Search

U ovoj doktorskoj disertaciji ispitivano je fotodinamičko citotoksično dejstvo grafenskih kvantnih tačaka (GKT) na ćelije humanog glioma, kao i njihov antibakterijski efekat na bakterije rezistentne na konvencionalnu antibiotsku terapiju. Iako odlične fotoluminiscentne karakteristike GKT omogućavaju njihovu široku primenu u biomedicini, njihova citotoksičnost, kao i antibakterijsko dejstvo do sada nisu ispitivani. Gliomi su najčešći i najletalniji tumori mozga otporni na konvencionalnu terapiju i često inoperabilni, pa su stoga neophodni novi terapijski pristupi u njihovom lečenju. GKT, ovalne ugljenične dvodimenzionalne nanočestice, sintetisane su elektrohemijskom oksidacijom grafita i karakterisane su metodama UV-Vis spektroskopije, mikroskopijom atomskih sila i transmisionom elektronskom mikroskopijom. Nakon fotoekscitacije plavom svetlošću (470 nm, 1 W) GKT su produkovale reaktivne kiseonične vrste, uključujući i singletni kiseonik (1O2), što je dovelo do oksidativnog stresa i smrti U251 ćelija humanog glioma. Ćelijska smrt indukovana fotoekscitiranim GKT pokazivala je morfološke i biohemijske karakteristike kako apoptoze (eksternalizacija fosfatidil-serina, aktivacija kaspaza, DNK fragmentacija), tako i autofagije (formiranje autofagnih vezikula, konverzija LC3-I u LC3-II, degradacija autofagnog kargo receptora SQSTM1/p62). Genetska inaktivacija ključnog autofagnog proteina LC3B smanjila je fotodinamičku citotoksičnost GKT. Otkrivanje novih, efikasnijih metoda lečenja bakterijskih infekcija postalo je neophodno usled porasta učestalosti infekcija uzrokovanih sojevima bakterija koje pokazuju rezistenciju na veliki broj antibiotika. Iz tih razloga je ispitivan uticaj fotoekscitiranih GKT na Gram-pozitivne i Gram-negativne bakterije, meticilinrezistentni Staphylococcus aureus i Escherichia coli, koje spadaju u grupu najznačajnijih nozokomijalnih patogena, ali se sa velikom učestalošću izoluju i kao izazivači infekcija u vanbolničkoj sredini..., In this doctoral dissertation the photodynamic cytotoxic effect of graphene quantum dots (GQD) was investigated in human glioma cells and antibiotic-resistant bacteria. The excellent physicochemical properties of GQD make them suitable candidates for biomedical applications, but their cytotoxicity towards cancer cells or bacteria has not been extensively studied thus far. Gliomas are among the most frequent and letal brain tumors, often inoperable and highly refractive to the standard chemotherapy protocols, thus there is a pressing need for the development of new therapy approaches. GQD, the two-dimensional carbon nanoparticles, were synthesized by the electrochemical oxidation of graphite and characterized by UV-Vis, atomic force microscopy, and transmission electronic microscopy. It was shown that GQD irradiated with the blue light (470 nm, 1 W) produced reactive oxygen species, including singlet oxygen (1O2), which killed U251 human glioma cells by causing oxidative stress. The cell death induced by the photoexcited GQD displayed morphological and/or biochemical characteristics of both apoptosis (phosphatidylserine externalization, caspase activation, DNA fragmentation) and autophagy (formation of autophagic vesicles, LC3-I/LC3-II conversion, degradation of autophagic cargo receptor SQSTM1/p62). Moreover, genetic inactivation of autophagy-essential LC3B protein partly abrogated the photodynamic cytotoxicity of GQD. Searching for new treatments for bacterial infections has become necessary, because of a dramatic increase in the frequency of infections caused by drug-resistant bacteria. Therefore, we examined potential antimicrobial effect of photoexcited GQD on the Gram-positive and Gram-negative bacteria, methicillin-resistant Staphylococcus aureus and Escherichia coli, which are leading nosocomial pathogens...

