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Submitted by Boris Flegr (boris@uerj.br) on 2021-01-07T15:14:11Z No. of bitstreams: 1 TESE_FINAL_PUBLICADA_Thais_Bezerra_Ferreira.pdf: 14103897 bytes, checksum: dc92fed50b3a2044f991ca570e4d454d (MD5) Made available in DSpace on 2021-01-07T15:14:11Z (GMT). No. of bitstreams: 1 TESE_FINAL_PUBLICADA_Thais_Bezerra_Ferreira.pdf: 14103897 bytes, checksum: dc92fed50b3a2044f991ca570e4d454d (MD5) Previous issue date: 2017-10-06 Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior Multiple sclerosis is an autoimmune, demyelinating disease, of the Central Nervous System, in which the onset and severity depends on the influence of environmental factors, including psychological stress and infections, on the immune system of individuals with genetic predisposition to the disease. In light of that, in our first paper, we observed that the in vitro blockage of IL-6 receptor, using anti-IL-6R IgG, reduced the Th17-related cytokines production. In addition, the ability of supernatants from lipolyssacharide (LPS)-activated monocytes cultures, in increasing IL-17 production and reducing IL-10 levels by autologous CD4+ T cells was abolished after neutralization of IL-6R signaling in these phagocytes' cultures. Interestingly, the addition of this monoclonal antibody increased the ability of hydrocortisone in inhibiting proliferation and IL-17 production by CD4+ and CD8+ T cells from MS patients. In our second paper, we observed that the stress-related dopamine levels, by IL-6-depending mechanisms, elevated the cytokine production by CD4+ T cells with an encephalitogenic profile and hydrocortisone-resistance. In our third and last paper, an elevated percentage of circulating CD4+ and CD8+ T cells capable of expressing toll-like receptors (TLR)2, TLR4 and TLR9 was detected in MS patients samples as compared to the control group. Among these cells, the subtypes of CD4+ and CD8+ T lymphocytes able to produce IL-17 with along IL-6 or IFN-gamma were positively related with the number of active brain lesions and the neurological disability. When CD4+ and CD8+ T cells were maintained in the presence of TLR ligands alone, greater levels of Th17-related cytokines were dosed at the supernatants of cell cultures stimulated with the TLR2L, Pam3CSK4. In these cell cultures, the levels of IL-6 and IL-17 in response to Pam3CSK4 were positively related to clinical parameters of the disease. Finally, CD4+ T cells cultures from patients with severe MS symptoms released higher levels of GM-CSF and IFN-gamma. Collectively, our findings suggest that IL-6 has an important role in MS immunopathogenesis and the production of this cytokine, as well as others Th17-related ones, are increased by dopamine and different PAMPs. The findings obtained here help not only to explain how psychological stress and infectious diseases are considered risk factors for MS, but they offer information that could aid in the development of new therapeutic strategies. A esclerose múltipla (EM) é uma doença desmielinizante, de caráter autoimune, do sistema nervoso central, cujo o desenvolvimento e gravidade dependem da influência de fatores ambientais, incluindo estresse psicológico e infecções, no sistema imune de indivíduos com predisposição genética para a doença. Os mecanismos pelos quais esses fatores impactam negativamente na EM podem estar relacionados ao favorecimento de vias de ativação e expansão de clones de linfócitos T encefalitogênicos. Diante do exposto, em nosso primeiro artigo, observamos que o bloqueio in vitro do receptor de IL-6 reduziu a produção de citocinas relacionadas ao perfil Th17. Ademais, a capacidade dos sobrenadantes de monócitos, ativados com lipopolissacarídeo (LPS), em potencializar a produção da IL-17 e reduzir os níveis de IL-10 pelas células T CD4+ de pacientes com EM foi anulada após a neutralização da sinalização via IL-6R nas culturas desses fagócitos. De forma interessante, a adição desse anticorpo monoclonal potencializou a capacidade da hidrocortisona (HC) em inibir a proliferação e produção de IL-17 pelas células T CD4+ e T CD8+ dos pacientes com EM. No segundo artigo, nós observamos que níveis de dopamina relacionados ao estresse, por mecanismos dependentes da IL-6, elevaram a produção de citocinas por células T CD4+ com perfil encefalitogênico