatas, de importantes genes de vias redox, tais como: NRF2, FOXO3, MST1, YWHAQ (14-3-3z), CAT, SOD1, GPX1, PRX1, TRX1 e TXNIP. A quantificação dos resultados se baseou na derivação da fórmula 2-ΔΔCT. As análises estatísticas foram realizadas pelo General Linear Model, no formato one-way ANOVA, seguido pelo teste post hoc de Bonferroni. Resultados: Os resultados demonstraram que a expressão do NRF2 (̃3 vezes), FOXO3 (̃3 vezes) e MST1 (̃6 vezes) foram induzidas nos SS, resultado este não observado nos SS+MEL; além disso, o YWHAQ foi induzido no SS+MEL (̃2 vezes) e se manteve similar ao controle no SS. Já para via TRX1/TXNIP, para os SS+MEL, a TRX1 se manteve similar ao SF e a TXNIP foi inibida (̃3 vezes), enquanto para os SS ocorreu uma inibição da TRX1 (̃3 vezes) e os níveis de TXNIP se mantiveram similares ao controle. Em relação aos genes que codificam antioxidantes, CAT e GPX1 foram induzidas 4 e 8 vezes, respectivamente, nos SS; porém, não quando sob tratamento com MEL. Já a SOD1 e PRX1 foram mantidos similares aos SF nos SS+MEL e inibidos nos SS. Discussão: Vários mecanismos moleculares têm sido propostos como contribuintes para uma elevada taxa oxidativa em pessoas com AF. Intermediários da homeostase redox não são apenas marcadores potenciais da gravidade da doença, mas também alvos importantes para terapias antioxidantes. Nossos resultados evidenciaram a atuação essencial dos fatores de transcrição NRF2 e FOXO3, em resposta ao distresse oxidativo característico da doença, como observado nos camundongos SS através da indução de seus transcritos associada a de genes sob seu controle, como das enzimas CAT e GPX1. Por outro lado, observamos uma restauração dos níveis de transcritos semelhante ao controle no grupo tratado com MEL. Já foi demonstrado que a MEL pode eliminar até dez espécies radicalares antes que o metabólito final seja eliminado do corpo, o que resulta em um efeito antioxidante em cascata. Esses resultados sugerem a noção de que a MEL atuou diretamente na detoxificação das espécies reativas no modelo usado, não sendo necessária a ativação das vias de sinalização redox. Além disso, alguns antioxidantes, como TRX, PRX1 e SOD1, que desempenham diversas outras funções celulares e são atualmente sugeridos como possíveis fatores de transcrição, foram mantidos com níveis de transcritos similares ao controle, demonstrando assim a modulação da MEL sobre genes envolvidos na resposta ao estresse oxidativo e outros processos celulares. Conclusão: A suplementação de camundongos transgênicos com MEL evidenciou o uso promissor dessa indolamina como estratégia terapêutica antioxidante na AF por meio da restauração dos níveis de transcritos de importantes genes envolvidos na manutenção redox para valores semelhantes ao grupo controle.

