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La dystrophie musculaire oculopharyngée est une des maladies en rapport avec des expansions pathologiques de triplets nucléotidiques. Sa physiopathologie est encore imparfaitement connue même si la présence d'agrégats au niveau des noyaux de la fibre musculaire semble jouer un rôle déterminant. Les travaux fondamentaux présentés ici permettent de mieux comprendre leur composition et leur rôle délétère. Autant d'éléments qui pourraient déboucher sur des voies thérapeutiques nouvelles.

Prion diseases are caused by the propagation of PrP(Sc), the pathological conformation of the PrP(C) prion protein. The molecular mechanisms underlying PrP(Sc) propagation are still unsolved and no therapeutic solution is currently available. We thus sought to identify new anti-prion molecules and found that flunarizine inhibited PrP(Sc) propagation in cell culture and significantly prolonged survival of prion-infected mice. Using an in silico therapeutic repositioning approach based on similarities with flunarizine chemical structure, we tested azelastine, duloxetine, ebastine, loperamide and metixene and showed that they all have an anti-prion activity. Like flunarizine, these marketed drugs reduced PrP(Sc) propagation in cell culture and in mouse cerebellum organotypic slice culture, and inhibited the protein folding activity of the ribosome (PFAR). Strikingly, some of these drugs were also able to alleviate phenotypes due to PABPN1 nuclear aggregation in cell and Drosophila models of oculopharyngeal muscular dystrophy (OPMD). These data emphasize the therapeutic potential of anti-PFAR drugs for neurodegenerative and neuromuscular proteinopathies. SUPPLEMENTARY INFORMATION: The online version contains supplementary material available at 10.1007/s13311-020-00992-6.

International audience

Fibrosis is described as an excessive accumulation of extracellular matrix proteins that replace tissue and alter its function. In skeletal muscle, fibrosis is a pathological feature common to many dystrophies including Oculopharyngeal Muscular Dystrophy (OPMD) and Duchenne Muscular Dystrophy (DMD). In many tissues, resident cells called fibroblasts seem to have a key role in establishing and maintaining fibrosis, however, the exact nature and role of these cells in human muscle fibrosis are still very poorly defined. In this context, we characterized the non-myogenic cell population (CD56- cells) of control and fibrotic muscles and showed that CD56- fibrotic muscle cells have a different phenotype than control muscle cells (proliferative capacity, sensitivity to TGF-β, secretion, impact on fusion and regeneration). Our study highlights the importance of the cross-talk between cell types within the muscle, especially fibrotic and dystrophic muscle. Currently, many anti-fibrotic gene therapy strategies are being developed but while most of them prevent the apparition of fibrosis, none has yet been able to revert pre-existing fibrosis. In this context, we first compared 10 serotypes of AAV by intramuscular injection to evaluate whether one of these serotype was able to transduce fibroblasts in vivo and whether fibrosis impair the transduction of muscle fibers. Then we tested the anti-fibrotic therapeutic potential of AAV-Relaxin (RLN) on DBA/2-mdx mice, model for DMD. Altogether these studies will allow us to improve our understanding of the pathophysiological mechanisms involved in muscle fibrosis and to develop effective anti-fibrotic strategies., La fibrose est une accumulation excessive de protéines de la matrice extracellulaire qui remplace le tissu et en altèrent la fonction. Dans le muscle squelettique c’est une caractéristique pathologique commune à plusieurs dystrophies dont la dystrophie musculaire oculopharyngée et la dystrophie musculaire de Duchenne (DMD). Dans de nombreux tissus, les cellules résidentes appelées fibroblastes semblent avoir un rôle clé dans l’établissement et le maintien de la fibrose, cependant, la nature exacte et le rôle de ces cellules dans la fibrose musculaire humaine sont peu connus. Nous avons caractérisé les populations cellulaires non-myogéniques (CD56-) de muscles contrôles et fibrotiques et montré que les cellules CD56- de muscles fibrotiques ont un phénotype différent des cellules de muscles contrôles (capacité proliférative, sensibilité au TGFβ, sécrétion, impact sur la fusion et la régénération). Notre étude met en évidence l’importance de la communication entre types cellulaires au sein du muscle, en particulier du muscle fibrotique et dystrophique. Actuellement, de nombreuses stratégies anti-fibrotiques se développent mais aucune n’a encore été capable de réduire une fibrose pré-existante. Nous avons comparé 10 sérotypes d’AAV par injection intramusculaire afin d’évaluer si un sérotype était capable de transduire les fibroblastes in vivo et si la fibrose gênait la transduction des fibres musculaires. Puis, nous avons testé le potentiel anti-fibrotique d’un AAV-Relaxine sur des souris DBA/2-mdx, modèle pour DMD. L’ensemble de ce travail permettra d’améliorer la compréhension des mécanismes en jeu dans la fibrose musculaire et de développer des thérapies efficaces.

