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Die Regulation der Insulinfreisetzung in vivo ist ein komplexer Prozeß. Über unterschiedliche Mechanismen kommt es sowohl durch Aktivierung des PLC/IP3-als auch des c-AMP- Signaltransduktionsweges zu einem Anstieg der [Ca2+]i. Dieser gilt als zentrales intrazelluläres Signal für die Insulinfreisetzung. Ziel der vorliegenden Arbeit war die molekulare Analyse der an der Regulation des Calciumstoffwechsels beteiligten PKC- Isoenzymformen. Die Dissektion der Signaltransduktionswege erfolgte nach Aktivierung der PKC-Isoformen durch Acetylcholin am Modell der isolierten β-Zelle der Maus. In den Versuchen konnte durch Aktivierung und Inhibierung der PKC-Isoformen gezeigt werden, daß insbesondere die konventionellen, calciumabhängigen PKC-Isoformen eine zentrale Rolle für das Acetylcholin-induzierte Ca2+-Signal in primären β-Zellen spielen.

Die Glukose-induzierte Aktivierung der PKC-β bei der Entstehung der diabetischen Folgekomplikationen ist in vielen Untersuchungen im Tiermodell und zunehmend auch in menschlichen Zellen gesichert. Die transkriptionelle Regulierung der PKC-β durch Glukose wurde hier untersucht. Promotorkonstrukte der humanen PKC-β wurden transient in die humane, embryonale Nierenzellinie HEK-293 transfiziert. Nach 72h Inkubation in 16,5 mmol/l Glukose zeigte sich eine hochsignifikante Aktivierung des PKC-β-Promotorkonstruktes C2. Der Effekt wurde durch den PKC-β-Agonisten TPA verstärkt, GF109203X, ein unselektiver Antagonist, hemmte diesen Promotorabschnitt. LY379196, ein PKC-β-selektiver Antagonist, zeigte keinen Einfluß auf den PKC-β-Promotor. Hohe Glukose bewirkt eine transkriptionelle Aktivierung des humanen PKC-β-Promotors. Der Transkriptionsfaktor AP-2 ist ein Aktivator dieser Sequenz und damit ein möglicher Vermittler dieser Glukosewirkung.

Die Proteinkinase C (PKC) besteht aus einer Familie von 11 Isoenzymen (IE). Zur genaueren Charakterisierung der Wirkung der PKC-IE, wurden 4 Hydroxytamoxifen induzierbare PKC-Fusionsproteine (PKC-FP) hergestellt. Die katalytische Domäne der PKCα, β1 und δ wurde mit dem mutierten Östrogenrezeptor fusioniert und in die pcDNA3.1/HisB subkloniert. Die Expression wurde für alle drei FP nachgewiesen. Die Funktionalität des PKCβ1-FP ist aufgrund des Nachweises einer Mutation mittels Sequenzanalyse fraglich. Die Enzymaktivität wurde im Phosphorylierungsassay für das PKCα- und PKCδ- FP in vitro nachgewiesen. Im dualen Luciferase-Assay wurde die PKC-abhängige Aktivierung und Hemmung des MAPK- Signaltransduktionsweges über ERK1/ERK2 in vivo gezeigt. Als Schlüsselenzym für die Signaltransduktion spielt die PKC u.a. eine Rolle beim Diabetes mellitus und seinen Folgeerkrankungen. Die hergestellten und etablierten FP können in weiteren Experimenten neue isoenzymspezifische Erkenntnisse ermöglichen.

Die Proteinkinase Pkc1p der Hefe \(\textit {Saccharomyces cerevisiae}\) konnte \(\textit {in vitro}\) als Effektor der GTPase Rho1p identifiziert werden. Diese GTPase-Effektorwechselwirkung ist von der Nukleotidbeladung der GTPase abhängig und wird über deren Effektorregion vermittelt. Die C1B Domäne der Pkc1p ist für diese Interaktion verantwortlich; sie wechselwirkt über ein polares Bindungsepitop mit GTP-beladenem Rho1p. Diese Interaktion mit der GTPase moduliert den Pkc1p-Signalweg. Es konnte gezeigt werden, dass die HR1 Domänen, welche bei der PKC-ähnlichen Kinase PRK1 der Säuger die Bindung von RhoA vermitteln, im Falle der Pkc1p keine Rolle für die Interaktion mit Rho1p spielen. Auch PKC-\(\alpha\), eine PKC der Säuger, wechselwirkt mit der GTPase RhoA und wird durch diese Wechselwirkung \(\textit {in vivo}\) aktiviert, was sich in der Translokation der PKC-\(\alpha\) an die Zellmembran und einer Morphologieänderung der Zelle äußert. \(\textit {In vivo}\) wird diese Wechselwirkung von PKC-\(\alpha\) und RhoA wiederum über die C1 Domänen vermittelt.

Die Proteinkinase C (PKC) kontrolliert Differenzierung und Wachstum. Untersucht wurden subzelluläre Veränderungen der PKC-Proteinexpression in der frühen kolorektalen Karzinogenese. In Biopsien (n=19) wurde die Expression der PKCα, - βI, -βII, -δ, -ε, -ζ in Adenomen und umgebender Mukosa gemessen. Die PKCα und -βI war in Adenomen im Vergleich zur Mukosa in der zytosolischen Fraktion signifikant stärker exprimiert. Bei der PKCβII zeigte in der Membranfraktion der Adenome eine erniedigte Expression. Diese Isoformen zeigten auch eine verminderte Aktivität in Adenomen. Bei der PKCδ, -ε und -ζ ergaben sich keine Expressionsunterschiede zwischen Adenomen und Mukosa. An T84-Kolonkarzinomzellen wurde die Expression der PKCδ untersucht. T84-Zellen zeigten eine PKCδ-vermittelte, TPA-induzierbare Proliferationsinhibition. Die Ergebnisse belegen eine essentielle Rolle der PKC an der Kontrolle von Wachstumsprozessen. Bereits in kleinen Adenomen liegt eine Regulationsstörung der PKC vor.

Die Protein Kinase C hat Einfluß auf die Regulation von Wachstum und Differenzierung und spielt eine Rolle bei der Karzinogenese . Hier wurde die Genexpression der PKC-Isotypen α und δ auf mRNA-Ebene in der Kolonkarzinomzellinie T 84 und in frühen Kolonadenomen mit einem Durchmesser unter 1 cm mit der RNase-Verdauungsschutzanalyse untersucht. Weiterhin wurden die Kolonadenome und Schilddrüsentumore auf eine Punktmutation der PKCα untersucht. Die Stimulation der PKC mit dem Phorbolester TPA, mit der Folge einer Proliferationshemmung, bewirkte einen Anstieg der PKCδ mRNA auf 400% und eine Reduktion der PKCα mRNA. In Kolonadenomen ließ sich eine Abnahme der PKCδ mRNA auf 53 % im Vergleich zum Normalgewebe nachweisen, die mRNA der PKCα war unverändert. Nach Korrelation mit Daten zur Proteinexpression zeigen diese Ergebnisse einen proliferationshemmenden Effekt sowohl der PKCδ wie auch der PKCα und eine verminderte Aktivität der Isoenzyme in Kolontumoren. Beide Isoenzyme scheinen einen protektiven Effekt im Bezug auf eine Tumorentstehung zu haben. Eine Punktmutation der PKCα konnte weder in Kolonadenomen noch in Schilddrüsentumoren nachgewiesen werden.