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Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biologia Molecular, 2015. Tomato spotted wilt virus (TSWV) bem como outras espécies de tospovírus (Família Bunyaviridae) é responsável por perdas substanciais na produção de vegetais ao redor do mundo. Tospovírus são transmitidos de maneira circulativa e propagativa por tripes (Ordem Thysanoptera). Como para outros patógenos, ações contra tospovírus exigem um olhar holístico, envolvendo uma combinação de táticas culturais, fitosanitárias, químicas e biológicas, quando apropriadas, além do uso de cultivares resistentes. Entretanto, o controle de doenças causadas por tospovírus tem se mostrado difícil, dado o grande espectro de hospedeiros desses vírus e a grande eficiência dos tripes vetores em transmiti-los. Além disso, a dependência e o aumento no uso de inseticidas de baixo custo tem exacerbado a presença de tospovírus pela forte pressão de seleção sobre os tripes vetores que se tornam resistentes a diferentes inseticidas. Para solucionar de forma simples todas as questões financeiras e ambientais associadas ao uso abusivo de inseticidas para o controle de tripes, esforços têm aumentado para a obtenção de cultivares geneticamente resistentes como um componente integral das estratégias de controle de doenças. Até o momento existem duas fontes de resistência disponíveis para o melhoramento genético de hortaliças à TSWV. Uma dessas fontes é o cluster genético Sw-5, o qual foi encontrado em Solanum peruvianum L., uma espécie de tomate selvagem do Peru, e tem sido introduzido em cultivares de S. lycopersicum L. (tomate comercial). Após mapeamento gênico, pelo menos cinco parálogos compõem o cluster genético Sw-5 em S. peruvianum, os quais foram nomeados de Sw-5a a Sw-5e. Esses parálogos codificam receptores do tipo NB-LRR, uma classe de proteínas citoplasmática que ativam resistência após reconhecimento direto ou indireto de patógenos que tenham ultrapassado as primeiras barreiras de defesa do sistema imune vegetal. Transformação de plantas de tabaco com os parálogos Sw-a e Sw-5b revelou que somente o último ativa resistência contra isolados de TSWV. Com a disponibilidade do genoma do tomate, genes ortólogos também foram mapeados em S. lycopersicum. Esta tese inicia-se com uma descrição detalhada do sistema imune vegetal e descobertas anteriores sobre o cluster genético Sw-5 (Capítulo 1). Como parte da introdução, os problemas causados por tospovírus e suas características são descritas. Tendo essas informações como ponto de partida, esta tese focou no entendimento de pontos-chaves da resistência mediada pela proteína Sw-5b contra tospovírus com uma atenção especial nos eventos moleculares e celulares envolvidos atrás desse mecanismo de resistência. Análises funcionais foram realizadas para esclarecer as delimitações genéticas entre os ortólogos funcionais e não funcionais do cluster Sw-5 no reconhecimento de tospovírus e ativação de resistência. Já que transformantes de N. tabacum com o gene Sw-5b feitos anteriormente não apresentaram resposta hipersensitiva (HR) após inoculação com TSWV, plantas de N. benthamiana foram transformadas com o gene Sw-5b buscando linhas transgênicas que poderiam responder com HR e assim facilitar a identificação do determinante de avirulência (Avr) de TSWV (Capítulo 2). Enquanto N. tabacum foi transformada com o gene Sw-5b sob controle de seus próprios elementos regulatórios, N. benthamiana foi transformada com o gene Sw-5b sob controle do promotor 35S do Cauliflower mosaic virus (CaMV). De forma interessante, as plantas transformadas de N. benthamiana apresentaram forte HR após inoculação de suas folhas com TSWV e outras quatro espécies de tospovírus: Alstroemeria necrotic streak virus (ANSV), Tomato chlorotic spot virus (TCSV), Groundnut ringspot virus (GRSV) and Impatiens necrotic spot virus (INSV) (Capítulos 2 e 7). Para identificação do Avr, os genes de TSWV foram clonados e expressos individualmente em folhas de N. benthamiana expressando Sw-5b e em isolinhas de tomate resistentes (contendo Sw-5) para monitoramento de HR. Como resultado, HR foi induzida após expressão da proteína não-estrutural NSM do isolado BR-01 de TSWV que induz resistência, mas não do isolado GRAU de TSWV que quebra resistência (Capítulo 2). Foco sobre a proteína NSM seguiu no capítulo 3. Versões truncadas dessa proteína foram transientemente co-expressas com Sw-5b em folhas de N. benthamiana (wild type). Tais versões truncadas excluíam domínios anteriormente associados com formação de túbulos, movimento viral célula-célula e sistêmico. Proteínas