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Mestrado em Biologia Molecular e Celular Submitted by Alexandra Bastos (alexandrabastos@ua.pt) on 2016-07-20T15:47:42Z No. of bitstreams: 1 tese.pdf: 1449108 bytes, checksum: 7e7a11c3b83f05a7b53eb51cfa239591 (MD5) Made available in DSpace on 2016-07-20T15:47:44Z (GMT). No. of bitstreams: 1 tese.pdf: 1449108 bytes, checksum: 7e7a11c3b83f05a7b53eb51cfa239591 (MD5) Previous issue date: 2016-01-08

Mestrado em Biologia Molecular e Celular Colorectal cancer (CRC) results from histologic and gene alterations can lead to a massive cellular proliferation. Most of the authors assume multifactorial causes to CRC genesis. Low physical activity, a fat diet poor in fibers and smoking habits seems to have an important role in CRC. However, there are also genetic causes associated with CRC risk. It has been described that oxidative stress levels could influence CRC development. Thus, cellular balance reactive species and defense enzymes involved in oxidative stress are crucial to maintain a good tissue function and avoid neoplasic process. Therefore, genome variations on these defense enzymes, such as MNSOD, SOD3, GSTP1, GSTT1 and GSTM1, could be important biomarkers to colorectal adenocarcinomas. We intend to determine frequencies distribution of most common polymorphisms involved on oxidative stress regulation (MNSOD, SOD3, GSTP1, GSTT1 and GSTM1) in patients with sporadic colorectal adenocarcinoma (SCA) and in healthy controls, evaluation their possible correlation with SCA risk. Samples common polymorphisms of antioxidant and detoxify genes (MNSOD T175C, SOD3 R213G, GSTP1 A105G, GSTP1 C114T, GSTT1del and GSTM1del) analysis was done by PCR-SSP techniques. In this study we found a higher prevalence of MNSOD 175CC (55% vs 2%; p

Mestrado em Biologia Molecular e Celular Iron is an essential element for cell viability since it is a component of several metalloproteins, containing iron-sulfur clusters and heme centers. The ability to gain and lose electrons, switching between the ferrous (Fe2+) and ferric (Fe3+) states, renders the involvement of iron in many cellular processes. Iron acquisition systems have to be highly regulated to assure a continuous supply of iron but simultaneously prevent its toxicity associated with the formation of hydroxyl radicals by the Fenton reaction. Loss of iron homeostasis is behind many pathologies, highlighting the importance of understanding the mechanisms involved in iron homeostasis. The Saccharomyces cerevisiae inositolphosphosphingolipid phospholipase C (Isc1p) hydrolyses complex sphingolipids to produce ceramide, a bioactive sphingolipid. ISC1 deletion is characterized by premature aging, oxidative stress sensitivity and mitochondrial dysfunction. This mutant also exhibits an up regulation of genes involved in iron uptake leading to increased levels of iron. However the growth phase in which iron accumulation occurs, the specific site of accumulation or even the oxidation state of the accumulated iron in isc1Δ cells remains uncharacterized. Futhermore, the molecular mechanisms behind the iron overload in isc1Δ cells are not known. By monitoring iron levels and oxidation state along growth, it was possible to observe that deletion of ISC1 caused iron accumulation in all phases of growth in both the ferric and ferrous forms. Additionally to the increased iron levels, isc1Δ cells also exhibited an altered distribution of iron within the cell. Unlike wild type, isc1Δ cells did not accumulate ferric iron in the vacuole, but instead, iron seemed to be distributed throughout the cell. Furthermore, iron accumulation in isc1Δ cells was associated with the activation of Aft1p, the low iron-sensing transcriptional activator. Cells lacking Isc1p exhibed higher levels of Aft1p retained in the nucleus, and AFT1 deletion abolished iron accumulation in the isc1Δ mutant. It was also found that dephosphorylation of Aft1p in isc1Δ cells is associated with its activation. Additionally the activation of the phosphatase Sit4p in isc1Δ cells was discarded as a potential mechanism behind Aft1p dephosphorylation and activation, since isc1Δsit4Δ cells still exhibit iron overload. Overall, these results indicate that the dephosphorylation and activation of Aft1p is the factor behind the accumulation of iron in the isc1Δ mutant and reinforce the role of Isc1p in the regulation of iron homeostasis. O Ferro é um elemento essencial para a viabilidade celular, sendo um componente de diversas metaloproteínas, contendo grupos de ferro e enxofre e centros heme. A capacidade de ganhar e perder eletrões, alterando entre os estados ferroso (Fe2+) e férrico (Fe3+), faz com que o ferro esteja envolvido em diversos processos celulares. Os sistemas de aquisição de ferro têm de ser altamente regulados para assegurar um fornecimento contínuo de ferro e simultaneamente prevenir a sua toxicidade associada à formação de radicais hidroxilo pela reação de Fenton. A perda da homeostasia do ferro está associada a muitas patologias, o que enfatiza a importância do estudo dos mecanismos envolvidos na homeostasia do ferro. A proteína inositolfosfoesfingolípido fosfolipase C (Isc1p) presente em Saccharomyces cerevisiae hidrolisa esfingolípidos complexos para produzir ceramida, um esfingolípido bioativo. A deleção do ISC1 é caracterizada pelo envelhecimento celular prematuro, sensibilidade ao stresse oxidativo e disfunção mitocondrial. Este mutante também exibe uma sobreexpressão dos genes envolvidos na captação de ferro, resultando em níveis elevados de ferro. No entanto, a fase do crescimento em que a acumulação do ferro ocorre, o compartimento específico de acumulação ou mesmo o estado de oxidação do ferro acumulado nas células isc1Δ permanece por caracterizar. Além disso, os mecanismos moleculares subjacentes à acumulação de ferro nas células isc1Δ não são conhecidos. Monitorizando os níveis de ferro e o estado de oxidação ao longo do crescimento, foi possível observar que a deleção do ISC1 causou uma acumulação de ferro em todas as fases de crescimento em ambas as formas ferrosa e férrica. Além dos níveis de ferro elevados, as células isc1Δ também exibiram uma alteração na distribuição de ferro no interior da célula. Ao contrário das células wt, as células isc1Δ não acumularam ferro férrico no vacúolo, mas em vez disso, o ferro pareceu estar distribuído por toda a célula. Adicionalmente, a acumulação de ferro nas células isc1Δ foi associada à ativação do Aft1p, o ativador transcricional sensível a níveis baixos de ferro. Células sem a proteína Isc1p exibiram níveis mais elevados de Aft1p retido no núcleo e a delecção do AFT1 suprimiu a acumulação de ferro observada no mutante isc1Δ. Também se observou que a defosforilação do Aft1p nas células isc1Δ está associada à sua ativação. Adicionalmente, a ativação da fosfatase Sit4p nas células isc1Δ como um potencial mecanismo responsável pela defosforilação e ativação do Aft1p foi descartada, uma vez que as células isc1Δsit4Δ continuam a apresentar acumulação de ferro. Em conclusão, estes resultados indicam que a defosforilação e ativação do Aft1p é o fator responsável pela acumulação de ferro no mutante isc1Δ e reforça o papel do Isc1p na regulação da homeostasia do ferro.

Mestrado em Biologia Molecular e Celular Submitted by Alexandra Bastos (alexandrabastos@ua.pt) on 2016-04-15T17:46:48Z No. of bitstreams: 1 tese.pdf: 2359543 bytes, checksum: ecd8a6d32bce02730fc58a2a0a528b75 (MD5) Made available in DSpace on 2016-04-15T17:46:48Z (GMT). No. of bitstreams: 1 tese.pdf: 2359543 bytes, checksum: ecd8a6d32bce02730fc58a2a0a528b75 (MD5) Previous issue date: 2015-12-22

Mestrado em Biologia Molecular e Celular Submitted by Alexandra Bastos (alexandrabastos@ua.pt) on 2016-04-14T14:24:20Z No. of bitstreams: 1 Tese.pdf: 2169668 bytes, checksum: f5ec709ecbd1152697e6c6e496dadcbf (MD5) Made available in DSpace on 2016-04-14T14:24:20Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Tese.pdf: 2169668 bytes, checksum: f5ec709ecbd1152697e6c6e496dadcbf (MD5) Previous issue date: 2015-12-18

Mestrado em Biologia Molecular e Celular Comprehending the mechanisms that make lifelong neurogenesis possible has a clear interest for the better understanding of the basic principles that govern cellular and molecular interactions in the nervous system, as well as a relevant clinical interest. The limited ability of the central nervous system to generate new neurons in order to replace those that have been lost is a formidable obstacle to recovery from neuronal damage caused by injury or neurodegenerative disease. The olfactory system (OS) is an ideal system to study the process of neuronal recovery after injury, as it is known for its lifelong capacity to replenish cells lost during natural turnover, as well as its remarkable ability to regenerate after severe lesion. The olfactory epithelium (OE) shows neurogenesis throughout life. Newly differentiated olfactory receptor neurons (ORNs) are continuously reintegrated into an existing circuitry to maintain the sense of smell. The aim of this thesis is to describe the morphological and functional alterations that occur over time in the OS of larval Xenopus laevis, after transection of the olfactory nerve (ON). Results obtained using immunohistochemistry essays, as well as sensory neuron labeling and calcium imaging techniques, indicate that ORN cell death reaches its peak 48 hours after transection, and that proliferating stem cells found in the basal cell layer of the OE are quickly upregulated after lesion. Supporting cells seem to maintain both morphological and functional integrity after transection of the ON. The OE recovers its original morphological structure 1 week after transection, at which time the first axons reach the olfactory bulb (OB) and begin the process of reinnervation. Spontaneous activity of mitral/tufted cells occurs in the OB during the first weeks after transection but no odor-induced activity is observed. After 3-4 weeks glomerular responses were observed in some animals upon application of stimulus, but the response and glomerular morphology are clearly altered as compared to control. After 6-7 weeks responses seem to have fully recovered, indicating that the OS of larval X. laevis recovers morphologically and functionally 6-7 weeks after ON transection. O estudo dos mecanismos responsáveis pela neuro-regeneração tem um marcado interesse para a compreensão dos princípios básicos que governam as interações celulares e moleculares no sistema nervoso, bem como um interesse clínico relevante. A limitada capacidade do sistema nervoso central para dar origem a novos neurónios é um obstáculo formidável para a recuperação do sistema após lesão neuronal ou doença neurodegenerativa. O sistema olfativo é um sistema ideal para o estudo do processo de recuperação após lesão neuronal, pois é conhecido no mundo científico pela sua capacidade contínua e vitalícia para repor células perdidas durante a renovação celular natural, bem como a sua notável capacidade para regenerar após uma lesão grave. O epitélio olfativo apresenta a capacidade para dar origem a novos neurónios ao longo de toda a vida. Neurónios sensoriais olfativos diferenciados são continuamente reintegrados num circuito já existente, mantendo assim o sentido do olfato. O objetivo desta tese é descrever as alterações morfológicas e funcionais que ocorrem ao longo do tempo no sistema olfativo de Xenopus laevis em estado larvar, após o corte do nervo olfativo. Os resultados obtidos através do uso de ensaios de imunohistoquímica, bem como técnicas de marcação neuronal sensorial e de imagiologia de cálcio, indicam que a morte celular na população de neurónios sensoriais olfativos atinge o seu máximo 48 horas após a lesão, e que células estaminais encontradas na camada basal do epitélio olfativo são positivamente reguladas após lesão e proliferam rapidamente. Células de suporte parecem manter tanto a integridade morfológica como funcional após o corte do nervo olfativo. O epitélio olfativo recupera a sua estrutura morfológica inicial 1 semana após a lesão, momento em que os primeiros axónios atingem o bolbo olfativo e começam o processo de reintegração. Ocorre atividade espontânea das células mitrais/tufados do bolbo olfativo durante as primeiras semanas após a lesão, mas nenhuma atividade induzida por estímulo com odor foi observada. Depois de 3-4 semanas, atividade glomerular foi observada em alguns animais após a aplicação de estímulos, mas a resposta e morfologia glomerular foram claramente alteradas em relação ao controlo. Depois de 6-7 semanas as respostas parecem ter recuperado totalmente, indicando que o sistema olfativo de X. laevis em estado larvar recupera morfológica e funcionalmente 6-7 semanas após o corte do nervo olfativo.

Mestrado em Biologia Molecular e Celular Toxoplasma gondii is considered to be the world’s most successful zoonotic parasite, causing congenital toxoplasmosis, a prevalent disease worldwide with serious implications for the fetus. The mechanisms playing a role in the induction of pathology during infection are not clear, but are potentially associated with disruption of normal homeostatic immunological pathways including macrophage activation. Macrophages have a variety of activation states, being able to adapt their functions to environmental changes of cytokines, described as innate (TLR ligation), classical/M1 (TLR ligation with IFN) or alternative/M2 (IL4Ralpha ligation) activation states. Thus, while classical macrophage activation can control replication through induction of inducible nitric oxide synthase (NOS2), alternative activation can control parasite replication through induction of arginase 1 (Arg-1) and depletion of arginine. Our study was focused on the effects of T. gondii infection on Arg-1 and NOS2 expression at the fetomaternal interface (FMI) and systemic level (peritoneal exudate cells and spleen cells) using the mice model. Infection of pregnant BALB/c and C57Bl/6 (B6) mice with a type II strain of T. gondii allowed the follow-up of pregnancy. Morphometric analysis of decidua and placenta was performed using haematoxylin-eosin sections of the fetoplacental units. The parasite loads’ evaluation was done by quantitative Real Time-PCR (q-PCR) using Taqman probes. Arg-1 and NOS2 expression were evaluated by qRT-PCR, immunohistochemistry and Western Blotting. It was observed a significant decrease in placental and decidual areas in infected B6 compared to control but not in Balb/c mice. Immunohistochemical analysis indicated an increased expression of Arg-1 and a decreased expression of NOS2 in the decidua from infected compared to control animals from both strains of mice. This indicates that infection interferes with the process of placentation delaying decidualization and this might be correlated with altered expression of Arg-1 and NOS2 in B6 but not in Balb/c mice. This work aims not only understanding the role of macrophage activation in congenital infection by T. gondii, but also should provide valuable information regarding the role of macrophages during healthy pregnancy and infection complicated pregnancy. Toxoplasma gondii é considerado um parasita zoonótico, causando toxoplasmose congênita, uma doença prevalente em todo o mundo com implicações graves para o feto. Os mecanismos que desempenham um papel, induzindo patologia durante a infeção por este parasita não são claros, mas são potencialmente associados com alterações dos processos homeostáticos imunológicos normais, incluindo a ativação de macrófagos. Os macrófagos apresentam uma variedade de estadios de ativação descritos como ativação inata (ligação TLR), clássica/M1 (ligação TLR com IFN) ou alternativa/M2 (ligação IL4Ralpha). Assim, enquanto os macrófagos M1 controlam a replicação dos parasitas pela indução de sintetase do óxido nítrico induzível (NOS2), os macrófagos M2 controlam a replicação dos parasitas induzindo a arginase-1 (Arg-1) e depletando a arginina. O nosso estudo incidiu sobre os efeitos da infeção por T. gondii, na expressão de Arg-1 e de NOS2 na interface feto-materna (FMI) e a nível sistémico (células de exsudado peritoneal e células do baço) utilizando murganhos como modelo de estudo. A infeção de animais gestantes Balb/c e C57BL/6 (B6) com uma estirpe de T. gondii tipo II permitiu o acompanhamento da gravidez. A análise morfométrica da decídua e da placenta foi realizada utilizando seções de unidades fetoplacentárias coradas com hematoxilina-eosina. A determinação da carga parasitária foi realizada por PCR quantitativo em tempo real utilizando sondas Taqman (q-PCR). A expressão de Arg-1 e NOS2 foi avaliada por qRT-PCR, Imuno-histoquímica e Western-Blotting. Observou-se uma diminuição significativa na área da placenta e da decídua em B6 infetados em comparação com os animais controlo, mas não nos animais Balb/c. A análise imunohistoquímica indicou um aumento da expressão de Arg-1 e uma diminuição da expressão de NOS2 na decídua de animais infetados em comparação com os animais controlo em ambas as estirpes. Os resultados obtidos sugerem que a infeção interfere com o processo de placentação atrasando a decidualização, podendo existir uma relação com as alterações da expressão de Arg-1 e NOS2 nos B6, mas não nos animais Balb/c. O trabalho desenvolvido visa não só a compreensão do papel da ativação de macrófagos na infeção congénita pelo T. gondii, mas poderá fornecer informações essenciais sobre o papel dos macrófagos durante uma gravidez saudável e uma gravidez com infeção.