Autofagija, proces programirane ćelijske razgradnje unutarćelijskog sadržaja, je uključena u regulaciju preživljavanja i smrti ćelija kancera. U ovoj doktorskoj disertaciji je po prvi put ispitivana sposobnost antileukemijskih lekova citarabina i idarubicina da indukuju autofagiju u različitim humanim leukemijskim ćelijskim linijama i mononuklearnim ćelijama periferne krvi (MNPK) pacijenata obolelih od leukemije in vitro. Takođe, ispitivani su unutarćelijski mehanizmi odgovorni za indukciju autofagije, kao i uloga autofagije u citotoksičnosti ovih lekova. Vijabilitet REH, HL-60, K562 leukemijskih ćelijskih linija, MNPK pacijenata obolelih od leukemije i MNPK zdravih kontrola je određivan merenjem aktivnosti kisele fosfataze i mitohondrijalnih dehidrogenaza. Protočna citofluorimetrija je korišćena za detekciju apoptoze i zakišeljavanja citoplazme. Indukcija autofagije je ispitivana fluorescentnom mikroskopijom (detekcija unutarćelijskih kiselih vezikula obojenih akridin oranžom), transmisionom elektronskom mikroskopijom (posmatranje autofagnih vezikula) i imunoblot analizom (konverzija LC3-I u LC3-II, degradacija SQSTM1/p62). Aktivacija signalnih puteva koji učestvuju u regulaciji autofagije je analizirana imunoblot metodom. Uloga autofagije u citotoksičnosti citarabina i idarubicina je ispitivana primenom farmakološke inhibicije bafilomicinom A1, hlorokinom, vortmaninom i amonijum hloridom, kao i genetske inaktivacije ekspresije beklina-1, LC3β i SQSTM1 transfekcijom odgovarajućim malim interferirajućim RNK. Citarabin i idarubicin su izazvali povećanje unutarćelijske kiselosti i pojavu autofagnih vezikula sa delimično razgrađenim ćelijskim sadržajem u leukemijskim ćelijskim linijama. Antileukemijski lekovi su stimulisali razgradnju supstrata autofagije SQSTM1 i povećali konverziju LC3-I u LC3-II formu asociranu autofagozomima u odsustvu ili prisustvu inhibitora proteolize, ukazujući tako na povećanje autofagnog fluksa. Oba leka su smanjila fosforilaciju mTOR kinaze, Autophagy, a process of programmed cellular self-digestion, has been implicated in regulation of cancer cell survival and death. The present study investigated for the first time the ability of antileukemic drugs cytarabine and idarubicin to induce autophagy in different human leukemic cell lines and peripheral blood mononuclear cells (PBMC) from leukemia patients in vitro. Intracellular mechanisms responsible for the induction of autophagy, as well as the role of autophagy in cytotoxicity of these drugs were also investigated. Cell viability of REH, HL-60, K562 leukemic cell lines, and PBMC from leukemic patients and healthy controls was determined by measuring the acid phosphatase and mitochondrial succinate dehydrogenase activity. Flow cytometry was used for the detection of apoptosis and intracellular acidification. Autophagy induction was assessed by fluorescent microscopy (detection of acridine orange stained intracellular acidic vesicles), by transmission electron microscopy (observation of autophagic vacuoles), as well as by immunoblot analysis of LC3 conversion and SQSTM1/p62 proteolysis. Activation of autophagy-regulating signaling pathways was analyzed by immunoblotting. Pharmacological inhibition of autophagy with bafilomycin A1, chloroquine, wortmannin, and NH4Cl or RNA interference-mediated knockdown of beclin-1, LC3β and SQSTM1 were used to determine the role of the autophagy in cytotoxicity of antileukemic drugs. Cytarabine and idarubicin induced an increase in intracellular acidification and appearance of autophagic vesicles with partially digested cellular components in leukemic cell lines. Antileukemic drugs stimulated the degradation of autophagic target SQSTM1 and enhanced the conversion of LC3-I to autophagosome-associated LC3-II in the absence or presence of proteolysis inhibitors, thus indicating the increase in autophagic flux...