NSM truncadas faltando até 50 aminoácidos (aa) de ambos N e C terminais (NSM inteira contém 301 aa) ainda induziram HR, sugerindo que funções associadas ao movimento viral e comportamento como Avr são características independentes para NSM. No capítulo 4 experimentos foram realizados para caracterizar uma nova espécie de tospovírus observado em plantas de feijão que apresentavam sintomas de mosaico necrótico em São Paulo, Brasil (2006). Microscopia eletrônica de folhas sintomáticas revelou partículas pleiomórficas agrupadas em vesículas. Devido ao fato de feijão ser um hospedeiro não usual e pelo resultado negativo em testes de ELISA para outras espécies já conhecidas por circular no Brasil, testes biológicos, sorológicos e moleculares foram realizados para caracterização de uma provável nova espécie de tospovírus. Este vírus apresentou um estreito espectro de hospedeiros, infectando sistemicamente três de vintes espécies de plantas indicadoras e apresentou propriedades sorológicas únicas quando comparado com outras espécies de tospovírus encontradas no Brasil. O sequenciamento do genoma deste tospovírus revelou uma nova espécie que, junto com Soybean vein necrosis-associated virus (SVNaV), representa uma nova linhagem evolutiva de tospovírus circulando no continente americano. Este tospovírus foi tentativamente chamado Bean necrotic mosaic virus (BeNMV). Já que a proteína Sw-5b reconhece pelo menos cinco espécies de tospovírus de origem “americana”, a proteína NSM do BeNMV também foi testada para monitoramento de HR através de sua co-expressão com Sw- 5b em folhas de N. benthamiana. O resultado, entretanto, mostrou que a proteína NSM do BeNMV não é um Avr cognato da proteína Sw-5b. No capítulo 5 é mostrado que a proteína Sw-5b induz HR dependentemente e independentemente da presença de NSM. A forma independente foi observada através da coexpressão da proteína Sw-5b com supressores de silenciamento gênico (p19 e NSS), os quais aumentaram a acumulação celular da proteína Sw-5b, induzindo auto-HR. Esta observação permitiu o screening de indução de HR e reconhecimento de NSM como eventos independentes para as outras proteínas Sw-5. Enquanto Sw-5a induziu auto-HR, ela não foi capaz de reconhecer NSM como Avr. De forma diferente, o ortólogo mais conservado das proteínas Sw- 5a e Sw-5b de S. lycopersicum susceptível a TSWV, nomeado Sw-5aS, não induziu qualquer tipo de HR. Através da co-expressão dos domínios individuais de Sw-5b, CC, NB-ARC, LRR ou de versões combinadas (CC-NB-ARC e NB-ARC-LRR) com NSM e com o supressor de silenciamento gênico p19, o papel desses domínios na indução de HR e no reconhecimento de NSM foram determinados. Enquanto NB-ARC foi suficiente para induzir auto-HR, NB-ARC-LRR induziu tanto auto quanto HR dependente de NSM, indicando que o domínio LRR especifica o reconhecimento do Avr. Já o domínio CC suprimiu HR induzida por NB-ARC em cis e trans, apontando para uma função regulatória de CC. A superexpressão do domínio NB-ARC de Sw- 5aS não resultou em HR, similar ao resultado da proteína Sw-5aS completa. Após alinhamento dos domínios NB-ARC, três variações de aminoácidos (aa) foram encontradas entre as proteínas Sw-5a, Sw-5b e Sw-5aS, os quais foram revertidos no último. Quando a glutamina da posição 599 foi convertida em uma arginina (Q599R), igual a proteína Sw-5b nesta posição, o domínio NB-ARC da proteína Sw-5aS tornou-se funcional para indução de HR. Modelagem deste domínio revelou que esta mutação encontra-se fora do domínio de ligação de ADP/ATP, o qual é importante para o switching entre os estados on e off dos domínios NB-ARC. Finalmente, a fusão do domínio LRR da proteína Sw-5b na variante Q599R do domínio NBARC de Sw-5aS resultou em auto-HR e HR dependente de NSM. Os construtos codificando os domínios da proteína Sw-5b também foram usados para estudos subcelulares no capítulo 6. Para este propósito, todas as proteínas estavam fusionadas a Green Fluorescence Protein (GFP) na porção N-terminal para tornar possível a visualização por microscopia confocal em tecido folhear. Enquanto a proteína Sw-5b inteira, os domínios CC, NB-ARC e LRR e o combinado CC-NB-ARC apresentaram distribuição nucleocitoplasmática, NB-ARC-LRR localizou-se somente no citoplasma, sugerindo que CC sinaliza o importe nuclear. Os domínios NB-ARC e LRR também foram investigados para uma possível interação direta com NSM através da técnica Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC). Enquanto interação direta não foi observada entre LRR e NSM, o domínio NB-ARC aparentou interagir com NSM. As especificidades para o reconhecimento de NSM como Avr são