Mestrado em Biologia Molecular e Celular Recent evidences indicate that tRNA modifications and tRNA modifying enzymes may play important roles in complex human diseases such as cancer, neurological disorders and mitochondrial-linked diseases. We postulate that expression deregulation of tRNA modifying enzymes affects the level of tRNA modifications and, consequently, their function and the translation efficiency of their tRNA corresponding codons. Due to the degeneracy of the genetic code, most amino acids are encoded by two to six synonymous codons. This degeneracy and the biased usage of synonymous codons cause alterations that can span from protein folding to enhanced translation efficiency of a select gene group. In this work, we focused on cancer and performed a meta-analysis study to compare microarray gene expression profiles, reported by previous studies and evaluate the codon usage of different types of cancer where tRNA modifying enzymes were found de-regulated. A total of 36 different tRNA modifying enzymes were found de-regulated in most cancer datasets analyzed. The codon usage analysis revealed a preference for codons ending in AU for the up-regulated genes, while the down-regulated genes show a preference for GC ending codons. Furthermore, a PCA biplot analysis showed this same tendency. We also analyzed the codon usage of the datasets where the CTU2 tRNA modifying enzyme was found deregulated as this enzyme affects the wobble position (position 34) of specific tRNAs. Our data points to a distinct codon usage pattern between up and downregulated genes in cancer, which might be caused by the deregulation of specific tRNA modifying enzymes. This codon usage bias may augment the transcription and translation efficiency of some genes that otherwise, in a normal situation, would be translated less efficiently. Estudos recentes indicam que as modificações de tRNAs e as enzimas modificadoras de tRNAs desempenham papéis importantes em doenças Humanas complexas como são exemplos: cancro, doenças neurológicas e mitocondriais. Conjecturamos que a desregulação na expressão das enzimas modificadoras de tRNAs afecta o nível de modificações dos tRNAs e, consequentemente, as suas funções e eficiência de tradução dos codões correspondentes aos tRNAs que afectam. Devido à degeneração do código genético, a maior parte dos aminoácidos são codificados por dois a seis codões sinónimos. Esta degeneração e o uso tendencioso de codões sinónimos causam alterações que podem ir desde problemas de enovelamento proteico a um aumento de eficiência de tradução de um grupo de genes específico. Neste trabalho, focámo-nos no cancro e fizemos um estudo de metaanálise para comparar perfis de expressão génica de microarrays, onde foram encontradas enzimas modificadoras de tRNA desreguladas e analisar o codon usage dos diferentes tipos de cancro nestes dados, reportados em estudos anteriores. Encontrámos um total de 36 diferentes enzimas modificadoras de tRNAs que se encontram desreguladas na maior parte das datasets de cancro analisadas. A análise de codon usage revelou uma preferência, por parte dos genes sobre-expressos, por codões acabados em AU e uma preferência por codões acabados em GC, em genes sub-expressos. Uma subsequente análise de PCA biplot veio mostrar esta mesma tendência. Analisámos também o codon usage de datasets onde a enzima modificadora de tRNA CTU2 se encontrava desregulada uma vez que esta enzima afecta a posição “wobble” (posição 34) de tRNAs específicos. Os nossos dados apontam para um padrão de codon usage distinto entre genes sobre-expressos e sub-expressos em cancro, que pode ser causado pela desregulação de enzimas modificadores de tRNA específicas. Esta tendência de codon usage pode aumentar a transcrição e eficiência de tradução de alguns genes que, de outra forma, numa situação normal, seriam traduzidos de forma menos eficiente.

Mestrado em Biologia Molecular e Celular Submitted by Alexandra Bastos (alexandrabastos@ua.pt) on 2016-08-30T14:33:45Z No. of bitstreams: 1 tese.pdf: 3074084 bytes, checksum: ca25810fda24ba025e17ee2240df270f (MD5) Made available in DSpace on 2016-08-30T14:33:45Z (GMT). No. of bitstreams: 1 tese.pdf: 3074084 bytes, checksum: ca25810fda24ba025e17ee2240df270f (MD5) Previous issue date: 2015-12-16

Mestrado em Biologia Molecular e Celular Submitted by Alexandra Bastos (alexandrabastos@ua.pt) on 2016-04-14T14:33:59Z No. of bitstreams: 1 TESE.pdf: 2436052 bytes, checksum: 5c24520765193af74533fd180cac0ef0 (MD5) Made available in DSpace on 2016-04-14T14:33:59Z (GMT). No. of bitstreams: 1 TESE.pdf: 2436052 bytes, checksum: 5c24520765193af74533fd180cac0ef0 (MD5) Previous issue date: 2015-12-16

Mestrado em Biologia Molecular e Celular The scavenger receptor cysteine-rich (SRCR) superfamily is characterized by proteins containing scavenger domains composed of about 100 amino acids with cysteine residues placed in a highly conserved manner among species. It is divided into two groups, A and B. The proteins of this superfamily can be expressed in diverse types of cells and be secreted or cell surface-bound, mediating protein-protein interactions and binding to (a) ligand(s). There is no special feature that unifies these proteins, except for the structural properties of the highly conserved domains. SRCR B proteins are involved in diverse functions such as pathogen recognition, modulation of immune response, epithelial homeostasis and tumor development among others. Spα and S4DSRCRB belong to this group. Spα is being associated to inflammatory conditions, like metabolic disorders (atherosclerosis and obesity), liver and lung cancer, being a pattern recognition receptor for diverse bacteria and fungi. Although structurally similar to Spα, very little is known about the expression pattern and localization of S4D-SRCRB. The characterization of both Spα and S4D-SRCRB proteins is important to understand what kind of roles they have in the homeostasis of the immune system. While the role(s) of S4D-SRCRB remain largely unknown, the importance of Spα as a pattern recognition receptor (PRR) and its involvement in inflammation was already observed. Nonetheless, numerous mechanisms associated with these proteins remain unexplored. The goal of this work was therefore to study the role of these proteins in inflammation. For that, different detection techniques were used for the characterization of the expression of the two proteins, at the tissue and cellular levels in a resting state. Then the variation of these proteins expression depending on inflammatory and anti-inflammatory stimuli given to epithelial or hematopoietic-origin cells was also analyzed. In this work new localizations of these two proteins are reported and their expression was shown to be different in response to inflammatory/antiinflammatory conditions, suggesting that they may have a role in different cellular locations and a function in the inflammatory modulation of both innate and adaptive immunity. Through the purification of the recombinant Spα, it was possible to identify cells that express ligand(s) for this protein, an important step to understand its function. A superfamília de recetores scavenger ricos em cisteína é caracterizada por proteínas contendo domínios scavenger compostos por 100 aminoácidos com resíduos de cisteínas dispostos de uma forma bem conservada entre espécies. A superfamília encontra-se dividida em dois grupos, A e B, podendo as proteínas ser expressas em diversos tipos de células e serem secretadas ou estarem associadas à superfície celular mediando interações com outras proteínas e ligandos. Não há uma característica específica que unifique estas proteínas, exceto as propriedades estruturais dos domínios altamente conservados que apresentam. As proteínas pertencentes ao grupo SRCR B estão envolvidas em diversas funções como reconhecimento de patogénios, modulação da resposta imune, homeostasia do epitélio e desenvolvimento de tumores entre outros. Spα e S4D-SRCRB pertencem a este grupo. A proteína Spα tem sido associada a condições inflamatórias, como doenças metabólicas (aterosclerose e obesidade), cancro do pulmão e fígado, sendo também considerado um recetor de reconhecimento de patogénios para diversas bactérias e fungos. Apesar de estruturalmente semelhante ao Spα, pouco se sabe acerca do padrão de expressão da proteína S4D-SRCRB. As características de ambas proteínas Spα e S4D-SRCRB são importantes para a compreensão do tipo de papéis que estas proteínas têm na homeostasia do sistema imunitário. Enquanto que o papel de S4D-SRCRB permanece desconhecido, a importância de Spα como recetor de reconhecimento a patogénios e o seu envolvimento na inflamação foram já observados. No entanto, inúmeros mecanismos associados a estas proteínas permanecem desconhecidos. O objetivo deste trabalho foi, por conseguinte, estudar o papel destas proteínas na inflamação. Para tal, diferentes técnicas foram utilizadas para a caracterização da expressão destas duas proteínas, a nível tecidular e celular num estado de repouso. Após isto, foi analisado também a variação da expressão destas proteínas após estímulos inflamatórios e anti-inflamatórios dados a células de origem epitelial ou hematopoiética. Neste trabalho são reportadas novas localizações destas duas proteínas e demonstrado que a sua expressão parece ser diferente em resposta a condições de inflamação/anti-inflamação, sugerindo que possam ter um papel em diferentes localizações celulares e uma função na modulação da inflamação tanto na imunidade inata como adaptativa. Pela purificação da proteína recombinante Spα foi possível identificar células que expressam ligando(s) para esta proteína, um passo importante para entender a sua função.

Mestrado em Biologia Molecular e Celular Submitted by Alexandra Bastos (alexandrabastos@ua.pt) on 2016-05-31T15:18:28Z No. of bitstreams: 1 tese.pdf: 3169995 bytes, checksum: 81fd7eb3dc72c199350d724bd0c6e1a0 (MD5) Made available in DSpace on 2016-05-31T15:18:28Z (GMT). No. of bitstreams: 1 tese.pdf: 3169995 bytes, checksum: 81fd7eb3dc72c199350d724bd0c6e1a0 (MD5) Previous issue date: 2015-12-09

Mestrado em Biologia Molecular e Celular Cannabinoids (CBs) can be classified as: phytocannabinoids, the constituents of the Cannabis sativa plant; synthetic cannabinoids lab-synthesized and the endocannabinoids that are endogenous lipid mediators. Cannabinoid compounds activate cannabinoid receptors – CB1 and CB2. The most prevalent psychoactive phytocannabinoid is Δ9tetrahydrocannabinol (THC), but more than 60 different CBs were already identified in the plant. The best characterized endocannabinoids (eCBs) are anandamide (AEA) and 2arachidonoylglycerol (2-AG), that are involved in several physiological processes including synaptic plasticity, pain modulation, energy homeostasis and reproduction. On the other hand, some synthetic cannabinoids that were initially designed for medical research, are now used as drugs of abuse. During the period of placental development, highly dynamic processes of remodeling occur, involving proliferation, apoptosis, differentiation and invasion of trophoblasts. It is known that a tight control of eCBs levels is required for normal pregnancy progression and that eCBs are involved in trophoblast cells turnover. Therefore, by sharing activation of the same receptors, exposure to exocannabinoids either by recreational or medicinal use may lead to alterations in the eCBs levels and in the endocannabinoid system homeostasis In this work, it was studied the impact of CBs in BeWo trophoblastic cells and in primary cultures of human cytotrophoblasts. Cells were treated for 24 hours with different concentrations of THC, the synthetic cannabinoid WIN‐55,212 (WIN) and 2-AG. Treatment with THC did not affect BeWo cells viability while WIN and 2-AG caused a dose-dependent viability loss. Morphological studies together with biochemical markers indicate that 2-AG is able to induce apoptosis in cytotrophoblasts. On the other hand, morphological studies after acridine orange staining suggest that autophagy may take part in WIN-induced loss of cell viability. All cannabinoids caused a decrease in mitochondrial membrane potential (Δψm) but only 2-AG led to ROS/RNS generation, though no changes in glutathione levels were observed. In addition, ER-stress may be involved in the 2-AG induced-oxidative stress, as preliminary results point to an increase in CCAAT-enhancer-binding protein homologous protein (CHOP) expression. Besides the decrease in cell viability, alterations in cell cycle progression were observed. WIN treatment induced a cell cycle arrest in G0/G1 phase, whereas 2-AG induced a cell cycle arrest in G2/M phase. Here it is reinforced the relevance of cannabinoid signaling in fundamental processes of cell proliferation and cell death in trophoblast cells. Since cannabis-based drugs are the most consumed illicit drugs worldwide and some of the most consumed recreational drugs by pregnant women, this study may contribute to the understanding of the impact of such substances in human reproduction. Os canabinóides (CBs) podem ser classificados como: fitocanabinóides, os constituintes da planta Cannabis sativa L.; canabinóides sintéticos, sintetizados em laboratório e os endocanabinóides, que são mediadores lipídicos endógenos. Os compostos canabinóides ativam recetores canabinóides – CB1 e CB2. O composto psicoativo mais prevalente é o Δ9-tetrahidrocanabinol (THC), mas mais de 60 diferentes CBs foram já identificados a partir da planta. Os endocanabinóides (eCBs) melhor caracterizados são a anandamida (AEA) e o 2-araquidonoilglicerol (2-AG), que estão envolvidos em vários processos biológicos, incluindo plasticidade sináptica, modulação da dor, homeostasia energética e reprodução. Por outro lado, alguns canabinóides sintéticos, inicialmente projetados para investigação médica, são agora usados como drogas de abuso. Durante o período de desenvolvimento placentário ocorrem processos de remodelação que envolvem proliferação, apoptose, diferenciação e invasão dos trofoblastos. Sabe-se que um controlo rigoroso dos níveis de eCBs é necessário para uma progressão normal da gravidez e que os eCBs estão envolvidos no turnover celular dos trofoblastos. Assim sendo, ao partilharem a ativação dos mesmos recetores, a exposição a exocanabinóides, seja pelo uso recreativo ou medicinal, pode levar a alterações nos níveis de eCBs e na homeostasia do sistema endocanabinóide (ECS). Neste trabalho foi estudado o impacto dos CBs em células trofoblásticas BeWo e em culturas primárias de citotrofoblastos humanos. As células foram tratadas durante 24 horas com diferentes concentrações de THC, do canabinóide sintético WIN-55,212 (WIN) e de 2AG. O tratamento com THC não afetou a viabilidade das células BeWo, enquanto que o WIN e o 2-AG causaram uma perda de viabilidade dependente da dose. Estudos morfológicos, juntamente com marcadores bioquímicos, indicam que o 2-AG é capaz de induzir apoptose em citotrofoblastos. Por outro lado, estudos morfológicos realizados com laranja de acridina sugerem que a autofagia pode estar envolvida na perda de viabilidade induzida pelo WIN. Todos os canabinóides induziram perda de potencial de membrana mitocondrial (Δψm), mas apenas o 2-AG levou a um aumento na formação de ROS/RNS, sem terem sido observadas diferenças nos níveis de glutationa. O stress reticular pode estar envolvido no stress oxidativo induzido pelo 2-AG, visto que resultados preliminares apontam para um aumento na expressão de CCAAT-enhancer-binding protein homologous protein (CHOP). Para além da diminuição da viabilidade celular, os resultados sugerem alterações na progressão do ciclo celular. O tratamento com WIN induziu retenção do ciclo celular em fase G0/G1, enquanto que o 2-AG levou a uma retenção em fase G2/M. Neste trabalho é reforçada a importância da sinalização canabinóide em processos importantes de proliferação e morte celular de células trofoblásticas. Visto que as drogas canabinóides são as mais consumidas a nível mundial, e umas das drogas recreativas mais consumidas pelas mulheres grávidas, este estudo pode contribuir para a compreensão do impacto destas substâncias na reprodução humana.

Mestrado em Biologia Molecular e Celular Submitted by Alexandra Bastos (alexandrabastos@ua.pt) on 2016-07-20T16:22:38Z No. of bitstreams: 1 tese.pdf: 4559981 bytes, checksum: c07fb5ad5fde50b8e835262cd8f3ff68 (MD5) Made available in DSpace on 2016-07-20T16:22:38Z (GMT). No. of bitstreams: 1 tese.pdf: 4559981 bytes, checksum: c07fb5ad5fde50b8e835262cd8f3ff68 (MD5) Previous issue date: 2015-12-04

