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Durch einen Prozess, der als sekundäre Endosymbiose bezeichnet wird, wurde eine Rotalge als Endosymbiont aufgenommen. Dies führte zur Entstehung der komplexen Plastiden von Cryptophyten, Haptophyten, Heterokontophyten und Apicomplexa. Das Genom dieser ehemaligen Rotalge wurde im Laufe der Evolution dramatisch reduziert und zum größten Teil in den Wirtskern transferiert. Dies führte dazu, dass die meisten plastidären Proteine nun im Zellkern des Wirtes kodiert sind und aus dem Cytosol in die Plastide importiert werden müssen. Es mussten entsprechende Translokationsmechanismen entwickelt werden. Im Rahmen dieser Arbeit wurde versucht neue Komponenten der dritten Plastidenmembran zu identifizieren, welche auf die äußere Chloroplastenmembran primärer Plastiden zurückgeht. Diese Membran unterscheidet sich von anderen plastidären Membranen durch die Präsenz von β-barrel Proteinen, die für die äußeren Membranen von Gram-negativen Bakterien, Mitochondrien und Chloroplasten charakteristisch sind. Mit Hilfe verschiedener Algorithmen wurden putative plastidäre β-barrel Proteine vorhergesagt und als Fusionsproteine in P. tricornutum lokalisiert. Es wurden von 23 Proteinen, vier in der Plasmamembran, vier im Cytosol, fünf im ER, fünf außerhalb der Plastide und fünf in der Plastide lokalisiert. Es konnte kein Protein in der dritten Plastidenmembran identifiziert werden. Die Vorhersagealgorithmen sind nicht dafür geeignet eukaryote Proteome auf β-barrel Proteine hin zu analysieren. Des Weiteren lag ein anderes Problem in der Beschaffenheit der Genmodelle, welche die Basis der Vorhersage bildeten. In einem zweiten Projekt wurde die Subkompartimentierung des ERs in P. tricornutum untersucht. Basierend auf der Erkenntnis, dass das ER in ein hostER, die Kernhülle (NE) und das cER eingeteilt werden kann, wurde untersucht, ob sich hER und cER in ihrer Funktion unterscheiden. Basierend auf der Annahme, dass hER und cER durch den Tag-Nacht-Zyklus der Photosynthese unterschiedlichen physiologischen Bedingungen ausgesetzt sind, wurde gefolgert, dass einige Funktionen wie zum Beispiel die Proteinqualitätskontrolle und -faltung auf das hER beschränkt sein könnten. Daher wurden Faktoren der UPR in P. tricornutum untersucht. Überraschenderweise konnten IRE1 und PERK in Heterokontophyten und Haptophyten identifiziert werden. Lokalisationsstudien der UPR-Faktoren zeigten, dass diese hauptsächlich auf das hER und den NE beschränkt sind, wohingegen hDer1-2 als Beispiel für Proteindegradation im gesamten ER und Transporterproteine wie Tpt1 hauptsächlich im cER vorhanden sind. Die Abwesenheit der UPR im cER lässt sich durch die Physiologie begründen. Außerdem wirft die Präsenz von PERK und IRE1 in Protisten ein neues Licht auf die Sichtweise der Evolution der UPR. So ist eine alternative Entstehungsgeschichte der UPR denkbar., In a process termed secondary endosymbiosis a red alga was established as an endosymbiont. This led to the evolution of the complex plastids found in cryptophytes, haptophytes, heterokontophytes and apicomplexans. The genome of this former red alga was drastically reduced and mostly transferred into the host nucleus. Thus, most plastidal proteins are now encoded in the host nucleus and have to be imported from the cytosol into the plastid. Appropriate transport mechanisms had to be evolved. The aim of this work was the identification of new components of the third plastid membrane. It evolved from the outer chloroplast envelope of primary plastids. This membrane is distinct from other plastidal membranes due to the fact that it presumably contains β-barrel proteins which are characteristic of outer membranes of gram-negative bacteria, mitochondria and chloroplasts. With different algorithms putative plastidal β-barrel proteins were predicted and localized as fusion proteins in P. tricornutum. Out of 23 proteins, four were localized to the plasma membrane. Four other proteins were localized to the cytosol. Five proteins were localized to the ER. Additionally five proteins were localized to various compartments outside the plastid and five proteins were localized to the plastid. There were no new proteins of the third plastidal membrane identified. The used prediction algorithms are not suited to analyze a eukaryotic genome for β-barrel proteins. Moreover, the quality of the predicted gene models of the database complicated the analysis. In the second part of this work the subcompartmentalization of the ER of P. tricornutum was analyzed. Based on the classification of the ER into a hostER, nuclear envelope and cER the functions of these two subcompartments were tested. Based on the assumption that hER and cER are exposed to different physiological conditions during night and day, functions as protein quality control and protein folding might be restricted to the hER. Therefore, factors of the UPR were studied. Surprisingly, IRE1 and PERK were identified in heterokontophytes and haptophytes. Localization studies of these UPR factors showed that these are indeed mainly found in the hER and only in minor concentrations in the nuclear envelope and cER. hDer1-2 which takes part in protein degradation shows an equal distribution over the complete ER, while transporter proteins like Tpt1 are mainly found in the cER and nuclear envelope. The absence of the UPR factors in the cER can be explained by different physiological conditions during night and day inside of these two subcompartments. Additionally, the presence of PERK and IRE1 in protists sheds a new light on the evolution of the UPR. An alternative evolutionary history is conceivable.