discutidas no capítulo 7, levando em consideração aspectos evolutivos de tomates e tospovírus. Um modelo da ativação da proteína Sw-5b é postulado no texto tendo como base a dissecção desta proteína e os ensaios de localização subcelular, além de sua putativa interação direta com NSM. Tomato spotted wilt virus (TSWV) along with other tospovirus species (family Bunyaviridae) is responsible for substantial losses in crop production around the world. Tospoviruses are transmitted in a propagative and circulative manner by thrips vectors (Order Thysanoptera). As for other pathogens, disease management against tospoviruses pursues a holistic approach involving a combination of cultural, phytosanitary, chemical, and biological tactics, when suitable in addition to the use of resistant crops. Nevertheless, successful control has proven difficult given the broad host range of these viruses and their effective spread by thrips vectors. More importantly, increased reliance on the use of low-cost insecticides has exacerbated tospovirus spread by causing thrips resistance. To ease the financial and environmental constraints associated with insecticide abuse to control thrips, efforts have been increased to obtain genetically resistant cultivars as an integral component of disease management strategies. So far there are two resistance sources available for commercial breeding of vegetables against TSWV. One of these sources is the Sw-5 gene cluster, which has been found in Solanum peruvianum L., a wild species of tomato from Peru, and has been introgressed in S. lycopersicum L. cultivars (commercial tomatoes). After gene mapping, it has been reported that at least five paralogs compose the Sw-5 gene cluster in S. peruvianum, which were named Sw- 5a to Sw-5e. These paralogs encode NB-LRR receptors, a class of cytoplasmic proteins that activate disease resistance upon direct or indirect recognition of pathogens that have overcome the first lines of defense of the plant immune system. Transformation of tobacco plants with the paralogs Sw-5a and Sw-5b, revealed that only the latter triggers resistance against TSWV isolates. With the availability of the tomato genome, highly conserved orthologs have been mapped in S. lycopersicum as well. This thesis started off with a detailed description of the plant immune system and previous findings about the Sw-5 gene cluster (Chapter 1). As part of this introduction, the problems caused by tospoviruses, to which Sw-5b locus confers resistance and the characteristics of these viruses have been described. With this knowledge as a starting point, this thesis focused on unraveling the key features of Sw-5b-mediated resistance against TSWV with special attention to the molecular and cellular events underlying the resistance mechanism. Functional analyses have been performed towards clarification of the genetic delimitations between functional and non-functional Sw-5 orthologs considering tospovirus recognition and resistance triggering. Since earlier made N. tabacum transformants containing Sw-5b did not show a hypersensitive response (HR) upon challenging with TSWV, N. benthamiana have been transformed with Sw-5b aiming to obtain transgenic lines that would respond with a visual HR and thereby facilitate the identification of the avirulence determinant (Avr) from TSWV (Chapter 2). While N. tabacum plants were transformed with Sw-5b gene under control of its own regulatory elements, the N. benthamiana plants were transformed with the Sw-5b gene under control of the Cauliflower mosaic virus (CaMV) 35S promoter. Interestingly, the Sw-5btransformed N. benthamiana plants presented a strong HR upon challenging with TSWV and four other tospoviruses: Alstroemeria necrotic streak virus (ANSV), Tomato chlorotic spot virus (TCSV), Groundnut ringspot virus (GRSV) and Impatiens necrotic spot virus (INSV) (Chapter 2 and 7). To identify the Avr, TSWV genes were cloned and expressed individually in leaves of Sw-5b-transformed N. benthamiana plants and Sw-5-resistant tomato isolines for HR monitoring. As a result, HR was triggered upon expression of the non-structural protein NSM from the resistance-inducing TSWV isolate BR-01, but not from the resistance-breaking TSWV isolate GRAU (Chapter 2). The research on NSM was continued in Chapter 3, in which truncated versions of this protein were transiently co-expressed with Sw-5b in wild type N. benthamiana leaves. These truncations lacked domains previously associated with tubule formation, cell-tocell and systemic viral movement. Truncated NSM proteins lacking up to 50 amino acids (aa) from either the