Mestrado em Biologia Molecular e Celular Spinal cord injury (SCI) is a devastating neurological disorder that affects thousands of people each year. Although in recent decades significant progress has been made in relation to understanding the molecular and cellular events underlying the nervous damage, spinal cord injury is still a highly disabling condition for which there is no curative therapy. People affected by spinal cord injuries manifested dysfunction or loss, temporary or permanent, of motor, sensory and / or autonomic functions depending on the spinal lesion damaged. Currently, the incidence rate of this type of injury is approximately 15-40 cases per million people worldwide. At the origin of these lesions are: road accidents, falls, interpersonal violence and the practice of sports. In this work we placed the hypothesis that HA is one of the component of the scar tissue formed after a compressive SCI, that it is likely synthetised by the perilesional glial cells and that it might support the permeation of the glial scar during the late phase of SCI. Nowadays, much focus is drawn on the recovery of CNS function, made impossible after SCI due to the high content of sulfated proteoglycans in the extracellular matrix. Counterbalancing the ratio between these proteoglycans and hyaluronic acid could be one of the experimental therapy to re-permeate the glial scar tissue formed after SCI, making possible axonal regrowth and functional recovery. Therefore, we established a model of spinal cord compression in mice and studied the glial scar tissue, particularly through the characterization of the expression of enzymes related to the metabolism of HA and the subsequent concentration thereof at different distances of the lesion epicenter. Our results show that the lesion induced in mice shows results similar to those produced in human lesions, in terms of histologic similarities and behavioral results. but these animals demonstrate an impressive spontaneous reorganization mechanism of the spinal cord tissue that occurs after injury and allows for partial recovery of the functions of the CNS. As regards the study of the glial scar, changes were recorded at the level of mRNA expression of enzymes metabolizing HA i.e., after injury there was a decreased expression of HA synthases 1-2 (HAS 1-2) and an increase of the expression HAS3 synthase mRNA, as well as the enzymes responsible for the HA catabolism, HYAL 1-2. But the amount of HA measured through the ELISA test was found unchanged after injury, it is not possible to explain this fact only with the change of expression of enzymes. At two weeks and in response to SCI, we found synthesized HA by reactive astrocytes and probably by others like microglial cells as it was advanced by the HA/GFAP+ and HA/IBA1+ cells co-location. A lesão medular é uma desordem neurológica devastadora que afeta milhares de pessoas a cada ano. E apesar de nas últimas décadas ter sido feito um enorme progresso relativamente à compreensão dos eventos moleculares e celulares que este dano desencadeia, a lesão medular ainda é uma condição altamente incapacitante e mortal para a qual ainda não há cura. Os indivíduos que apresentam lesões medulares, manifestam disfunção ou perda, temporária ou permanente, das funções motoras, sensoriais e/ou autonómicas. Atualmente a taxa de incidência desta tipologia de lesões é de aproximadamente, 15-40 casos por milhão de pessoas em todo o mundo. Na origem destas lesões estão: acidentes rodoviários, quedas, violência interpessoal e a prática de desportos. Neste trabalho foi colocada a hipótese de que o ácido hialurónico (HA) seja um dos componentes do tecido cicatricial formado após a compressão medular e que provavelmente seja sintetizado pelas células gliais situadas à volta da lesão, podendo ajudar na penetração da cicatriz glial, por parte das células nervosas, durante uma fase mais tardia da lesão da espinal medula. Atualmente tem sido dada muita atenção ao restabelecimento da função do SNC, impossibilitado pelo elevado teor de proteoglicanos sulfatados na matriz extracelular. O contrabalanço do rácio entre o teor de proteoglicanos e de HA pode ser uma terapia experimental para a re-permeabilização do tecido da cicatriz glial formada após a lesão medular, possibilitando o crescimento axonal e a recuperação funcional. Por isso, estabeleceu-se um modelo de compressão da espinal medula em ratinhos e estudou-se o tecido da cicatriz glial, em particular, a caracterização da expressão de enzimas relacionadas com o metabolismo do HA e a sua posterior concentração a diferentes distâncias do epicentro da lesão. Os nossos resultados mostram que a lesão induzida em ratinhos produziu resultados semelhantes às lesões encontradas em humanos, tanto do ponto de vista histológico como funcional. No entanto, após traumatismo, estes animais demonstraram um mecanismo de recuperação espontânea impressionante na espinal medula resultando numa recuperação parcial da função do SNC. Quanto ao estudo da cicatriz glial, as alterações foram detetadas na expressão do mRNA das enzimas metabolizadoras de HA, isto é, após a lesão houve uma diminuição na expressão das HAS1-2 e um aumento na expressão de mRNA da sintase HAS3 assim como das enzimas ligadas à degradação do HA, HYAL 1-2. Porém, duas semanas após LM a concentração de HA medida através do teste ELISA encontrou-se inalterada. É impossível explicar este facto apenas com a mudança na expressão das enzimas ligadas ao HA. A duas semanas pós-trauma, em resposta à LM, encontrámos HA sintetizado por astrócitos reativos e, provavelmente, por outras células, como a microglia tal como foi avançado pela co-localização de HA/IBA1+ e HA/GFAP+. Le traumatisme médullaire est une affection neurologique dévastatrice qui affecte des milliers de personnes chaque année. Bien que ces dernières décennies d'énormes progrès ont été fait par rapport à la compréhension des événements moléculaires et cellulaires qui déclenchent les dommages au sein du tissu nerveux, les dommages de la moelle épinière sont encore irréversibles et rendent les personnes atteintes très invalidées. Aucun traitement visant à remédier aux pertes fonctionnelles n’est disponible. Les gens atteints de traumatismes de la moelle épinière, manifestent un dysfonctionnement ou une perte, temporaire ou permanente, des fonctions motrice, sensorielle et / ou autonome. Actuellement, l’incidence de ce type de blessure est d'environ 15-40 cas par million de personnes dans le monde. L'origine de ces lésions sont: accidents de la route, chutes, violence interpersonnelle et pratique de sports. Dans ce travail, nous avons placé l'hypothèse que l'acide hyaluronique (HA) est l'un des composants du tissu cicatriciel formé après une compression de la moelle épinière, qu'il est probablement synthétisé par les cellules gliales péri lésionnelles et qu'il pourrait soutenir la pénétration de la cicatrice gliale pendant la phase tardive de la LM. Actuellement beaucoup d'attention est attirée sur le rétablissement de la fonction du système SNC, rendue impossible après la LM en raison de la contenu élevé en protéoglycanes sulfatés dans la matrice extracellulaire. Contrebalançant le rapport entre ces protéoglycanes et l'HA peut être une thérapie expérimentale de la re-pénétration dans le tissu de cicatrice gliale formé après la LM, ce qui rend possible le repousse axonale et la récupération fonctionnelle. Par conséquent, nous avons établi un modèle de compression de la moelle épinière chez des souris et étudié le tissu de la cicatrice gliale, en particulier par la caractérisation de l'expression des enzymes liées au métabolisme de l'HA et la concentration ultérieure de celui-ci à des distances différentes de l'épicentre de la lésion. Les résultats montrent que la lésion induite chez la souris produit des résultats similaires à ceux trouvés dans les lésions humaines, d'un point de vue fonctionnel et histologique. Toutefois, après un traumatisme, ces animaux ont démontré un mécanisme de récupération spontanée impressionnante dans la moelle épinière entraînant une reprise partielle de la fonction du système nerveux central. De manière surprenante, la quantité d'HA vérifiée par le test ELISA s’est trouvé inchangée deux semaines après traumatisme médullaire. Il est impossible d'expliquer ce fait uniquement avec le changement de l'expression d'enzymes liées à l'HA. Nous avons constaté que deux semaines après traumatisme, il ya l' HA synthétisé par les astrocytes réactifs et probablement par d'autres comme les cellules microgliales comme il a été avancé par les résultats de colocalisation de l' HA et cellules GFAP+ ainsi que l'HA et cellules IBA1+.

Mestrado em Biologia Molecular e Celular Submitted by Alexandra Bastos (alexandrabastos@ua.pt) on 2016-08-29T12:35:24Z No. of bitstreams: 1 Tese.pdf: 3950852 bytes, checksum: 0a7e7fa203b3039b8e1381aaf8f2cb12 (MD5) Made available in DSpace on 2016-08-29T12:35:24Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Tese.pdf: 3950852 bytes, checksum: 0a7e7fa203b3039b8e1381aaf8f2cb12 (MD5) Previous issue date: 2015-11-26

Mestrado em Biologia Molecular e Celular Malaria remains the leading cause of morbidity and mortality in tropical and subtropical regions, contributing to the emergence of 198 million clinical cases in 2013. The mosquito Anopheles stephensi is one of the most prevalent malaria vectors in the Asian region having recently been implicated in malaria resurgence in Djibouti. Using techniques as RNA sequencing, differentially expressed genes in the salivary glands of the mosquito in response to infection by Plasmodium berghei were identified. Some of these genes can be selected to evaluate their potential as targets for malaria transmission blocking. Among the genes with differentially expression resulting from the analysis of RNA-seq results and confirmation by qPCR, a gene related transport of Cl- and HCO3 2-, prestin, was upregulated after infection with P. berghei. This gene plays a crucial role in parasite invasion in the midgut and the optimization of the environment in which the parasite develops. For this reason, the silencing of this transcript was made to evaluate the function of prestin in salivary glands. The gene silencing, using RNA interference technique, allow inferring about the role or function of prestin gene in a particular metabolic or physiological process. After prestin gene silencing, the number of viable mosquitoes had a significant decrease in comparison with the control (β2M). There was also a significant decrease in the number of mosquitoes before injection and at the last day after injection. The number of sporozoites were not generally affected by silencing of prestin when compared with the control. To clarify other results obtained during the study, as the influence of the silencing of prestin in the survival of mosquitoes and the presence and number of sporozoites in the salivary glands, will be essential to perform qPCR to determine differential expression of this gene after silencing. Furthermore, it is also important to examine differential expression of off-target (ASTE006714) after silencing prestin, since the sequence of this gene have a high percentage of identity with prestin. A malária continua a ser a principal causa de morbilidade e mortalidade nas regiões tropicais e subtropicais, contribuindo para o surgimento de 198 milhões de casos clínicos no ano de 2013. O mosquito Anopheles stephensi é um dos vectores de malária mais prevalentes na região asiática, tendo sido recentemente implicado no ressurgimento de malária em Djibouti. Através de técnicas como sequenciação de RNA, genes diferenciadamente expressos nas glândulas salivares deste mosquito em resposta à infecção por Plasmodium berghei foram identificados. Alguns destes genes podem ser selecionados para avaliar a sua potencialidade como alvos para bloqueio da transmissão da malária. Entre os genes com expressão diferencial resultante da análise dos resultados de RNA-seq e confirmação por qPCR, um gene relacionado com o transporte de Cl- e HCO3 2-, prestin, estava sobrexpresso após infeção com P. berghei. Este gene tem um papel crucial na invasão do parasita no intestino médio e na optimização do meio em que o parasita se desenvolve. Por esse motivo, o silenciamento deste transcrito foi efectuado para averiguar o papel funcional nas glândulas salivares. O silenciamento de genes utilizando a técnica de RNA de interferência permite inferir sobre o seu papel ou função num dado processo metabólico ou fisiológico. Após o silenciamento do gene prestin, o número de mosquitos viáveis apresentou um decréscimo significativo em comparação com o controlo (β2M). Também houve uma queda significativa entre o número de mosquitos antes da injeção e no último dia após injecção. O número de esporozoítos em geral não foi afectado pelo silenciamento da prestin quando comparado com o controlo. Para esclarecer resultados obtidos durante o estudo, tais como a influência do silenciamento da prestin na sobrevivência dos mosquitos e a presença e número de esporozoítos na glândulas salivares, seria fundamental realizar ensaios de qPCR para determinar a expressão diferencial deste gene após silenciamento. Além disso, será também importante analisar a expressão diferencial do off-target (ASTE006714) após silenciamento da prestin, uma vez que a semelhança da sequência entre este e a prestin é elevada.

Mestrado em Biologia Molecular e Celular Submitted by Rita Goncalves (ritaisabel@ua.pt) on 2015-09-14T16:10:17Z No. of bitstreams: 1 Análise transcriptómica de glândulas salivares de Anopheles Stephensi....pdf: 3471947 bytes, checksum: 38d976d714c47ec1f520a6a470ab22de (MD5) Made available in DSpace on 2015-09-14T16:10:17Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Análise transcriptómica de glândulas salivares de Anopheles Stephensi....pdf: 3471947 bytes, checksum: 38d976d714c47ec1f520a6a470ab22de (MD5) Previous issue date: 2015-08-03

Mestrado em Biologia Molecular e Celular Microglial cells are the resident immune cells of central nervous system (CNS) and the major players in neuroinflammation. These cells are also responsible for surveilling the neuronal microenvironment, and upon injury to the CNS they change their morphology and molecular profile and become activated. Activated status is associated with microglia proliferation, migration to injury foci, increased phagocytic capacity, production and release of reactive oxygen species (ROS), cytokines (pro- or anti-inflammatory) and reactive nitrogen species. Microglia activation is crucial for tissue repair in the healthy brain. However, their chronic activation or deregulation might contribute for the pathophysiology of neurodegenerative diseases. A better understanding of the mechanisms underlying microglial cell activation is important for defining targets and develop appropriate therapeutic strategies to control the chronic activation of microglia. It has been observed an increase in profilin (Pfn) mRNA in microglial cells in the rat hippocampus after unilateral ablation of its major extrinsic input, the entorhinal cortex. This observation suggested that Pfn might be involved in microglia activation. Pfn1 is an actin binding protein that controls assembly and disassembly of actin filaments and is important for several cellular processes, including, motility, cell proliferation and survival. Here, we studied the role of Pfn1 in microglial cell function. For that, we used primary cortical microglial cell cultures and microglial cell lines in which we knocked down Pfn1 expression and assessed the activation status of microglia, based on classical activation markers, such as: phagocytosis, glutamate release, reactive oxygen species (ROS), pro- and anti-inflammatory cytokines. We demonstrated that Pfn1 (i) is more active in hypoxia-challenged microglia, (ii) modulates microglia pro- and anti-inflammatory signatures and (iii) plays a critical role in ROS generation in microglia. Altogether, we conclude that Pfn1 is a key protein for microglia homeostasis, playing an essential role in their activation, regardless the polarization into a pro or anti-inflammatory signature. As células da microglia são células imunes residentes no sistema nervoso central (SNC) e desempenham um papel importante em processos neuroinflamatórios. Estas células são responsáveis por monitorizar o parênquima neuronal, sendo capazes de responder rapidamente a danos no SNC. Após ativação, a microglia altera a sua morfologia e o seu perfil de expressão de proteínas. O processo de ativação induz a proliferação, migração para a foco da lesão, aumento da capacidade fagocítica, bem como produção e libertação de espécies reativas de oxigénio (EROs), espécies reativas de azoto e citocinas (pro- e anti-inflamatórias). A ativação da microglia é essencial para a reparação de tecidos e a manutenção da homeostasia do SNC. No entanto, a ativação crónica ou a sua desregulação podem contribuir para a patofisiologia de doenças neurodegenerativas. Assim sendo, o estudo dos mecanismos subjacentes à ativação das células da microglia é importante para ajudar a definir e desenvolver estratégias terapêuticas apropriadas para prevenir a sua ativação crónica. Um estudo anterior reportou o aumento dos níveis de RNAm da profilina (Pfn) em células da microglia no hipocampus de ratos após lesão unilateral no córtex entorrinal, sugerindo que a Pfn poderá estar envolvida no processo de ativação da microglia. A Pfn1 é uma proteína de ligação à actina que regula a polimerização do citoesqueleto de actina, sendo importante em diversos processos celulares, incluindo motilidade, proliferação e sobrevivência. Neste trabalho, nós estudamos o papel da Pfn1 na função da microglia. Para tal, utilizamos linhas celulares e células primárias de microglias corticais de rato nas quais reduzimos a expressão da Pfn1 e avaliamos o seu estado de ativação com base em marcadores clássicos de ativação, tais como: fagocitose, libertação de glutamato, produção e libertação de EROs e citocinas pro- e anti-inflamatórias. Nós demonstramos que a Pfn1 (i) se encontra mais ativa após estímulo da microglia por hipoxia, (ii) modula as assinaturas pro- e anti-inflamatória da microglia e (iii) desempenha um papel importante na produção de EROs pela microglia. Nesse estudo concluímos que a Pfn1 é uma proteína importante para o funcionamento da microglia, desempenhando um papel essencial na ativação da microglia, independentemente da polarização pró ou anti-inflamatória.

Mestrado em Biologia Molecular e Celular Submitted by Alexandra Bastos (alexandrabastos@ua.pt) on 2016-05-31T10:09:08Z No. of bitstreams: 1 tese.pdf: 3668217 bytes, checksum: 4ff28c6c5599a46f168532f4c0c78195 (MD5) Made available in DSpace on 2016-05-31T10:09:09Z (GMT). No. of bitstreams: 1 tese.pdf: 3668217 bytes, checksum: 4ff28c6c5599a46f168532f4c0c78195 (MD5) Previous issue date: 2015-07-31

Mestrado em Biologia Molecular e Celular Endothelial dysfunction and impaired endothelial regenerative capacity play a key role in the pathogenesis of cardiovascular disease, which is one of the major causes of mortality in chronic kidney disease (CKD) patients. Circulating endothelial cells (CEC) may be an indicator of vascular damage, while circulating endothelial progenitor cells (EPC) may be a biomarker for vascular repair. However, the simultaneously evaluation of CEC and EPC circulating levels and its relation were not previously examined in CKD population. A blood sample (18ml) of healthy subjects (n=10), early CKD (n=10) and advanced CKD patients (n=10) was used for the isolation of early and late EPCs, CECs, and hematopoietic cells, identified by flow cytometry (BD FACSCanto™ II system) using a combination of fluorochrome-conjugated primary antibodies: CD31-PE, CD45-APC Cy7, CD34-FITC, CD117-PerCp Cy5.5, CD133-APC, CD146-Pacific Blue, and CD309-PECy7. Exclusion of dead cells was done according to a fixable viability dye staining. This eightcolor staining flow cytometry optimized protocol allowed us to accurate simultaneously identify EPCs, CECs and hematopoietic cells. In addition, it was also possible to distinguish the two subpopulations of EPCs, early and late EPCs subpopulation, by CD45intCD31+CD34+CD117-CD133+CD309-CD146- and CD45intCD31+CD34+CD117-CD133-CD309+CD146- multiple labeling, respectively. Moreover, the identification of CECs and hematopoietic cells was performed by CD45-CD31+CD34-/lowCD117-CD133-CD309-CD146+ and CD34+CD117+, respectively. The levels of CECs were non-significantly increased in early CKD (312.06 ± 91.34) and advanced CKD patients (191.43±49.86) in comparison with control group (103.23±24.13). By contrast, the levels of circulating early EPCs were significantly reduced in advanced CKD population (17.03±3.23) in comparison with early CKD (32.31±4.97), p=0.04 and control group (36.25 ± 6.16), p=0.03. In addition the levels of late EPCs were significantly reduced in both advanced (6.60±1.89), p=0.01, and early CKD groups (8.42±2.58), p=0.01 compared with control group (91.54±29.06). These results were accompanied by a dramatically reduction in the recruitment, differentiation and regenerative capacity indexes in CKD population. Taken together, these results suggest an imbalance in the process of endothelial repairment in CKD population, and further propose that the indexes of recruitment, differentiation and regenerative capacity of EPCs, may help to select the patients to benefit from guiding intervention strategies to improve cardiovascular health by inducing vascular protection. A disfunção endotelial e as alterações nos processos de regeneração endotelial podem desempenhar um papel determinante na patogénese da doença cardiovascular, que é uma das principais causas de mortalidade na doença renal crónica (DRC). As células endoteliais circulantes (CEC) podem ser um indicador de dano vascular, enquanto que as células progenitoras endoteliais circulantes (CPEC) pode ser um biomarcador de reparação vascular. No entanto, a avaliação simultânea dos níveis de CECs e de CPECs e sua relação não foram previamente avaliados numa população de doentes renais crónicos. Amostras de sangue (18 mL) foram recolhidas a partir de indivíduos saudáveis (n = 10), e a partir de doentes renais crónicos em estadios precoces (n=10) e em estádios avançados (n=10), para se proceder ao isolamento de populações de CPECs imaturas e maduras, CECs e células hematopoiéticas. Estas populações de células foram identificadas por citometria de fluxo (sistema BD FACS Canto II) usando uma combinação de anticorpos primários conjugados com fluorocromos: CD31-PE, CD45-APC Cy7, CD34-FITC, CD117-PerCp Cy5.5, CD133-APC, CD309-PE Cy7 e CD146-Paciific blue. Para a exclusão das células mortas recorreu-se a um marcador de viabilidade (“fixable viability dye”). Este protocolo otimizado de citometria de fluxo de oito cores permitiu identificar simultaneamente e com precisão as subpopulações de CECs, CPECs e células hematopoiéticas. Além disso, também foi possível distinguir as duas subpopulações de CPECs, imaturas e maduras, por marcação múltipla CD45intCD31+ CD34+ CD117-CD133+ CD309-CD146- e CD45intCD31+ CD34+CD117- CD133-CD309+ CD146-, respetivamente. Adicionalmente, a identificação de CECs e células hematopoiéticas foi realizada por CD45-CD31+ CD34-/lowCD117- CD133-CD309- CD146+ e CD34+ CD117+, respetivamente. Os níveis de CECs foram mais elevados em pacientes em estadios precoces de DRC (312,1±91,3) e em estadios avançados (191,4±49,9) comparativamente com o grupo controlo (103,23±24,13), n.s. Para além disso, os níveis de CPECs imaturas foram significativamente diminuídos em estadios avançados de DRC (17,1±3,2) em comparação com estadios precoces (32,3±4,9), p=0,04, e com o grupo controlo (36,3±6,2), p=0,03. Os níveis de CPECs maduras foram significativamente reduzidos em estadios avançados de DRC (6,6±1,9), p=0,01 e em estadios precoces (8,4±2,6), p=0,01, em comparação com o grupo controlo (91,5±29,1). Estes resultados foram acompanhados por uma diminuição acentuada nos índices de capacidade de recrutamento, diferenciação e regeneração na população de doentes renais crónicos. Globalmente, estes resultados sugerem um desequilíbrio no processo de reparação endotelial na DRC, e sugerem ainda, que os índices de recrutamento, diferenciação e regeneração podem ajudar na seleção de pacientes que possam beneficiar de estratégias de intervenção para melhorar a saúde cardiovascular induzindo proteção vascular.