Objetivo: Avaliar a dinâmica do metabolismo redox, ao longo do tempo, comparando eritrócitos falcêmicos e saudáveis, em um modelo de autoincubação celular prolongada; considerando o impacto sobre marcadores de hemólise e lesões oxidativas. Materiais e métodos: O estudo envolveu 12 brasileiros consentidos (19-42 anos), não aparentados e independente do sexo, dentre os quais, seis não apresentavam hemoglobinopatia (grupo controle - CG) e os demais possuíam anemia falciforme (grupo de estudo – AF). As amostras de sangue foram devidamente coletas e processadas, obtendo ao final, os eritrócitos lavados, os quais foram suspensos no seu próprio plasma na concentração celular de 40% (v/v) e submetidos a seis horas de incubação à 37°C, com dois períodos de análise (t0h e t6h). Ao final de cada período, a fragilidade osmótica, os níveis de hemoglobina livre [Hb livre (μM)] e atividade de enzimas antioxidantes, incluindo catalase [CAT (U/L)], glutationa peroxidase [GPx (U/mL)], glutationa redutase [GR (U/mL)], metahemoglobina redutase [metaHb-redutase (U/mL)] e tiorredoxina redutase [TrxR (U/mL)] foram avaliados por espectrofotometria. Ademais, a proporção de colesterol [Ch (nM)] para colesterol-aldeído [ChAld (uM)] foi analisada, como marcador de lesão oxidativa, utilizando HPLC-UV e HPLC-FD, respectivamente. Comparou-se os grupos celulares e os períodos de incubação isoladamente e em seguida a interação deles. Resultados: Na comparação entre os grupos, os eritrócitos falcêmicos apresentaram resistência osmótica na concentração de 5 g/L de NaCl, aumento de 33,8% nos níveis de Hb livre [AF:1,72 ± 0,30; p < 0,01], redução de 22,8% e 27,4% na atividade das enzimas CAT [AF:15,39 ± 4,02; p < 0,05] e GPx [AF: 2,91 ± 0,74; p < 0,01], respectivamente. Ademais, houve o aumento de 31,5% na atividade da metaHb-redutase [AF:3,75 ± 0,90; p < 0,01] e acúmulo de 22,5% de produtos oxidativos da membrana celular [AF: 2,45 ± 0,17; p < 0,01] nos eritrócitos falcêmicos. Entretanto, não houve interação significativa entre os grupos e o período de incubação, quanto as enzimas CAT (p = 0,93), GPx (p = 0,59), GR (p = 0,69), TrxR (p = 0,34), metaHb-redutase (p = 0,53), assim como nos níveis de Hb livre (p = 0,58) e na proporção ChAld/Ch (p = 0,12). Discussão: A estrutura e a bioquímica da hemoglobina S induzem um estado hiperoxidativo nos eritrócitos falcêmicos. Isso leva ao consumo de enzimas antioxidantes, danos oxidativos na membrana celular e aumento da hemólise, evidenciado na comparação entre os grupos CG e AF, desconsiderando o tempo. Entretanto, ao longo da incubação, houve um prejuízo semelhante das enzimas antioxidantes e um grau equivalente de lesão oxidativa nos grupos estudados, demonstrando que apesar das condições oxidativas distintas a que são submetidos, ambos os grupos eritrocíticos mantiveram uma dinâmica de metabolismo redox similar ao longo do tempo testado, fornecendo subsídio argumentativo para pesquisas futuras focadas na análise das características metabólicas dessas células durante a eritropoiese, a fim de averiguar a adaptabilidade celular nos precursores eritrocitários e possíveis alvos terapêuticos. Conclusão: A curiosa semelhança na dinâmica do metabolismo redox de eritrócitos falcêmicos e saudáveis sugere que os primeiros apresentam alta adaptabilidade celular em seus precursores, possibilitando respostas redox semelhantes aos saudáveis no período testado.