N- or C-terminus (full NSM is 301 aa in size) still triggered Sw-5b-mediated HR, suggesting that viral movement functions of NSM and its fate as Avr are independent from each other. Chapter 4 described experiments to characterize a new tospovirus collected from bean plants showing necrotic mosaic symptoms during a field survey in São Paulo, Brazil (2006). Electron microscopy of symptomatic leaves revealed pleomorphic particles packed in vesicles. Due to its unusual natural host for a “Brazilian” tospovirus and being negative in ELISA for tospovirus species known to be circulating in Brazil, biological, serological, and molecular tests were performed to further characterize this putatively new tospovirus species. The virus appeared to have a narrow host-range, systemically infecting only three out of twenty test-plants of various species and presented unique serological properties when compared to other known tospovirus species. The genome sequencing of this tospovirus revealed a completely new species, which, together with Soybean vein necrosis-associated virus (SVNaV), represents a second evolutionary lineage of tospoviruses circulating in the American continent. This new tospovirus was tentatively named Bean necrotic mosaic virus (BeNMV). Since the Sw-5b protein recognizes at least five tospovirus species of “American” origin, the NSM protein of BeNMV was also tested for HR-triggering through co-expression with Sw-5b in N. benthamiana leaves. The outcome, however, indicated that the NSM protein of BeNMV is not a cognate Avr of the Sw-5b protein. In Chapter 5 it is shown that the Sw-5b protein triggers both NSM-dependent and - independent HR. The latter was achieved by co-expression of Sw-5b with RNA silencing suppressors (p19 and NSS), which increased the Sw-5b cellular accumulation and lead to auto- HR. This observation allowed the screening of HR-triggering and NSM-recognition as uncoupled events for other Sw-5 proteins as well. While Sw-5a could trigger auto-HR, it lacked the ability to recognize NSM as Avr. On the other hand, the highest conserved ortholog of Sw-5a and Sw-5b from susceptible S. lycopersicum, named here as Sw-5aS, lacked both auto-HR and NSMdependent HR. By co-expression of the individual Sw-5b domains CC, NB-ARC, LRR or combined versions (CC-NB-ARC and NB-ARC-LRR) with NSM and the silencing suppressor p19, the role of these domains in HR-triggering and NSM-recognition was determined. While NBARC was sufficient for auto-HR, NB-ARC-LRR triggered both auto- and NSM-dependent HR, indicating that LRR specifies the Avr recognition. The CC domain suppressed HR triggered by NB-ARC in cis and trans, pointing towards a regulatory function for CC. The overexpression of the NB-ARC domain from Sw-5aS did not result in HR, similar to the outcome with the full-length Sw-5aS protein. After alignment of the NB-ARC domain, three mismatches were found between Sw-5a, Sw-5b, and Sw-5aS which were reverted in the latter. When the glutamine at position 599 was converted into an arginine (Q599R), to mimic the situation in the Sw-5b protein at this position, the Sw-5aS NB-ARC domain became functional for auto-HR triggering. Modeling of this domain revealed that this mutation was outside of the ADP/ATP binding site, which is important for the switching between “on” and “off” states of NB-ARC domains. Finally, the fusion of the LRR domain of Sw-5b to the Q599R variant of the Sw-5aS NB-ARC domain resulted in both auto- and NSM-dependent HR. The constructs encoding the various Sw-5b domains were used for subcellular studies in Chapter 6. To this end, all constructs encoded proteins were fused with Green Fluorescence Protein (GFP) at their N-terminus, to enable easy visualization by confocal microscopy in leaf tissue. Whereas the full-length Sw-5b protein, the individual domains CC, NB-ARC, and LRR and the combined CC-NB-ARC version showed a nucleocytoplasmic distribution, NB-ARC-LRR localized only in the cytoplasm, suggesting that CC signalizes nuclear import. The subdomains NB-ARC and LRR were also investigated for a possible direct interaction with NSM using Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC). While for LRR interaction with NSM was not observed, the NB-ARC domain seemed to directly bind to NSM. The specificities for NSM recognition have been discussed in Chapter 7 taking into consideration evolutionary aspects of tomatoes and tospoviruses. A model for Sw-5b activation is postulated throughout the text based on the dissection of this protein in HR-triggering and subcellular localization assays and on its putative direct interaction with NSM.