Search

Aim. To study a role of C-terminal domain of T. thermophilus leucyl-tRNA synthetase (LeuRSTT) in the reactions of aminoacylation and editing. Methods. A mutant of LeuRSTT without C- terminal domain (ΔС) was obtained by the method of mutagenesis. The kinetic constants in aminoacylation reaction catalyzed by LeuRS and its mutant (ΔС) were determined by the methods of equilibrium enzyme kinetics. To evaluate the contribution of C-terminal domain to interaction of the enzyme with tRNALeu, Kd of a complex between tRNA and LeuRSTT and its mutant ΔС was determined by fluorescence titration. Results. The C-terminal domain is shown to play a significant role in the aminoacylation and editing reactions of LeuRSTT and not essential for the activity in the reaction of amino acid activation. The kinetic parameters of aminoacylation of tRNALeu and tRNATyr by LeuRS and ΔС mutant were also determined, their analysis suggests that the C-domain is not critical for the manifestation of specificity of the enzyme in the recognition of homologous RNAs. At the same time a significant influence of the C-terminal domain on the value of catalytic constant was shown. At the domain deletion the kcat value is lower by 152-fold. Conclusion. The C-terminal domain of LeuRSTT is evolutionarily acquired to enhance the rate of catalysis in the aminoacylation and editing reactions, and makes no significant contribution to the specificity of the enzyme in the recognition of tRNA.

Leucyl-tRNA synthetase from Thermus thermophilus (LeuRSTT) was purified to homogeneity using a five-step purification procedure. The enzyme was characterized and crystallized. Molecular mass determinations of the native and denatured proteins indicate monomeric structure of LeuRSTT with the molecular mass of about 101 kDa. The protein obtained is remarkably thermostable and retains 97 % of its initial aminoacylation activity after 1 hour of incubation at 88 °C. Crystals of LeuRSTT were obtained from ammonium sulfate solution by the vapour diffusion techniques. The crystals quality was improved by crystallization from the precipitate. Лейцил-тРНК синтетаза из Thermus thermophilus (ЛейРСТТ) выделена в гомогенном состоянии с использованием пяти стадий очистки. Фермент охарактеризован и получены его кристаллы. Определена молекулярная масса нашивного и дена­турированного белка. Установлено, что ЛейРСТТ представ­ляет собой мономер с молекулярной массой 101 кДа. Получен­ный фермент обладает значительной термостабильностью и сохраняет 97 % аминоацилирующей активности после инкуба­ции в течение 1 ч при температуре 88 °С. Кристаллы ЛейРСТТ получены методом диффузии паров с использованием в качестве осадителя раствора сульфата аммония Лейцил-тРНК синтетазу із Thermus thermophilus (ЛейРСТТ) виділено в гомогенному стані з використанням п'яти стадій очищення. Фермент охарактеризовано та отримано його кристали. Визначено молекулярну масу нативного і денатуро­ваного білка. Встановлено, що ЛейРСТТ являє собою мономер з молекулярною масою 101 кДа. Отриманому ферментові притаманна значна термостабільність і він зберігає 97 % аміноацилюючої активності після інкубації протягом 1 год при температурі 88 ° С Кристали ЛейРСТТ одержано методом дифузії парів із використанням як осаджувана розчину сульфату амонію.