Mestrado em Biologia Molecular e Celular Submitted by Alexandra Bastos (alexandrabastos@ua.pt) on 2016-08-30T15:26:52Z No. of bitstreams: 1 tese.pdf: 5455239 bytes, checksum: 1bcdd6fb6961409514d4dddf4d22999e (MD5) Made available in DSpace on 2016-08-30T15:26:52Z (GMT). No. of bitstreams: 1 tese.pdf: 5455239 bytes, checksum: 1bcdd6fb6961409514d4dddf4d22999e (MD5) Previous issue date: 2015-07-06

Mestrado em Biologia Molecular e Celular The last decades of the 20th century defined the genetic engineering advent, climaxing in the development of techniques, such as PCR and Sanger sequencing. This, permitted the appearance of new techniques to sequencing whole genomes, identified as next-generation sequencing. One of the many applications of these techniques is the in silico search for new secondary metabolites, synthesized by microorganisms exhibiting antimicrobial properties. The peptide antibiotics compounds can be classified in two classes, according to their biosynthesis, in ribosomal or nonribosomal peptides. Lanthipeptides are the most studied ribosomal peptides and are characterized by the presence of lanthionine and methylanthionine that result from posttranslational modifications. Lanthipeptides are divided in four classes, depending on their biosynthetic machinery. In class I, a LanB enzyme dehydrate serine and threonine residues in the C-terminus precursor peptide. Then, these residues undergo a cyclization step performed by a LanC enzyme, forming the lanthionine rings. The cleavage and the transport of the peptide is achieved by the LanP and LanT enzymes, respectively. Although, in class II only one enzyme, LanM, is responsible for the dehydration and cyclization steps and also only one enzyme performs the cleavage and transport, LanT. Pedobacter sp. NL19 is a Gram-negative bacterium, isolated from sludge of an abandon uranium mine, in Viseu (Portugal). Antibacterial activity in vitro was detected against several Gram-positive and Gram-negative bacteria. Sequencing and in silico analysis of NL19 genome revealed the presence of 21 biosynthetic clusters for secondary metabolites, including nonribosomal and ribosomal peptides biosynthetic clusters. Four lanthipeptides clusters were predicted, comprising the precursor peptides, the modifying enzymes (LanB and LanC), and also a bifunctional LanT. This result revealed the hybrid nature of the clusters, comprising characteristics from two distinct classes, which are poorly described in literature. The phylogenetic analysis of their enzymes showed that they clustered within the bacteroidetes clade. Furthermore, hybrid gene clusters were also found in other species of this phylum, revealing that it is a common characteristic in this group. Finally, the analysis of NL19 colonies by MALDI-TOF MS allowed the identification of a 3180 Da mass that corresponds to the predicted mass of a lanthipeptide encoded in one of the clusters. However, this result is not fully conclusive and further experiments are needed to understand the full potential of the compounds encoded in this type of clusters. In conclusion, it was determined that NL19 strain has the potential to produce diverse secondary metabolites, including lanthipeptides that were not functionally characterized so far. O final do século XX marcou o advento da engenharia genética, que culminou com o desenvolvimento de diversas técnicas, como o PCR ou a sequenciação de Sanger. Isto permitiu o aparecimento de novas técnicas de sequenciação de genomas, conhecidas como next-generation sequencing. Uma das suas aplicações é a procura in silico de novos metabolitos secundários, sintetizados por microrganismos e com ação antimicrobiana. Os péptidos antimicrobianos podem ser classificados em péptidos ribossomais e péptidos não-ribossomais, de acordo com a sua biossíntese. Os lantipéptidos são os péptidos ribossomais mais estudados, sendo caracterizados pela presença de lantioninas e metillantioninas na sua estrutura, que resultam de modificações pós-traducionais. Estes podem ser classificados em quatro classes consoante a sua maquinaria de biossíntese. Na classe I, resíduos de serina e treonina são desidratados no terminal C do péptido precursor por uma enzima LanB. Em seguida, estes resíduos sofrem ciclização por ação de uma enzima LanC, formando ligações de lantionina. A clivagem e transporte são posteriormente realizadas por duas enzimas LanP e LanT, respectivamente. Na classe II uma enzima bifuncional LanM é responsável pela desidratação e ciclização, e uma enzima LanT, pela clivagem e transporte. Pedobacter sp. NL19 é uma bactéria de Gram-negativo, isolada a partir de lamas de uma mina de urânio abandonada, em Viseu (Portugal). Possui atividade antimicrobiana in vitro contra várias bactérias de Gram-positivo e de Gram-negativo. A sequenciação e análise do genoma desta bactéria permitiu identificar a presença de 21 clusters biossintéticos para metabolitos secundários, incluindo clusters que codificam para péptidos ribossomais e nãoribossomais. Foram identificados quatro clusters de lantipéptidos contendo péptidos precursores, enzimas de modificação (LanB e LanC) de classe I, e a enzima bifuncional LanT, de classe II. Este resultado revela a existência de clusters de genes híbridos, pouco descritos na literatura, possuindo características de duas classes distintas. A análise filogenética efectuada revelou que as enzimas destes clusters agrupam dentro da clade de bacteroidetes. Assim, verificou-se que outras espécies deste filo também possuem os clusters de gene híbridos de lantipéptidos, mostrando que esta não é uma característica rara neste grupo de organismos. Por fim, a análise de colónias da NL19 por MALDI-TOF MS permitiu detectar uma massa com 3180 Da, correspondente à massa prevista para um lantipéptido codificado por um dos clusters híbridos. Contudo, este resultado não é totalmente conclusivo e mais procedimentos experimentais terão que ser realizados para caracterizar totalmente o potencial destes péptidos. Assim, a análise realizada revelou que a bactéria NL19 possui potencial para produzir diversos metabolitos secundários, incluindo lantipéptidos que não se encontram ainda funcionalmente caracterizados.

Mestrado em Biologia Molecular e Celular Oxidative stress (OS) is believed to be an important cause of male infertility, which accounts for about half of all infertility cases. Reactive species (RS)- induced OS is detrimental to spermatozoa, leading to the damage of many biomolecules, such as lipids, proteins and DNA. Several lifestyle factors, such as alcohol and tobacco consumption, are known to induce OS and have been studied for their negative effects on male reproductive system. The aim of this study was to evaluate the impact of acute lifestyle changes, namely alcohol and tobacco consumption, on semen quality, accessory glands function and oxidative balance of sperm cells. Furthermore, the correlation between the OS parameters analyzed and the basic semen parameters was also assessed. Male students, in reproductive age, who participated in the academic festivities, donated a semen sample at three time points: before and one week and three months after the academic festivities. Basic semen analysis was performed and, subsequently, semen samples were processed. Acessory glands function was evaluated and OS was analyzed through measurement of the total antioxidant capacity of the sperm cells and through determination of the expression of antioxidant enzymes glutathione peroxidase 4 and superoxide dismutase 1. The impact of ROS in spermatozoa was also assessed through the determination of the protein carbonyl and 3-nitrotyrosine groups. The results indicate that a decrease in semen quality, demonstrated by a decrease in progressive motility and neutral α-glucosidase concentration and an increase in tail defects, occurs due to lifestyle alterations. The total antioxidant status of sperm cells and variations in protein oxidation levels are dependent on the alcohol and tobacco consumption. Moreover, some correlations were observed between the studied parameters, which may be useful in a clinical perspective. In conclusion, the lifestyle alterations are responsible for a decrease in semen quality and by an increase in protein modifications, which may consequently lead to a decrease in fertilizing potential. O stress oxidativo (OS) tem sido considerado uma causa importante da infertilidade masculina, que está envolvida em cerca de metade dos casos de infertilidade. O OS induzido pelas espécies reativas (RS) é prejudicial para os espermatozoides, levando a lesões em várias biomoléculas, como os lípidos, proteínas e DNA. Alterações no estilo de vida, como o consumo excessivo de álcool e tabaco, induzem o OS e têm sido extensivamente estudadas devido aos seus efeitos negativos ao nível do sistema reprodutor masculino. O objetivo deste estudo foi analisar o impacto de alterações agudas no estilo de vida, nomeadamente o consumo de álcool e tabaco, na qualidade seminal, na função das glândulas acessórias e no equilibrio oxidativo dos espermatozoides. Para além disso, outro objetivo deste trabalho foi avaliar a possível relação entre os parâmetros de OS e os parâmetros seminais analisados. Estudantes masculinos, em idade fértil, que participaram nas festividades académicas, doaram uma amostra de sémen em três períodos de tempo: antes e uma semana e três meses após as festividades académicas. A análise básica ao sémen foi realizada e, posteriormente, as amostras foram processadas. A função das glândulas acessórias foi avaliada, assim como determinada a capacidade antioxidante total das células, a expressão das enzimas antioxidantes superóxido dismutase 1 e glutationa peroxidase 4 e a presença de grupos carbonilo e 3-nitrotirosina. Os resultados indicam que uma diminuição na qualidade seminal, demostrada por um decréscimo na motilidade progressiva dos espermatozoides e na concentração de α-glucosidase neutra e um aumento nos defeitos da cauda, ocorre devido a alterações no estilo de vida. A capacidade antioxidante total das células e as variações ao nível da oxidação proteica demonstram também ser dependentes do consumo de alcool e tabaco. Foram também verificadas algumas correlações entre os parâmetros analisados que poderão ser importantes numa perspetiva clínica. Concluindo, alterações no estilo de vida são responsáveis pela diminuição da qualidade seminal e pelo aumento de modificações proteicas, o que pode levar consequentemente a um decréscimo do potencial de fertilização.

Mestrado em Biologia Molecular e Celular Submitted by Alexandra Bastos (alexandrabastos@ua.pt) on 2016-05-17T12:26:56Z No. of bitstreams: 1 tese.pdf: 4234309 bytes, checksum: 5d6adf9a6ea5d14263a76774ca3cf859 (MD5) Made available in DSpace on 2016-05-17T12:26:56Z (GMT). No. of bitstreams: 1 tese.pdf: 4234309 bytes, checksum: 5d6adf9a6ea5d14263a76774ca3cf859 (MD5) Previous issue date: 2015-01-09

Mestrado em Biologia Molecular e Celular Cell cycle and differentiation are two highly coordinated processes during organ development. Recent studies have demonstrated that core cell cycle regulators also play cell cycle-independent functions in post-mitotic neurons, and are essential for the maintenance of neuronal homeostasis. CDC25 phosphatases are well-established CDK activators and their activity is mainly associated to proliferating tissues. The expression and activity of mammalian CDC25s has been reported in adult brains. However, their physiological relevance and the potential substrates in a non-proliferative context have never been addressed. string (stg) encodes the Drosophila CDC25 homolog. Previous studies from our group showed that stg is expressed in photoreceptors (PRs) and in lamina neurons, which are two differentiated cell types that compose the fly visual system. The aims of this work are to uncover the function of stg and to identify its potential neuronal substrates, using the Drosophila visual system as a model. To gain insight into the function of stg in a non-dividing context we used the GAL4/UAS system to promote downregulation of stg in PR-neurons, through the use of an RNAi transgene. The defects caused by stg loss-of-function were evaluated in the developing eye imaginal disc by immunofluorescence, and during adult stages by scanning electron microscopy. This genetic approach was combined with a specific proteomic method, two-dimensional difference gel electrophoresis (2D-DIGE), to identify the potential substrates in PR-cells. Our results showed that stg downregulation in PRs affects the well-patterned retina organization, inducing the loss of apical maintenance of PR-nuclei on the eye disc, and ommatidia disorganization. We also detected an abnormal accumulation of cytoskeletal proteins and a disruption of the axon structure. As a consequence, the projection of PR-axons into the lamina and medulla neuropils of the optic lobe was impaired. Upon stg downregulation, we also detected that PR-cells accumulate Cyclin B. Although the rough eye phenotype observed upon stg downregulation suggests neurodegeneration, we did not detect neuronal death during larval stages, suggesting that it likely occurs during pupal stages or during adulthood. By 2D-DIGE, we identified seven proteins which were differentially expressed upon stg downregulation, and are potential neuronal substrates of Stg. Altogether, our observations suggest that Stg phosphatase plays an essential role in the Drosophila visual system neurons, regulating several cell components and processes in order to ensure their homeostasis. O ciclo celular e a diferenciação são dois processos altamente coordenados durante o desenvolvimento dos órgãos. Estudos recentes demonstraram que os reguladores do ciclo celular também desempenham funções independentes do ciclo celular em neurónios pós-mitóticos e são essenciais para a manutenção da homeostasia neuronal. As fosfatases CDC25 são conhecidas como ativadores de CDKs e a sua atividade está principalmente associada a tecidos em proliferação. A sua expressão e atividade têm sido descritas em cérebros adultos de mamíferos. Contudo, a sua relevância fisiológica e os seus potenciais substratos nunca foram abordados num contexto não proliferativo. O homólogo de CDC25 em Drosophila é codificado por string (stg). Estudos prévios do nosso grupo mostram que stg é expresso nos fotorreceptores e nos neurónios da lâmina, que são dois tipos celulares diferenciados que constituem o sistema visual da mosca. Os objetivos deste trabalho são identificar a função de stg e os seus potenciais substratos neuronais, utilizando o sistema visual de Drosophila como modelo. Para obter informação acerca da função de stg utilizámos o sistema GAL4/UAS para reduzir a expressão de stg nos fotorreceptores, através de um transgene RNAi. Os defeitos provocados pela perda de função de stg foram avaliados no disco imaginal do olho por imunofluorescência, e durante a fase adulta por microscopia eletrónica de varrimento. Esta abordagem genética foi acoplada a uma técnica de proteómica específica, eletroforese diferencial em gel bidimensional (2D-DIGE), para identificar os substratos de Stg nos fotorreceptores. Os nossos resultados mostraram que a redução da expressão de stg nos fotorreceptores afetou o padrão de organização da retina, induzindo a perda da manutenção apical do núcleo dos fotorreceptores no epitélio do disco do olho e a desorganização dos omatídios. Também detetámos uma distribuição anormal de proteínas do citoesqueleto e destabilização da estrutura axonal. Consequentemente, a projeção dos axónios para os neurópilos da lâmina e médula do lobo óptico foi perturbada. Após a redução de expressão de stg, observamos também que os fotorreceptores acumularam Ciclina B. Apesar do fenótipo olho rugoso observado após redução da expressão de stg sugerir neurodegeneração, não detetámos morte neuronal durante a fase larvar, sugerindo que provavelmente ocorre durante a fase de pupa ou do desenvolvimento do adulto. Através da análise por 2D-DIGE identificámos sete proteínas com expressão diferencial que constituem potenciais substratos de Stg nos fotorreceptores. Em conjunto, as nossas observações sugerem que a fosfatase Stg desempenha uma função essencial em neurónios do sistema visual de Drosophila, regulando vários componentes e processos celulares para manter a sua homeostasia.