e resistentes à HC. Em nosso último artigo, elevada percentagem de células T CD4+ e T CD8+ circulantes capazes de expressar receptores do tipo Toll (TLR)2, TLR4 e TLR9 foram detectadas no sangue periférico dos pacientes com EM quando comparado ao grupo controle. Dentre essas células, os subtipos de células T CD4+ e T CD8+ capazes de produzir simultaneamente IL-17 com IL-6 ou com IFN-γ foram diretamente associados ao número de lesões cerebrais ativas e grau de incapacidade neurológica. Quando as células T CD4+ e T CD8+ foram mantidas na presença apenas de ligantes de TLR (TLR-L), maiores níveis de citocinas relacionados ao fenótipo Th17 foram dosados nos sobrenadantes recolhidos nas culturas estimuladas com TLR2-L, o Pam3CSK4. Nessas culturas, os níveis de IL-6 e IL-17 em resposta ao Pam3CSK4 foram diretamente correlacionados aos parâmetros clínicos da doença. Finalmente, culturas de células T CD4+ dos pacientes com EM mais grave responderam ao agonista de TLR2 liberando elevados níveis de GM-CSF e IFN-γ. Coletivamente, nossos achados sugerem que a IL-6 exerce um papel importante na imunopatogênese da EM, sendo a produção dessa citocina, assim como de outras relacionadas a diferentes subtipos de células Th17, elevada pela dopamina e diferentes padrões moleculares associados a patógenos. Os achados obtidos aqui ajudam não apenas a explicar como o estresse psicológico e doenças infecciosas são considerados fatores de risco para a EM, como também podem ajudar na criação de novas estratégias terapêuticas.

Submitted by Boris Flegr (boris@uerj.br) on 2021-01-05T19:42:24Z No. of bitstreams: 1 Andrezza do Espirito Santo Cucinelli Dissertacao completa.pdf: 2380711 bytes, checksum: 0cff40d64e6dff4207d8ddf3e2168317 (MD5) Made available in DSpace on 2021-01-05T19:42:24Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Andrezza do Espirito Santo Cucinelli Dissertacao completa.pdf: 2380711 bytes, checksum: 0cff40d64e6dff4207d8ddf3e2168317 (MD5) Previous issue date: 2016-12-21 Diphtheria is an acute and immunopreventable disease caused by Corynebacterium diphtheriae. Besides classical diphtheria, C. diphtheriae has also been isolated from invasive infections, mainly caused by non-toxigenic strains, revealing the involvement of other virulence factors. The sequencing of the first pangenomic study of this species allowed the identification of 57 genomic islands, with highly differentiated genetic content, suggesting the horizontal transference of genetic material, and those differences could be involved in host-parasite interaction. The importance of hemolysins on the virulence of different bacterial species has been emphasized in the literature, alongside its possibility of transference between bacterial strains. Some C. diphtheriae strains may produce hemolysins, and some authors have classified C. diphtheriae strains according to its hemolytic activity. Nevertheless, little is still known about the virulence associated to hemolytic activity in C. diphtheriae, and this is the proposal of this investigation. At first, we have investigated the presence of putative protein sequences related to cytotoxin/hemolysin in the sequenced NCTC 13129, as a model to search for the sequences in other sequenced Brazilian strains deposited in NCBI; to predict the tridimensional structure and analyze the functional similarity to hemolysins of other species; to design primers and to evaluate the amplification after PCR reactions, and to construct a mutant strain through homologous recombination. The influence of this gene on the pathogenicity was evaluated based on hemolytic activity assays, interaction on both biotic an non-biotic surfaces, and evaluation of the strain to cause hematogenous infection and bone infection, in vivo, using mice model. The codifying sequence of hemolysin DIP 1180, was found in the wild type strain, and presented high similarity with other C. diphtheriae strains deposited in NCBI. The tridimensional structure was very similar to hemolysins of Streptococcus genera, reinforcing the probable hemolytic activity. The gene truncation by homologous recombination in the gene dip1180, demonstrated the hemolytic properties was related to the expression of this gene in C. diphtheriae. Non-toxigenic C. diphtheriae strains presented an intense hemolytic activity when compared to toxigenic