Objetivo: Relatar o primeiro caso no Brasil de interação da hemoglobina (Hb) variante Ottawa com alfa talassemia em um estudo familial. Materiais e métodos: Amostra de sangue total de uma criança do sexo feminino de dez meses, proveniente da APAE – Salvador/BA, foi recebida pelo Laboratório de Genética e Biologia Molecular (LGBM) da UFMS/CPTL, juntamente com as amostras de ambos os progenitores para confirmação diagnóstica de hemoglobinopatias. No hemograma do probando constava Hb (9,8 g/dL), VCM (78,6%), HCM (26,8%), CHCM (34,0%) e RDW (14,4%). Com base nesses dados, a amostra da criança, bem como a dos pais, foi submetida a Cromatografia Líquida de Alta Performance (HPLC), Trinity Biotech, e análises moleculares (PCR-RE, PCR-Multiplex e Sequenciamento de DNA por Sanger). Resultados: O perfil cromatográfico do probando indicou uma concentração incomum de Hb A (66,4%) e elevada concentração de Hb A2 (3,1%), acompanhadas de uma Hb variante no tempo de retenção relativo a Hb S de 1.06 (RRT/S 1.06) em uma concentração sugestiva de Hb alfa(α)-variante (18,9%), com possível presença de α-talassemia. A cromatografia do pai revelou a presença de Hb A (69,6%), Hb A2 (2,7%) e uma Hb variante (20,8%) de comportamento similar à encontrada no probando, enquanto a mãe apresentou um perfil cromatográfico sem sinais aparentes de hemoglobinopatias, com concentrações normais de Hb A (95,3%) e Hb A2 (2,7%). Os perfis cromatográficos guiaram as análises moleculares, onde identificou-se a mutação delecional de α-talassemia (-α3,7kb) em heterozigose tanto no probando quanto na mãe, e ausência de Hb S no probando e no pai. Devido às suspeitas de Hb α-variante, as amostras foram encaminhadas para sequenciamento dos genes HBA2 e HBA1 , no qual foi identificada a presença da mutação HBA1:c.46G>C (Hb Ottawa) em heterozigose tanto no probando, quanto no genitor. Discussão: Os resultados obtidos permitiram a conclusão do diagnóstico do probando como heterozigoto para Hb Ottawa e coerança de alfa talassemia (-α3,7kb) em heterozigose (-α3,7/ααOttawa). A Hb Ottawa (ou Siam) é uma variante rara de cadeia alfa, onde a mutação resulta na substituição de uma glicina por uma arginina no códon 15 do gene HBA2 ou HBA1 . Até o momento, essa variante não havia sido documentada no Brasil em coerança com alfa talassemia, tornando este o primeiro registro dessa associação. Em heterozigose, a Hb Ottawa é assintomática, sugerindo que a anemia microcítica e hipocrômica observada no hemograma do probando é decorrente da presença da α+talassemia, a qual acarreta na redução das sínteses de cadeias alfa, e portanto, no prejuízo, principalmente, da formação do tetrâmero Hb A. Apesar da sua baixa ocorrência e ausência de manifestações clínicas em heterozigose, a associação da Hb Ottawa com o traço falciforme (HbAS), pode desencadear crises vaso-oclusivas graves, e a não detecção dessa variante por análises moleculares pode levar ao falso diagnóstico de doença falciforme, considerando que seu perfil cromatográfico e padrão de migração eletroforética são similares a Hb S. Conclusão: Casos de Hb variantes raras acompanhadas de talassemias demonstram a relevância da associação das metodologias laboratoriais, bem como de laboratórios de apoio com profissionais especializados na identificação molecular de variantes globínicas para a determinação genotípica os pacientes, permitindo uma posterior orientação genética e acompanhamento clínico adequados aos familiares.

Objetivo: Analisar se a heterozigose composta de hemoglobina (Hb) S com beta(β)+ talassemia silenciosa representa fenótipo clínico da Doença Falciforme (DF). Material e Métodos: Amostras de sangue total de oito pacientes, com idades variando de 1 mês a 1 ano, foram enviadas pela Associação de Pais e Amigos dos Excepcionais (APAE - Salvador/BA) para o Laboratório de Genética e Biologia Molecular da Universidade Federal de Mato Grosso do Sul (LGBM - UFMS/CPTL), devido ao perfil de hemoglobina inconclusivo. As amostras foram submetidas à Cromatografia Líquida de Alta Performance (HPLC – Premier Resolution, Trinity Biotech ), extração de DNA genômico (Fenol-Clorofórmio) e análises moleculares (Reação em Cadeia da Polimerase seguida de Restrição Enzimática [PCR-RE] e sequenciamento do gene da beta globina [HBB , sequenciador 3730xl DNA Analyzer , Thermo Fisher Scientific ]). Resultados: A análise por PCR-RE detectou em todos da amostra a presença de um alelo com a mutação HBB:c.20A>T (Hb S), e o sequenciamento demonstrou as mutações para β+ talassemia silenciosa: (1) HBB:c.