Mestrado em Biologia Molecular e Celular Submitted by Alexandra Bastos (alexandrabastos@ua.pt) on 2016-04-14T18:07:35Z No. of bitstreams: 1 tese.pdf: 1780611 bytes, checksum: df6cb9a6e8da683bfa3a36600eb58ac8 (MD5) Made available in DSpace on 2016-04-14T18:07:35Z (GMT). No. of bitstreams: 1 tese.pdf: 1780611 bytes, checksum: df6cb9a6e8da683bfa3a36600eb58ac8 (MD5) Previous issue date: 2016-01-04

Mestrado em Biologia Molecular e Celular Staphylococcus aureus are Gram-positive bacteria who integrate the human microbiota. Nevertheless, these bacteria can be pathogenic to the humans. Due to the increasing occurrence of antibiotic-resistant S. aureus new approaches to control this pathogen are necessary. The antimicrobial photodynamic inactivation process (PDI) is based in the combined use of a light source, an oxidizing agent like oxygen and an intermediary agent (a photosensitizer). These three components interact to form cytotoxic reactive oxygen species that irreversibly damage vital constituents of the microbial cells and ultimately lead to cell death. In fact, PDI is being shown to be a promising alternative to the antibiotic approach in the inactivation of pathogenic microorganisms. However, information on effects of photosensitization on particular virulence factors is strikingly scarce. The objective of this work was to evaluate the effect of PDI on virulence factors of S. aureus. For this, as photosensitizer the 5,10,15,20-tetrakis(1-methylpyridinium-4-yl)porphyrin tetra-iodide (Tetra-Py+-Me) and six strains of S. aureus (one reference strain, one strain with 1 enterotoxin, two strains with 3 enterotoxins and two strains resistant to methicillin, MRSA – one with 5 enterotoxins and the other without enterotoxins) were used. The effect of photosensitization on catalase activity, beta hemolysis, lipases, thermonuclease, enterotoxins, coagulase production and resistance to methicillin was assessed. The results indicate that the expression of some virulence factors in the cells subjected to this therapy is affected. Additionally the susceptibility of the strains to PDI did not decrease upon successive treatments. Staphylococcus aureus é uma espécie bacteriana Gram-positiva que integra a microbiota humana. No entanto, as bactérias desta espécie podem tornar-se patogénicas para os humanos. Devido ao aumento de ocorrência de S. aureus resistentes a antibióticos tornam-se necessárias novas abordagens terapêuticas no controlo deste organismo patogénico. O processo antimicrobiano de inativação fotodinâmica (PDI) é baseado no uso combinado de luz, oxigénio e um agente fotoativado (designado por fotossensibilizador). A interação destes três componentes leva à formação de espécies reativas de oxigénio, altamente citotóxicas, que danificam, de forma irreversível, componentes vitais das células microbianas, podendo culminar na morte celular. A inativação fotodinâmica tem-se mostrado, de facto, uma alternativa promissora na inativação de microrganismos patogénicos. Ainda assim, o conhecimento sobre o efeito que esta abordagem tem sobre os fatores de virulência ainda é escasso. O objetivo deste trabalho de dissertação foi avaliar os efeitos da PDI sobre fatores de virulência de S. aureus, Para tal, recorreu-se ao tetra-iodeto de 5,10,15,20-tetraquis(1-metilpiridínium-4il)porfirina (Tetra-Py+-Me), usado como fotossensibilizador, e estudou-se o seu efeito seis estirpes de S. aureus (uma estirpe de referência, uma estirpe que expressa uma enterotoxina, duas estirpes com três enterotoxinas e duas estirpes resistentes à meticilina, MRSA, uma expressa cinco enterotoxinas e a segunda não enterotoxica). O efeito da fotossensibilização foi verificado na atividade da catalase, beta hemólise, lípases, termonuclease, produção de enterotoxinas e da enzima coagulase, bem como na resistência à meticilina. Os resultados indicaram que a expressão de alguns fatores de virulência das células sujeitas ao processo fotodinâmico são afetados pela PDI. Adicionalmente verificou-se que a suscetibilidade das estirpes bacterianas à PDI não diminui ao longo de vários tratamentos consecutivos.

Mestrado em Biologia Molecular e Celular Marine sponges harbor microbial communities of immense ecological and biotechnological importance. Recently, they have been focus of heightened attention due to the wide range of biologically active compounds with potential application, particularly, in chemical, cosmetic and pharmaceutical industries. However, we still lack fundamental knowledge of their microbial ecology and biotechnological potential. The development of high-throughput sequencing technologies has given rise to a new range of tools that can help us explore the biotechnological potential of sponges with incredible detail. Metagenomics, in particular, has the power to revolutionize the production of bioactive compounds produced by unculturable microorganisms. It can offer the identification of biosynthetic genes or gene clusters that can be heterologously expressed on a cultivable and suitable host. This review focus on the exploration of the biotechnological potential of sponge-associated microorganisms, and integration of molecular approaches, whose increasing efficiency can play an essential role on achieving a sustainable source of natural products. As esponjas marinhas abrigam comunidades microbianas de grande importância ecológica e biotecnológica. Recentemente, estas têm recebido maior atenção devido ao grande número de compostos com actividade biológica, com potencial aplicação, particularmente, nas indústrias química, cosmética e farmacêutica. No entanto, a ecologia e o potencial biotecnológico dos seus microrganismos ainda permanecem largamente desconhecidos. O desenvolvimento de tecnologias de sequenciação de alta resolução deu origem a novo grupo de abordagens que nos podem ajudar a explorar o potencial biotecnológico das esponjas com um detalhe sem precedentes. As abordagens metagenómicas, em particular, tem poder para revolucionar a produção de compostos com actividade biológica produzidos por microrganismos não cultiváveis, ao permitir a identificação de genes ou clusters de genes biosintéticos com capacidade para serem expressos heterologamente num organismo hospedeiro adequado e cultivável. Esta revisão foca particularmente a exploração do potencial biotecnológico dos microrganismos associados a esponjas, e a integração de abordagens moleculares, cuja eficiência crescente pode desempenhar um papel essencial no desenvolvimento de uma fonte sustentável de produtos naturais.

Mestrado em Biologia Molecular e Celular As alterações climáticas emergentes têm um grande impacto no crescimento e desenvolvimento de espécies florestais, nomeadamente em espécies de valor industrial e medicinal, como é o caso do eucalipto (Eucalyptus globulus) e da moringa (Moringa oleifera). Assim, é urgente conhecer as respostas fisiológicas e entender as variações que ocorrem nos perfis metabólicos de espécies vegetais. Neste trabalho, plantas jovens de Eucalyptus globulus foram expostas a radiação UVB (12kJ/m2) e foram avaliadas as respostas fisiológicas e o perfil metabólico, um e onze dias após a aplicação da radiação. A dose de UVB usada não afetou as reações fotoquímicas nem as trocas gasosas, contudo ao nível do metabolismo do carbono (AST e amido) e do conteúdo de pigmentos verificaram-se pequenas alterações (AST e pigmentos). Através da análise do perfil metabólico de E. globulus foram encontrados compostos voláteis e semi-voláteis pertencentes às famílias dos terpenos, sesquiterpenos e aldeídos. Em geral, os sesquiterpenos e os álcoois monoterpénicos apresentaram uma tendência para manter e, em alguns casos, diminuir com o stress, enquanto que o grupos dos aldeídos aumentou e os monoterpenos apresentaram um comportamento mais heterogéneo. O E. globulus mostrou ser uma espécie tolerante à aplicação da dose de UVB usada neste trabalho. Por outro lado, plantas jovens de M. oleifera foram expostas a défice hídrico (DH). Um grupo de plantas foi recolhido um dia após o final da exposição e o outro grupo após onze dias do final da exposição. Foi avaliado o perfil metabólico desta espécie através de GC/MS. Os dados cromatográficos indicaram que em condições de stress (DH(1) e DH(11)), as quantidades de compostos associados a vias primárias e secundárias de defesa (como os alcanos, álcoois, ácidos carboxílicos, esteróis, aminoácidos e açucares) sofreram algumas alterações. As plantas analisadas 11 dias após a remoção do stress mostraram maiores variações do perfil de metabolitos. No entanto, tanto um como onze dias após a remoção do stress, as plantas apresentaram a formação de novos rebentos. Apesar do perfil de metabolitos ter sofrido algumas alterações, por não se registarem casos de morte, conclui-se que as plantas de moringa mostraram ser tolerantes aos tratamentos aplicados. The emerging climate change scenarios have a major impact on growth and development of forest species, including those with industrial and medicinal value, such as eucalyptus (Eucalyptus globulus) and drumstick (Moringa oleifera). Thus, it is urgent to know the physiological responses and understand the changes that occur in metabolic profiles of the most affected species. Young plants of E. globulus were exposed to UVB radiation. The physiological and metabolic responses were evaluated 1 day and 11 days after the end of the stress application. The UVB dose (12kJ/m2) used did not affect nor the photochemical reactions nor the gas exchange, but the carbon metabolism (TSS and starch), and pigment content showed small changes that remained until 11 days after the end of stress exposure (TSS and pigments). Through the metabolic profile analysis of E. globulus were found volatile and semi-volatile compounds belonging to the families of terpenes, sesquiterpenes, alcohols and aldehydes. In general, monoterpene alcohols and sesquiterpenes were tend to maintain and, in some cases, to reduce under stress conditions, while monoterpene and aldehydes increased and showed a more heterogeneous behaviour. The E. globulus showed some tolerance to the UVB dose tested in this study. By the other hand, young plants of M. oleifera were exposed to other stress, water deficit (DH). One group of plants was collected one day after the end of stress exposure and the other group eleven days after of the end of exposure. The metabolic profile was evaluated by GC/MS. In stress conditions (DH (1) and DH (11)), the chromatographic data indicate that the amounts of compounds associated with primary and secondary defense pathways (like alkanes, alcohols, carboxylic acids, sterols, aminoacids and sugars) have been changed. Eleven days after the end of the stress, the plants showed higher variations of the metabolic profile. However, either one or eleven days after the removal of stress, plants showed new shoots. Despite the metabolic profile have changed and considering that DH did not induced plant death, it is concluded that M. oleifera plants have tolerance to the treatment applied.

Mestrado em Biologia Molecular e Celular O cancro da mama é um dos cancros mais frequentes na população, principalmente nas mulheres pós-menopausa. As células tumorais apresentam um aumento da captação de glicose associado a um aumento da produção de lactato mesmo em ambiente aeróbico – o efeito de Warburg. Esta característica está associada a um aumento da expressão e atividade dos transportadores de glicose (da família GLUT) na membrana plasmática. O GLUT1 é o principal transportador de glicose presente nas células de cancro da mama. Um outro nutriente essencial para estas células é o ácido fólico, indispensável para a síntese e metilação de DNA. O estrogénio é uma hormona com um papel importante no desenvolvimento e progressão da carcinogénese mamária, que se liga a recetores de estrogénio específicos (ERα e ERβ). Anteriormente, foi demonstrado pelo nosso grupo que o polifenol kaempferol tem um efeito antiproliferativo em células de cancro da mama (células MCF-7) dependente da inibição do GLUT1. Assim, decidimos estudar se o efeito do 17β-estradiol é dependente de alterações da captação dos nutrientes glicose e ácido fólico. Paralelamente, decidimos investigar quais os recetores do estrogénio envolvidos no efeito do 17β-estradiol e decidimos investigar também se o seu efeito é alterado pelos polifenóis rutina e ácido cafeico. Para isso, as células MCF-7 foram expostas a 17β-estradiol e foi avaliado o seu efeito na viabilidade celular, proliferação celular, crescimento da cultura e capacidade de migração celular. Para o estudo do efeito dos polifenóis os mesmo foram adicionados às culturas e foi avaliada a viabilidade celular e a proliferação, procedendo-se da mesma forma para o estudo dos antagonistas dos recetores de estrogénio. Foi também avaliado o efeito do 17β-estradiol na produção celular de lactato. O efeito do 17β-estradiol na expressão do RNAm e na atividade do GLUT1 foi avaliado por qRT-PCR e pela quantificação da captação de 3H-desoxi-D-glicose, respetivamente. Por fim o efeito do 17β-estradiol na captação de ácido fólico foi avaliado pela quantificação da captação de 3H-ácido fólico. Verificou-se que o 17β-estradiol (48h; 100 nM) induziu um aumento no crescimento da cultura, na proliferação e na viabilidade celular e na produção de lactato, sem contudo afetar significativamente a migração celular. Relativamente aos polifenóis, nenhum deles modificou o efeito do 17β-estradiol. O antagonista do ERβ (PHTPP) reverteu o efeito pró-carcinogénico do 17β-estradiol, sugerindo que este efeito envolve ativação de recetores Erβ. Verificou-se também que o 17β-estradiol (48h; 100 nM) não afetou a captação de 3H-desoxi-D-glicose nem de 3H-ácido fólico. Por fim, o 17β-estradiol (48h; 100 nM) não teve efeito sobre os níveis de RNAm do GLUT1. Em conclusão, o efeito positivo do 17β-estradiol na proliferação e viabilidade das células MFC-7 não está relacionado com alterações na captação celular de glicose nem de ácido fólico. Breast cancer is one of the most frequent cancers in the population, especially in older women, and its rate has been increasing over the years. Among several distinguishing characteristics, cancer cells present an increase in glucose uptake together with in an increase in lactate production –the Warburg effect. These characteristics are associated with an increase in glucose facilitative transporters (GLUT) expression and activity. GLUT1 is the main glucose transporter in breast cancer cells. Another essential nutrient for cancer cells is folic acid, which has an important role in DNA synthesis and methylation. Estrogen is known to be a key hormone in the development and progression of mammary carcinogenesis, and it bind to specific estrogen recetors present in breast cancer cells (ERα and ERβ). Previously, our group found that the antiproliferative effect of kaempferol on MCF7 cells was dependent on GLUT1 inhibition. So, we decided to investigate if the effect of 17β-estradiol in breast cancer cells is dependent on changes in nutrient (glucose and folic acid) uptake. Moreover, we also investigated which estrogen recetors are involved in the effect of 17β-estradiol and if the effect of 17β-estradiol is changed by the polyphenols rutin and caffeic acid. MCF-7 cells were exposed to 17β-estradiol and then we evaluated cellular viability, cell proliferation rate, culture growth, and migration capacity. For the study of the effect of the polyphenols and of ER antagonists, they were added to the culture and cellular viability and cell proliferation rate were evaluated. We also evaluated the effect of 17β-estradiol in the cellular production of lactate. GLUT1 activity and expression was assessed by measuring uptake of 3H-deoxy-D-glucose and by qRT-PCR, respectively. Finally, the effect of 17β-estradiol in folic acid uptake was evaluated by quantification of 3H-folic acid uptake. We were able to show that 17β-estradiol (48h; 100 nM) induces an increase in culture growth as well as an increase in cell proliferation rate and in cell viability. Additionally, an increase in lactate production was observed. In contrast, 17β-estradiol (48h; 100 nM) did not significantly affect the migration capacity. None of the polyphenols was able to change the effect of 17β-estradiol. In contrast, the ERβ antagonist (PHTPP) reversed the pro-carcinogenic effect of 17β-estradiol, suggesting that this effect involves ERβ activation. Neither the uptake of 3H-deoxy-D-glucose nor the expression of GLUT1 was affected by 17β-estradiol (48h; 100 nM); a similar effect was found in relation to 3H-folic acid uptake. In conclusion, the positive effect of 17β-estradiol upon proliferation and viability of MCF-7 cells is not dependent on inhibition of glucose or folic acid cellular uptake.

Mestrado em Biologia Molecular e Celular The neuronal cytoskeleton is an interconnected network of filamentous polymers, having in its constitution three major components: actin, microtubules and intermediate filaments. Up to the discovery of axon actin rings, the neuronal actin cytoskeleton has gained relevance. Still, the molecular details of the regulation of the actin cytoskeleton in neurons are largely unknown. Helping in the actin cytoskeleton regulation and maintenance, there is adducin. Adducin is organized in heterotetamers of heterodimers which comprises α/β and α/γ subunits. In the nervous system, the depletion of α subunit results in an almost complete absence of functional adducin. Given this, α-adducin KO mice arose as relevant models to study the role of this protein in actin cytoskeleton. Results from our group showed that α-adducin KO mice develop progressive axon enlargement and degeneration. As defects in axonal transport have been related to axon enlargement, we determined the importance of adducin in the axonal cytoskeleton and, more specifically, in axonal transport. Although no differences were found in the retrograde transport of CTB in the optic nerve, the lack of adducin resulted in a decreased speed of axonal transport of mitochondria and lysosomes. Several neurodegenerative disorders have been associated with axonal transport deficits and, consequently, with alterations in MT-based transport. Although no differences were found in the levels of acetylated and de-tyrosinated tubulin, the levels of tyrosinated tubulin were significantly decreased in α-adducin KO brains, suggesting a less dynamic status of the MT cytoskeleton in the absence of adducin. Besides differential PTMs of tubulin the decreased axonal transport speed may result from the decreased levels of dynein and kinesin in α-adducin KO mice. Lastly, we hypothesized that adducin might be involved in the organization and/or plasticity of the AIS that requires actin dynamics. In α-adducin KO animals, although the AIS forms normally, neurons do not have the ability to relocate it in response to chronic depolarization. Still, the specific role of actin and its associated proteins, like adducin, in this process remains unclear. In sum, with this Thesis we contributed to understand the relevance of the actin in cytoskeleton, more specifically, of the actin-binding protein adducin in neuron biology. O citoesqueleto neuronal é maioritariamente constituído por três componentes: actina, microtúbulos e filamentos intermédios. Com a descoberta dos anéis de actina presentes no axónio, o citoesqueleto neuronal de actina tem vindo a ganhar bastante relevância. Contudo, os mecanismos moleculares envolvidos na regulação da actina no citoesqueleto continuam por esclarecer. Nesta tese focámo-nos no estudo da importância da aducina, uma proteína de ligação à actina, na regulação do citoesqueleto neuronal. A aducina é uma proteína constituída por heterotetrameros de heterodímeros das subunidades α/β e α/γ, sendo que no sistema nervoso, a depleção da subunidade α resulta numa completa ausência da proteína no seu estado funcional. Assim, murganhos KO para α-aducina demonstraram ser um modelo animal relevante para o estudo do papel desta proteína no citoesqueleto de actina. Resultados do nosso grupo demonstraram que murganhos KO para α-aducina desenvolvem uma degeneração progressiva e um aumento do calibre do axónio. Uma vez que defeitos no transporte axonal têm vindo a ser relacionados com o alargamento axonal, tornou-se importante determinar o papel da aducina no citoesqueleto axonal, mais especificamente no transporte ao longo do axónio. Apesar de não terem sido encontradas diferenças no transporte da toxina da cólera no nervo óptico, a ausência da aducina resultou num decréscimo significativo na velocidade de transporte axonal de mitocôndrias e lisossomas. Diversos distúrbios neurodegenerativos têm sido associados com deficiências no transporte axonal consequentes de alterações na maquinaria de transporte incluindo microtúbulos e proteínas relacionadas. Apesar de não terem sido encontradas diferenças nos níveis de acetilação e de-tirosinação da tubulina em amostras de cérebro α-aducina KO, os níveis de tirosinação da tubulina estão significativamente diminuídos quando comparados com aqueles encontrados em amostras WT, sugerindo uma menor dinâmica dos microtúbulos na ausência de aducina. Além das modificações da tubulina, a diminuição da velocidade de transporte axonal poderá resultar também do decréscimo dos níveis de ambos os motores moleculares dineina e cinesina nos murganhos α-aducina KO. Por fim, sugere-se que a aducina poderá também estar envolvida na organização e/ou plasticidade do segmento inicial do axónio dada a sua ligação ao citoesqueleto de actina, importante para a sua função e organização. Nos murganhos KO para α-aducina, foi verificado que apesar da formação do segmento inicial ser normal, as células não têm a capacidade para o relocalizar após uma depolarização crónica. Porém, o papel específico da actina e das suas proteínas associadas, tal como a aducina, neste processo deverá ser investigado com maior detalhe. Sumariamente, com esta tese, foi possível contribuir para uma melhor compreensão da relevância da actina, mais especificamente, da proteína de ligação à actina aducina, na biologia de um neurónio.