Fibrosis is described as an excessive accumulation of extracellular matrix proteins that replace tissue and alter its function. In skeletal muscle, fibrosis is a pathological feature common to many dystrophies including Oculopharyngeal Muscular Dystrophy (OPMD) and Duchenne Muscular Dystrophy (DMD). In many tissues, resident cells called fibroblasts seem to have a key role in establishing and maintaining fibrosis, however, the exact nature and role of these cells in human muscle fibrosis are still very poorly defined. In this context, we characterized the non-myogenic cell population (CD56- cells) of control and fibrotic muscles and showed that CD56- fibrotic muscle cells have a different phenotype than control muscle cells (proliferative capacity, sensitivity to TGF-, secretion, impact on fusion and regeneration). Our study highlights the importance of the cross-talk between cell types within the muscle, especially fibrotic and dystrophic muscle. Currently, many anti-fibrotic gene therapy strategies are being developed but while most of them prevent the apparition of fibrosis, none has yet been able to revert pre-existing fibrosis. In this context, we first compared 10 serotypes of AAV by intramuscular injection to evaluate whether one of these serotype was able to transduce fibroblasts in vivo and whether fibrosis impair the transduction of muscle fibers. Then we tested the anti-fibrotic therapeutic potential of AAV-Relaxin (RLN) on DBA/2-mdx mice, model for DMD. Altogether these studies will allow us to improve our understanding of the pathophysiological mechanisms involved in muscle fibrosis and to develop effective anti-fibrotic strategies.; La fibrose est une accumulation excessive de protéines de la matrice extracellulaire qui remplace le tissu et en altèrent la fonction. Dans le muscle squelettique c’est une caractéristique pathologique commune à plusieurs dystrophies dont la dystrophie musculaire oculopharyngée et la dystrophie musculaire de Duchenne (DMD). Dans de nombreux tissus, les cellules résidentes appelées fibroblastes semblent avoir un rôle clé dans l’établissement et le maintien de la fibrose, cependant, la nature exacte et le rôle de ces cellules dans la fibrose musculaire humaine sont peu connus. Nous avons caractérisé les populations cellulaires non-myogéniques (CD56-) de muscles contrôles et fibrotiques et montré que les cellules CD56- de muscles fibrotiques ont un phénotype différent des cellules de muscles contrôles (capacité proliférative, sensibilité au TGFβ, sécrétion, impact sur la fusion et la régénération). Notre étude met en évidence l’importance de la communication entre types cellulaires au sein du muscle, en particulier du muscle fibrotique et dystrophique. Actuellement, de nombreuses stratégies anti-fibrotiques se développent mais aucune n’a encore été capable de réduire une fibrose pré-existante. Nous avons comparé 10 sérotypes d’AAV par injection intramusculaire afin d’évaluer si un sérotype était capable de transduire les fibroblastes in vivo et si la fibrose gênait la transduction des fibres musculaires. Puis, nous avons testé le potentiel anti-fibrotique d’un AAV-Relaxine sur des souris DBA/2-mdx, modèle pour DMD. L’ensemble de ce travail permettra d’améliorer la compréhension des mécanismes en jeu dans la fibrose musculaire et de développer des thérapies efficaces.

Copyright © 2019 The Authors. Background: Oculopharyngeal muscular dystrophy (OPMD) is a late-onset muscle disease affecting one per 80 000 of the general population characterized by profound dysphagia and ptosis, and limb weakness at later stages. Affected muscles are characterized by increased fibrosis and atrophy. Myostatin is a negative regulator of muscle mass, and inhibition of myostatin has been demonstrated to ameliorate symptoms in dystrophic muscles. Methods: In this study, we performed a systemic delivery of a monoclonal antibody to immunologically block myostatin in the A17 mouse model of OPMD. The mice were administered a weekly dose of 10 mg/kg RK35 intraperitonially for 10 weeks, following which histological analyses were performed on the samples. Results: This treatment significantly (P < 0.01) improved body mass (11%) and muscle mass (for the tibialis anterior and extensor digitorum longus by 19% and 41%) in the A17 mice treated with RK35 when compared to saline controls. Similarly, a significantly (P < 0.01) increased muscle strength (18% increase in maximal tetanic force) and myofibre diameter (17% and 44% for the tibialis anterior and extensor digitorum longus), and reduced expression of markers of muscle fibrosis (40% reduction in area of expression), was also observed. No change in the density of intranuclear inclusions (a hallmark of disease progression of OPMD) was however observed. Conclusions: Our study supports the clinical translation of such antibody-mediated inhibition of myostatin as a treatment of OPMD. This strategy has implications to be used as adjuvant therapies with gene therapy based approaches, or to stabilize the muscle prior to myoblast transplantation.