-151C>T (-101C>T), em sete pacientes e (2) HBB:c.-176C>A (-126C>A), em apenas um paciente, ambas em heterozigose composta para a mutação de Hb S. Por meio de análises prévias, obtiveram-se as seguintes médias de concentração das frações hemoglobínicas e hematológicas para as mutações -101C>T e -126C>A, respectivamente: Hb A = 23.6 e 34.7%, Hb A2= 3.0 e 4.6%, Hb F= 31.0 e 6.7%, Hb S = 36.4 e 47.7%, Eritrócito = 4.10 e 4.07 x106/mm3, Hb total= 11.02 e 10.21 g/L, Hematócrito = 33.12 e 33.80%, VCM = 82.17 e 83.05 fL, HCM = 26.38 e 25.10 pg, RDW = 16.74 e 12.50%. Discussão: DF é um termo amplo que define um grupo caracterizado pela presença da Hb S, tanto em homozigose (Anemia Falciforme, Hb SS) quanto em heterozigose composta com outra mutação no gene HBB , ocasionando diferentes complicações clínicas. Dito isso, a coexistência de mutações para β-talassemia e Hb S no mesmo indivíduo gera casos de DF. Entretanto, existem diferentes manifestações clínicas a depender da natureza da mutação de β-talassemia, que pode acarretar na redução total (β0) ou parcial (β+) da síntese de cadeias β-globina, o que impacta na concentração da Hb A. Os pacientes aqui relatados apresentaram concentração de Hb A próximas da Hb S, aspecto que atenua os processos fisiopatológicos cruciais na DF, a exemplo da polimerização da Hb S e falcização dos eritrócitos. Portanto, o perfil hemoglobínico desses pacientes é compatível com um fenótipo assintomático, justificando a reflexão sobre essas mutações de β+-talassemia silenciosa, na associação com Hb S, pertencerem ou não ao grupo da DF. Conclusão: As mutações de β+ talassemia silenciosa caracterizadas nesse estudo, associado com a Hb S, não resulta em perfis hemoglobínicos e hematológicos condizentes com a DF, o que pode auxiliar no acompanhamento e manejo da doença.

Objetivo: Investigar a associação de polimorfismos de base única (SNPs) nos genes ACE2 e CNR2 e a severidade da infecção pelo vírus SARS-CoV-2. Materiais e métodos: Pacientes diagnosticados com COVID-19 por RT-qPCR (n = 469) foram triados no Laboratório de Doenças Infecciosas e Parasitárias (LABDIP/UFMS) quanto à gravidade clínica da infecção entre casos leves (sem necessidade de hospitalização) ou graves (com a necessidade de hospitalização e suplementação de O2). Amostras de sangue total foram coletadas e enviadas ao Laboratório de Genética e Biologia Molecular (LGBM/UFMS). O DNA genômico foi extraído (PureLink Genomic DNA Mini Kit) e as amostras foram genotipadas para os polimorfismos ACE2 rs2285666 (C>T) e CNR2 rs35761398 (TT>CC) via TaqMan Genotyping SNP Assays em qPCR (QuantStudio5, Thermo Fisher Scientific). Foram realizados modelos ajustados de regressão logística binomial, com cálculo de razão de probabilidades (OR) e intervalo de confiança para 95% dos dados (p < 0,05). Resultados: Para o SNP ACE2 rs2285666 , os indivíduos foram clinicamente classificados em leves (n = 245) e graves (n = 224), e os fatores associados ao risco aumentado da forma grave de COVID-19 foram: gênero masculino [OR = 2,99 (1,96–4,57)], idade ≥ 60 anos [OR = 4,43(2,32–8,44)] e apresentar comorbidades [OR = 4,40(2,87–6,74)]. Em mulheres, o risco maior de COVID-19 severa foi associado ao polimorfismo de ACE2 em homozigose para o alelo mutante [TT = 7,1%; OR = 2,97(1,02–8,62)], e em homens (hemizigotos), o maior risco foi também associado ao alelo mutante [T = 29,9%; OR = 2,37(1,18–4,75)]. Já para o SNP CNR2 rs35761398 , obteve-se maior frequência em casos leves (n = 235) comparativamente aos graves (n = 203), de modo que os fatores idade ≥ 60 anos [OR = 1,06(1,04–1,08)], ser do gênero masculino [OR = 3,17(1,99–5,03)] e a presença de comorbidades [OR = 3,52(2,20–5,64)], foram também associados à maior severidade. A presença do alelo mutante desse SNP em heterozigose (TT-CC) demonstrou ter efeito protetivo à forma grave da doença [TT-CC; OR = 0,35(0,19–0,64)]. Discussão: A Enzima Conversora de Angiotensina-2 (ECA2), codificada pelo gene ACE2 , é responsável pela internalização