Uvod: Glukokortikoidni hormoni (GH) su mimo svog anti-inflamatornog dejstva i jedni od najpoznatijih inhibitora zarastanja rana. Nedavno je pokazano da farnezil pirofosfat (FPP), ključni međuprodukt mevalonatskog puta sinteze holesterola i farnezilacije proteina može delovati i kao agonista za nekoliko nuklearnih hormonskih receptora uključujući glukokortikodni receptor (GR). Interesantno je da statini, lekovi koji se koriste u terapiji ateroskleroze, svoje dejstvo ostvaruju upravo inhibirajući ovaj sintetski put. Međutim, statini imaju i dodatne plejotropne efekte, koji se ostvaruju nezavisno od sniženja koncentracije holesterola u plazmi i značajno doprinose njihovom korisnom dejstvu u različitim bolestima. Jedan od dobro dokumentovanih plejotropnih efekata je poboljšana reparacija tkiva uključujući i zarastanje rana. Zanimljivo je da se upravo inhibicija farnezilacije signalnih molekula, usled sniženja nivo ćelijskog FPP-a, smatrala do sada ključnim mehanizmom kojim statini ostvaruju ove svoje dodatne efekte. Međutim otkriće da FPP može delovati kao ligand za GR otvara vrata za drugačiju interpretaciju mehanizma dejstva plejotropnih efekata statina i novu primenu ovih lekova. Ciljevi: U ovoj disertaciji dokazivano je postojanje novog mehanizma dejstva statina, kojim oni mogu pospešiti zarastanje rana. Ovaj efekat se zasniva na sniženju koncentracije endogenog FPP-a u ćelijama kože, putem inhibicije HMG-CoA reduktaze Osnovna hipoteza je da, s obzirom da statini svoje dejstvo ostvaruju upravo inhibirajući ovaj sintetski put, modifikuju FPP-GR signalizaciju i tako učestvuju u stimulaciji zarastanje rana. Prvi cilj istraživanja je bio aktivacije glukokortikoidnog signalnog puta i stimulacije transkripcije gena. Potom je ispitatano da li povećanje nivoa endogenog FPP-a putem inhibicije enzima skvalen sintetaze i farnezil transferaze ima isti efekat na aktivaciju glukokortikoidnog receptora kao i dodavanje egzogenog FPP-a..., Introduction: Glucocorticoid hormones, in addition to their anti-immflamatory effect, are well known inhibitors of wound healing. Recent studies have shown that farnesyl pyrophosphate (FPP), a key intermediate in the mevalonate pathway of the cholesterol synthesis and protein farnesylation, can act as an agonist for several nuclear hormone receptors including glucocorticoid receptor (GR). Interestingly, mechanism of action of statins, drugs used in therapy of atherosclerosis, is based on inhibition of mevalonath pathway. However, statins might exert also additional pleiotropic, noncholesterol lowering effects which significantly contribute to their therapeutic action. One of the well known pleiotropic effects of the statins is stimulation of tissue repair, including wound healing. Interestingly, mechanism of pleiotropic effects is traditionally explained by statin mediated inhibition of the farensylation of signaling molecules. By inhibiting the enzime HMG-CoA reductase, statins prevent the synthesis of substrate for reaction, farnesylpyrophosphate. Given that is recently shown that FPP can act as a ligand for GR, it is not surprising that statins might have additional mechanisms of action beyond inhibition of the farnesylation. Better understanding of this mechanism may contribute to novel therapeutic roles for this drugs. Objectives: In this study we are exploring new mechanism of action of statins that can contribute to improvement of wound healing. This effect is based on decreasing the levels of endogenus FPP in keratinocytes by inhibition of the HMG-CoA reductase. We postulate that statins, acting as an inhibitors of mevalonate pathway, stimulate wound healing through modulation of FPP-GR signal. The first step in in our study is to prove that the exogenous FPP, acting as an agonist for GR, can activate the glucocorticoid signaling pathway and regulate the transcription of the target genes. Second, will explore the effects of ZGA and B581, which both can incre

Uvod. Langerhansove ćelije (LĆ) predstavljaju subpopulaciju dendritskih ćelija (DĆ) koja ima ulogu u započinjanju imunskog odgovora na antigene koji su dospeli u epidermis ili sluzokože. DĆ vezuju molekulske obrasce patogena (engl. Pathogen-associated molecular patterns, PAMP) i oštećenih ćelija (engl. Damage-associated molecular patterns, DAMP) pomoću membranskih i citosolnih receptora za prepoznavanje molekulskih obrazaca (engl. Pattern recognition receptors, PRR). Među PRR su najviše proučavani receptori slični Tollu (engl. Toll-like receptors, TLR) i lektinski receptori C-tipa (engl. C-type lectin receptors, CLR). Uspostavljanje kontakta između DĆ i PAMP i DAMP je ključni događaj kojim se povezuju urođena i stečena imunost, što za posledicu ima eradikaciju antigena i nastanak imunološke memorije ili izazivanje periferne tolerancije. Nakon internalizacije i obrade PAMP i DAMP u proinflamacijskom okruženju, DĆ započinju migraciju u T-zavisne zone regionalnih limfnih čvorova u toku koje fenotipski i