Toxoplasma gondii is an obligatorily intracellular living, parasitical protozoon of great medical importance particularly in two cases: On the one hand with first infection during a pregnancy, which can harm the Foetus. On the other hand as opportunistic pathogen in immunocompromised patients (e.g. AIDS). Here a reactivation of continuous stages could lead to death. A starting point for the fight against the parasites represents a special metabolic pathway, the glycosylphosphatidylinositol (GPI) biosynthesis. GPIs consist of a conserved hydrophilic glycan structure, which can be modified by side chains, and a hydrophobic inositol-phospholipid. Like numerous other parasitic protozoa the T. gondii major surface proteins are anchored by GPIs in the cell surface - a blocking of the GPI biosynthesis leads to killing the parasites. In order to fight only the parasites with therapeutic efforts and not to affect the GPI biosynthesis that is likewise taking place in the host cells however, detailed knowledge of this metabolic pathway is necessary. A system of permeabilized Tachyzoites of T. gondii was developed and the distribution of GPI anchor precursors and further GPI biosynthetic intermediates over the membrane of the endoplasmic reticulum (ER) was examined for the first time. The cell membrane is effectively permeabilized by hypotonic treatment, which remains ER with this treatment intact. This system was used, in order to label GPIs with different radioactive precursor molecules (sugar nucleotides). The GPI intermediates formed by permeabilized Toxoplasma were characterized on the basis of specific enzymatic treatments and chemical hydrolyses and compared with already well-known data. It was stated that the hydrophilic components of the GPI intermediates match with the described structures. In addition it could be proven in this work that before starting the mannosylation steps an acylation from GlcN-PI to GlcN-(acyl)-PI at the inositol takes place. Following radioactive labelling of the glycolipids the enzyme PI-PLC, which cleaves between hydrophilic and hydrophobic portion of the GPIs, was used to examine orientation of the GPI biosynthesis intermediates in the ER membrane. It could be shown that both early, and higher glycosylated intermediates and even GPI anchor precursors to the predominant part exhibit a cytoplasmic orientation in the ER membrane. In connection with transient acylation of the inositol ring a repeated change of the different intermediates over the ER membrane ("flip-flop") seems possible. For the first time it could be shown here that such large GPI anchor precursors with an additional hydrophilic side chain, consisting of N-Acetyl-Galactosamina1-4Glucose, cross a lipid bilayer membrane., Toxoplasma gondii ist ein obligat intrazellulär lebendes, parasitisches Protozoon mit großer medizinischer Bedeutung vor allem in zwei Fällen: Zum einen bei Erstinfektion während einer Schwangerschaft, hier kann es zur Schädigung des Fötus kommen, zum anderen als opportunistischer Krankheitserreger bei immunsupprimierten Patienten (z. B. AIDS), hier kann eine Reaktivierung von Dauerstadien zum Tod führen. Einen Ansatzpunkt zur Bekämpfung der Parasiten stellt ein spezieller Stoffwechselweg dar, die Glycosylphosphatidylinositol- (GPI-) Biosynthese. GPIs bestehen aus einer konservierten hydrophilen Glycan-Grundstruktur, die durch Seitenketten modifiziert werden kann, und einem hydrophoben Inositol-Phospholipid. Wie bei einer Vielzahl anderer parasitärer Protozoen sind auch bei T. gondii die Hauptoberflächenproteine durch GPIs in der Zelloberfläche verankert, eine Blockierung der GPI-Biosynthese führt zum Absterben der Parasiten. Um bei therapeutischen Ansätzen jedoch nur die Parasiten zu bekämpfen und die in den Wirtszellen ebenfalls stattfindende GPI-Biosynthese nicht zu beeinflussen, sind detaillierte Kenntnisse über diesen Stoffwechselweg nötig. Es wurde ein System aus permeabilisierten Tachyzoiten von T. gondii entwickelt und erstmals die Verteilung von GPI-Ankervorläufern und weiterer GPI-Biosyntheseintermediate über die Membran des endoplasmatischen Reticulums (ER) untersucht. Durch hypotone Behandlung wird die Zellmembran effektiv permeabilisiert, das ER bleibt bei dieser Behandlung intakt. Dieses System wurde genutzt, um GPIs mit verschiedenen radioaktiven Vorläufermolekülen (Zuckernukleotiden) zu markieren. Die von permeabilisierten Toxoplasmen gebildeten GPI-Intermediate wurden anhand spezifischer enzymatischer Behandlungen und chemischer Hydrolysen charakterisiert und mit bereits bekannten Daten verglichen. Dabei wurde festgestellt, daß die hydrophilen Komponenten der GPI-Intermediate mit den beschriebenen Strukturen übereinstimmen. Außerdem konnte in dieser Arbeit nachgewiesen werden, daß vor Einsetzen der Mannosylierungs-Schritte eine Acylierung am Inositol von GlcN-PI zu GlcN-(acyl)-PI erfolgt. Anschließend an die radioaktive Markierung der Glycolipide wurde mit Hilfe des Enzyms PI-PLC, das zwischen hydrophilem und hydrophobem Anteil der GPIs spaltet, die Orientierung der GPI-Biosyntheseintermediate in der ER-Membran untersucht. Es konnte gezeigt werden, daß sowohl frühe, als auch höher glycosylierte Intermediate und sogar GPI-Ankervorläufer zum überwiegenden Teil eine cytoplasmatische Orientierung in der ER-Membran aufweisen. Im Zusammenhang mit transienter Acylierung des Inositolringes scheint ein mehrfacher Wechsel der verschiedenen Intermediate über die ER-Membran ("flip-flop") möglich. Erstmals konnte hier gezeigt werden, daß derart große GPI-Ankervorläufer mit einer zusätzlichen hydrophilen Seitenkette, bestehend aus N-Acetyl-Galactosamina1-4Glucose, eine Lipid-Doppelmembran überqueren.