do SARS-CoV-2 nas células hospedeiras. O SNP rs2285666 está localizado no início do íntron 3 deste gene, no cromossomo X, possivelmente responsável por aumentar sua expressão. Portanto, o risco aumentado de desenvolver o fenótipo grave da COVID-19 estaria associado aos portadores do alelo mutante devido ao aumento da ECA2 nas células hospedeiras, potencializando a carga viral. Já o SNP rs35761398 é caracterizado por uma mutação missense no códon 63 do gene CNR2, sendo o receptor mutante (CB2-R63) menos funcional e, portanto, associado a uma resposta imune desbalanceada ao inibir a proliferação de linfócitos. Indivíduos heterozigotos poderiam, possivelmente, manter a expressão equilibrada dos receptores CB2 Q63/R63, garantindo uma resposta imune balanceada e um menor risco de desenvolver a forma grave da doença em até 2 vezes. Conclusão: A presença do SNP rs2285666 no gene ACE2 em homozigose (mulheres) ou hemizigose (homens) está relacionado com o aumento de chance, em até 3 vezes, no estabelecimento do quadro mais grave da COVID-19. Já a presença do SNP rs35761398 em heterozigose está associada a um risco reduzido, em aproximadamente 3 vezes, no desenvolvimento de quadros severos da infecção por SARS-CoV-2.

Objetivo: Relatar um estudo familial de probando com hemoglobina (Hb) Korle-Bu e β talassemia. Material e métodos: Amostras de sangue total do probando, sexo masculino, 8 meses e de seus progenitores (mãe com 31 anos e pai com 26 anos), provenientes do ambulatório do Centro de Hematologia e Hemoterapia do Maranhão, foram enviadas ao Laboratório de Genética da UFMS/CPTL para diagnóstico molecular de perfil hemoglobínico inconclusivo. Foram realizados hemograma, reticulograma (ADVIA 2120i-Siemens Healthineers), análises bioquímicas (ARCHITECT ci4100-Abott), análises cromatográficas e análises moleculares (PCR-RE e sequenciamento do gene beta globina –HBB, sequenciador 3770xl DNA analyser). Resultados: O hemograma e reticulograma do probando, pai e mãe apresentaram respectivamente os seguintes parâmetros: E = 5.95, 5.71, 5.40 milhões/mm3; Hb = 11.2, 17.2, 12,0 g/dL; Ht = 33.8, 49.7, 38.6%; VCM = 56.8, 87.0, 71.4 fL; HCM = 18.8, 30.0, 22.2 pg; CHCM = 33.0, 34.5, 31.0%; RDW = 18.5, 13.5, 17.1%; Reticulócitos = 38.500, 34.300, 92.100/mm3; CHr = 20.4, 31.7, 25.4 pg; VCMr = 72.8, 106.3, 91.0 fL. Os resultados das dosagens de ferro sérico, ferritina, índice de saturação da transferrina do probando foram respectivamente: 57 ug/dL, 15.6 ng/mL, 21%. O perfil cromatográfico do probando indicou Hb Variante com tempo de retenção relativo (RRT) a Hb A2 (70.2%), Hb F (18.0%) e Hb A0 (5.7%). A cromatografia do pai apontou a presença de Hb A0 (47.9%) e Hb Variante (43.5%) com RRT de Hb A2. A sobreposição de picos entre Hb Variante e Hb A2 impossibilitou a quantificação da Hb A2 do probando e pai. A mãe apresentou Hb A0 (84.4%), Hb F (0.6%) e aumento de Hb A2 (5.3%). A análises moleculares detectaram a presença de um alelo com a mutação HBB:c.220G>A (Hb Korle Bu) para o pai e mutação HBB:c.92+5G>A (β+ grave talassemia IVS-I-5) em heterozigose para a mãe. Por fim, as análises moleculares do probando confirmaram a dupla heterozigose no gene HBB, formada pela presença de um alelo mutante para Hb Korle-Bu e de outro para talassemia β+ grave IVS-I-5. Discussão: A análise do hemograma do probando e da mãe não indicou anemia para a idade, mas revelou anisocitose com intensa microcitose. O hemograma do pai não apresentou alterações. O reticulograma do probando, pai e mãe não mostrou aumento absoluto na contagem de reticulócitos, no entanto, o VCMr do probando e da mãe estava diminuído. O perfil de ferro do probando não apresentou alterações, excluindo a possibilidade de deficiência de ferro e avaliado com o perfil do eritrograma, suspeitou-se de uma hemoglobinopatia quantitativa. A análise cromatográfica do probando revelou um perfil hemoglobínico inconclusivo. Contudo, com base na observação do eritrograma do probando e nos cromatogramas