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Biofilmes multiespécies formados em equipamentos na indústria do leite resultam em diversos problemas na qualidade dos produtos, para a saúde dos consumidores, além de prejuízos financeiros. O objetivo do presente trabalho foi avaliar a influência dos fatores como temperatura e nutrientes na estrutura e composição química do biofilme multiespéciess bacteriano utilizando técnicas microscópicas e espectroscopia vibracional. Buttiauxella agrestis, Rahnella inusitata, Pseudomonas fluorescens, Staphylococcus aureus, Lactococcus laudensis e Lactococcus garviae, isolados de biofilmes formados na presença de leite cru a 7 °C, foram avaliados quanto a capacidade de formação de biofilme em microplacas de poliestireno contendo leite em pó reconstituído (LDR) a 1% e 10% como meio de cultivo, às temperaturas de 7 °C e 25 °C. Os melhores formadores de biofilmes individuais e multiespécies nas condições avaliadas foram P. fluorescens e S. aureus e estas espécies foram selecionadas para a continuidade dos estudos. Biofilmes em cultura pura ou em co-cultivo de P. fluorescens e S. aureus foram formados a 7 °C em superfície de aço inoxidável por 10 dias. O meio de cultivo e inóculo foram trocados a cada dois dias e foram feitas análises de quantificação de células aderidas, observação em microscópio de epifluorescência e de varredura e, a composição do biofilme foi avaliada pela técnica de espectroscopia Raman. O crescimento das bactérias em co-cultivo não afetou o número de células no biofilme formado em aço inoxidável quando comparado com o biofilme individual. Nos biofilmes formados por P. fluorescens na presença de LDR 1% foi constatado maior número de células sésseis (P > 0,05) quando comparado ao LDR 10% no 6° dia de incubação. As imagens obtidas na microscopia de epifluorescência e de varredura corroboram os resultados da quantificação do número de células, com a população de P. fluorescens superior à de S. aureus em biofilmes simples e em co-cultivo. A partir da espectroscopia Raman foi possível observar a homogeneidade dos biofilmes e que todos os biofilmes formados eram compostos por carboidratos, proteínas, lipídeos e DNA. No entanto, as intensidades dos picos Raman de cada componente variaram de acordo com a espécie e a concentração de LDR utilizada. Pode-se concluir que na temperatura de 7 °C P. fluorescens formam biofilme individualmente ou multiespécie na superfície de aço inoxidável na presença de resíduos de leite, o que constitui um problema para a indústria laticinista. O conhecimento obtido sobre a composição do biofilme desses microrganismos contribuirá para a busca de métodos para evitar a formação dos biofilmes bem como para a sua remoção. Palavras-chave: Multiespécies. Resíduos de leite. Raman. Multispecies biofilm formed in the dairy industry's equipment result in several problems in the quality of products, financial losses, and health risks. The present work's objective was to evaluate the influence of factors such as temperature and nutrients on the structure and chemical composition of the bacterial multispecies biofilm using microscopic techniques and vibrational spectroscopy. Buttiauxella agrestis, Rahnella inusitata, Pseudomonas fluorescens, Staphylococcus aureus, Lactococcus laudensis, and Lactococcus garviae isolated from biofilm formed in the presence of raw milk at 7 °C were evaluated for biofilm formation capacity in polystyrene microplates containing 1% and 10% reconstituted whole milk (RWM) at 7 °C and 25 °C. The best individual and multispecies biofilm makers in the evaluated conditions were P. fluorescens and S. aureus, and these species were selected for further studies. Biofilms in pure culture or co-culture were formed at 7 °C on a stainless steel surface for 10 days. The culture medium and inoculum were changed every two days, and analyzes were performed to quantify adhered cells. Observation of under an epifluorescence and scanning microscope was done to evaluate biofilm formation and structure, and Raman's spectroscopy technique evaluated the biofilm composition. The growth of bacteria in co-cultivation did not affect the number of cells of both species in the biofilm formed in stainless steel. In biofilms formed in the presence of 1% RWM, a greater number of sessile cells was found (P > 0.05) when compared to the 10% RWM on the 6th day of incubation. The images obtained in the epifluorescence and scanning microscopy corroborate the quantification results of the number of cells. The population of P. fluorescens was greater than that of S. aureus in single and multispecies biofilms. Raman spectroscopy allowed observing the homogeneity of biofilms and that all biofilms formed were composed of carbohydrates, proteins, lipids, and DNA. However, the Raman peaks' intensities varied according to the species and substrate. It can be concluded that at a temperature of 7 °C, P. fluorescens form biofilms individually or multispecies on the stainless steel surface in milk residues, which shows a problem for the dairy industry. With the knowledge obtained about the biofilm composition of these microorganisms, it is essential to seek methods to prevent the formation of biofilms and their removal. Keywords: Multiespécies. Waste of milk. Raman.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) A produção aderida de biomassa algal em águas residuárias é promissora para o desenvolvimento de reatores de biofilme (RBs) destinados à separação e colheita da biomassa de forma econômica. No entanto, ainda não existe um RB consolidado no âmbito de produção e separação de biomassa e, por isso, diversos projetos de reatores são encontrados na literatura. Consequentemente, diversas configurações desses reatores também são reportadas como: material suporte para a aderência da biomassa, inclinações dos reatores, posicionamento integrado ao sistema de cultivo suspenso, entre outros. De forma a propor estratégias de superação de algumas dessas limitações, este estudo teve como objetivo otimizar as características de um RB para a sua integração a uma lagoa de alta taxa (LAT), formando um sistema hibrido de produção e separação de biomassa. Experimentos preliminares de avaliação dos materiais suportes para o crescimento da biomassa e de inclinação dos reatores foram realizados. O poliéster demonstrou ser o material suporte com melhores resultados de durabilidade, de produção de biomassa e de menores impactos ambientais negativos. Enquanto os reatores inclinados a 15o (500,9 g.m-2) e a 90o (528,1 g.m-2) em relação ao plano horizontal, apresentaram melhores resultados de produção de biomassa, sob condições climáticas, em estações climáticas secas e chuvosas, respectivamente. Portanto, esses resultados preliminares foram considerados para a otimização e implementação de um RB a uma LAT, em escala piloto. Os resultados dessa integração demostraram que a produção de biomassa aderida ao RB (69,8 g.m-2) foi, aproximadamente, o dobro do que a biomassa suspensa da lagoa de alta taxa (36,8 g.m-2) e a colheita diária de biomassa no RB (13,3 g.dia-1) foi cerca de cinco vezes maior em relação a biomassa sedimentada no decantador (2,6 g.dia-1). Além disso, esse reator contribuiu substancialmente com a eficiência de separação de biomassa no sistema híbrido, que apresentou uma retenção total de 64% de biomassa contra apenas 22% no sistema composto por LAT e decantador. O RB apresentou maior densidade e diversidade de organismos fotossintéticos durante a maior parte do período experimental. Além disso, os resultados da avaliação de ciclo de vida (ACV) de 1 Kg de biomassa separada no sistema híbrido mostrou uma redução de impactos ambientais negativos de, aproximadamente, 19% em todas as categorias, quando comparado ao sistema de tratamento de esgotos e separação de biomassa convencional, composto por LAT e decantador. O RB contribuiu positivamente com as demandas energéticas, de água e nutrientes do sistema em que estava integrado. Portanto, o aprimoramento de sistemas de tratamento de esgotos com os RBs é promissor para a produção, separação e colheita de biomassa algal. Este estudo contribuiu com algumas características de projetos de RBs, visando a sua aplicação em larga escala de estações de tratamento de águas residuárias, tornando o saneamento ambiental mais atrativo do ponto de vista de sustentabilidade. Palavras-chave: Águas residuárias. Biofilme algal. Crescimento aderido. Microalgas. Attached algal biomass production in wastewater is promising for biofilm reactors (BRs) development intended to biomass separation and harvesting in an economic way. However, there is still no consolidated BR in the scope of biomass production and harvesting and, therefore, several reactor projects are found in the literature. Consequently, several configurations of these reactors are also reported as: support material for the biomass attachment, reactors slopes, positioning integrated to the suspended cultivation system, among others. In order to propose strategies to overcome some of these limitations, this study aimed to optimize the characteristics of a BR for its integration into a high-rate algal pond (HRAP), forming a hybrid system for biomass production and separation. Preliminary experiments to evaluate the supporting materials for biomass growth and reactors slope were carried out. Polyester proved to be the supporting material with the best results in terms of durability, biomass production and less negative environmental impacts. While the reactors inclined at 15o (500.9 g.m-2) and 90o (528.1 g.m-2) in relation to the horizontal plane, presented better results of biomass production, under climatic conditions, in dry and rainy seasons, respectively. Therefore, these preliminary results were considered for the optimization and implementation of a BR to a HRAP, on pilot scale. The results of this integration showed that the biomass production attached to the BR (69.8 g.m-2) was approximately twice the biomass suspended in the HRAP (36.8 g.m-2) and the daily biomass harvest in the BR (13.3 g.day-1) was about five times higher in relation to the sedimented biomass in the settling tank (2.6 g.day-1). In addition, this reactor contributed substantially to the efficiency of biomass separation in the hybrid system, which presented a total retention of 64% of biomass against only 22% in the system composed of HRAP and settling tank. The BR showed higher photosynthetic organisms density and diversity during most of the experimental period. In addition, the life cycle assessment (LCA) results of 1 kg of biomass separated in the hybrid system showed a reduction of negative environmental impacts of approximately 19% in all categories, when compared to the conventional wastewater treatment and biomass separation system, composed of HRAP and settling tank. BR contributed positively to the system energy, water and nutrient demands in which it was integrated. Therefore, wastewater treatment systems improvement with BRs is promising for algal biomass production, separation and harvesting. This study contributed to some characteristics of BR projects, aiming their large-scale application in wastewater treatment plants, making environmental sanitation more attractive from the sustainability point of view. Keywords: Wastewater. Algal biofilm. Attached growth. Microalgae.