strains. Capnophilic environment appeared to favor the hemolytic activity, except to non-hemolytic strains MA 136 and the mutant LDCIC-A1. A reduction in the capability to adhere to polystyrene and glass and to form biofilm was observed in the mutant LDCIC-A1 strain, demonstrating the influence of this gene in biofilm production. Iron deprivation in the culture medium was able to promote a significant reduction in biofilm production, demonstrating the relevance of this ion in the adhesion of C. diphtheriae, regardless of the presence of both tox and dip1180 genes. The in vivo analysis of the influence of the dip1180 gene on the arthritogenic activity of C. diphtheriae demonstrated a noticeable reduction in the severity of the lesions presented by the mice infected with the mutant strain. The data obtained indicate the important contribution of the dip1180 gene to the virulence of C. diphtheriae strains, especially in non-TD producing strains, which have long been neglected and associated with increasing frequency of invasive infections. A difteria é uma doença infectocontagiosa, imunoprevenível e de evolução aguda causada, principalmente, pelo Corynebacterium diphtheriae. Além da difteria clássica, o bacilo diftérico tem sido isolado de quadros de infecções invasivas atípicas, associadas a cepas não produtoras de toxina diftérica (TD), indicando o envolvimento de outros fatores de virulência. O primeiro pangenoma desta espécie permitiu identificar 57 ilhas genômicas, com conteúdo gênico altamente diferenciado, evidenciando indícios de transferência gênica horizontal, podendo esta ser uma estratégia para estabelecer diferenças nas interações hospedeiro-patógeno. A importância das hemolisinas na virulência de diferentes espécies bacterianas tem sido cada vez mais enfatizada na literatura, especialmente por serem passíveis de transferência. Algumas cepas de C. diphtheriae podem ser produtoras de hemolisinas, uma vez que são classificadas quanto a atividade hemolítica. Contudo, pouco se sabe sobre sua virulência, sendo este o propósito deste trabalho. Inicialmente, foi avaliada a presença de possíveis sequências gênicas codificadoras de hemolisinas em C. diphtheriae. Foi encontrada a sequência de uma proteína com função de citotoxina/hemolisina na cepa NCTC13129, utilizada como modelo para: encontrar sequências nas demais cepas desta espécie; prever a estrutura tridimensional e a semelhança funcional com proteínas de outras espécies; confeccionar primers para avaliação in vitro, através de PCR e construir cepa mutante, por recombinação homóloga. A influência deste gene na patogenicidade da espécie foi avaliada a partir de ensaios sobre a atividade hemolítica, interação em superfícies bióticas e abióticas e avaliação da capacidade de causar infecção hematogênica e do osso, in vivo, utilizando camundongos. A sequência codificante da hemolisina DIP1180, encontrada na cepa selvagem, apresentou elevada similaridade nas demais cepas desta espécie, com estrutura tridimensional altamente similar a de hemolisinas de espécies do gênero Streptococcus, reiterando sua possível atividade hemolítica. Através do truncamento do gene dip1180, foi possível demonstrar a dependência da atividade hemolítica em relação à expressão deste gene em C.diphtheriae. Cepas não produtoras de TD apresentaram atividade hemolítica mais intensa. A condição de microareofilia pareceu favorecer a hemólise, exceto para as cepas não hemolíticas, MA 136 e cepa mutante LDCIC-A1. A redução na capacidade de aderir ao poliestireno e ao vidro, observada na cepa mutante demonstrou a influência deste gene na produção de biofilme. No entanto, a privação de ferro no meio de cultivo foi capaz de promover uma expressiva redução na produção de biofilme demonstrando a relevância deste íon na aderência de C. diphtheriae, independente da presença dos genes tox e dip1180. A análise in vivo da influência do gene dip1180 sobre a atividade artritogênica de C. diphtheriae, demonstrou uma redução perceptível da gravidade das lesões apresentadas pelos camundongos infectados com a cepa mutante. Os dados obtidos indicam a importante contribuição do gene dip1180 para a virulência de cepas de C. diphtheriae, sobretudo naquelas não produtoras de TD, por muito tempo negligenciadas e relacionadas com frequência crescente a infecções invasivas.