dos progenitores, em que a mãe possui um aumento de Hb A2 e o pai com presença de heterozigose para Hb Variante, concluiu-se tratar-se de uma provável β talassemia (herdada da mãe) em heterozigose composta com uma Hb Variante (herdada do pai) não identificável por HPLC. As análises moleculares foram realizadas para o diagnóstico confirmatório, com a presença de mutações correspondentes a Hb Korle-Bu e talassemia β+ grave IVS-I-5. Conclusão: A combinação de diferentes metodologias laboratoriais, especialmente as técnicas de biologia molecular, foi essencial para o diagnóstico preciso deste caso complexo, evitando interpretações errôneas e tratamentos inadequados.

Objetivo: Relatar um estudo de caso de uma hemoglobina (Hb) rara denominada Hb I-Interlaken, a qual foi recebido e diagnosticado pelo Laboratório de Genética e Biologia Molecular da UFMS/CPTL. Materiais e métodos: Amostra de sangue de uma paciente do sexo feminino de 64 anos de idade, procedente de Campinas/SP, foi encaminhada para Laboratório de Genética e Biologia Molecular (UFMS/CPTL) para análise laboratorial de perfil hemoglobínico inconclusivo, juntamente com exames hematológicos complementares. Para determinar as frações hemoglobínicas da paciente, a amostra foi submetida à Cromatografia Líquida de Alta Performance (HPLC-Premier Resolution, Trinity Biotech). Para confirmação molecular do genótipo, os genes da α-globina (HBA2 e HBA1) foram amplificados por PCR-Touchdown e sequenciados pelo método de Sanger (sequenciador 3730xl DNA Analyzer, Thermo Fisher Scientific). Resultados: Após análises por HPLC, o perfil cromatográfico da paciente apresentou Hb A (67,9%), Hb A2 (2,0%) e Hb variante (22,2%) com o tempo de retenção relativo (RRT) a Hb A de 0,84 (RRT/A = 0,84). O sequenciamento completo do gene HBA2 não demonstrou presença de mutações para Hb variantes, enquanto o sequenciamento do gene HBA1 demonstrou a presença da mutação HBA1:c.47G>A em heterozigose, correspondente à Hb I-Interlaken (genótipo αα/ααI-Interlaken). Em relação aos dados hematológicos, os seguintes parâmetros foram observados: Eritrócitos de 4,27 milhões/mm3, Hb de 13,3 g/dL, Hct de 39,7%, VCM de 93 fl, HCM de 31,2 pg, CHCM de 33,5 g/dL e RDW de 13,3 %. Discussão: A Hb I-Interlaken (também conhecida como Hb J Oxford) corresponde a uma Hb α-variante rara, caracterizada por uma substituição de glicina na posição 15 da cadeia α por um ácido aspártico (GlyAsp), e ocorre principalmente entre os indivíduos descendentes de ingleses e italianos. Relatamos aqui o segundo caso dessa Hb no Brasil, sendo seu primeiro relato curiosamente também em paciente proveniente de Campinas/SP, demonstrando o efeito da imigração europeia e da miscigenação na composição gênica dessa população. Apesar da alteração estrutural na proteína final, a Hb Interlaken não apresenta alterações funcionais, sendo estável e possuindo afinidade normal pelo oxigênio; portanto, seus portadores não apresentam manifestações clínicas, com parâmetros hematológicos dentro dos valores de referência. No entanto, mesmo assintomática, a detecção dessa e de outras variantes raras de Hb é imprescindível para a determinação de sua incidência e para o entendimento do fluxo dessas mutações na população brasileira. Além disso, a combinação de Hb α-variantes com outras mutações estruturais ou talassemias pode resultar em fenótipos clinicamente relevantes, realçando a importância da identificação dessas Hb. Nesse sentido, a associação de diferentes metodologias laboratoriais, como análises cromatográficas e moleculares, permite a detecção correta de Hb raras. Conclusão: A Hb I-Interlaken é uma Hb α-variante rara e tem pouco significado clínico. A presença de Hb anormais podem refletir o grau de miscigenação no Brasil e evidenciam a importância do estabelecimento de padrões e estratégias cromatográficas e moleculares para análises das amostras de Hb da população, além de desenvolver estudos com métodos combinados visando um diagnóstico preciso.