Dois grandes desafios da atualidade são o crescente aumento da resistência de patógenos aos antibióticos usados na clínica médica e a geração de resíduos e subprodutos de baixo valor durante os processos agroindustriais. A obtenção de compostos e ingredientes a partir desses subprodutos é uma forma interessante de valorização do material vegetal. As plantas produzem inúmeros compostos a partir de seu metabolismo secundário os quais apresentam diferentes atividades biológicas de interesse biotecnológico. Este trabalho teve por objetivo avaliar a atividade biológica de extratos preparados a partir de plantas da Mata Atlântica e grãos de café verde, cereja e boia visando futura identificação de compostos de interesse das indústrias farmacêutica e alimentícia. Inicialmente, avaliou-se a atividade antibacteriana de 179 extratos preparados de 45 espécies da Mata Atlântica sobre Staphylococcus aureus ATCC 29213. Extratos aquosos de seis espécies apresentaram forte inibição com concentração inibitória mínima (CIM) até 0,5 mg/mL. Cinco extratos macerados em diclorometano e metanol (1:1) também mostraram forte inibição da atividade antibacteriana, com destaque para aqueles preparados a partir de caules de Casearia ulmifolia, Rheedia gardneriana e Trichilia catigua que apresentaram CIM de 0,093 mg/mL, 0,07 mg/mL e 0,093 mg/mL, respectivamente. As atividades antibacteriana, antioxidante e antibiofilme de extratos de cafés bóia, cereja e verde preparados em diferentes solventes também foi avaliada. Não foram observadas atividades antibacteriana e antibiofilme nas condições testadas. Nenhuma atividade antioxidante foi identificada nas frações hexânicas, porém, observou-se nos cafés bóia e verde, atividade antioxidante das frações etanólica e acetato de etila que foram equivalentes à rutina e hidroxitolueno butilado (BHT), controles positivos dos ensaios. A determinação de fenólicos totais nas amostras de cafés bóia, cereja e verde foi realizada pelo teste de Folin–Ciocalteu. Os extratos etanólicos apresentaram as maiores quantidades de equivalente de ácido gálico em mg por grama de extrato (GAE g/L), sendo a amostra de café verde preparada em etanol a de maior conteúdo de compostos fenólicos (109,6 ± 2,2 GAE g/L). Em resumo, este trabalho comprovou a atividade biológica de extratos de Casearia ulmifolia, Rheedia gardneriana, Trichilia catigua e grãos de café verde e bóia que devem ser fracionados para a identificação de compostos de interesse biotecnológico. Palavras-Chave: Staphylococcus aureus. Mata Atlântica. Grãos de Café. Atividade Biológica. Two major challenges today are the increasing resistance of pathogens to antibiotics and the generation of low-value and byproducts during the agro- industrial processes. To obtain compounds and ingredients from these byproducts is an interesting way of valuing the plant material. Plants produce thousands of compounds from their secondary metabolism which present different biological activities of biotechnological interest. This work aimed to evaluate the biological activity of extracts prepared from Atlantic Forest plants, and green, cherry, and buoy coffee beans to further identify compounds that are of interest to the pharmaceutical and food industries. Initially, the antibacterial activity of 179 extracts prepared out of 49 plant species was evaluated against Staphylococcus aureus ATCC 29213. Aqueous extracts from eight species showed strong inhibition with a minimal inhibitory concentration (MIC) under 0.5 mg/mL. Seven extracts macerated in dichloromethane and methanol (1:1) also showed strong activity, especially those prepared from stems of Casearia ulmifolia, Rheedia gardneriana, and Trichilia catigua that had MIC of 0.093 mg/mL, 0.07 mg/mL, and 0.093 mg/mL, respectively. The antibacterial, antioxidant, and antibiofilm activities of extracts from buoy, cherry, and green coffee beans prepared in different solvents were also evaluated. Antibacterial and antibiofilm activities were not observed in the tested conditions. No antioxidant activity was observed in the hexane fraction; however, antioxidant activity was observed in the ethanolic and ethyl acetate fractions of buoy and green coffee beans which were equivalent to the rutin and butylated hydroxytoluene (BHT), positive controls used in the assays. The determination of total phenolics in the samples of buoy, cherry, and green coffee was determined by the Folin–Ciocalteu test. The ethanolic extracts showed higher gallic acid equivalent amounts per gram of extract (GAE g/L), while the green coffee sample prepared in ethanol showed the highest content of phenolic compounds (109,6 ± 2,2 GAE g/L). In summary, this work proved the biological activity of extracts from Casearia ulmifolia, Rheedia gardneriana, Trichilia catigua, and also green and buoy coffee beans that must be fractionated for the identification of compounds of biotechnological interest. Keywords: Staphylococcus aureus. Atlantic Forest. Coffee Beans. Biological Activity.

Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Minas Gerais L. monocytogenes está presente em baixas frequências em animais a serem abatidos, mas pode persistir por longos períodos no ambiente de processamento de alimentos. No presente estudo, a contaminação por L. monocytogenes foi avaliada em diferentes etapas de uma cadeia produtiva de carne suína no Estado de Minas Gerais. Dez lotes de suínos foram amostrados em diferentes etapas da cadeia de produção, abrangendo amostras de galpão de terminação, abate (após sangria, após chamuscamento, após evisceração e após lavagem final), processamento (facas, mesas de desossa e mão de manipuladores) e produtos finais (costelas, paleta, pernil e linguiça) totalizando 670 amostras. Todas as amostras foram submetidas à detecção de L. monocytogenes, e os isolados obtidos foram caracterizados por análises bioquímicas, sorogrupos, genes de virulência, PFGE, susceptibilidade à antibióticos e habilidade de adesão. Os resultados revelaram a baixa ocorrência de Listeria spp. na cadeia de produção de suínos avaliada. No entanto, quatro amostras de linguiça testadas (40%) foram positivas para Listeria spp., Sendo L. monocytogenes identificada em duas (20%). Dez isolados foram identificados como L. monocytogenes (oito de serogrounp 1/2a ou 3a e dois de sorogrupo 4b, 4d ou 4e), todos positivos para genes relacionados a virulência hlyA, iap, plcA, actA, inlA, inlB, inlC e inlJ e suscetíveis aos antibióticos testados. Uma amostra de linguiça foi contaminada por ambos os sorogrupos 1/2a ou 3a e 4b, 4d ou 4e. Os isolados do sorogrupo 1/2a ou 3a obtidos nas visitas 5 e 6 apresentaram perfis genéticos distintos por PFGE, sugerindo que a contaminação pode vir de fonte diferente. O potencial de adesão exibido por Listeria spp. isolados (n = 18) variaram de fraco (sorogrupo 4b, 4d ou 4e) a moderado (L. innocua e L. monocytogenes sorogrupo 1/2a ou 3a). Apesar da baixa ocorrência de L. monocytogenes, foram detectados sorogrupos patogênicos em linguiça, exigindo medidas de controle por parte da indústria. Uma vez que L. monocytogenes é um patógeno capaz de aderir a variadas superfícies e formar biofilmes, o que pode explicar sua persistência em ambientes de processamento de alimentos este trabalho também avaliou a capacidade de adesão de L. monocytogenes e a interferência de fatores estressantes na capacidade de adesão de cepas selecionadas (cepas de L. monocytogenes pertencentes às linhagens I e II, também provenientes do ambiente de processamento de carnes, caraterizadas em trabalhos paralelos por forte potencial adesão (1 isolado) e capacidade de persistência no ambiente de processamento por 3 anos (2 isolados)), estes isolados foram incorporados a este trabalho e testados junto a 3 isolados provenientes de linguiça. Estes isolados foram submetidos a testes de potencial de adesão e concentração inibitória mínima contra quatro desinfetantes. A capacidade de adesão dos isolados selecionados também foi testada considerando: diluições de desinfetantes, concentrações de NaCl e sais de cura, tempo de incubação e temperatura. Cada isolado foi classificado de acordo com sua capacidade de adesão como fraco, moderado ou forte. Os quatro desinfetantes testados foram eficazes na eliminação de L. monocytogenes. Os isolados selecionados para testes de estresse apresentaram maior capacidade de adesão a 37 °C/ 72 horas, e os meios com 5% de NaCl e amônia quaternária (1:1,024) foram ineficazes na inibição da adesão ao poliestireno. Os dados coletados permitiram a identificação do potencial de adesão de L. monocytogenes, da eficácia dos sanitizantes testados no controle da contaminação por este patógeno e a capacidade de adesão na presença de amônio quaternário (1:1024) e sais de alguns isolados. Considerando sua habilidade de adesão em condições estressantes nos testes descritos acima e o fato de terem o genoma sequênciado por (cg) MLST em estudos paralelos quatro isolados de L. monocytogenes pertencentes às linhagens I e II provenientes do ambiente de processamento de carne foram ainda investigados para capacidade de formação de biofilme em aço inoxidável na presença de sal de cura 7.5% (linhagem I) e amônio quaternário (1:1,024) (linhagem II). Adicionalmente foi realizada uma análise preditiva da expressão dos genes relacionados à formação de biofilme e adaptação a condições estressantes por ensaios qPCR (previamente detectados por análise in silico do genoma dos isolados selecionados, caracterizado por cg MLST em trabalhos paralelos). A formação de biofilme de L. monocytogenes em aço inoxidável foi testada em dois sistemas diferentes (microplaca e cupons) a 37 °C por 72 horas. Os ensaios foram realizados como triplicatas biológicas e incluíram os controles apropriados para verificar diferenças significativas pela análise de variância (p < 0,05). Foi possível observar que as linhagens testadas (I e II) foram capazes de formar biofilme em aço inoxidável. Embora os tratamentos utilizados em cada linhagem tenham sido significativos na redução do biofilme formado (p < 0,05), os isolados foram capazes de formar biofilme na condição de estresse avaliada. As suspensões de biofilme de L. monocytogenes a partir de testes em cupons de aço inoxidável deram resultados positivos em ensaios de qPCR para onze genes alvo testados. De maneira geral este trabalho demonstrou que o suíno não pareceu ser um portador representativo deste patógeno. Mesmo que não tenha sido possível a obtenção de amostras positivas para L. monocytogenes oriundas do ambiente de abate e processamento amostrado, a obtenção de produtos finais (linguiça) contaminados com sorogrupos patogênicos evidencia o risco de saúde ao consumidor final e a capacidade deste patógeno em persistir no ambiente de processamento de carne suína, uma vez que sua presença foi detectada no produto final. Os isolados de L. mococytogenes obtidos pertencem às linhagens filogêneticas reconhecidas por serem altamente adptadas ao ambiente de processamento de alimentos, e apresentaram habilidade em aderir às superfícies testadas sob condições de estresse. A reconhecida capacidade deste patógeno em formar biofilme em superfícies comumente encontradas no ambiente de processamento de carnes também pôde ser demonstrada, os isolados testados foram capazes de formar biofilme em aço inoxidável na presença de agentes usualmente utilizados para preparações de embutidos e também nos procedimentos de limpeza e desinfecção da planta de processamento. A analise in silico do cg MLST destes isolados permitiu a identificação de regiões genômicas relacionadas à formação de biofilme e adaptação a condições ambientais estrassantes, em isolados das linhagens I e II, sendo ainda possível detectar a ação desta maquinaria genética na formação de biofilme em aço inoxidável sob ação de agentes estressantes, pela predição da