Oculopharyngeal muscular dystrophy (OPMD) is caused by a small expansion of a short polyalanine (polyAla) tract in the poly(A)-binding protein nuclear 1 protein (PABPN1). Despite the monogenic nature of OPMD, no treatment is currently available. Here we report an RNA replacement strategy that has therapeutic potential in cell and C. elegans OPMD models. We develop selective microRNAs (miRNAs) against PABPN1, and we report that miRNAs and our previously developed hammerhead ribozymes (hhRzs) are capable of reducing the expression of both the mRNA and protein levels of PABPN1 by as much as 90%. Since OPMD derives from a very small expansion of GCG within the polyAla tract, our hhRz and miRNA molecules cannot distinguish between the wild-type and mutant mRNAs of PABPN1. Therefore, we designed an optimized-codon wild-type PABPN1 (opt-PABPN1) that is resistant to cleavage by hhRzs and miRNAs. Co-expression of opt-PABPN1 with either our hhRzs or miRNAs restored the level of PABPN1, concomitantly with a reduction in expanded PABPN1-associated cell death in a stable C2C12 OPMD model. Interestingly, knockdown of the PABPN1 by selective hhRzs in the C. elegans OPMD model significantly improved the motility of the PABPN1-13Ala worms. Taken together, RNA replacement therapy represents an exciting approach for OPMD treatment., Graphical Abstract

Objective:Oculopharyngeal muscular dystrophy (OPMD) is an autosomal dominant adult-onset disease characterized by progressive ptosis, dysphagia, and proximal limb weakness. The genetic cause is an expanded (GCN)n mutation in the PABPN1 gene encoding for the polyadenylate-binding protein nuclear 1. We hypothesized a potential correlation between the size of the (GCN)n expansion and the severity of the phenotype. To do this, we characterized the distribution of the genotypes as well as their correlation with age at diagnosis and phenotypical features in a large cohort of heterozygous and homozygous patients with OPMD in France with a confirmed molecular diagnosis of PABPN1.Methods:We explored 354 unrelated index cases recruited between 1999 and 2014 in several neuromuscular centers in France.Results:This cohort allowed us to characterize the frequency of mutated alleles in the French population and to demonstrate a statistical correlation between the size of the expansion and the mean age at diagnosis. We also confirmed that homozygous patients present with a more severe disease.Conclusions:It has been difficult to establish phenotype–genotype correlations because of the rare nature of this disease. Our work demonstrates that patients with OPMD with longer PABPN1 expansion are on average diagnosed at an earlier age than patients with a shorter expansion, confirming that polyalanine expansion size plays a role in OPMD, with an effect on disease severity and progression.

PABPN1 is an RNA binding protein involved in many post-transcriptional RNA regulation mechanisms. A pathological expansion of the GCN triplet in the gene leads to a muscular dystrophy called Oculopharyngeal muscular dystrophy (OPMD). The molecular mechanisms leading to a small expansion in an ubiquitous protein to a disease, where only few muscles are impaired are still not fully understood. The main pathological hallmark is the presence in the myonuclei of nuclear aggregates of the PABPN1 protein. Today there is no cure for OPMD patients. In this context the projects developed during this thesis have been to 1) study the molecular mechanisms involved in OPMD, 2) study the contribution of the nuclear aggregates in the physiopathology of the disease and 3) develop a gene therapy strategy. We found mitochondrial dysfunctions present in OPMD muscles and we decipher the molecular mechanism involved. Study of PABPN1 aggregates in OPMD has highlighted splicing deregulation events. Among them TNNT3, a RNA which encodes a muscle specific protein is deregulated and we found that the pre-mRNA is trapped in nuclear aggregates outsides speckles nuclear domain containing its natural splicing factor (SC35), leading to an imbalance of the ratio of two mutually exclusives exons of the transcript. The gene therapy strategy developed is a replacement strategy that consists of silencing PABPN1 using RNAi and also bringing a novel version of the protein using a cDNA, untargeted by RNAi thanks to the genetic code redundancy, which encodes a wild-type form of PABPN1. We obtained promising results both in vitro and in vivo in mice OPMD model with a rescue of the pathological phenotype.; PABPN1 est une protéine de liaison à l'ARN nucléaire et ubiquitaire impliquée dans de nombreux mécanismes de régulation post-transcriptionnelle des ARN. Une expansion anormale de triplets GCN dans le gène PABPN1 conduit à une dystrophie musculaire appelée dystrophie musculaire oculopharyngée (OPMD). A l'heure actuelle les mécanismes moléculaires conduisant d'une expansion de quelques triplets dans le gène d'une protéine ubiquitaire vers cette pathologie où seulement quelques muscles sont touchés ne sont pas connus. La caractéristique phénotypique majeure de la maladie est la présence d'agrégats intranucléaires dans les noyaux des muscles atteints et non atteints. Cependant le rôle exact de ces agrégats et leur implication dans la pathologie reste encore incertain. A l'heure actuelle il n'y a pas de traitements curatifs pour l'OPMD. Dans ce contexte, ce projet de thèse a porté sur 1) l'étude des mécanismes moléculaires dérégulés dans la pathologie, 2) l'étude de la contribution des agrégats nucléaires et 3) le développement d'un stratégie de thérapie génique. Au cours de ce travail il a été mis en évidence des défauts mitochondriaux et les mécanismes moléculaires sous-jacents ont été élucidés. L'étude de l'implication des agrégats dans la maladie a révélé la présence de défauts d'épissage et en particulier dans un ARN muscle spécifique codant la protéine TNNT3. Le projet de thérapie génique dit de remplacement consiste à éteindre PABPN1 par interférence à ARN et amener un ADNc (PABopt) qui code la forme saine et qui est non ciblée par les outils interférence grâce à la redondance du code génétique. Les résultats obtenus ont été très positifs à la fois in vitro et in vivo