Objetivo: Avaliar a incidência de hemoglobinas (Hb) variantes sintomáticas e assintomáticas em recém nascidos (RN) vivos e triados no estado de Mato Grosso do Sul (MS) entre 2015 e 2022. Materiais e métodos: trata-se de um estudo de coorte retrospectivo e descritivo de 288.753 RN vivos triados pelo Programa Nacional de Triagem Neonatal (PNTN) de 2015 a 2022, abrangendo todos os 79 municípios do estado de MS. Os dados para confecção de dados epidemiológicos foram fornecidos pelo Instituto de Pesquisas, Ensino e Diagnóstico da Associação de Pais e Amigos dos Especiais (IPED-APAE), centro de referência em triagem neonatal do estado MS. As amostras de casos inconclusivos foram enviados para o Laboratório de Genética e Biologia Molecular (UFMS/CPTL) para diagnóstico confirmatório molecular. Os RN com hemoglobinopatias foram separados em assintomáticos, sintomáticos leves e graves. Resultados: De todos os 288.753 RN triados pelo PNTN, 7.525 foram diagnosticados com alguma hemoglobinopatia e apresentaram uma incidência de 1:38,4 (2,61%) entre os RN triados nos oito anos de estudo. Os RN com Hb variantes assintomáticas apresentaram uma incidência de 1:39 RN e agrupou os perfis FAS, FAC, FAD, FA/Korle-Bu, FA/Basking Ridge, FA/Deer Lodge, FA/Tyne, FA/Hasharon, FA/Stanleyville-II, FAS/Chicago e S/PHHF. Os perfis FAS e FAC foram os mais comuns, incidindo em 1:52 e 1:155 RN, respectivamente. Já as hemoglobinopatias sintomáticas leves tiveram incidência de 1:22.212 RN, caracterizado pelos perfis FAE, FC e FC/Beta+ talassemia, sendo o primeiro mais frequente com 1:32.083 RN. Os sintomáticos graves incidiram em 1:4.734 RN, comparativamente maior ao anterior, e compreende os perfis FS e FSC, com respectivas incidências de 1:6.875 e 1:15.197 RN. Além disso, a HbS foi a variante hemoglobínica mais comum no estado de MS, apresentando uma incidência do alelo BS em 1:33 RN. Discussão: Estudos epidemiológicos são instrumentos essenciais para os profissionais de saúde, atuantes no diagnóstico neonatal das hemoglobinopatias, em virtude da ampla gama de Hb variantes documentadas ao direcionarem o diagnóstico de casos inconclusivos, tornando-o mais rápido e preciso, além de contribuírem para ações de saúde pública. Ademais, nossos dados corroboram valores estabelecidos na literatura acerca das Hb anormais mais frequentes na população. Estudos indicam a prevalência das hemoglobinopatias em 3,7% no Brasil, valor maior que a incidência de 2,6% no MS, refletindo assim sua heterogeneidade. Contudo, o traço falciforme segue como mais frequente, sendo 2,5% da população portadora da HbS, em concordância com o presente estudo que apontou 2,4% dos RN com esse perfil. Conclusão: A incidência das hemoglobinopatias em RN triados no estado de MS foi de 1:38,4, destacando-se o perfil FAS como o mais frequente, incidindo em 1:52 RN e o alelo BetaS sendo a mutação mais comum com 1:33 RN. A caracterização epidemiológica, em especial da HbS, é de alta relevância clínica por esta constituir quadros sintomáticos graves, como na Doença Falciforme. Os perfis assintomáticos ressaltam a alta frequência de indivíduos portadores deste alelo na população, contribuindo ao direcionamento do profissional de triagem, desde o diagnóstico correto até o momento do aconselhamento genético familiar e eventual tratamento da hemoglobinopatia.