expressão de onze gene alvo realizada por qPCR. L. monocytogenes is present at low frequencies in animals to be slaughtered but may persist for long periods in the food processing environment. In the present study, L. monocytogenes contamination was evaluated at different stages of a pork meat production chain in the state of Minas Gerais. Ten lots of pigs were sampled at different stages of the production chain, covering samples from termination sheds, slaughtering (after bleeding, after singeing, after evisceration and after final washing), processing (knives, deboning tables and hand handlers) and end products (ribs, shoulder, ham and sausage) totaling 670 samples. All samples were submitted to L. monocytogenes detection, and the isolates obtained were characterized by biochemical analyzes, serogroups, virulence genes, PFGE, antibiotic susceptibility and adhesion ability. The results revealed the low occurrence of Listeria spp. in the pork production chain evaluated. However, four sausage samples tested (40%) were positive for Listeria spp., with L. monocytogenes identified in two (20%). Ten isolates were identified as L. monocytogenes (eight from serogrounp 1/2a or 3a and two from serogrounp 4b, 4d or 4e), all positive for virulence-related genes hlyA, iap, plcA, actA, inlA, inlB, inlC and inlJ and susceptible to the tested antibiotics. A sausage sample was contaminated by both serogroups 1/2a or 3a and 4b, 4d or 4e. Isolates from serogroup 1/2a or 3a obtained at visits 5 and 6 showed distinct genetic profiles by PFGE, suggesting that contamination may come from a different source. The adhesion potential exhibited by Listeria spp. isolates (n = 18) ranged from weak (serogroup 4b, 4d or 4e) to moderate (L. innocua and L. monocytogenes serogroup 1/2a or 3a). Despite the low occurrence of L. monocytogenes, pathogenic serogroups were detected in sausage, requiring industry control measures. Since L. monocytogenes is a pathogen capable of adhering to various surfaces and forming biofilms, which may explain its persistence in food processing environments, this work also evaluated L. monocytogenes adhesion capacity and the interference of stress factors on adhesion capacity of selected strains (L. monocytogenes strains belonging to lineages I and II, also coming from the meat processing environment, characterized in parallel work by strong adhesion potential (one isolate) and persistence capacity in the processing environment for 3 years (two isolates)), were incorporated into this work and tested with 3 selected isolates from sausage samples. These isolates were submitted to adhesion potential and minimum inhibitory concentration tests against four disinfectants. The adhesion capacity of the selected isolates was also tested considering: disinfectant dilutions, NaCl concentrations and curing salts, incubation time and temperature. Each isolate was classified according to its adherence capacity as weak, moderate or strong. The four disinfectants tested were effective in eliminating L. monocytogenes. The isolates selected for stress tests showed greater adhesion capacity at 37 °C/72 hours, and the BHI broth with 5% NaCl and quaternary ammonia (1: 1,024) were ineffective in inhibiting polystyrene adhesion. The collected data allowed the identification of the adhesion potential of L. monocytogenes, the efficacy of the sanitizers tested in the control of contamination by this pathogen and the adhesion capacity in the presence of quaternary ammonium (1: 1,024) and salts of some isolates. Considering their ability to adhere to stressful conditions in the tests described above and the fact that they have the genome sequenced by (cg) MLST in parallel studies four isolates of L. monocytogenes belonging to strains I and II from the meat processing environment were further investigated for stainless steel biofilm formation capacity in the presence of curing salt 7.5% (lineage I) and quaternary ammonium (1: 1,024) (lineage II). Additionally, a predictive analysis of gene expression related to biofilm formation and adaptation to stressful conditions was performed by qPCR assays (previously detected by in silico genome analysis of selected isolates, characterized by (cg) MLST in parallel work). L. monocytogenes biofilm formation in stainless steel was tested in two different systems (microplate and coupons) at 37 °C for 72 hours. Assays were performed as biological triplicates and included appropriate controls to verify significant differences by analysis of variance (p < 0.05). It was observed that the tested strains (I and II) were able to form stainless steel biofilm. Although the treatments used in each strain were significant in reducing the biofilm formation (p < 0.05), the isolates were able to form biofilm under the stress condition evaluated. L. monocytogenes biofilm suspensions from stainless steel coupon testing gave positive results in qPCR assays for eleven target genes tested. In general this work showed that the pig did not appear to be a representative carrier of this pathogen. Even though it was not possible to obtain positive samples for L. monocytogenes from the slaughtered and processing environment, obtaining final products (sausage) contaminated with pathogenic serogroups shows the health risk to the final consumer and the ability of this pathogen to persist in the pork meat processing environment once its presence has been detected in the final product. The isolates of L. mococytogenes obtained belong to phylogenetic lineages recognized for being highly adapted to the food processing environment, and showed ability to adhere to the tested surfaces under stress conditions. The recognized ability of this pathogen to form biofilm on surfaces commonly found in the meat processing environment could also be demonstrated, the tested isolates were able to form stainless steel biofilm in the presence of agents usually used for sausage preparations and also in the processing plant cleaning / disinfection procedures. The in silico analysis of cg MLST allowed the identification of genomic regions related to biofilm formation and adaptation to stressful environmental conditions in lineages I and II isolates. It is also possible to detect the action of this genetic machinery in the stainless steel biofilm formation under action of stress factors, by predicting the expression of eleven target genes performed by qPCR.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior Biofilme é um conglomerado de células aderidas a uma superfície, envolvidas em uma matriz de exopolímeros (EPS). É resistente a antimicrobianos tornando difícil sua erradicação. Alternativas para o controle do biofilme estão sendo pesquisadas e os compostos naturais têm apresentado importantes resultados ao interferirem na comunicação pelo mecanismo de quorum sensing. Visando avaliar o efeito de concentrações sub-inibitórias (sub-MIC) do extrato fenólico de pitanga (Eugenia uniflora L.; EFP) sobre a formação de biofilme de Serratia liquefaciens L53. Pitangas foram coletadas, despolpadas e realizou-se a extração purificando os compostos fenólicos utilizando extração em fase sólida (mini-coluna C18). Os compostos fenólicos totais foram quantificados pelo ensaio do reagente Folin-Ciocalteu, identificados por análise em cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) e por Chromatography Electrospray Ionization Tandem Mass Spectrometric (LC-ESI-MS/MS) e a concentração inibitória mínima (MIC) para S. liquefaciens L53. Foram determinadas as concentrações sub-MIC foram avaliadas sobre a formação de biofilme total e sobre os componentes da matriz do biofilme nos tempos de 7, 48 e 168 h. Foi avaliada a susceptibilidade do biofilme de 48 h formado na presença do EFP a agentes antimicrobianos e seu efeito combinado com os antibióticos ampicilina (30 μg.mL -1 ), canamicina (10 μg.mL -1 ) e getamicina (10 μg.mL -1 ). O EFP apresentou 231 mg de ácido gálico equivalente (AGE). 100 g -1 de polpa de compostos fenólicos totais e os flavonoides majoritários identificados foram elagitaninos e derivados glicosilados de quercetina. Em concentrações sub-MIC, o EFP diminuiu a formação do biofilme total e os componentes da matriz dos EPS, polissacarídeos, proteínas e DNA, nos tempos de 7 e 48 h e, em contrapartida, aumentou em 168 h. O EFP não alterou o número de células viáveis de S. liquefaciens L53 aderidas ao poliestireno no tempo de 48 h nem a susceptibilidade ao tratamento com 200 mg.L -1 de dicloroisocianurato e 0,1 mg.mL -1 de canamicina comparados ao controle. O EFP, em uso combinado com os antibióticos, apresentou efeito antagônico com os mesmos. Nesse contexto, o uso de concentraçãos sub-MIC do EFP apresentou efeitos divergentes na formação do biofilme em função do tempo de análise, diminuindo o biofilme em menor tempo e aumentando em tempo maior de cultivo. O EFP não alterou a susceptibilidade do biofilme ao tratamento com antimicrobianos comparado ao controle e atuou como antagonista com antibióticos. Sendo assim, a utilização do EFP é controversa, pois pode apresentar efeitos indesejáveis, aumentando o biofilme no tempo maior de contato, além de apresentar efeito antagônico com antibióticos. Biofilm is a conglomerate of cells adhered to a surface, wrapped in a matrix of exopolymers (EPS). It is resistant to antimicrobials making it difficult to eradicate it. Alternatives for biofilm control are being investigated and natural compounds have shown important results by interfering in communication by the mechanism of quorum sensing. In order to evaluate the effect of subinhibitory concentrations (sub-MIC) of the phenolic extract of pitanga (Eugenia uniflora L., FEP) on the biofilm formation of Serratia liquefaciens L53. Pitangas were collected, pulped and extraction was carried out by purifying the phenolic compounds using solid phase extraction (mini C18 column). The total phenolic compounds were quantified by the Folin-Ciocalteu reagent assay, as well as identified by High Performance Liquid Chromatography (HPLC) and by Chromatography Electrospray Ionization Tandem Mass Spectrometry (LC-ESI-MS/MS). The minimum inhibitory concentration (MIC) for S. liquefaciens L53 was performed. The sub-MIC concentrations were evaluated on total biofilm formation and biofilm matrix components at 7, 48 and 168 h. The susceptibility of the 48 h biofilm formed in the presence of FEP to antimicrobial agents and their combined effect with the antibiotics ampicillin (30 μg.mL -1 ), kanamycin (10 μg.mL -1 ) and getamycin (10 μg.mL -1 ). The FEP showed 231 mg gallic acid per 100 g -1 pulp AGE. de polpa 17,133.1 per liter (AGE.L -1 ) of total phenolic compounds and the identified major flavonoids were ellagitannins and glycosylated derivatives of quercetin. In sub-MIC, concentrations, the FEP decreased of the total biofilm formation and matrix components such as EPS, polysaccharides, proteins and DNA after 7 and 48 h cultivation and increased after 168 h. The FEP did not change the number of viable cells of S. liquefaciens L53 adhered to the polystyrene in the time of 48 h nor the susceptibility to treatment with 200 mg.L -1 of dichloroisocyanurate or 0.1 mg.mL -1 of kanamycin in comparision with the control. The EFP combined with antibiotics showed an antagonistic effect. In this context, the use of sub-MIC concentrations of EFP showed divergent effects on biofilm formation as a function of the time of cultivation, reducing biofilm in a shorter time and increasing in time of culture. The EFP did not alter the susceptibility of the biofilm to antimicrobial treatment compared to control and acted as an antagonist with antibiotics. Therefore, the use of EFP is controversial, as it may present undesirable effects, increasing the biofilm in the longer time of contact, besides presenting an antagonistic effect with antibiotics.