Mestrado em Biologia Molecular e Celular A carne continua a ser a fonte proteica mais comum no quotidiano das pessoas. Além disso, os produtos cárneos processados apresentam-se como uma mais-valia nas suas vidas agitadas. Este tipo de produto torna difícil a diferenciação das carnes utilizadas na sua confecção, sendo por isso propícios a adulteração. A Reacção em Cadeia da Polimerase (PCR) tem ganho cada vez mais importância nos laboratórios de biologia molecular, revelando-se uma técnica de análise rápida, sensível e altamente específica na identificação de espécies em produtos alimentares. No entanto, vários factores podem interferir com o processo de amplificação, pelo que alguns cuidados devem ser implementados desde a aquisição da amostra a analisar, ao seu acondicionamento e posterior extração de ADN. Existem inúmeros protocolos de extração de ADN, devendo para cada estudo avaliar-se e optar-se pelo mais adequado, considerando a finalidade estabelecida para a amostra extraída. O trabalho laboratorial apresentado nesta dissertação baseou-se em três etapas principais. Inicialmente, avaliaram-se diferentes protocolos de extração de ADN, utilizando-se amostras de carne adquiridas num talho. Entre os protocolos testados, o método de Brometo de Cetil-Trimetil-Amónio (CTAB) modificado foi o que permitiu obter amostras de ADN com maior concentração e elevado nível de pureza. Posteriormente, foram testados e optimizados diferentes protocolos de amplificação, por PCR em tempo real, para a detecção das espécies Bos taurus (vaca), Sus scrofa (porco), Equus caballus (cavalo) e Ovis aries (ovelha). Foram empregues primers específicos de espécie para a detecção de genes mitocondriais e genómicos, consoante cada protocolo. Para o caso concreto do porco, foi efectuada a avaliação de dois protocolos, singleplex com EvaGreen® e tetraplex com AllHorse, para possível aplicação dos mesmos na sua quantificação. Os resultados demonstraram elevada especificidade e sensibilidade das reacções para esta espécie, permitindo a sua detecção até um limite de 0,001 ng e 0,1%, respectivamente. Somente a primeira metodologia se mostrou adequada para quantificação. Por último, as metodologias sugeridas foram aplicadas com sucesso na análise de 4 amostras comerciais de hambúrgueres, tendo-se verificado a consistência da rotulagem em todos os casos, no que concerne a composição em termos de espécies animais. O interesse de trabalhos neste âmbito recai na importância da autenticidade dos rótulos de produtos alimentares, principalmente nos produtos cárneos, para segurança dos consumidores e salvaguarda dos produtores. Meat remains the most common protein source in people’s everyday lives. In addition, processed meat products represent an asset in their hectic state of living. In this type of product it is difficult to identify the different meat species used in its manufacture and therefore they are prone to food fraud. Polymerase Chain Reaction (PCR) has gained increasing importance in molecular biology laboratories, revealing it´s suitability for rapid, sensitive and highly specific analysis of species identification in food products. However, several factors can interfere with the amplification process. Hence some precaution procedures must be implemented since the acquisition of the test sample, to its conditioning and subsequent DNA extraction process. There are numerous DNA extraction protocols and for each study a number of methods shall be evaluated so the most appropriate will be selected, considering the subsequent purpose of the extracted DNA sample. The laboratory work presented in this thesis was based on three main steps. Initially, different DNA extraction protocols were evaluated. The modified Cetyl Trimethyl Ammonium Bromide (CTAB) method showed the best results considering DNA yield and purity. Subsequently, several amplification protocols were tested and optimized, for real time PCR detection of Bos taurus (beef), Sus scrofa (pork), Equus caballus (horse) and Ovis aries (sheep) species. Species specific primers were used for detection of mitochondrial and genomic genes, according to each protocol. In the particular case of Sus scrofa species, two protocols were tested for their quantification accuracy, a singleplex based on EvaGreen® detection and a tetraplex based on AllHorse amplification kit. The results demonstrated high specificity and sensitivity for both reactions, allowing a LOD of 0.001 ng and 0.1%, respectively. Only the first of the two tested methodologies proved to be accurate for DNA quantification. Finally, the suggested methods were successfully applied to the analysis of four hamburgers commercial samples. All checked for the consistency of labeling regarding animal species composition. The interest of this work in this area lies in the importance of authenticity of food labels, especially in meat products, for consumer safety and producers protection.

Mestrado em Biologia Molecular e Celular O objetivo do presente trabalho é apresentar os resultados clínicos e embriológicos de pacientes com microdeleções no cromossoma Y, tratados por injeção intracitoplasmática de espermatozoides (ICSI), através do uso de espermatozoides testiculares a fresco (TESE) ou criopreservados e descongelados (TESE-C), e através do uso de espermatozoides do ejaculado (EJAC). A originalidade deste trabalho reside nas comparações efetuadas entre os diferentes tipos de microdeleções no cromossoma Y (AZFa, AZFb e AZFc) e os tratamentos efetuados, com os detalhes dos resultados demográficos, de estimulação, embriológicos, clínicos e dos recém-nascidos (NB). Dos 128 pacientes com microdeleções no cromossoma Y, 18 realizaram ICSI com espermatozoides do ejaculado e 65 realizaram TESE. Houve 51 ciclos de tratamentos TESE e 43 ciclos de tratamento TESE-C, com nascimento de 19 NB (2 em AZFa/TESE-C; 12 Em AZFc/TESE; 5 em AZFc/TESE-C).Dos 29 ciclos EJAC houve nascimento de 8 NB (em AZFc). Nos ciclos TESE e EJAC não houve diferenças significativas nos parâmetros clínicos e embriológicos. Nos ciclos TESE-C, houve uma taxa de maturação de ovócitos, taxa de clivagem embrionária e média do número de embriões transferidos significativamente mais baixa em AZFb, uma média do número de ovócitos mais alta e uma taxa de fertilização mais baixa em AZFc. Em conclusão, embora os pacientes com microdeleção AZFc apresentem uma alta taxa de recuperação de espermatozóides e resultados clínicos aceitáveis, casos com microdeleções AZFa e AZFb apresentaram um prognóstico pobre. Devido à hereditariedade das microdeleções relatada, os pacientes devem ser informados acerca das consequências da infertilidade no recém-nascido e da possibilidade de utilizarem o diagnóstico genético de pré-implantação para a seleção do sexo feminino. The aim of the present work was to present the outcomes of patients with Y-chromosome microdeletions treated by intracytoplasmic sperm injection (ICSI), either using fresh (TESE) or frozen-thawed (TESE-C) testicular sperm, and ejaculated sperm (EJAC). The originality of this work resides in the comparisons between the different types of Y-microdeletions (AZFa, AZFb, AZFc) and treatments, with detailed demographic, stimulation, embryological, clinical and newborn (NB) outcomes. Of 128 patients with Y-microdeletions, 18 performed ICSI with ejaculated sperm and 65 went for TESE. There were 51 TESE treatment cycles and 43 TESE-C treatment cycles, with birth of 19 NB (2 in AZFa/TESE-C; 12 in AZFc/TESE; 5 in AZFc/TESE-C). Of the 29 EJAC cycles there was birth of 8 NB (in AZFc). In TESE and EJAC cycles there were no significant differences in embryological and clinical parameters. In TESE-C cycles, there was a significant lower oocyte maturity rate, embryo cleavage rate and mean number of embryos transferred in AZFb, and a higher mean number of oocytes and lower fertilization rate in AZFc. In conclusion, although patients with AZFc microdeletions presented a high testicular sperm recovery rate and acceptable clinical outcomes, cases with AZFa and AZFb microdeletions presented a poor prognosis. Due to the reported heredity of microdeletions, patients should be informed about the infertile consequences on the newborn and the possibility of using preimplantation genetic diagnosis for female sex selection.

Mestrado em Biologia Molecular e Celular The Attention Deficit Hyperactivity Disorder and Dyslexia are neurodevelopmental diseases with a very high prevalence in children which often persist into adolescence and adulthood. With a difficult diagnosis, based on scales quantifying the signs and symptoms, a method of reliable, noninvasive diagnosis, suitable for children is urgent. A diagnosis using saliva samples quantifying salivary biomarkers is ideal for this study population. The establishment of the standard operating procedure with procedures for collecting, processing and storage of samples is essential to use saliva. Furthermore, since there appears to be a relationship between cognitive diseases and inflammation, the evaluation of the protein profile and quantification of cytokines related to inflammation are a starting point to understand the pathology. The evaluation of the chemokine (c-c motif) ligand 13 (CCL13) and of the chemokine (c-c motif) ligand 3 (CCL3), present in inflammation, was done using multiplex technology. The levels of these two chemokines are increased in multicompromised individuals which leads us to infer that neuroinflammation is present in these pathologies. Future studies should be done to validate inflammatory biomarkers in these diseases. A Perturbação de Hiperatividade e Défice de atenção e a Dislexia são doenças do neuro-desenvolvimento com uma prevalência muito elevada nas crianças e que frequentemente persistem na adolescência e no adulto. Com um diagnóstico difícil, baseado em escalas nas quais se quantificam os sinais e sintomas, um método de diagnóstico fiável, não invasivo e adequado a crianças é apropriado. Para isso, um diagnóstico utilizando amostras de saliva com recurso a biomarcadores salivares é o ideal para a população em estudo. O estabelecimento do SOP com procedimentos de recolha, processamento e armazenamento são essenciais para o uso da saliva. Além disso, e uma vez que parece haver relação entre doenças cognitivas e inflamação, a avaliação do perfil de proteínas e quantificação de citocinas relacionadas com a inflamação são um ponto de partida para entendermos estas patologias. A avaliação de duas citocinas CCL3 e CCL13, presentes em inflamação, foi realizada com recurso à tecnologia multiplex. Os níveis destas duas citocinas encontram-se aumentados em indivíduos multi-comprometidos o que nos leva a inferir que a neuroinflamação está presente nestas patologias. Estudos futuros devem ser feitos no sentido de validar biomarcadores inflamatórios nestas patologias.

Mestrado em Biologia Molecular e Celular O osteossarcoma é o tumor maligno mais comum do osso, afetando particularmente adolescentes e jovens adultos, sendo o sexo masculino o mais afetado. O tratamento da doença nem sempre é eficaz, mas com a ajuda da quimioterapia aliada à remoção da parte afetada, a qualidade de vida dos doentes tem vindo a melhorar, verificando-se um aumento de sobrevivência. Este projeto surge com o intuito de desenvolver uma terapia combinada que venha a diminuir a resistência a quimioterápicos, utilizando compostos frequentemente usados na quimioterapia (etoposido e doxorrubicina) e um fitocomposto (hesperetina). Foi possível investigar os efeitos citotóxicos de fitocomposto isolado e em combinação na linha celular U2OS relativamente a diversos parâmetros celulares, nomeadamente a formação de colónias, proliferação celular, bem como a genotóxicidade e citótoxicidade. A formação de colónias foi seguida através do ensaio clonogénico, a proliferação celular foi determinada através dos ensaios de violeta de cristal (CV) e brometo de 3-[4,5-dimetil-tiazol-2-il]-2,5-difeniltetrazólio (MTT). O potencial genotóxico e citostático foi avaliado por ensaio de micronúcleos com bloqueio de citocinese (CBMN) e por análise citométrica do ciclo celular. Não ocorreram efeitos genotóxicos significativos, contudo a hesperetina isolada e em combinação induziu efeitos citostáticos, tal como observado por diminuição de índice de divisão nuclear (NDI) e alteração do perfil de fases do ciclo celular. Por comparação com agentes antineoplásicos, observou-se que também as combinações com hesperetina testadas não permitiram o desenvolvimento de colónias de U2OS. Estudos futuros de dano no ADN poderiam ilucidar na melhor compreensão das alterações que estes compostos provocam nesta linha celular e a comparação com outras linhas celulares também ajudaria na compreensão. Osteosarcoma is the most common malignant tumor of the bone, occurring with more frequency in adolescents and young adults, with a greater percentage being male. The treatment is not always effective, but with chemotherapy as well as the removal of the affected section the quality of life of the patients has been increasing, together with the survival rate. This project has the aim of developing a combined therapy that can decrease the resistance to chemotherapeutics, utilizing compounds frequently used in chemotherapy (etoposide and doxorubicin) and a phytocompound (hesperetin). It was possible to investigate the cytotoxic effects of phytocompound alone and in combination on the cell line U2OS on several parameters such as colony formation, cellular proliferation, cytotoxicity and genotoxicity. Colony formation was followed by clonogenic assay, cell proliferation was determined by crystal violet (CV) and 3- [4,5-dimethyl-thiazol-2-yl] -2,5-diphenyltetrazolium (MTT) assays. The cytostatic and genotoxic potential was assessed by micronucleus assay with blocked cytokinesis (CBMN) and flow cytometric cell cycle analysis. There were no significant genotoxic effects, however, the hesperetin both isolated and in combination induced cytostatic effects as observed by a decrease in nuclear division index (NDI) and modification of profile phases of the cell cycle. Compared to antineoplastic agents, it was observed that also combinations containing hesperetin did not allow the development of U2OS colonies. Future studies of DNA damage could elucidate the alterations that these compounds cause in this cell line and a comparison with other cell lines would also increase the knowledge on the cytotoxicity and genotoxicity mechanisms.