Objetivo: : Aplicar o conhecimento da expressão dos genes HBA2 e HBA1 como ferramenta de direcionamento de diagnóstico para casos complexos de hemoglobinopatias. Material e métodos: Duas amostras (probando, 3 meses, e mãe, 28 anos) de sangue total, provenientes da APAE/Salvador-BA, foram encaminhadas ao Laboratório de Genética e Biologia Molecular (UFMS/CPTL) para diagnóstico confirmatório de hemoglobinopatias, por suspeita de perfil Hb A/D-Los Angeles. Análises cromatográficas foram realizadas a partir de Cromatografia Líquida de Alta Performance (HPLC) - Premier Resolution (Trinity Biotech) e análises moleculares utilizadas foram PCR-Multiplex (diagnóstico de alfa-talassemia), PCR-RE (Hb D-Los Angeles) e sequenciamento de DNA (método de Sanger). Resultados: A análise cromatográfica da mãe revelou Hb variante com 90,6% (RRTA2 de 1,06 - Premier Resolution) e um pico menor de 4% (RRTS de 1,00). A amostra do probando demonstrou HbA (58,8%), HbF (4,4%), Hb variante de 32,3% (RRTA2 de 1,06) e um pico menor de aproximadamente 1% (RRTS de 1,00). A partir das concentrações da Hb beta-variante e do RRT do HPLC, a primeira suspeita foi de heterozigoto para Hb beta-variante (Hb D-Los Angeles) (probando) e Hb D-Los Angeles/Beta0-talassemia (mãe). Entretanto, o resultado da PCR-RE para Hb D-LA e o sequenciamento do gene HBB não detectaram mutações nos genes HBB. Descartada a possibilidade de Hb beta-variante e evidenciando a presença do pico menor (fração referente à associação de cadeias alfa mutantes com delta normal), suspeitou-se de Hb alfa variante, embora houvesse coerência com alfa-talassemia devido às concentrações estarem acima dos valores esperados para alfa variantes (> 25%). O teste de GAP-PCR Multiplex identificou mutações de α-talassemia em homozigose (-α3.7/-α3.7) na mãe e em heterozigose (αα/-α3.7) no probando. O sequenciamento dos genes HBA2 e HBA1 revelou, na amostra da mãe, a mutação G-philadelphia (HBA1C>G) em ambos os genes α funcionais (-α3.7+G-phil/-α3.7+G-phil) e no probando (-α3.7+G-phil/αα). Discussão: O diagnóstico das interações de Hb variantes com alfa-talassemia é complexo devido às mutações que alteram o padrão normal da expressão dos genes das globinas. Por isso, surge a necessidade de um profissional capacitado com apoio de técnicas moleculares. No presente caso, demonstramos que o entendimento da expressão das cadeias alfa globinas pode ser útil no direcionamento de casos complexos de hemoglobinopatias. Os diferentes níveis de concentração das Hb alfa-variantes foram impactados pela coerência com alfa-talassemia, pela presença do pico menor e pela ausência da Hb A na amostra da mãe. Conclusão: O perfil cromatográfico pode ser interpretado de forma incorreta em casos de interações de Hb alfa-variante com alfa-talassemia, pois, nessa situação, a concentração da alfa-variante assemelha-se à da beta-variante. Diante desse cenário, este relato demonstra a importância do conhecimento da expressão dos genes alfa-globina e da associação de técnicas laboratoriais para o diagnóstico preciso de hemoglobinopatias.