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Tesis doctoral presentada por Beatriz Vallejo Estará para optar al grado de Doctora por la Universitat de València., [ES]: La fermentación alcohólica del mosto de uva es llevada a cabo principalmente por la levadura Saccharomyces cerevisiae. Esta tesis aborda el análisis de las rutas de señalización de nutrientes de cepas vínicas de S. cerevisiae en condiciones de vinificación para comprender su respuesta frente a las condiciones adversas de disponibilidad de fuentes de nitrógeno y carbono en el mosto. El mosto de uva se caracteriza por un elevado contenido en azúcares y una limitación de fuente de nitrógeno, lo que podría explicar la mayor tolerancia de las cepas vínicas, respecto a las de laboratorio, frente a rapamicina (inhibidor del complejo TORC1) y a análogos estructurales no metabolizables de la glucosa, sugiriendo una organización diferencial de flujos metabólicos. Se han realizado dos experimentos de evolución dirigida, frente a rapamicina y frente a un análogo estructural de la glucosa (2-desoxiglucosa), que han permitido obtener cepas más tolerantes a dichos compuestos, pero sin fenotipos con aplicabilidad industrial. También se ha analizado el estado de activación de las rutas de señalización de nutrientes a través del estudio del estado de fosforilación de proteínas diana de las mismas, y se ha encontrado que las rutas TORC1 y Snf1 solo están activas en las primeras horas de vinificación, mientras que la ruta RAS/cAMP/PKA se mantiene activa a lo largo de todo el proceso, sugiriendo que ésta es la ruta reguladora principal en esas condiciones. Dado que el mosto de uva presenta una concentración deficitaria de nitrógeno, se estudiaron, además de TORC1, otras rutas que también responden a disponibilidad de nitrógeno, como el control general de aminoácidos (GAAC) y la represión por catabolito de nitrógeno (NCR), encontrándose que la proteinquinasa Sch9p y el factor transcripcional Gcn4p influyen profundamente en la fisiología celular, en el metabolismo y en la longevidad cronológica. Mutaciones en los genes codificantes de estas proteínas alteran, de manera similar, el metabolismo central del carbono y la producción de glicerol en vinificación y, sin embargo, tienen diferente impacto sobre el resto del metabolismo. Se realizó también un análisis fenómico global de las cepas y mutantes de deleción en genes de proteínas diana de las rutas de señalización de nutrientes. Los resultados mostraron la importancia de las proteínas Ras2p y Bcy1p, recalcando la importancia de la ruta Ras/cAMP/PKA en vinificación, así como la relación entre Snf1p y Gln3p. También mostraron que el gen MKS1, regulador negativo de la ruta retrógrada, es una buena diana para la obtención de cepas mejoradas de aplicabilidad industrial en vinificación. El conjunto de resultados obtenidos demuestra que no existe división entre la señalización de fuentes de carbono y de nitrógeno en vinificación, sino una comunicación cruzada adecuadamente regulada entre todas las rutas de señalización de nutrientes que permite que el metabolismo celular se adecúe a las condiciones ambientales., [EN]: Alcoholic fermentation of grape must is mainly carried out by the yeast Saccharomyces cerevisiae. This thesis deals with the analysis of nutrient signalling pathways of Saccharomyces cerevisiae wine strains in winemaking conditions to understand their response to low conditions of nitrogen and carbon availability of sources in the must. Grape must is characterized by high sugar content and limited nitrogen sources, which could explain the greater tolerance of wine strains, compared to laboratory strains, against rapamycin (inhibitor of the TORC1 complex) and non-metabolizable structural analogues of glucose, suggesting a differential organization of metabolic fluxes. Two experiments of directed evolution have been carried out, one against rapamycin ( an inhibitor of TOR activity) and the other against 2-deoxyglucose (a structural analogue of glucose), which have allowed us to obtain strains more tolerant to those compounds however none of them displayed improved phenotypes for winemaking. The activation state of nutrient signalling pathways has also been analysed through the study of the phosphorylation state of their target proteins, and it has been found that both the TORC1 and SNF1 pathways are only active during the first hours of vinification, while the RAS/cAMP/PKA pathway remains active throughout the entire process, suggesting that this is the main regulatory pathway in these conditions. Since grape must has a nitrogen deficit concentration, other pathways that also respond to nitrogen availability, such as the general amino acid control (GAAC) and nitrogen catabolite repression (NCR), were studied in addition to TORC1. Sch9p protein kinase and the transcriptional factor Gcn4p deeply impact cell physiology, metabolism and chronological longevity. Deletion of SCH9 and overexpression of GCN4 similarly alter central carbon metabolism and glycerol production in winemaking but they have different impact on the rest of metabolic pathways. A global phenomic analysis of deletion mutants in genes coding for target proteins from the nutrient signalling pathways was also performed. The results showed the significance of Ras2p and Bcy1p proteins, emphasizing the importance of the Ras/cAMP/PKA pathway in winemaking, as well as the relationship between Snf1p and Gln3p. They also showed that the MKS1 gene, a negative regulator of the retrograde pathway, is a good target for the improvement of strains for industrial winemaking. The main general conclusion from the obtained results is that no division exists between signalling of carbon and nitrogen sources in vinification conditions, but a properly regulated crosstalk between all nutrient signalling pathways that allows cellular metabolism to adapt to the singular environmental conditions during winemaking.

