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La determinación de metabolitos de vitamina D es muy importante en el metabolismo óseo, en enfermedades coronarias, cáncer, inmunología innata, etc. Desafortunadamente, la variabilidad entre los métodos para la determinación de los metabolitos de la vitamina D limita la capacidad de los clínicos para monitorizar el estado, la suplementación y la toxicidad de vitamina D. En este trabajo se presenta un método automático para la determinación de los metabolitos más importantes de la vitamina D. Se inyectan 0,2 ml de suero en una plataforma XLC-MS/MS (eXtraction Liquid Chromatography-tandem Mass Spectrometry) para ser limpiados y preconcentrados mediante extracción en fase sólida (SPE). Los analitos retenidos en el cartucho de SPE son eluídos directamente por la fase móvil cromatográfica que contiene un 10% de agua en metanol con 5 mM de formato amónico como agente ionizante a un flujo de 0,3 ml/min para la separación de los analitos y posterior detección mediante espectrometría de masas (MS/MS) triple cuádrupolo. Los límites de detección oscilaron entre 3,5 y 8,2 pg/ml. Los coeficientes de variación oscilaron entre un 1,5 y 2,3% intra-ensayo en un mismo día y 2,5-3,9% inter-ensayo realizado durante una semana. La recuperación osciló entre 97 y 99,7% para todos los analitos. El tiempo total de análisis fue de 20 minutos. Por tanto, el método propuesto es robusto, barato y adecuado para su uso en laboratorios clínicos y de investigación.