Sigilo expirado em 19/2/2021, conforme termo de publicação. Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) A mastite bovina é uma doença caracterizada pela inflamação do parênquima mamário. A enfermidade é causada principalmente por bactérias, sendo a Staphylococcus aureus a mais comum. Atualmente o protocolo de tratamento é a antibioticoterapia, mas o surgimento de estirpes resistentes faz necessário o emprego de novas estratégias terapêuticas. A Salvia officinalis L. é utilizada na medicina popular como anti-inflamatório, antifúngico, antibacteriano e antioxidante. Baseado na necessidade de um tratamento eficaz para mastite e o potencial farmacológico da sálvia, o presente trabalho teve como objetivo avaliar a atividade antibacteriana dos extratos, frações e de uma formulação de S. officinalis sobre diferentes estirpes de S. aureus isoladas de animais acometidos com mastite bovina. Nesse trabalho, foram testados três extratos brutos de folhas de sálvia e seu óleo essencial sobre 18 cepas de S. aureus. Primeiramente, foi realizado o teste de concentração inibitória mínima (CIM). Em seguida, foi estabelecido o efeito do extrato ativo sobre a formação e a inibição do biofilme bacteriano já formado, assim como sua toxicidade sobre células epiteliais bovinas (MAC-T). Posteriormente, foi realizado um fracionamento biomonitorado do extrato por cromatografia em coluna. Através da cromatografia gasosa acoplada ao espectrômetro de massas foram identificados os compostos responsáveis pela atividade antibacteriana. Os resultados de CIM mostraram o extrato hexânico como o mais ativo, este também foi eficaz para inibição do biofilme e não apresentou alta toxicidade para células MAC-T. O fracionamento biomonitorado demonstrou que os compostos ferruginol e sugiol são os responsáveis pela bioatividade do extrato. A formulação contendo o extrato hexânico de S. officinalis a 1,5 mg/mL foi efetiva para inviabilizar as cepas de S. aureus testadas. Os resultados sugerem que o extrato de S. officinalis seja considerado um promissor fitoterápico para a utilização como agente profilático ou tratamento da mastite bovina. Bovine mastitis is a disease characterized by inflammation of the breast parenchyma. The disease is mainly caused by bacteria, with Staphylococcus aureus being the most common. Currently the treatment protocol is antibiotic therapy, but the emergence of resistant strains requires the use of new therapeutic strategies. Salvia officinalis L. is used in folk medicine as anti- inflammatory, antifungal, antibacterial and antioxidant. Based on the need for an effective treatment for mastitis and the pharmacological potential of sage, the present study aimed to evaluate the antibacterial activity of extracts, fractions and a formulation of S. officinalis on different strains of S. aureus isolated from animals affected with bovine mastites. In this work, three crude extracts of sage leaves and their essential oil were tested on 18 strains of S. aureus. First, the minimum inhibitory concentration (MIC) test was performed. Then, the effect of the active extract on the formation and inhibition of the bacterial biofilm already formed was established, as well as its toxicity on bovine epithelial cells (MAC- T). Subsequently, a biomonitoring of the extract was carried out by column chromatography. Through the gas chromatography coupled to the mass spectrometer the compounds responsible for the antibacterial activity were identified. The MIC results showed the hexane extract as the most active, this was also effective for biofilm inhibition and did not present high toxicity to MAC- T cells. The biomonitoring fractionation showed that the compounds ferruginol and sugiol are responsible for the bioactivity of the extract. The formulation containing the hexane extract of S. officinalis at 1,5 mg.mL -1 was effective to prevent the S. aureus strains tested. The results suggest that S. officinalis extract is considered a promising phytotherapeutic for use as a prophylactic agent or treatment of bovine mastitis.

Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico Biofilme é uma comunidade microbiana contida em uma matriz polimérica e aderida a uma superfície. Essa estrutura é responsável por garantir maior resistência de células bacterianas imersas nessa matriz a agentes antimicrobianos. Uma alternativa para controlar a ocorrência de biofilmes em ambientes de processamento de alimentos é o uso de agentes surfactantes. Os biossurfactantes têm atraído a atenção como substitutos dos surfactantes sintéticos, exibindo entre diversas qualidades, maior biodegradabilidade, baixa toxicidade e baixa concentração crítica micelar (CMC). O objetivo desse trabalho foi avaliar a formação de biofilme de Pseudomonas fluorescens em aço inoxidável, em contato com leite integral UHT, por 120 h, em temperatura de 7 °C. E avaliar o efeito dos biossurfactantes ramnolipídeo e surfactina e do surfactante sintético cloreto de benzalcônio (CB) em concentrações abaixo, próxima ou igual e acima da CMC, além de avaliar o tempo de contato, na redução do biofilme pré-formado. Cupons de aço inoxidável AISI 304 # 4, foram incubados em poços de placas de poliestireno, com inóculo inicial de 10 4 UFC mL -1 de P. fluorescens 07A em leite integral UHT, e incubados a 7 °C. Foi realizada quantificação de células aderidas a cada 24 h. A aplicação dos agentes surfactantes foi realizada sobre os biofilmes pré-formados por 120 h. Além disso, antes e após os tratamentos, os cupons de aço inoxidável foram observados por Microscopia Confocal de Varredura a Laser. Constatou-se que a cepa de P. fluorescens estudada foi capaz de formar biofilme em temperatura de refrigeração em contato com leite integral UHT, após 72 h de incubação. Os biossurfactantes não foram tão eficazes quanto o surfactante sintético estudado. O aumento da concentração de surfactina não aumentou a redução de células do biofilme, no entanto o aumento do tempo de contato demonstrou efeito positivo sobre a redução. Ramnolipídeo foi capaz de reduzir aproximadamente 1 ciclo log de UFC cm -2 de células viáveis, na CMC; aumento do tempo de contato também demonstrou efeito. Para ambos os biossurfactantes a interação entre concentração e tempo de contato foi não significativa (P > 0,01); enquanto para o surfactante sintético CB a interação foi significativa (P < 0,01), mostrando que o aumento do tempo de contato e da concentração desse agente garantem maior redução do número de células viáveis no biofilme. A partir dos resultados obtidos verificou-se que P. fluorescens pode formar biofilmes em superfície utilizada no processamento de alimentos em temperatura de refrigeração com a presença de resíduos de leite. No entanto, surfactantes sintéticos ainda demostram melhor efeito do que os biossurfactantes sobre biofilme. Biofilm is a microbial community contained in a polymer matrix and adhered to a surface. This structure is responsible for ensuring greater resistance of bacterial cells immersed in this matrix to antimicrobial agents. An alternative to control the occurrence of biofilms in food processing environments is the use of surfactants. Biosurfactants have garnered attention as substitutes for synthetic surfactants, exhibiting among several qualities, greater biodegradability, low toxicity and low critical micelle concentration (CMC). The objective of this study is to evaluate the formation of Pseudomonas fluorescens biofilm in stainless steel, in contact with UHT whole milk, for 120 h at a temperature of 7 ° C. And to evaluate the effect of the biosurfactants rhamnolipid and surfactin and the synthetic surfactant benzalkonium chloride (BC) in concentrations below, near or equal to and above the CMC, besides evaluating the contact time, in reducing the preformed biofilm. Stainless steel coupons AISI 304 # 4 were incubated in polystyrene plate wells with initial inoculum of 10 4 CFU mL -1 of P. fluorescens 07A in UHT whole milk and incubated at 7 ° C. Quantification of adhered cells were performed every 24 h. The application of the surfactants was performed after the biofilm had been preformed for 120 h. In addition, before and after the treatments, the stainless steel coupons were observed by Confocal Laser Scanning Microscopy. It was verified that the strain of P. fluorescens studied was able to form biofilm at refrigeration temperature in contact with UHT whole milk, after 72 h of incubation. The biosurfactants were not as effective as the synthetic surfactant studied. The increased surfactin concentration did not increase the reduction of biofilm cells, however, the increase in contact time showed a positive effect on the reduction. Ramnolipid was able to reduce approximately 1 log cycle of CFU cm -2 of viable cells in CMC; the increased contact time was also effective. For both biosurfactants the interaction between concentration and contact time was not significant (P > 0,01); while for the synthetic surfactant BC the interaction was significant (P < 0,01), showing that increased contact time and concentration of this agent provides a greater reduction in the number of viable cells in the biofilm. From the results obtained it was verified that P. fluorescens can form biofilms on surfaces used in food processing at refrigeration temperature with the presence of milk residues. However, synthetic surfactants still have a better effect than biosurfactants on biofilm.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior Bacillus cereus é um dos microrganismos de maior preocupação na indústria de alimentos, pois possui alta capacidade de se aderir e formar biofilmes, podendo contaminar os alimentos que entram em contato com as superfícies. Estratégias de controle devem ser buscadas a fim de eliminar esta possibilidade de ocorrência desse microrganismo na cadeia alimentar. Para isso, é necessário conhecer as condições que propiciam sua adesão. Modelos matemáticos podem ser usados para descrever o comportamento microbiano sob diferentes condições ambientais. Assim, o objetivo desse estudo foi avaliar a adesão e formação de biofilmes de diferentes estirpes de B. cereus, isoladas de bebida láctea, leite pasteurizado e ricota, frente a diferentes valores de pH (4,5, 6,0, 7,5 e 9,0) e temperatura (5, 15, 25 e 32 oC). A adesão e formação de biofilmes microbianos foi avaliada utilizando-se placas de 24 poços contendo cupons de aço inoxidável e caldo Brain Heart Infusion (BHI), ajustado com HCl e NaOH 1 mol.L -1 para os valores de pH citados acima e incubadas sob diferentes temperaturas, sendo realizadas contagens em placas a cada 24 h, durante 48 e 120 h de incubação para adesão e formação de biofilmes, respectivamente. Os resultados foram expressos em UFC.cm - 2. As estruturas dos biofilmes foram visualizadas por meio de microscópio eletrônico de varredura. Modelos probabilísticos de regressão logística foram construídos para descrever a probabilidade de adesão e formação de biofilmes de cada estirpe. Os modelos foram validados estatisticamente e em meio de cultura e matriz alimentícia para determinar sua confiabilidade e versatilidade. Os fatores pH e temperatura influenciaram nas respostas de adesão e formação de biofilmes, em que altas temperaturas de 25 e 32 oC e valores de pH 6,0, 7,5 e 9,0 favoreceram esses mecanismos, sendo observada uma maior capacidade de adesão em uma das 3 estirpes testadas em relação às demais, quando submetida à temperatura de 15 oC. A combinação entre pH 4,5 e temperatura de 5 oC conseguiu impedir a adesão e formação de biofilmes durante todo o período de incubação. A visualização por microscopia eletrônica de varredura corroborou com os resultados obtidos por contagem em placas. Os modelos probabilísticos de regressão logística construídos se mostraram eficazes para descrição da região de interface de adesão/não adesão e formação de biofilme/não formação de biofilme. A validação dos modelos probabilísticos em meio de cultura e matriz alimentícia confirmou que os modelos desenvolvidos são adequados para avaliação da adesão e formação de biofilmes das estirpes de B. cereus estudadas. A utilização da modelagem probabilística é de grande utilidade para a indústria de alimentos que pode utilizar das informações sobre combinações de fatores que afetam a adesão e formação de biofilmes por B. cereus para análise de riscos, visando garantir a qualidade dos alimentos, assegurando desse modo, a saúde dos consumidores. Bacillus cereus is one of the microorganisms of major concern in the food industry, as it has a high capacity to adhere and form biofilms. Control strategies should be sought in order to eliminate this possibility of this microorganism occurring in the food chain. Mathematical models can be used to describe microbial behavior under different environmental conditions. The objective of this study was to evaluate the adhesion and biofilm formation of different strains of B. cereus, isolated from dairy products against different pH (4.5, 6.0, 7.5 and 9.0) and temperature values (5, 15, 25 and 32 ° C). The adhesion and formation of microbial biofilms was monitored using 24-wells plates containing stainless steel coupons and Brain Heart Infusion (BHI) broth. This adjusted with 1 mol.L-1 HCl and NaOH at the above mentioned pH values and incubated under different temperatures. The plaque counts were performed every 24 h for 48 and 120 h incubation for adhesion and biofilm formation, respectively. The structures of the biofilms were visualized by scanning electron microscope. Probabilistic logistic regression models were constructed to describe the probability of adhesion and formation of biofilms of each strain. The models were validated statistically, in culture medium and food matrix to determine their reliability and versatility. The pH and temperature factors influenced the adhesion and biofilm formation responses, where high temperatures of 25 and 32 oC and values of pH 6.0, 7.5 and 9.0 favored these mechanisms, with a higher adhesion capacity in one of the three strains tested in relation to the others when submitted to a temperature of 15 oC. The combination between pH 4.5 and 5 ° C was able to prevent adhesion and formation of biofilms throughout the incubation period. The scanning electron microscopy confirmed the results obtained by plate. The probabilistic logistic regression models were effective for describing the adhesion / non-adhesion interface region and biofilm formation / non-biofilm formation. The validation of the probabilistic models in culture medium and food matrix confirmed the good fit of the models. The use of probabilistic modeling is very useful for the food industry, which can utilize information on combinations of factors that affect the adhesion and formation of biofilms by B. cereus for risk analysis, in order to guarantee the quality of the food, thus ensuring, consumer health.