Tesis doctoral: 356 páginas, [EN]The central dogma of molecular biology purposes that every gene codifies for one protein that it will be the responsible for carry out only one function. Nevertheless, the number of multiple function proteins, known as moonlighting proteins, is increasing constantly. The dUTPases are an example of these moonlighting proteins. In particular, the model of which this thesis is about focuses on the moonlighting activity of dUTPases codified by phages of Staphylococcus aureus, which are able to induce the mobility of some pathogenicity islands that are present in this organism, also known as SaPIs. The protein Stl, which is codified by the own SaPI, blocks the mobility of SaPIs. The dUTPases of certain phages of S. aureus induce the mobility of these islands through the interaction to the repressor Stl, in a case that seems to be a clear example of cell signaling mechanism. Using macromolecular X-ray crystallography, as the main technique, and also in vivo and in vitro assays, this thesis tries to deal with the molecular mechanism through dUTPases carry out this new function. The obtained data allow us to suggest a mechanistic model for this novel signaling ability for dUTPases codified by phages of S. aureus. This mechanism, which is similar to eukaryotic G protein mechanism, implies the conserved motifs present in both monomeric and trimeric dUTPases, additional no conserved motifs and the dUTP as second messenger. In addition, comparisons at sequence and structural level between these two dUTPases families allow us to suggest this mechanism as “universal mechanism” for signaling ability of these proteins in all organisms from virus to eukaryotic organisms. This thesis, in addition, deals with the signaling molecular mechanism of dimeric dUTPases codified by phages of S. aureus. This mechanism, apparently, differs with the previously described for trimeric dUTPases and leaves a lot of non resolved question relating to the manner by which these proteins carry out with this new function., [ES] El dogma central de la biología molecular propone que para cada gen se traduce en una proteína que será responsable de una única función. No obstante, cada vez son más numerosos los casos de proteínas multifunción o moonlighting proteins capaces de llevar a cabo múltiples funciones. Entre estas proteínas moonlighting encontramos las dUTPasas. En concreto, y el modelo sobre el que gira el presente trabajo de tesis, nos hemos centrado en la actividad moonlighting que presentan las dUTPasas codificadas por fagos de Staphylococcus aureus, capaces de inducir la movilidad de islas de patogenicidad presentes en el genoma de este organismo. Las islas de patogenicidad de S. aureus, más conocidas como SaPIs, se encuentra reprimidas por un inhibidor general codificado por la propia isla, la proteína Stl. Las dUTPasas de ciertos fagos de S. aureus inducen la movilidad de estas SaPIs, a través de su unión a Stl, en lo que parece ser un claro mecanismo de señalización celular. Utilizando como técnica principal la cristalografía de moléculas mediante Rayos-X, suplementada con ensayos in vivo e in vitro, esta tesis pretende abordar el mecanismo molecular mediante el cual las dUTPasas llevan a cabo esta nueva función. Los resultados obtenidos, nos han permitido proponer un modelo de mecanismo para esta novedosa capacidad señalizadora que presentan las dUTPasas de fagos de S. aureus. Este mecanismo, similar al de las proteínas G de eucariotas, implica motivos conservados en dUTPasas triméricas y monoméricas, motivos adicionales y el dUTP como segundo mensajero. Además, la comparación a nivel de secuencia y estructural entre dUTPasas de estas dos familias permite proponer este mecanismo como un mecanismo “universal” para la capacidad señalizadora de estas proteínas en organismos que van desde virus hasta eucariotas. En este trabajo se aborda también el mecanismo molecular de señalización de dUTPasas diméricas de fagos de S. aureus, un mecanismo aparentemente muy diferente para el descrito en las triméricas y que deja sin resolver muchas cuestiones en cuanto a cómo actúan estas proteínas., Para la realización de esta Tesis, Jorge Donderis Martínez ha disfrutado de una beca lanzadera del CIBER de Enfermedades Raras y un contrato en la modalidad de prácticas suscrito en el marco del Programa Junta para la Ampliación de Estudios (JAE). El trabajo se ha enmarcado en los proyectos “Estructura y función de máquinas moleculares implicadas en redes de señalización de microorganismos.” (BIO2010-15424) y “Análisis global de mecanismos reguladores antisentido en Staphylococcus aureus.” (PIM2010EPA-00606) financiados por el Ministerio de Ciencia e Innovación; y ”Estructura, función, reconocimiento y evolución en señalización celular: de lo bacteriano (sistemas de dos componentes) a lo universal (dUTPasas).” (BIO2013-42619-P) financiado por el Ministerio de Economía y Competitividad, ; de los cuales el doctorando ha estado contratado a través de los proyectos PIM2010EPA-00606 y BIO2010-15424.

Tesis doctoral, 123 páginas., Para la realización de esta tesis doctoral, Pablo Sánchez Martín ha disfrutado de una ayuda para la Formación de Profesorado Universitario (FPU) (FPU13-00507), del Ministerio de Educación, Cultura y Deporte.El trabajo se ha llevado a cabo en el grupo U742 del CIBERER-Instituto de Salud Carlos III (IP, P. Sanz) enmarcado dentro de los siguientes proyectos de investigación: – Programa Nacional de Biomedicina. Proyecto SAF2011-27442. “Bases moleculares de la fisiopatología de la epilepsia mioclónica progresiva de tipo Lafora. Identificación de nuevos sustratos del complejo laforina-malina” Años 2012-2014. Investigador Principal: Dr. Pascual Sanz. Centro: Instituto de Biomedicina de Valencia (CSIC), Valencia. – Programa Nacional de Biomedicina. Proyecto SAF2014-54604-C3-1-R. “Buscando una terapia para la epilepsia mioclónica progresiva de Lafora” Años 01/01/2015-31/12/2017. Investigador Principal: Dr. Pascual Sanz. Centro: Instituto de Biomedicina de Valencia (CSIC), Valencia

211 páginas, figuras y tablas