funkcionalno sazrevaju. Aktivacija CD40 receptora na DĆ nakon vezivanja liganda ovog molekula (CD40L) ispoljenog na površini aktivisanih T-limfocita dovodi do okončanja maturacije DĆ. Tada one postaju potpuno efikasne antigen-prezentujuće ćelije sposobne da polarizuju imunski odgovor CD4+ T-limfocita u Th1 smeru i da indukuju citotoksičnu efektorsku funkciju CD8+ T-limfocita. Konvencionalne DĆ, sa napred navedenim funkcionalnim karakteristikama, su našle primenu u prevenciji i terapiji infektivnih bolesti i maligniteta u obliku DĆ vakcina. Iako je za in vivo ili in vitro sazrevanje DĆ često dovoljna stimulacija samo jednim agonistom TLR ili CLR, fenotipski stabilniji i funkcionalno potentniji imunski odgovor u eksperimentalnim i kliničkim ispitivanjima se najčešće dobija tek kombinovanom primenom njihovih analoga, što je posledica specifične integracije različitih, međusobno nezavisnih, unutarćelijskih signala. Nakon nedavne potvrde da LĆ imaju sposobnost unakrsne preze, Introduction. Langerhans cells (LCs) represent a subpopulation of dendritic cells (DCs) whose function is to initiate immune responses against the antigens from epidermis and mucoses. DCs bind pathogen-associated molecular patterns (PAMPs) and damage-associated molecular patterns (DAMPs) via membrane and cytosolic pattern recognition receptors (PRRs). The most frequently studied PRRs are Toll-like receptors (TLRs) and C-type lectine receptors (CLRs). Similarly to conventional DCs, the contact established between LC’s PRRs and PAMPs and DAMPs is the key event that links innate and adaptive immunity and leads to eradication of the antigen, initiation of the peripheral tolerance and introduction of the immunological memory. After LCs internalise and process PAMPs and DAMPs in a proinflammatory environment, they start to migrate toward T-dependent regions of the regional lymph nodes and, at the same time, become phenotipically and functionally mature. The activation of the CD40 molecule on LCs with a CD40 ligand (CD40L) expressed on the surface of activated T-lymphocytes brings the maturation of LCs to its end, when they become fully efficient antigen-presenting cells, capable of inducing the Th1 polarisation of CD4+ T-lymphocytes and citotoxic effector functions of CD8+ T-lymphocytes. Conventional DCs with the aforementioned functional characteristics are used in the prevention and therapy of infectious or malignant diseases as DC-vaccines. Although DCs require stimulation with a single TLR or CLR agonist to become mature in vitro and in vivo conditions, phenotipically stable and functionally more potent immune response of these cells in experimental and clinical studies is usually achieved only after combined treatment with analoges of these receptors because of the specific integration of the various, mutually independent, intracellular signals. LCs became candidates for DC-vaccines after recent confirmation that they are capable to cross-present antigens. Until now

Multipla skleroza (MS) je hronična, zapaljenska, demijelinizaciona i neurodegenerativna bolest centralnog nervnog sistema (CNS). Smatra se da je MS autoimunska bolest kod koje autoreaktivni pomoćnički T-limfociti (Th) specifični za antigene mijelina pokreću proces oštećenja direktno i aktivacijom drugih imunskih i neimunskih ćelija. Njihovo dejstvo bar delom antagonizuju regulatorni T-limfociti (Treg). Prva linija terapije za najčešću formu MS, relapsno-remitentnu (RR), je interferon-β koji svoje efekte ostvaruje dejstvom na ekspresiju različitih gena. Problem koji se nameće u lečenju ovim lekom je relativno visoka učestalost slabog terapijskog odgovora. U ovoj doktorskoj disertaciji prospektivno je praćena relativna genska ekspresija iRNK u mononuklearnim ćelijama periferne krvi kod bolesnika sa RRMS. Mereni su markeri biološkog odgovora na IFN-β, marker T-limfocita, Th1/17 − polarišući citokini, njihovi receptori, transkripcioni faktori Th1/17 i Treg, efektorski citokinii endogeni IFN-β pre početka terapije sa IFN-β1b i nakon 6, 12, 24 i 36 meseci trajanja terapije. Pored toga, praćena je kinetika koncentracije odabranih proinflamatornih citokina u plazmi. Analiziran je potencijal ovih medijatora kao biomarkera kliničkog odgovora na terapiju. Tokom IFN-β terapije su se značajno menjali nivoi ekspresije svih ispitivanih gena, i to na isti način kod pacijenata koji dobro odgovaraju na terapiju i kod pacijenata koji suboptimalno odgovaraju na terapiju. IFN-β terapija nije uticala na koncentracije merenih proinflamatornih citokina u plazmi bolesnika sa RRMS. Nije postojala povezanost nivoa RNK, kao ni koncentracije citokina u plazmi sa kliničkim i demografskim parametrima obolelih. Međutim, kada su podaci analizirani u zavisnosti od pojave relapsa, nađena je povezanost niže ekspresije β2 subjedinice receptora za IL-12 (IL-12Rβ2) sa višim rizikom za pojavu relapsa. Relativna genska ekspresija IL-12Rβ2 ima potencijal kao biomarker odgovora na terapiju sa IFN-β1b. Dalja