Mestrado em Biologia Molecular e Celular Polyadenylation is a fundamental processing step of mRNA maturation, essential for its export, stability and translation. Bioinformatic analyses have shown that 70% of human genes have several polyadenylation signals (pA signals) in the 3’untranslated region (3’UTR) that are used to produce multiple mRNA isoforms by alternative polyadenylation (APA). This process has a fundamental role in gene expression in a variety of cellular programs as well as in non-pathological conditions and diseases. When it occurs in the 3’UTR, APA gives rise to transcripts with different 3’UTR lengths. MicroRNAs (miRNAs) and RNA-binding proteins (RBPs) often bind to sequences present in that region and thus mRNA isoforms with longer 3’UTRs have more sites where these regulators can bind, being more prone to regulation. miRNAs are 23 nucleotides in length post-transcriptional regulators of gene expression that have been implicated in a variety of cell conditions. In the immune system, it has been shown that upon T cell activation there is a global switch in pA signal selection from a distal to a proximal pA signal, originating mRNAs with shorter 3’UTRs and, consequently, with less miRNAs and RBPs target sites. The MCL1 (Myeloid Cell Leukemia Sequence 1) gene encodes an anti-apoptotic protein (Mcl-1), which is a member of the Bcl-2 (B cell lymphoma-2) family of apoptosis regulators. MCL1 is essential for development and maintenance of both B and T lymphocytes in animals. It has been demonstrated that MCL1 is highly regulated at both transcriptional and post-transcriptional levels. The aims of our study were to characterize the pattern of MCL1 APA and to unravel the role of miRNAs in the regulation of MCL1 APA-derived isoforms. We discovered that MCL1 produces four mRNA isoforms by the usage of four canonical pA signals located in the 3’UTR and that these pA signals are highly conserved in mammals. We verified that the longest mRNA isoform is regulated at a post-transcriptional level in activated PBMCs. We also demonstrated that the shortest 3’UTRs give rise to higher amounts of luciferase activity than the longest mRNA. Additionally, we showed that Mcl-1 protein levels increase upon PBMCs activation. This suggests that during PBMCs activation the increase in Mcl-1 protein is due to the translation of the shortest isoforms. In the second part of this study we identified miRNA-17 as a putative regulator of the longest isoform upon T cell activation. The expression of this miRNA increased upon activation of T cells and when we mutated its putative-binding site on MCL1 3’UTR we observed an increase in luciferase activity in HeLa cells. We also overexpressed miRNA-17, miRNA-29b and miRNA-92a and showed that this causes a decrease in endogenous Mcl-1 expression. From this study we conclude that the MCL1 longest APA-derived isoform is down-regulated at a post-transcriptional level upon T cell activation in order to increase Mcl-1 expression and that miRNA-17 may be the key regulator in this mechanism. A poliadenilação é um passo de processamento fundamental da maturação do mRNA, essencial para o seu transporte, estabilidade e tradução. Análises bioinformáticas têm demonstrado que cerca de 70% dos genes humanos têm vários sinais de poliadenilação na região 3’ não traduzida (3’UTR). Estes sinais são usados para produzir várias isoformas de mRNA por poliadenilação alternativa (APA), um processo com um papel fundamental na expressão génica em programas celulares bem como em condições patológicas e não patológicas. Quando ocorre na região 3’ não traduzida, a APA dá origem a transcritos com diferentes tamanhos da 3’UTR. Os microRNAs (miRNAs) e as proteínas que se ligam ao RNA (RBPs) ligam-se frequentemente a sequências presentes nesta região e portanto isoformas de mRNA com 3’UTRs mais longas contêm mais locais onde estes reguladores se podem ligar e, por isso, estão mais sujeitos a regulação. Os miRNAs são reguladores pós-transcricionais da expressão génica com cerca de 23 nucleótidos, que têm sido envolvidos numa variedade de condições celulares. No sistema imune, tem sido demonstrado que após activação dos linfócitos T passa a haver uma maior seleção dos sinais de poliadenilação proximais em vez dos distais, originando mRNAs com 3’UTRs mais curtas e consequentemente com menos locais onde se possam ligar miRNAs e RBPs. O gene MCL1 (Myeloid Cell Leukemia Sequence 1) codifica uma proteína (Mcl-1) com função anti-apoptótica essencial para o desenvolvimento e manutenção dos linfócitos T em animais, que faz parte da família proteica da Bcl-2, uma família de reguladores da apoptose. Tem sido demonstrado que o MCL1 é altamente regulado tanto ao nível transcricional como pós-transcricional. Os objetivos do nosso estudo são determinar o padrão de APA que ocorre no MCL1 em linfócitos T humanos e caracterizar o papel dos miRNAs na regulação das isoformas de mRNA do MCL1 produzidas por APA. Verificamos que o MCL1 produz quatro isoformas de mRNA pelo uso de quatro sinais de poliadenilação canónicos localizados na 3’UTR e que esses sinais são altamente conservados nos mamíferos. Observamos que a isoforma de mRNA mais longa é regulada ao nível pós-transcricional nos PBMCs ativados. Nos nossos resultados demonstramos também que as 3’UTR mais curtas dão origem a uma maior actividade de luciferase do que o mRNA mais longo. Isto sugere que durante a ativação dos PBMCs o aumento na proteína Mcl-1 é devida à tradução das isoformas mais curtas. Na segunda parte do estudo identificamos o miRNA-17 como um possível regulador da isoforma longa após ativação dos linfócitos T. A expressão deste miRNA está aumentada após ativação dos linfócitos T e quando é mutado o seu local de ligação ao mRNA putativo na 3’UTR do MCL1 observou-se um aumento na atividade da Luciferase na linha celular HeLa. Também realizamos a sobreexpressão do miRNA-17, do miRNA-29b e do miRNA-92a o que levou a uma diminuição na expressão endógena do Mcl-1. A partir deste estudo concluímos que a isoforma do MCL1 gerada por APA mais longa é regulada negativamente ao nível pós-transcricional após ativação celular de modo a aumentar a expressão do Mcl-1 e que o miRNA-17 poderá ser o regulador chave deste mecanismo.

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Mestrado em Biologia Molecular e Celular Submitted by Alexandra Bastos (alexandrabastos@ua.pt) on 2016-03-24T16:18:07Z No. of bitstreams: 1 tese.pdf: 2918242 bytes, checksum: 2565442cb502b49d68d65732a25a5287 (MD5) Made available in DSpace on 2016-03-24T16:18:07Z (GMT). No. of bitstreams: 1 tese.pdf: 2918242 bytes, checksum: 2565442cb502b49d68d65732a25a5287 (MD5) Previous issue date: 2014-12-18

Mestrado em Biologia Molecular e Celular Although the genetic code is generally viewed as immutable, alterations to its standard form occur in the three domains of life. A remarkable alteration to the standard genetic code occurs in many fungi of the Saccharomycotina CTG clade where the Leucine CUG codon has been reassigned to Serine by a novel transfer RNA (Ser-tRNACAG). The host laboratory made a major breakthrough by reversing this atypical genetic code alteration in the human pathogen Candida albicans using a combination of tRNA engineering, gene recombination and forced evolution. These results raised the hypothesis that synthetic codon ambiguities combined with experimental evolution may release codons from their frozen state. In this thesis we tested this hypothesis using S. cerevisiae as a model system. We generated ambiguity at specific codons in a two-step approach, involving deletion of tRNA genes followed by expression of non-cognate tRNAs that are able to compensate the deleted tRNA. Driven by the notion that rare codons are more susceptible to reassignment than those that are frequently used, we used two deletion strains where there is no cognate tRNA to decode the rare CUC-Leu codon and AGG-Arg codon. We exploited the vulnerability of the latter by engineering mutant tRNAs that misincorporate Ser at these sites. These recombinant strains were evolved over time using experimental evolution. Although there was a strong negative impact on the growth rate of strains expressing mutant tRNAs at high level, such expression at low level had little effect on cell fitness. We found that not only codon ambiguity, but also destabilization of the endogenous tRNA pool has a strong negative impact in growth rate. After evolution, strains expressing the mutant tRNA at high level recovered significantly in several growth parameters, showing that these strains adapt and exhibit higher tolerance to codon ambiguity. A fluorescent reporter system allowing the monitoring of Ser misincorporation showed that serine was indeed incorporated and possibly codon reassignment was achieved. Beside the overall negative consequences of codon ambiguity, we demonstrated that codons that tolerate the loss of their cognate tRNA can also tolerate high Ser misincorporation. This raises the hypothesis that these codons can be reassigned to standard and eventually to new amino acids for the production of proteins with novel properties, contributing to the field of synthetic biology and biotechnology. O código genético é geralmente visto como imutável, no entanto várias alterações à sua forma padrão são conhecidas. Uma das mais notáveis acontece em várias espécies do género Candida, onde o codão Leu-CUG é descodificado como serina por um novo RNA transferência (Ser-tRNACAG). O laboratório de acolhimento fez um grande progresso ao reverter a alteração atípica do código genético do fungo patogénico humano C. albicans, usando uma combinação de tRNAs mutantes, recombinação genética e evolução forçada. Estes resultados levantaram a hipótese que as ambiguidades sintéticas do codão, combinadas com evolução experimental, poderem libertar os codões do seu estado fixo. Nesta tese testamos esta hipótese usando S. cerevisiae como modelo biológico. Geramos ambiguidade em codões específicos, de forma bifásica, envolvendo a deleção de genes de tRNA, seguida pela expressão de tRNAs não-cognatos capazes de compensar o tRNA eliminado. Tendo como base a ideia que os codões raros são mais suscetíveis a alterações que aqueles usados frequentemente, usamos duas estirpes knock-out, nas quais não existem os tRNAs cognatos capazes de descodificar os codões raros CUC-Leu e AGG-Arg. Exploramos então a vulnerabilidade destes codões pela construção de tRNAs mutantes que incorporam erradamente Ser nestes locais. Estas estirpes recombinantes foram evoluídas ao longo do tempo, usando evolução experimental. Apesar de ter havido um forte impacto negativo na taxa de crescimento de estirpes que expressam o tRNA mutante a altos níveis, esta expressão a baixos níveis teve pouco impacto no fitness celular. Descobrimos que não só a ambiguidade do codão, mas também destabilizações da pool de tRNAs endógenos têm um impacto negativo na taxa de crescimento. Após a evolução, as estirpes com elevada expressão do tRNA mutante recuperaram significativamente em vários parâmetros de crescimento, o que mostra que estas adaptam-se e exibem maior tolerância à ambiguidade do codão. Através do sistema repórter fluorescente desenvolvido monitorizamos a incorporação errónea de Ser, o que nos indica que a Ser está de facto a ser incorporada e que, possivelmente, a alteração da identidade do codão foi atingida. Apesar das consequências negativas gerais da ambiguidade do codão, demonstramos que os codões capazes de tolerar a perda do seu tRNA cognato, conseguem também tolerar a incorporação elevada de Ser. Isto levanta a hipótese que estes codões podem ser recodificados para outros aminoácidos naturais e/ou artificiais para a produção de proteínas com novas propriedades, contribuindo assim para o campo da Biologia Sintética e Biotecnologia.

Mestrado em Biologia Molecular e Celular Alternative polyadenylation (APA) is an important mechanism of gene regulation that occurs in 70% of eukaryotic organisms. This process comprises the formation of alternative 3’ ends of an mRNA by cleavage of the pre-mRNA and polyadenylation at different sites according to the polyadenylation signals (pAs). The choice of pAs in APA is a co-transcriptional mechanism that depends on auxiliary cis- and trans-acting factors. The usage of the proximal or the distal pAs has been related to global physiologic events. It is consensually assumed that in proliferative conditions there is preferential usage of proximal pAs, while during development and in differentiated cellular states occurs lengthening of the 3’UTRs by selection of the distal pAs. This pattern is also confirmed in brain tissues, where most of the cells are differentiated, and where it was observed a lengthening of the 3’ UTRs. However, there is not a complete switch for the distal pA, since the shortest mRNA is still expressed. Rho GTPases are key molecular switchers essential for several cellular processes, including differentiation, however nothing is known about transcriptional regulation in these genes. Therefore, we started to explore if Rho GTPases genes undergo APA. We found by 3’RACE analyses, that classical Rho GTPAses express two alternative mRNA isoforms. However during oligodendrocytes differentiation, they preferentially express the shortest mRNA isoform, and we did not observe a switch towards the distal pA usage, in contrast with the published genome-wide data obtained from brain tissues. Since Rho GTPases are tightly regulated at the protein level by GEFs and GAPs, they may not require this mode of co-transcriptional regulation. The atypical RhoBTB2, which is constitutively active, present a global induction of distal pA sites, distinct from the classical Rho GTPases. Interestingly, this pattern suggests that APA is a gene specific mechanism. As longer 3'UTRs contain more binding sites for miRNAs and RNA binding proteins (RBPs) this suggests that atypical Rho GTPases require a fine-tune regulation at the co-transcriptional level, by APA. Additionally, we showed that APA is also cell-specific, by analyzing the expression of the different mRNA isoforms of Rho GTPases in other glial cells (microglia, astrocytes) and different types of neurons (cortical, striatal and hippocampal). We observed the same APA profile for the selected Rho GTPases in all glial cells types. However, in cortical and striatal neurons we observed a lengthening in the 3’UTR Rac1 mRNA during axonal growth, which results in the increase of the total protein levels. Taken together, our results indicate for the first time that APA is a gene- and cell- specific mechanism. In addition, we have found a differential expression of both Cdc42 isoforms during OL and sciatic nerve differentiation. During in vitro OL and in vivo sciatic nerve differentiation we observed an increase in the expression ratio between Cdc42 Iso1/Cdc42 Iso2. Further, constitutive expression of Cdc42 Iso2 in OLs induces a delay in differentiation, whereas constitutive expression of Cdc42 Iso1 induces an increase in OL branching, suggesting an exacerbation of the differentiated phenotype. Thus, these observations suggest a distinct role for the different Cdc42 isoforms during OL differentiation. Overall, this thesis opens new avenues to explore in the future that can impact our understanding on the regulation of the myelination/remyelination processes. A poliadenilação alternativa (APA) é um mecanismo importante de regulação genética que ocorre em 70% dos organismos eucariotas. Este mecanismo compreende a formação de extremidades 3’ alternativas por poliadenilação em diferentes locais do mRNA, de acordo com os sinais de poliadenilação (pAs). Na APA, a escolha dos pAs é um mecanismo co-transcripcional que depende de factores auxiliares cis e trans necessários para os processos de clivagem e poliadenilação de todos os pré-mRNAs. Além disso, o uso dos pAs proximais ou distais está relacionado com eventos fisiológicos gerais. Consensualmente assume-se que em estados de proliferação ocorre o encurtamento, enquanto em estados de desenvolvimento e diferenciação ocorre o alongamento das extremidades 3’ não traduzidas (3’UTRs). Este padrão de APA é confirmado em tecidos cerebrais, onde a maior parte das células são diferenciadas, no entanto não existe uma alteração completa para a isoforma de mRNA longa uma vez que a isoforma curta continua a ser expressa. As Rho GTPases são ‘interruptores’ moleculares essenciais a vários processos celulares, incluindo a diferenciação, no entanto nada é conhecido sobre a sua regulação transcripcional. Assim, começamos a explorar se estes genes são regulados por APA. Descobrimos por análise de 3´RACE que, as Rho GTPases clássicas, expressam duas formas alternativas de mRNA. Contudo durante a diferenciação dos oligodendrócitos (OLs), eles expressam preferencialmente a isoforma mRNA mais curta, e não se observou uma alteração para a escolha da isoforma mais longa, em contraste com os dados de estudos globais do genoma em tecido cerebral. Uma vez que estas proteínas são altamente reguladas por GEFs e por GAPs, provavelmente não necessitam de regulação a nível transcripcional. As Rho GTPases atípicas, que estão constitutivamente activas, apresentam um indução global dos pAs distais, distintas das Rho GTPases clássicas. Curiosamente, este padrão sugere que APA é um mecanismo específico do gene. Como 3’UTRs mais longas providenciam mais locais de ligação para microRNA ou proteínas de ligação ao RNA (RBPs), isto sugere que as Rho GTPases atípicas requerem uma regulação mais fina ao nível co-transcriptional, por APA. Adicionalmente, mostramos que a APA é também específica de cada tipo celular, pela análise da expressão do mRNA em outras células da glia (microglia, astrócitos), e em diferentes tipos de neurónios (corticais, estriatais e hipocampais). Nós observamos o mesmo padrão de APA para as Rho GTPases selecionadas em todas as células da glia. No entanto, em neurónios corticais e do estriado, observámos a existência do alongamento do 3’UTR no mRNA da Rac1 durante o crescimento axonal, o que resulta num aumento da quantidade total de proteína. Em resumo, estes resultados indicam, pela primeira vez, que a APA é um mecanismo específico de cada gene e de cada tipo celular. Para além disso, descobrimos uma expressão diferencial de ambas as isoformas da Cdc42 durante a diferenciação dos OLs e do nervo ciático. Durante a diferenciação in vitro de OLs e in vivo do nervo ciático, observámos um aumento do rácio da expressão entre Cdc42 Iso1/Cdc42 Iso2. Mais ainda, a expressão constitutiva de Cdc42 Iso2 em OLs induz um atraso na diferenciação, enquanto a expressão constitutiva da Cdc42 Iso1 induz um aumento das ramificações, sugerindo uma exacerbação do fenótipo de diferenciação. Assim, estas observações sugerem um papel distinto para as diferentes isoformas de Cdc42 durante a diferenciação de OLs. Globalmente, esta tese abre novos caminhos para explorar no futuro, que podem ter um impacto no nosso conhecimento, na regulação do processo de mielinização/remielinização.