PABPN1 is an RNA binding protein involved in many post-transcriptional RNA regulation mechanisms. A pathological expansion of the GCN triplet in the gene leads to a muscular dystrophy called Oculopharyngeal muscular dystrophy (OPMD). The molecular mechanisms leading to a small expansion in an ubiquitous protein to a disease, where only few muscles are impaired are still not fully understood. The main pathological hallmark is the presence in the myonuclei of nuclear aggregates of the PABPN1 protein. Today there is no cure for OPMD patients. In this context the projects developed during this thesis have been to 1) study the molecular mechanisms involved in OPMD, 2) study the contribution of the nuclear aggregates in the physiopathology of the disease and 3) develop a gene therapy strategy. We found mitochondrial dysfunctions present in OPMD muscles and we decipher the molecular mechanism involved. Study of PABPN1 aggregates in OPMD has highlighted splicing deregulation events. Among them TNNT3, a RNA which encodes a muscle specific protein is deregulated and we found that the pre-mRNA is trapped in nuclear aggregates outsides speckles nuclear domain containing its natural splicing factor (SC35), leading to an imbalance of the ratio of two mutually exclusives exons of the transcript. The gene therapy strategy developed is a replacement strategy that consists of silencing PABPN1 using RNAi and also bringing a novel version of the protein using a cDNA, untargeted by RNAi thanks to the genetic code redundancy, which encodes a wild-type form of PABPN1. We obtained promising results both in vitro and in vivo in mice OPMD model with a rescue of the pathological phenotype., PABPN1 est une protéine de liaison à l'ARN nucléaire et ubiquitaire impliquée dans de nombreux mécanismes de régulation post-transcriptionnelle des ARN. Une expansion anormale de triplets GCN dans le gène PABPN1 conduit à une dystrophie musculaire appelée dystrophie musculaire oculopharyngée (OPMD). A l'heure actuelle les mécanismes moléculaires conduisant d'une expansion de quelques triplets dans le gène d'une protéine ubiquitaire vers cette pathologie où seulement quelques muscles sont touchés ne sont pas connus. La caractéristique phénotypique majeure de la maladie est la présence d'agrégats intranucléaires dans les noyaux des muscles atteints et non atteints. Cependant le rôle exact de ces agrégats et leur implication dans la pathologie reste encore incertain. A l'heure actuelle il n'y a pas de traitements curatifs pour l'OPMD. Dans ce contexte, ce projet de thèse a porté sur 1) l'étude des mécanismes moléculaires dérégulés dans la pathologie, 2) l'étude de la contribution des agrégats nucléaires et 3) le développement d'un stratégie de thérapie génique. Au cours de ce travail il a été mis en évidence des défauts mitochondriaux et les mécanismes moléculaires sous-jacents ont été élucidés. L'étude de l'implication des agrégats dans la maladie a révélé la présence de défauts d'épissage et en particulier dans un ARN muscle spécifique codant la protéine TNNT3. Le projet de thérapie génique dit de remplacement consiste à éteindre PABPN1 par interférence à ARN et amener un ADNc (PABopt) qui code la forme saine et qui est non ciblée par les outils interférence grâce à la redondance du code génétique. Les résultats obtenus ont été très positifs à la fois in vitro et in vivo