Mestrado em Biologia Molecular e Celular Submitted by Daisy Tavares (daisytavares@ua.pt) on 2015-11-09T15:37:55Z No. of bitstreams: 1 TESE.pdf: 2261008 bytes, checksum: d98fc62cac9c8dbb31474e19853e75a5 (MD5) Made available in DSpace on 2015-11-09T15:37:56Z (GMT). No. of bitstreams: 1 TESE.pdf: 2261008 bytes, checksum: d98fc62cac9c8dbb31474e19853e75a5 (MD5) Previous issue date: 2014-12

Mestrado em Biologia Molecular e Celular Submitted by Alexandra Bastos (alexandrabastos@ua.pt) on 2015-04-08T18:54:30Z No. of bitstreams: 1 tese.pdf: 4654266 bytes, checksum: e8863d04fff205c6cfefd42d7a4bd7ff (MD5) Made available in DSpace on 2015-04-08T18:54:30Z (GMT). No. of bitstreams: 1 tese.pdf: 4654266 bytes, checksum: e8863d04fff205c6cfefd42d7a4bd7ff (MD5) Previous issue date: 2014-07-10

Mestrado em Biologia Molecular e Celular T cell receptor recognition of peptide-MHC expressed on antigen presenting cells (APC) involves the formation of a tight cell-cell contact area, named immunological synapse. Upon successful T cell activation, several signal transduction pathways are triggered culminating with the induction of gene transcription. The T cell surface glycoprotein CD5, an inhibitor of TCR signaling, is one of the molecules that targets to the immunological synapse upon T cell activation, although no ligand in the APCs has yet been discovered. We have determined that a sequence containing two tyrosine residues (Y429 and Y441) within the cytoplasmic domain of CD5 is determinant both in the inhibitory function as well as in the synaptic localization of the molecule. In the current project we dissect the role of each of the two tyrosine residues in the modulatory properties of CD5. For this purpose, tyrosine-to-phenylalanine substitutions were introduced in the CD5 molecule, which was expressed in a CD5- negative T cell line. These mutants will be relevant for unveiling the molecular mechanisms induced upon T cell receptor-mediating triggering, such as intracellular phosphorylation, calcium signals and proliferation. Our results in calcium and proliferation assays confirm the inhibitory role of the ITAM sequence, and more precisely, of the Y429 residue, although the other tyrosine may also play a somewhat lesser part. These mutants will also be analyzed by fluorescence microscopy for their ability to translocate to the immunological synapse upon T cell interaction with superantigen-loaded APCs. An additional CD5 mutant, one devoid of the extracellular domain, will also be monitored and will determine the requirement for an APCexpressed ligand to induce CD5 translocation to the synapse. We found two new putative intracellular binding partners that can be part of, and help assembling, CD5 signalosomes. In vitro studies show that CD5 can associate with the adapter protein Crk, maybe acting as a bridge to other protein-protein interactions. On the other hand, the calcium-binding protein S100A4 also associates with CD5, Fyn and Lck. We hypothesized that S100A4 controls Lck-dependent Tcell proliferation and Fyn-dependent differentiation of T helper subsets through a CD5-dependent mechanism, highlighting once again a putative role of CD5 as a molecular switch. In the future, CD5 can be used as a therapeutic target in order to modulate immune responses. O reconhecimento por parte do receptor de células T (TCR) de péptidos processados e apresentados pelas células apresentadoras de antigénios (APC) via MHC envolve a formação de uma zona de contacto célula-célula, chamada sinapse imunológica. Após ativação das células T, diversas vias de sinalização celular são ativadas culminando na indução de transcrição génica. A glicoproteína de superfície, CD5, é considerada um inibidor da ativação via TCR, sendo uma das primeiras moléculas a ser recrutada para a sinapse imunológica após ativação da célula T. No entanto, até ao momento nenhum ligando na célula apresentadora de antigénios foi devidamente identificado e aceite como sendo o ligando do CD5. No nosso grupo, foi estabelecido que a sequência da cauda citoplasmática do CD5 que contém dois resíduos de tirosina (Y429 e Y441) é determinante para a sua função inibitória bem como para a translocação desta molécula para a sinapse imunológica. Neste projeto, propomos dissecar o papel de cada uma destas duas tirosinas nas propriedades modulatórias do CD5. Com esse propósito, foram introduzidas substituições na molécula do CD5, substituindo cada uma das referidas tirosinas por fenilalaninas. Estes mutantes foram expressos numa linha celular negativa para a expressão de CD5 endógeno e ajudarão a desvendar os mecanismos moleculares induzidos após ativação das células T e através dos quais o CD5 exerce o seu papel inibitório, avaliando por exemplo, fosforilação intracelular, fluxos de cálcio, e proliferação. Os nossos resultados nos ensaios de cálcio e de proliferação vieram confirmar o papel inibitório do pseudo-ITAM e, mais precisamente, da tirosina Y429. Estes mutantes serão também analisados por microscopia de fluorescência para avaliar a sua responsabilidade na mobilização do CD5 para a sinapse imunológica. Adicionalmente, será também monitorizada esta mobilização num mutante desprovido da porção extracelular, de forma a determinar a necessidade de estimulação por parte de um ligando expresso na célula apresentadora de antigénios. Um dos nossos resultados pioneiros mostram uma associação entre o CD5 e a proteína adaptadora Crk, que poderá funcionar como uma ponte para outras interações. A proteína dependente de cálcio S100A4 também se associa com CD5 bem como a Fyn e Lck, levando-nos a propor que S100A4 controla os mecanismos de proliferação e de diferenciação de populações de células T auxiliares, dependentes de Lck e de Fyn, respetivamente, através de um mecanismo dependente do CD5. No futuro, CD5 poderá ser usado como alvo terapêutico com o objetivo de modular a resposta imune.

Mestrado em Biologia Molecular e Celular Submitted by Alexandra Bastos (alexandrabastos@ua.pt) on 2016-03-23T18:43:42Z No. of bitstreams: 1 tese.pdf: 2716291 bytes, checksum: 9f05ac3282d949e344a99a5dd52a8e1d (MD5) Made available in DSpace on 2016-03-23T18:43:42Z (GMT). No. of bitstreams: 1 tese.pdf: 2716291 bytes, checksum: 9f05ac3282d949e344a99a5dd52a8e1d (MD5) Previous issue date: 2015-01-09

Mestrado em Biologia Molecular e Celular Pulmonary arterial hypertension (PAH) is a syndrome based on diverse aetiologies, characterized by a persistent increase in pulmonary vascular resistance and overload of the right ventricle (RV), leading to heart failure (HF) and death. Urocortin (UCN)-2 is a peptide highly expressed in the cardiovascular system that has shown promising therapeutic effects in several studies both in humans and animal models of HF. Thus, this study aims to explore the effects of UCN-2 treatment in an animal model of RV HF secondary to PAH and its impact on myocardial function. Male Wistar rats (180-200g) randomly received monocrotaline (MCT, 60mg/kg) or vehicle. After 14 days, animals were randomly assigned to receive UCN-2 treatment (5μg/kg/day) or vehicle. The study resulted in 4 groups: CTRL (n=9), CTRL+UCN-2 (n=9), MCT (n=7) and MCT+UCN-2 (n=10). Echocardiographic, hemodynamic studies and sample collection were performed 24-25 days after MCT administration. Only significant results (mean±SEM, p

Mestrado em Biologia Molecular e Celular The human pathogen Candida albicans is characterized by the presence of a hybrid tRNA (tRNACAGSer) that can be aminoacylated by both LeuRS and SerRS. This tRNA is responsible for the ambiguity of the CUG codon that can be decoded as serine (97%) and Leucine (3%). Previous studies showed that the level of ambiguity is variable depending on the growth condition of the fungus. These studies also revealed that strains mistranslating at a higher level grew better in the presence of azoles, particularly in the presence of fluconazole. To analyse the effect of translation errors on the acquisition of drug resistance, three strains of C. albicans were used (T0, T1 and T2). These strains have increasing levels of Leu misincorporation and were constructed by inserting a copy (T1) or two copies (T2) of a tDNACAG Leu gene. These strains were evolved experimentally in the presence and absence of the antifungal agent according to the approved EUCAST protocol. The level of ambiguity of all strains was measured along the evolution experiment, using a reporter system based on the green fluorescent protein (GFP). Finally, the type of acquired resistance was also evaluated (genetic or phenotypic resistance). Experimental data suggest that the acquisition of resistance is dependent on the drug and the percentage of mistranslation. Strains with increased mistranslation (T2) acquired more resistance (256 μg/ml) and faster than the control T0. Mutations in ERG11 gene might be responsible for this resistance. Also, T2 strain showed a decrease in the mistranslation level during both evolution experiments (with and without drug) as a consequence of the deletion of one of the two copies of the mutant tDNACAG Leu gene. This result further highlights the genetic instability of strain T2. O fungo patogénico Candida albicans tem a particularidade de possuir um tRNA (tRNACAGSer) híbrido que é aminoacilado pelas sintetases SerRS e LeuRS. Esta característica é responsável pela ambiguidade do codão CUG que é decodificado como Ser (97%) e como Leu (3%). Estudos anteriores demonstraram que o nível de ambiguidade é variável dependendo da condição de crescimento do fungo e revelaram que estipes com maior erro de tradução crescem melhor na presença de azoís, particularmente em meio com fluconazol. Para analisar os efeitos dos erros de tradução na aquisição de resistência a drogas, construímos três estirpes de C. albicans (T0, T1 e T2) com níveis crescentes de incorporação de Leucina, inserindo uma cópia (T1) ou duas cópias (T2) do gene tDNACAG Leu. Estas estirpes foram evoluídas experimentalmente na presença e na ausência de fluconazol de acordo com o protocolo da EUCAST. O nível de ambiguidade destas estirpes foi avaliado durante o período da evolução usando um sistema reporter baseado na proteína fluorescente GFP. Finalmente foi também avaliada o tipo de resistência adquirida pelas estirpes ambíguas (resistência genética ou fenotípica). Os dados experimentais sugerem que a aquisição de resistência depende da droga e da percentagem do erro de tradução. As estirpes com maior erro de tradução (T2) adquirem mais resistência (256 μg/ml) e mais rapidamente sendo que mutações no gene ERG11 poderão ser responsáveis por essa resistência. Esta estirpe apresentou também um decréscimo da taxa de erro de tradução em ambas as evoluções (com e sem droga), resultado da deleção de uma das duas cópias do gene tDNACAG Leu. Este resultado reforça a instabilidade genética da estirpe T2.

Mestrado em Biomedicina Molecular Protein phosphatase 1 (PP1) is an ubiquitously expressed serine/threonine protein phosphatase with high expression levels in brain. PP1 is involved in many biological processes and signalling pathways and its specific function is determined by the binding of PP1 catalytic subunit to many regulatory subunits, called PP1 interacting proteins (PIPs). This interaction is mediated through specific amino acid sequences, the PP1 binding motifs, as RVxF motif. PP1 is encoded by three different genes: PPP1CA, PPP1CB and PPP1CC that encode PP1alpha, PP1beta/delta and PP1gamma. The later undergoes alternative splicing to give rise to PP1gamma1 and PP1gamma2. These isoforms differ in the C- and N-terminal domains and have distinct tissue distribution and subcellular localization. Recent data from our laboratory established both BRI2 and BRI3, members of a family of integral type II transmembrane glycoproteins, as PIPs and confirmed the presence of RVxF motifs in both proteins, KVTF and KISF for BRI2 and BRI3, respectively. Short hairpin RNA (shRNA) is a form of Ribonucleic acid interference (RNAi) artificially produced that consists of a small sequence of double stranded DNA with an hairpin loop and uses host machinery to silence or knockdown specific genes through degradation of its mRNA sequence, thereby preventing its translation. Knockdown of human PP1alpha and PP1gamma was induced in human neuroblastoma cells, through shRNA interference strategy in order to mimic the cellular behaviour in the absence of PP1alpha and PP1gamma and observe its effects on BRI2 and BRI3 expression. The transfection procedure was optimized and, through immunoblotting, we concluded that the best interference efficiency was obtained at 48 hours upon transfection of 3.5 μg of DNA using TurboFect reagent. Once more through immunoblotting, we verified that PP1alpha and PP1gamma knockdown might interfere with BRI2 and BRI3 processing. Additionally, fluorescent constructs of PP1alpha and PP1gamma1 isoforms were generated through PCR subcloning, using DsRed-Monomer vector. These constructs will be particularly important for future in vivo studies for the characterization of PP1:BRI complexes. A proteína fosfatase 1 (PP1) é uma proteína fosfatase específica para resíduos de serina e treonina que apresenta elevados níveis de expressão no cérebro. A PP1 está envolvida em vários processos biológicos e cascatas de sinalização e a sua função é determinada pela ligação da subunidade catalítica da PP1 com várias subunidades reguladoras (PIPs). Esta interação é mediada através de sequências de aminoácidos específicas designadas de motivos de ligação à PP1, como o motivo RVxF. As isoformas da PP1 são codificadas por três genes: PPP1CA, PPP1CB e PPP1CC que codificam a PP1alfa, PP1beta/delta e PP1gama. O último sofre splicing alternativo e origina as isoformas PP1gama1 e PP1gama2. Estas isoformas diferem nos domínios N- e Cterminal e apresentam distribuição tecidual e localização subcelular distintas. Estudos recentes realizados no nosso laboratório demonstraram que as proteínas BRI2 e BRI3, membros de uma família de glicoproteínas integrais transmembranares tipo II, interagem com a PP1 e confirmaram a presença de motivos RVxF em ambas as proteínas, KVTF e KISF para a BRI2 e BRI3, respectivamente. Short hairpin RNA (shRNA) é uma forma de RNA de interferência (RNAi) produzido artificialmente que consiste numa pequena sequência de DNA de cadeia dupla com um hairpin loop e que utiliza a maquinaria da célula hospedeira para silenciar ou provocar knockdown de genes específicos através da degradação da sequência de RNA mensageiro, impedindo assim a tradução. Knockdown das proteínas humanas PP1alpha e PP1gamma foi induzido em células de neuroblastoma humanas através da estratégia de shRNA de interferência, para mimetizar o comportamento da célula na ausência de PP1alpha e PP1gamma e para observar os seus efeitos na expressão das proteínas BRI2 e BRI3. O procedimento de transfeção foi optimizado e, através de immunoblotting, concluímos que a melhor eficiência de interferência foi obtida 48 horas após transfeção de 3.5 μg de DNA, com TurboFect. Novamente por immunoblotting, verificámos que o knockdown da PP1alfa e PP1gamma poderá interferir no processamento da BRI2 e BRI3. Adicionalmente, foram produzidos, através de PCR subcloning, constructs fluorescentes das isoformas PP1alpha e PP1gamma1 utilizando o vector DsRed-Monomer. Estes constructs serão particularmente importantes para estudos futuros in vivo para caracterização dos complexos PP1:BRI.

Mestrado em Biologia Molecular e Celular Submitted by Alexandra Bastos (alexandrabastos@ua.pt) on 2016-03-18T16:31:55Z No. of bitstreams: 1 tese.pdf: 2304643 bytes, checksum: 0f85cd099d12317d333a36f05b30edc3 (MD5) Made available in DSpace on 2016-03-18T16:31:55Z (GMT). No. of bitstreams: 1 tese.pdf: 2304643 bytes, checksum: 0f85cd099d12317d333a36f05b30edc3 (MD5) Previous issue date: 2015-01-08

Mestrado em Biologia Molecular e Celular Lichenicidin is a class II lanthipeptide composed by two peptides, Bliα and Bliβ, that is produced by several strains of Bacillus licheniformis. These peptides act synergistically in order to inhibit the growth of other Gram positive bacteria. Due to their antibacterial activity, they are also designated lantibiotics. Unlike other antimicrobial peptides produced by bacteria, lantibiotics are ribosomally synthesized as an immature peptide and suffer several post-translational modifications to achieve their active form. Thus, it is easier the application of bioengineering strategies aiming the creation of new variants with different bioactivity. The aims of this study were: i) the development a heterologous expression system for the production of lichenicidin allowing a white/blue selection and using E. coli, ii) the generation of two random mutagenesis libraries for each one of the lichenicidin peptides and iii) the selection and analysis of clones with reduced bioactivity when compared with the control. To develop the heterologous system, preliminary tests were conducted that allowed the selection of E. coli Mach1 as the recipient strain. In addition, 37 ºC was established as the best temperature for lichenicidin production. Thus, two random mutagenesis libraries of the structural genes licA1 and licA2, encoding the precursor peptides of Bliα and Bliβ, respectively. Subsequently, the bioactivity of around 4000 clones of each library was analyzed by colony-agar bioassay. In the present study, colonies with improved activity were not possible to detect in any of the libraries. Regarding the Bliα library, about 4,5 % of the clones showed null bioactivity, while 2,6 % and 2,2 % of the clones showed very reduced and activity reduced to half when compared with the control, respectively. In the Bliβ library, the values were very similar since about 5,1 % of the clones showed no bioactivity, 1,4 % showed very reduced activity and 3,8 % had activity reduced to half when compared with the control. Some of these clones were selected for sequencing reaction in order to identify the mutations causing the observed phenotypes. This analysis confirmed the importance of the conserved residues for the bioactivity of both peptides. Moreover, it was found that substitutions involving charged amino acids and prolines result in the production of inactive peptides. A lichenicidina é um lantipéptido da classe II constituído por dois péptidos, Bliα e Bliβ, produzido por diversas estirpes de Bacillus licheniformis. Estes péptidos atuam sinergisticamente, de forma a inibirem o crescimento de outras bactérias de Gram positivo, sendo por isso também designados de lantibióticos. Ao contrário de outros compostos antimicrobianos produzidos por bactérias, os lantibióticos são produzidos na sua forma imatura diretamente pelo ribossoma e sofrem diversas alterações pós-traducionais, que os tornam péptidos ativos. Desta forma, torna-se mais fácil a aplicação de técnicas de bioengenharia de modo a obter novas variantes com bioatividade alterada. Os objetivos deste trabalho foram i) a construção de um sistema de expressão heteróloga da lichenicidina em E. coli que permitisse a seleção azul/branco, ii) a construção de uma biblioteca por mutagénese aleatória para cada um dos péptidos que constituem a lichenicidina e iii) a seleção e análise de clones com bioatividade reduzida relativamente ao controlo. Para a criação do sistema de expressão heteróloga, foram realizados vários ensaios preliminares, que levaram à seleção da estirpe E. coli Mach1 como recetora assim como à seleção da temperatura de produção de 37 ºC. Assim sendo, foram construídas duas bibliotecas por mutagénese aleatória dos genes estruturais licA1 e licA2, que codificam os péptidos percursores de Bliα e Bliβ, respetivamente. Subsequentemente, a bioatividade de cerca de 4000 clones de cada biblioteca foi analisada através de bioensaio em agar. Através desta análise, não foi possível detetar nenhum clone com bioatividade aumentada em ambas as bibliotecas. Relativamente à biblioteca do péptido Bliα, cerca de 4,5 % dos clones apresentaram bioatividade nula, enquanto que 2,6 % e 2,2 % dos clones apresentaram atividade muito reduzida e atividade reduzida a metade quando comparada com o controlo, respetivamente. Na biblioteca do péptido Bliβ, os valores foram bastante semelhantes, com cerca de 5,1 % dos clones a exibir atividade nula, 1,4 % com atividade muito reduzida e 3,8 % com atividade reduzida a metade quando comparada com o controlo. A sequência dos genes estruturais de alguns destes clones foram analisados, com o objetivo de identificar as alterações responsáveis por estes fenótipos. Esta análise confirmou a importância dos resíduos conservados para a bioatividade dos dois péptidos. Foi também possível reconhecer que substituições envolvendo aminoácidos carregados e prolinas resultam na produção de péptidos inativos.