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior A adesão e formação de biofilmes por bactérias patogênicas e deteriorantes são indesejáveis na indústria de alimentos devido aos problemas de contaminação e a difícil remoção no processo de higienização. Desta forma, é importante quantificar e minimizar o risco de adesão e fatores que o afeta, uma ferramenta para 1sso é utilizar a microbiologia preditiva, que permite prever as influências das condições ambientais no comportamento microbiano. Além disso, os biofilmes são formados por várias espécies bacterianas, e possíveis Interações entre as espécies podem ocorrer, por exemplo, as interações sinérgicas podem tornar os membros desta comunidade mais tolerantes e resistentes aos sanitizantes, já nas interações competitivas ou antagônicas pode ocorrer a presença de micro-organismos inibidores de outros individuos nos biofilmes. Nesse contexto, a primeira parte do trabalho aborda o desenvolvimento de modelos matemáticos preditivos de adesão e formação de biofilmes das bactérias Escherichia coli, Listeria monocytogenes, e Salmonella enterica subsp. enterica e E. faecalis, em função dos efeitos do pH e temperatura. Utilizou-se microplacas de poliestireno com 96 poços contendo caldo Brain Heart Infusion em pH ajustado para a adesão e formação de biofilmes, os ensaios foram conduzidos em diferentes combinações de pH (4, 5,6, 7,8,€e 9) e temperatura (5 °C, 15°C, 25 °C, 25 °C e 45 °C). Com os dados experimentais, modelos de probabilidade de regressao logistica foram construidos para cada bacteria, os modelos apresentaram bom ajuste com poder preditivo adequado e, verificou-se que com o aumento da temperatura o risco de o evento acontecer é maior. Na segunda parte do estudo os objetivos foram verificar as interações sinérgicas em cocultura entre as bactérias e avaliar a capacidade antagônica de E. faecalis em competir, excluir ou deslocar os patógenos durante a formação dos biofilmes em diferentes temperaturas e correlacionar essa inibição com as propriedades de autoagregação e coagregação. Finalmente, determinar a cinética de inativação dos micro-organismos patogênicos presentes nos biofilmes em monocultura e em cocultura com E. faecalis sob ação do sanitizantes dicloroisocianurato de sódio e cloreto de benzalcônio e avaliar se houve aumento da resistência para inativação dos biofilmes quando cultivados em cocultura. Poucas ocorrências de efeitos sinérgicos foram encontradas na formação de biofilmes entre os isolados, em 144 combinações houve somente quatro efeitos sinérgicos que foram: S. enterica e L. monocytogenes nas temperaturas de 15 CempH8€e9,a25 CempH8e também E. coli e E. faecalis na temperatura de 35 CepH8. E. faecalis teve pouca capacidade em inibir a formação de biofilmes dos patógenos, promovendo baixas reduções decimais (

Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico Biofilmes bacterianos formados em áreas de processamento de alimentos podem se tornar fonte de contaminação cruzada. Dessa forma, torna-se importante a correta manipulação das matérias-primas que chegam até a indústria, além do uso adequado de sanitizantes no processo de higienização de equipamentos e superfícies. Objetivou-se com este estudo avaliar a formação de biofilme e potencial de biotransferência de Pseudomonas aeruginosa em aço inoxidável, em contato com leite integral UHT e caldo de vegetais. E o efeito de três surfactantes, em concentrações abaixo, próxima e acima da concentração crítica de micelas, na redução de biofilmes. Cada meio de cultivo foi inoculado com P. aeruginosa ATCC 15442, distribuídos em poços de microplaca contendo cupons de aço inoxidável AISI 304 # 4 e incubados a 15 °C. O número de células aderidas foi determinado após 24, 48, 72, 96 e 120 h e o potencial de biotransferência a partir de 48 h. Soluções de cloreto de benzalcônio (CB), dodecilbenzeno sulfonato de sódio (DBSS) e Tween 80 foram avaliados sobre os biofilmes formados por 72 h. Cupons de aço, antes e após os tratamentos, foram observados por microscopia confocal de varredura a laser. Verificou-se que, apesar do leite integral conter maior concentração de nutrientes em relação ao caldo de vegetais, não houve diferença na formação de biofilme de P. aeruginosa. O potencial de biotransferência do micro-organismo aos meios de cultivo foi observado durante todo o período avaliado. As soluções surfactantes mostraram-se eficientes na redução do número de células aderidas com o aumento da concentração, principalmente o CB. Tween 80 e DBSS reduziram menos de 2 log UFC∙cm -2 de células viáveis, enquanto o CB reduziu até 6 log UFC∙cm -2 . A partir dos resultados obtidos verificou-se que P. aeruginosa pode produzir biofilmes em superfície utilizada no processamento de alimentos, independente do tipo de resíduo alimentar presente. Os surfactantes aplicados apresentaram melhor eficiência em concentrações mais elevadas, acima da crítica de micelas, e a classe desses agentes também contribuiu para a redução das células aderidas. Bacterial biofilms formed in food processing areas can become a source of cross-contamination. Thus, the correct handling of the raw materials coming into the industry becomes important, as well as the proper use of sanitizing in the cleaning process of equipment and surfaces. The aim of this study was to evaluate the biofilm formation and biotransferential potential of Pseudomonas aeruginosa in stainless steel, in contact with UHT whole milk and vegetable broth. Also, it was evaluated the effect of three surfactants at concentrations below, above and near the critical micelle concentration, in the reduction of biofilms. Each culture medium was inoculated with P. aeruginosa ATCC 15442, distributed in microplate wells containing stainless steel coupons AISI 304 # 4 and incubated at 15 °C. The number of adhered cells was determined after 24, 48, 72, 96 and 120 h and the potential of biotransference after 48 h. Benzalkonium chloride (BAC), sodium dodecylbenzene sulfonate (SDBS) and Tween 80 solutions were evaluated on biofilms formed for 72 h. Steel coupons, before and after treatments, were observed by confocal laser scanning microscopy. It was verified that, although the milk had higher concentration of nutrients in relation to the vegetable broth, there was no difference in the formation of P. aeruginosa biofilm. The biotransfer potential of the microorganism to the culture media was observed throughout the evaluated period. The surfactant solutions were efficient in reducing the number of cells adhered with the concentration increase, mainly of the BAC. Tween 80 and SDBS reduced less than 2 log CFU∙cm -2 of viable cells, while BAC reduced up to 6 log CFU∙cm -2 . From the results obtained it was verified that P. aeruginosa can produce biofilms on the surface used in food processing, regardless of the type of food residue present. The applied surfactants presented better efficiency at higher concentrations, above the critical micelle, and the class of these agents also contributed to the reduction of the adhered cells.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior Staphylococcus aureus é um patógeno que causa diferentes patologias em humanos e animais. A bactéria produz vários fatores de virulência que desempenham papel determinante no estabelecimento das infecções e intoxicações. O desenvolvimento de novas estratégias de combate às bactérias é necessário, visto o crescente aumento mundial da resistência aos antibióticos convencionais. Nos últimos anos, tem se questionado se promover a diminuição na produção de toxinas, fatores de secreção e adesão não seria uma estratégia eficaz no combate a infecção. A Mata Atlântica é um importante bioma para a pesquisa de compostos bioativos. Pela crescente ameaça imposta às poucas áreas remanescentes corre-se o risco de perda de espécies vegetais que são fontes de produtos naturais com atividades biológicas ainda desconhecidas. Neste trabalho, avaliou-se a ação 99 extratos orgânicos e aquosos de 25 espécies arbóreas da Mata Atlântica sobre Staphylococcus aureus ATCC 29213. Um total de 29 extratos apresentou atividade antibacteriana, com destaque para o extrato orgânico de folhas de Maclura tinctoria (11FO). O fracionamento biomonitorado desse extrato permitiu a obtenção da fração diclorometano (11FO d), que exibiu forte atividade in vitro sobre isolados veterinários de S. aureus e ação protetora em lagartas Galleria mellonella infectadas com S. aureus ATCC 29213. A fração 11FO d não afetou a superfície bacteriana e não promoveu danos a estrutura da membrana celular. Os 70 extratos vegetais que não tiveram atividade antibacteriana foram avaliados quanto ao potencial antivirulência. Um total de 33 extratos interferiu na atividade hemolítica de S. aureus ATCC 29213, enquanto 14 diminuíram a formação de biofilme de S. epidermidis NRS101 (ATCC 35983), considerada forte produtora de biofilme. Os extratos orgânicos de galhos das espécies Casearia sylvestris e Siparuna guianenses inibiram esses dois fatores de virulência. Concentrações subinibitórias desses extratos interferiram na hemólise e na formação do biofilme por isolados veterinários de S. aureus. A expressão do gene que codifica a α-hemolisina (hla) e do gene RNAIII, regulador da expressão de fatores de virulência de S. aureus, também foi reduzida, confirmando o potencial dos extratos estudados. Staphylococcus aureus is a pathogen that causes different pathologies in humans and animals, and produces several virulence factors that play a determining role in the establishment of infections and foodborne intoxication. The development of new strategies to combat bacteria is needed, given the worldwide increase in resistance to conventional antibiotics. In recent years, it has been questioned whether promoting the decrease in toxin production, secretion, and adhesion factors would be an effective strategy for combating infection. The Atlantic Forest is an important biome for the research of bioactive compounds. Due to the growing threat posed to the few remaining areas there is a risk of loss of plant species that are sources of natural products with unexplored biological activities. In this work, the antibacterial activity of 99 organic and aqueous extracts from 25 tree species was evaluated on Staphylococcus aureus ATCC 29213. Activity of 29 extracts was demonstrated, featuring the organic extracts of leaves of Maclura tinctoria (11FO) that showed the minimum inhibitory concentration of 0.08 mg/mL. A dichloromethane fraction (11FO d) obtained through biomonitoring fractionation showed strong in vitro activity on S. aureus veterinary isolates and protective action on Galleria mellonella caterpillars infected with S. aureus ATCC 29213. Fraction 11FO d did neither affect bacterial surface nor caused damage to the cell membrane. The 70 plant extracts that did not show antibacterial activity were evaluated for their putative antivirulence activities. A total of 33 extracts interfered with the hemolysis of S. aureus ATCC 29213, while 14 decreased S. epidermidis NRS101 (ATCC 35983) biofilm formation. Organic extracts of branches of Casearia sylvestris and Siparuna guianenses species inhibited both virulence factors as well as the subinhibitory concentrations tested. The expression of the α-hemolysin (hla) encoding- gene and the RNAIII gene, which regulates the expression of S. aureus virulence factors, was also reduced, confirming the antivirulence potential of the studied extracts.

Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Minas Gerais A grande diversidade de estirpes de Staphylococcus aureus em circulação nos rebanhos leiteiros reforça a necessidade de uma melhor caracterização dessas bactérias a fim de gerar informações que possam ser usadas no controle da mastite bovina. Neste trabalho, hipotetizou-se que estirpes de S. aureus geneticamente relacionadas causam diferentes formas de mastite. As bactérias S. aureus 302 e S. aureus 322, foram isoladas de vacas com mastite persistente e não-persistente, respectivamente, e apresentaram os mesmos genes de virulência e perfis de bandas idênticos quando genotipadas por análise em multilocus de repetições em tandem de número variável (MLVA). Por eletroforese em gel de campo pulsado (PFGE), utilizado como um método genotípico adicional, comprovou-se que as bactérias são geneticamente relacionadas. Apesar dessa proximidade, ensaios in vitro de produção de biofilme, hemólise, invasão e persistência em células mamárias bovinas MAC-T e virulência in vivo em modelo Galleria mellonella comprovaram diferenças significativas entre as estirpes. Os resultados sugerem que apenas a caracterização molecular é insuficiente para correlacionar sintomas da doença à uma determinada estirpe. S. aureus 302 e S. aureus 322, além de S. aureus 469 (mastite persistente) e S. aureus 366 (mastite não-persistente) foram contrastadas por uma abordagem proteômica. Extratos de proteínas totais foram preparados a partir de bactérias crescidas até a fase exponencial e separados por eletroforese bidimensional. Um total de 35 spots com abundância diferencial foi detectado, dos quais três foram exclusivos de S. aureus 302 quando comparada a S. aureus 322 e S. aureus 366 e podem representar marcadores que indicam a persistência da bactéria no animal. Este trabalho também avaliou a dispersão de biofilmes de S. aureus NRS 155 e S. epidermidis NRS 101 pela lectina BjcuL, isolada de Bothrops jararacussu. Essa lectina não impediu a adesão inicial das células e foi capaz de inibir a formação de biofilmes quando pré-aderida a superfícies abióticas. Houve uma melhor atividade sobre biofilme pré-formado de S. aureus NRS 155 em comparação S. epidermidis NRS 101. Por qRT-PCR, detectou-se uma alteração na expressão de genes envolvidos no controle do operon ica, responsável pela produção do polissacarídeo de adesão intercelular. Finalmente, BjcuL foi capaz de restaurar a susceptibilidade de bactérias em biofilme pré-formado a antibióticos como gentamicina e ampicilina, revelando o potencial da estratégia antibiofilme no controle de infecções de S. aureus. The great diversity of Staphylococcus aureus strains isolated from milk- producing cattle reinforces the need of bacterial characterization to raise information that can be used in the control of bovine mastitis. In this work, we hypothesized that genetically related S. aureus strains can cause different forms of mastitis. The strains S. aureus 302 and S. aureus 322 were isolated from cows with persistent and non-persistent mastitis, respectively, and harbored the same virulence genes and identical banding profiles when genotyped by multilocus variable-number tandem repeats analysis (MLVA). Pulsed field gel electrophoresis (PFGE) was used as an additional genotyping method and confirmed that the bacteria were genetically related. Despite close proximity, in vitro assays like biofilm production, hemolysis, invasion, and persistence in the bovine mammary epithelial cells (MAC-T) and also in vivo assessment of virulence in the Galleria mellonella model revealed significant differences between the strains. These results suggest that molecular analysis alone is insufficient to establish a link between a bacterial strain and the clinical symptoms of mastitis. Also in this work, S. aureus 302 and S. aureus 322 besides the strains S. aureus 469 (persistent mastitis) and S. aureus 366 (non- persistent mastitis) were analyzed using a proteomic approach. Extracts of intracellular proteins were prepared from bacteria grown until exponential phase and separated by two-dimensional electrophoresis. A total of 35 spots differentially expressed was detected while three of them were exclusive of S. aureus 302 when compared to S. aureus 322 and S. aureus 366, and may represent markers of bacterial persistence in animals. Finally, this study studied the dispersion of S. aureus NRS 155 and S. epidermidis NRS 101 biofilms by the lectin BjcuL isolated from Bothrops jararacussu. The lectin did not prevent the initial adherence of bacterial cells and inhibited biofilm formation when abiotic surfaces were pre-coated with the protein. Anti-biofilm activity was higher on S. aureus NRS 155 preformed biofilms in comparison to S. epidermidis NRS 101. Change in the expression of genes involved in the control of the ica operon, responsible for the production of polysaccharide intercellular adhesin, was detected by qRT-PCR. BjcuL restored susceptibility of preformed biofilms to gentamicin and ampicillin, revealing the potential of antibiofilm strategy to control S. aureus infections.

Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico Staphylococcus aureus é um patógeno humano oportunista que apresenta riscos a saúde humana, é capaz de aderir em superfícies bióticas e abióticas e formar biofilmes, tornando as células mais protegidas e de difícil remoção. Células liberadas do biofilme podem se constituir em importante fonte de contaminação de alimentos, comprometendo a qualidade e a segurança dos mesmos. O objetivo deste estudo foi verificar o efeito da bacteriocina nisina e dos sanitizantes hipoclorito de sódio e ácido peracético, em concentrações subinibitórias, sobre a hidrofobicidade da superfície de poliestireno, sobre o crescimento e formação de biofilmes por estirpes de S. aureus e ainda, verificar a interferência da nisina sobre a composição e estrutura do biofilme desse patógeno. Células de Staphylococcus epidermidis ATCC 35984 foram usadas como referência para formação de biofilmes. O cultivo das bactérias foi feito em caldo Luria-Bertani (LB) ou em meio sintético (MS). A presença de genes de adesão foi determinada pela reação em cadeia da polimerase (PCR) e os três genes avaliados, icaA, icaD e clfB, foram encontrados nas estirpes COL e FRI 722 de S. aureus, enquanto a estirpe Embrapa 4018 de S. aureus e em S. epidermidis, apenas o gene icaA foi identificado. A hidrofobicidade da superfície de poliestireno foi avaliada por meio da medida do ângulo de contato e constatou-se que o meio LB reduziu a hidrofobicidade da superfície, dificultando a observação do efeito dos antimicrobianos sobre a mesma. O tratamento da superfície de poliestireno com MS adicionado de 1,34 mg/L de nisina reduziu a adesão de S. aureus. Concentrações subinibitórias de 2,01 mg/L; 1.500 mg/L e 0,40 mg/L respectivamente dos antimicrobianos nisina, hipoclorito de sódio e do ácido peracético foram adicionadas isoladamente ou combinadas entre si ao caldo LB e constatou-se a diminuição da formação de biofilmes pela cultura mista de estirpes de S. aureus e por S. epidermidis em microplacas de poliestireno quando os antimicrobianos agiram isoladamente. A composição de polissacarídeos e DNA nos biofilmes de S. aureus e S. epidermidis foi alterada quando o cultivo ocorreu na presença de 2,01 mg/L de nisina. Entretanto, o conteúdo em proteínas nos biofilmes formados pela cultura viiimista das estirpes de S. aureus estudadas ou por S. epidermidis não foi alterado pela presença de nisina no meio de cultura em concentração subinibitória. A estrutura do biofilme de S. aureus e S. epidermidis foi avaliada por microscopia confocal a laser, confirmando os resultados quantitativos de que a presença de concentração subinibitória de nisina reduz a formação de biofilmes por estas espécies. Estes resultados demonstram que a investigação de produtos alternativos para auxiliar no controle e combate aos biofilmes é estratégia promissora além de contribuir com informações sobre a composição do biofilme de S. aureus. Staphylococcus aureus is an opportunistic human pathogen that represents risks to the human health and is able to adhere and form biofilms on biotic and abiotic surfaces, being cells more protected and difficult to remove. Cells released from biofilms can be an important source of food contamination, compromising quality and safety. The aim of this work was to investigate the effect of the bacteriocin nisin and the sanitizers sodi- um hypochlorite and peracetic acid, in subinhibitory concentration, on the polystyrene surface hydrophobicity, on the growth and biofilm formation by S. aureus strains and also, verify the interference of nisin on the composition and structure of the pathogen biofilm. As a control of biofilm formation, Staphylococcus epidermidis ATCC 35984 was used. Bacteria were cultivated in Luria-Bertani (LB) broth or in synthetic medium (SM). The presence of adhesion genes was determined by polymerase chain reaction (PCR) and the three evaluated genes, icaA, icaD, and clfB, were found in S. aureus COL and FRI 722, while in the strain Embrapa 4018 and in S. epidermidis, only icaA gene was identified. The hydrophobicity of the polystyrene surface was evaluated by the con- tact angle measurement and it was found that the LB broth reduced the surface hydro- phobicity by itself, hindering the observation of the antimicrobials effect on it. Treat- ment of the polystyrene surface with SM supplemented with 1.34 mg/L of nisin reduced S.aureus adhesion. Subinhibitory concentrations of 2.01 mg/L; 1,500 mg/L and 0.40 mg/L of the antimicrobials nisin, sodium hypochlorite, and peracetic acid, respectively, were added separately or combined with each other in LB broth and the reduction of biofilm formed by S. aureus strains and S. epidermidis in polystyrene microtiter plates occurred when the antimicrobials acted alone. The content of polysaccharides and DNA in the biofilms of S. aureus and S. epidermidis was altered when cultivated in the pres- ence of 2.01 mg/L of nisin. However, the protein percentage in the biofilm formed by the culture mix composed by the three studied strains of S aureus or by S. epidermidis was not modified by the presence culture medium supplemented with subinhibitory concentration of nisin. Biofilm formation by S. aureus and S. epidermidis was also evaluated by confocal laser microscopy, confirming the quantitative results in which xsubinhibitory concentrations of nisin reduces biofilm by these species. These results demonstrate that the investigation of alternative products to help control and eradicate biofilms is a potential strategy and also provides information on the composition of S. aureus biofilms.

Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Minas Gerais Este trabalho foi desenvolvido com o objetivo de avaliar a viabilidade técnica da utilização de bactérias inibidoras de biofilme na desobstrução de gotejadores de sistemas de fertirrigação com esgoto doméstico, avaliando: a formação de biofilme no sistema de fertirrigação por gotejamento que usa água de esgoto doméstico bruto, esgoto doméstico tratado por rampa de escoamento superficial e esgoto doméstico tratado por lagoa facultativa; o desempenho hidráulico do sistema de irrigação por gotejamento durante o processo de formação de biofilme utilizando esgoto doméstico na fertirrigação; a eficiência de colônias de três tipos de bactérias na inibição de biofilme no sistema de irrigação por gotejamento com o uso de esgoto doméstico, na fertirrigação. Na 1° fase, as unidades de fertirrigação funcionaram diariamente por oito horas, com esgoto doméstico bruto, esgoto doméstico tratado por rampa de escoamento superficial e esgoto doméstico tratado por lagoa facultativa, até completar 300 horas de funcionamento. A cada 50 horas mediu-se a vazão de todos os gotejadores de cada linha lateral efluente determinou-se os coeficientes de uniformidade de Christianwen (CUC) e de distribuição (CUD). Na 2° fase do experimento o sistema funcionou diariamente por oito horas, aplicando-se o esgoto doméstico por 250 horas de funcionamento determinando os indicadores de uniformidade, identificando a obstrução dos gotejadores. Na 3° fase do experimento foram utilizadas três colônias de bactérias inibidoras de formação de biofilme, como agentes de desobstrução dos gotejadores, correspondentes a três cepas de Bacillus subtilis pertencentes à Coleção de Culturas do Laboratório de Biotecnologia e Biodiversidade/BIOAGRO/UFV, selecionadas a partir da identificação dos microrganismos presentes nos biofilmes. Utilizou-se colônias no nível populacional de 109 UFC mL-1 (unidades formadoras de colônias por mililitro). O esgoto doméstico bruto apresenta maior capacidade de formação de biofilme. O desempenho hidráulico do sistema de irrigação é afetado pelo uso do esgoto doméstico em fertirrigação reduzindo os valores de CUD e CUC; As colônias de bactérias utilizadas na desobstrução do sistema de fertirrigação localizada por gotejamento são eficientes quanto a seu desempenho na desobstrução dos gotejadores na fertirrigação, mas não o suficiente para tornar o sistema tecnicamente viável. This aim of this research was to evaluate the technical feasibility of using bacteria-inhibiting biofilm in clearing a drip fertirrigation system with sewage, evaluating: the ability of biofilm formation in the system an drip fertirrigation using domestic raw sewage and treated sewage for ramprunoff and domestic sewage treated by facultative lagoon, the hydraulic performance of drip irrigation system during the process of biofilm formation using domestic sewage in fertirrigation; and the efficiency of colonies of three bacteria in the inhibition of biofilm in a drip irrigation system using domestic sewage, in fertirrigation. In the 1st phase, fertirrigation units functioned for eight hours daily, with raw sewage, treated sewage for ramp runoff and domestic sewage treated by facultative pond, to complete 300 hours of operation. Every 50 hours the discharge was measured in all emitters of each drip lateral line to determine the Christiansen uniformity coefficient (CUC) and distribution uniformity nd coefficient (CUD). In a 2 stage of the experiment the system operated daily for eight hours, applying the sewage identified in the first stage for 250 hours of operation. And then take, uniformity indicators were determined identify the drippers obstruction. In the 3rd phase of the experiment three colonies of biofilm inhibiting bacteria were used, as agents of clearing the emitters, correspondenting of three strains of Bacillus subtilis belonging to the Culture Collection of the Laboratory of Biotechnology and Biodiversity / BIOAGRO / UFV, selected using microorganism’s presents in biofilms. We used colonies in the population level of 109 CFU ml-1 (colony-forming units per milliliter). The gross domestic wastewater has higher ability of biofilm formation; Performance Hydraulic irrigation system is affected by the use of domestic sewage in fertirrigation reducing the values of CUD and CUC at levels considered bad or unacceptable from the point of view of irrigation uniformity clearing system of drip irrigation are efficient as his performance in clearing the drippers in drip irrigation, but not enough to make the system technically feasible, the bacteria colony "155" is the most efficient in clearing the drip fertirrigation system in the colony then "111" and "RI 4914 ".

Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico Quorum sensing (QS) is a population density dependent communication system where bacteria produce, detect and respond to signaling compounds of low molecular weight, called autoinducers (AI), which are released into the environment. Salmonella has QS systems regulated by three different AIs: AI-1, AI-2, and AI-3. In this study, we identified and characterized the QS systems mediated by AI-1 and 2 in the human pathogen Salmonella enterica serovar Enteritidis PT4 578, isolated from chicken carcasses. Analyzes were performed in vitro and in silico. We carried out a growth curve of Salmonella Enteritidis in the presence of synthetic AI-1: C6-HSL, C8-HSL, C10-HSL and C12-HSL, and we confirmed that AI-1 do not interfere in the growth. The confirmation that Salmonella Enteritidis is not able to synthesize AI-1 came from TLC. Analysis based on the genome of Salmonella Enteritidis PT4, previously deposited in the GenBank, and the described QS system for Salmonella enterica serovar typhimurium we proposed a model for QS regulation mediated by AI-2 for strain PT4 578. Analysis of the nucleotide sequence that encodes SdiA, the regulatory protein of QS mediated by AI-1, demonstrates the conservation of sdiA in this serovar. The knowledge of phenotypes regulated by QS system may contribute to elucidate important processes in food microbiology and to development control strategies for pathogenic and spoilage microorganism. Therefore we evaluated the biofilm formation by Salmonella on polystyrene microtiter plates in the presence of AI-1 (C6-HSL, C8-HSL, C10-HSL and C12-HSL) at final concentration of 50 nM in the culture medium. It was found that in the presence of AIs and on anaerobic conditions, Salmonella Enteritidis showed a higher number of cells adhered on polystyrene surfaces. Among the AHLs analyzed, C12-HSL showed greater interference with this phenotype. Strong biofilm formation in the presence of C12-HSL was also observed on polystyrene surface by scanning electron microscopy and confocal microscopy. We performed tests to evaluate the interference of AIs in combination. In an attempt to verify the regulation biofilm formation, by AI-1 we added a mix of furanones, wich are know QS inhibitors, and a reduced number of adhered cells was observed. Using Real time polymerase chain reaction analysis, it was found that C12-HSL increased the expression of the genes lpfA, fimF, fliF, glgC, wich are important for biofilm formation as well as the hilA, invA and invF virulence genes. These results demonstrate for the first time the function of SdiA for detection of signalling molecules produced by bacteria in the modulation of important phenotypes for the survival of Salmonella Enteritidis. Quorum sensing (QS) é um sistema de comunicação entre bactérias dependente da densidade populacional, no qual as bactérias produzem, detectam e respondem a compostos sinalizadores de baixa massa molecular, os autoindutores (AIs). Salmonella apresenta sistemas de QS regulados por três diferentes AIs; AI-1, AI-2 e AI-3, que têm função ainda pouco elucidada. Neste trabalho foram identificados e caracterizados os sistemas de QS mediados pelos AIs 1 e 2 no patógeno humano Salmonella enterica sorovar Enteritidis PT4 578, isolado de carcaça de frango. As análises foram feitas in silico e in vitro. Foi acompanhado o crescimento de Salmonella Enteritidis na presença dos AIs-1sintéticos, as N-acil homoserina lactonas (AHLs): C6-HSL (homoserina lactona), C8-HSL, C10-HSL e C12-HSL e verificou-se que esses AIs não interferiram no crescimento deste patógeno. A confirmação de que Salmonella Enteritidis não sintetiza AI-1 foi feita por análise em cromatografia em camada fina. A partir do genoma de Salmonella Enteritidis PT4, previamente depositado no GenBank, foi confirmado que a regulação do QS mediado pelo AI-2 segue o modelo proposto para Salmonella enterica sorovar Typhimurium. A análise da sequência de nucleotídeos codificadora da proteína SdiA, reguladora do QS mediado pelo AI-1, demonstrou a conservação do gene sdiA neste sorovar. O conhecimento de fenótipos regulados pelo sistema QS pode contribuir para a elucidação de processos importantes na microbiologia de alimentos e permitir a elaboração de estratégias de controle deste patógeno. Portanto, foi avaliada a formação de biofilmes em microplaca de poliestireno por Salmonella na presença de AIs-1 (C6- HSL, C8-HSL, C10-HSL e C12-HSL) na concentração final de 50 nM no meio de cultivo. Foi constatado que, na presença de Ais e, em condições de cultivo em anaerobiose, Salmonella Enteritidis apresentou formação de biofilme mais denso e compacto em superfícies de poliestireno. A C12-HSL foi, dentre as AHLs analisadas, a que apresentou maior interferência nesse fenótipo. A formação de biofilme mais intensa na presença de C12-HSL em superfície de poliestireno também foi constatada por microscopia de varredura e microscopia confocal. Para comprovar a regulação do fenótipo de formação de biofilme pelo AI-1, o experimento foi repetido na presença de uma mistura de diferentes furanonas, inibidores de QS. A redução substancial de células aderidas na presença de furanonas confirma o efeito estimulador dos AIs-1 na formação de biofilmes por Salmonella Enteritidis PT4. Por meio da reação em cadeia da polimerase (PCR) em tempo real, foi comprovado que C12-HSL promoveu maior expressão dos genes lpfA, fimF, fliF e glgC, de importância para a formação de biofilmes, assim como, dos genes de virulência hilA, invA e invF. Estes resultados evidenciam, pela primeira vez, a função da SdiA na detecção de moléculas sinais produzidas por outras bactérias gram-negativas na modulação de fenótipos importantes para a sobrevivência e virulência de Salmonella Enteritidis.

Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico Escherichia coli is a microorganism of environmental origin highly adaptive and its ability to form biofilms under certain conditions may be critical for their resistance to antimicrobial treatments, which makes E. coli an important causative agent of mastitis. We studied 27 isolates of E. coli producing biofilms obtained from clinical mastitis belong to the collection of the Federal University of Viçosa. The isolates were tested for sensitivity to antibiotics used to treat mastitis, both for planktonic cells, by assessing the minimal inhibitory concentration - MIC as for the sessile, assessing the minimal biofilm eradication concentration - MBEC. In addition, all isolates were grown in minimal media containing different pH values and glucose concentrations and to assess the influence of these factors in producing biofilms. Similarly underwent the isolates at concentrations of antimicrobial sub-inhibitory to verify the possible induction of these doses on the formation of biofilms. Four isolates were chosen, large and weak biofilm producers, to be analyzed by scanning electron microscopy - SEM. The results revealed a high rate of sensitivity, confirmed by the evaluation of MIC, in which only four (14.8%) isolates had high MIC values ranging from 4 to 10 μg / mL and were classified as resistant. However, for the remaining isolates (85.2%) were lower, ranging from 0.125 to 2 μg/mL classified as sensitive. The evaluation of MBEC indicated that the concentration of antibiotic required to eliminate the sessile cells ranged from the 100 μg/mL 500 μg/mL. Gentamicin and enrofloxacin were possible inducers of biofilm formation, respectively, at 0.0312 and 0.0125 μg / mL. MBEC values were significantly higher in isolated large and moderate-producing biofilms in relation to isolated weak biofilm producers (p < 0.001). There was no correlation between the values of MCEC and MIC (p > 0.05). The biofilm production was higher (p < 0.001) in minimal media with limited glucose (0.5%) and pH values further away from neutrality (pH 5.5 and pH 8, 5) in relation to the minimum means-rich glucose (2,5% and 3.5%) and pH close to neutrality (pH 6.5 and 7,5). The presence of biofilms was confirmed in isolates submitted to the SEM, through visualization of adhered cells and the presence of exopolysaccharides, characterizing the typical architecture of biofilms. The knowledge of the characteristics of biofilm production in isolates of E. coli causing mastitis is an important tool for establishing more efficient treatment strategies. Escherichia coli é um micro-organismo de origem ambiental altamente adaptativo e sua habilidade em formar biofilmes em determinadas condições pode ser fundamental para sua resistência a tratamentos da mastite com antimicrobianos. Estudou-se 27 isolados de E. coli produtores de biofilmes obtidos de leite mastítico. Os isolados foram submetidos a testes de sensibilidade a antimicrobianos usados no tratamento da mastite, tanto para as células planctônicas, por meio da avaliação da concentração mínima inibitória CMI quanto para as sésseis, pela avaliação da concentração mínima de erradicação de biofilmes - CMEB. Todos os isolados foram cultivados em meios mínimos contendo diferentes valores de pH e concentrações de glicose visando investigar a influência desses fatores na produção de biofilmes. De mesmo modo submeteu-se os isolados às CMI para verificar a possível indução dessas concentrações na produção dos biofilmes. Foram escolhidos quatro isolados, grandes e fracos produtores de biofilmes, para serem analisados por microscopia eletrônica de varredura MEV. Os resultados obtidos revelaram uma alta taxa de sensibilidade, confirmada pela avaliação da CMI, na qual apenas quatro (14,8%) isolados obtiveram valores da CMI elevados, variando de 4 a 10 μg/mL, sendo classificados como resistentes. Entretanto, para os demais isolados (85,2%) os valores foram menores, variando de 0,125 a 2 μg/mL, classificados como sensíveis. A avaliação de CMEB indicou que a concentração dos antimicrobianos necessária para eliminar as células sésseis variou de 100 μg/mL a 500 μg/mL. Gentamicina e enrofloxacina foram indutores da produção de biofilmes, respectivamente nas concentrações de 0,0312 e 0,0125 μg/mL. Os valores de CMEB foram significativamente maiores nos isolados grandes e moderados produtores de biofilmes em relação aos isolados fraco produtores biofilmes (p < 0,001). Não houve correlação entre os valores de CMEB e CMI (p > 0,05). A produção de biofilmes foi maior (p < 0,001) nos meios mínimos com pouca disponibilidade de glicose (0,5%) e valores de pH mais distantes da neutralidade (pH 5,5 e 8,5) em relação aos meios mínimos ricos em glicose (2,5% e 3,5%) e com valores de pH próximos da neutralidade (pH 6,5 e 7,5). A presença dos biofilmes foi confirmada nos isolados submetidos à MEV por meio da visualização de células aderidas e da presença de matriz extracelular, caracterizando a arquitetura dos biofilmes. O conhecimento das condições da produção de biofilmes em isolados de E. coli causadores de mastite é uma importante ferramenta para se estabelecer estratégias de controle e tratamentos mais eficientes.

Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico Cyanobacteria produces a wide variety of biological compounds of economic-industrial interest, often referred to as "bioactive molecules". This is a broad term that include substances, which at low concentrations, are able to affect vital metabolic processes. Recently, a new species of cyanobacteria, Brasilonema octagenarum UFV-E1, was identified. The cyanobacteria was found forming a dense biofilm covering the aerial parts of young plants of Eucalyptus spp on a clonal plant nursery. The aim of this study was to investigate the consequences of B. octagenarum colonization, on morphological, biochemical, and growth traits of young plants of Eucalyptus urograndis. The experiments were carried out under humidity and temperature controlled conditions. A cellular suspension of B. octagenarum was applied over the aerial parts of young plants. The control group consisted of non inoculated plants. Thirty days after the inoculation, the formation of scattered colonies over the leaf was observed. There was a decrease of 19% in the chlorophyll a / b ratio in the leaf areas beneath the colonies. There was no significant difference in the content of pigments (chlorophyll a, b and carotenoids). The plants responded positively to the colonization, with increase of dry mass production, mainly of the stem and root. The increase of the root and stem dry mass of colonized plants were significantly higher compared to the control group (19 and 23%, respectively). Neither anatomic alterations nor an increase in the production of total phenolic compounds were observed. During the duration period of the experiment, which compromised the initial stages of colonization, B. octagenarum colonized the aerial part of the plant without damaging it, establishing an epiphytism relation. The effects of bioactive compounds by B. octagenarum, as stimuli to plant growth, such auxin, was tested by means of a bioassay, and the influence of this cyanobacteria species colonization on rooting process of E. urophylla and E. urograndis mini-cuttings was investigated. The extract of B. octagenarum cells was analyzed in liquid chromatography coupled to mass spectrometer, LC-MS/MS. Mini-cuttings of E. urophylla and E. urograndis were inoculated with a concentrated solution of B. octagenarum cells. There was a significant increase in dry mass in the roots (31%), and in the stem (44%) in the E. urophylla. Throught the LC-MS/MS analyses, indol acetic acid (IAA) was identified, has 175 Da. The colonization of B. octagenarum in Eucalyptus urograndis, under the conditions of this study, stimulated the growth of plants, possibly in response to the IAA production. It was demonstrated that B. octagenarum produces the auxin indol acetic acid, and that this cyanobacteria has the potential to be used in developing techniques of vegetative propagation of eucalyptus plants. As cianobactérias produzem uma grande diversidade de compostos biológicos de interesse econômico-industrial, referidos genericamente como "substâncias bioativas", uma expressão ampla que inclui substâncias capazes de, em baixas concentrações, afetar processos metabólicos vitais de outros organismos. Recentemente, uma nova espécie de cianobactéria, Brasilonema octagenarum UFV-E1 foi identificada, em viveiro de produção de mudas clonais, formando um biofilme denso sobre a parte aérea de plantas jovens de Eucalyptus spp. O objetivo deste trabalho foi investigar as conseqüências da colonização por B. octagenarum sobre plantas jovens de Eucalyptus urograndis, sendo analisados aspectos morfológicos, bioquímicos, e de crescimento. Os experimentos foram realizados sob condições de umidade e temperatura controladas. Suspensão celular de B. octagenarum foi aplicada sobre a parte aérea de plantas jovens e o controle consistiu de plantas não inoculadas. Decorridos trinta dias após a inoculação, observou-se a formação de colônias dispersas sobre o limbo foliar. Nas áreas colonizadas, houve diminuição na relação clorofila a / b em 19% em relação ao controle. Não houve diferença significativa no conteúdo dos pigmentos (clorofila a, b e carotenos). Dentre os parâmetros biométricos avaliados (massa seca de folhas, caule e raiz, área foliar e altura do caule) ficou evidente o aumento de massa seca de raiz e de caule em relação ao controle (19 e 23%, respectivamente). Não foram observadas alterações anatômicas, ou a produção de compostos fenólicos totais. B. octagenarum colonizou as folhas das plantas, numa relação de epifitismo, sem ocasionar efeitos prejudiciais, durante o período de avaliação deste estudo, em que foram observados os estágios iniciais da colonização. As plantas responderam positivamente à colonização, com maior produção de massa seca, principalmente de caule e de raiz. Diante deste estímulo no crescimento, semelhante ao tratamento com auxinas, investigou-se a produção de substâncias bioativas por B. octagenarum, através de bioensaio e a influência da colonização por esta espécie de cianobactéria no enraizamento de mini-estacas de E. urophylla e E. urograndis. O extrato de células de B. octagenarum foi analisado em cromatógrafo líquido acoplado em espectrômetro de massa, LC-MS/MS. Mini-estacas de E. urophylla e E. urograndis foram inoculadas com suspensão celular de B. octagenarum. Houve aumento de massa seca de raízes, em 31% e de caule (44%) na espécie E. urophylla. Através da análise em LC-MS/MS, identificou-se o ácido indol acético (AIA), com 175 Da. A colonização por B. octagenarum em Eucalyptus urograndis, sob as condições adotadas neste estudo, estimulou o crescimento das plantas, possivelmente, em resposta à produção do AIA. Foi demonstrado que B. octagenarum produz a auxina ácido indol acético e que essa cianobactéria possui potencial para ser utilizada no desenvolvimento de técnicas de propagação vegetativa em culturas de eucalipto.

Cyanobacteria were isolated from two sites with a different hyrocarbon contamination history. In the first case, biofilms of cyanobacteria were collected in a drainage system, from a gas station of Viçosa City, MG. From these biofilms, the one presenting the greater cyanobacterial diversity was selected to be enriched (using the AA4 liquid medium). Both the integral biofilm (mixed treatment), and a monoclonal culture of Phormidium sp. (monoclonal treatment), which was isolated from the integral biofilm, were tested for [C14] naphthalene biodegradation ability, under photoauthotrophic conditions, and at temperature of 20 ± 1ºC. Mixed treatment as well as monoclonal treatment showed to be able to readily mineralize naphthalene, in the ratio of 28 and 22,5%, respectively, during a experimental period of fifteen days. For both, the cumulative naphthalene degradation plateau was reached around the fourth day of the experiment. Two hypotheses were considered trying to explain the premature plateau degradation: (1) by naphthalene exhaustion, since 14CO2 losses were not registered by the respirometric system used in the test; (2) by nutrient depletion, since there was no soil correction in the experiment. In that case, the only inorganic nutrient source applied was provided by the culture medium (1 mL) used to ressuspend the inoculum. The integral biofilm and the monoclonal culture of Phormidium sp. were considered to have potencial to degrade naphthalene. It was suggested that they could be indicated for future biorremediation experiments of hydrocarbon contaminated sites. On the second case, a cyanobacteria from the genus Phormidium sp. ANT 01 was collected and isolated from antarctic soils without a hydrocarbon contamination history. Phormidium sp. ANT 01 was selected for another experiment using [C14] naphthalene biodegradation, under photoauthotrophic conditions, and at temperture of 15 ± 1ºC. The results showed that the monoclonal culture of Phormidium sp. ANT 01 were not able to degrade naphthalene, when compared with the abiotic treatment (control). A second experiment was carried out to test the biomass production of Phormidium sp. ANT 01 under naphthalene conditions. The exposure of Phormidium sp. ANT 01 to the naphthalene at concentration of 66,67 μg.L-1 caused a inibitory effect on the growth of the organisms around 37%. By reason of its great distribution and abundance in soils of Admiralty Bay, Antarctic, and its sensibility under low naphthalene concentrations, Phormidium sp. ANT 01 showed potencial to be used as a bioindicator of hydrocarbon contaminated soils of this region. Cianobactérias foram isoladas de ambientes com diferentes históricos de contaminação por hidrocarbonetos. Dois biofilmes de cianobactérias foram coletados em uma calha de escoamento, num posto de gasolina na cidade de Viçosa, MG, expostos a doses de hidrocarbonetos. Destes biofilmes, foi selecionado para enriquecimento, em meio AA4 líquido, aquele que apresentou a maior diversidade de organismos. Tanto o biofilme integral (tratamento misto), como a cultura monoclonal de Phormidium sp. (tratamento monoclonal), isolada a partir do biofilme integral, foram testados quanto a capacidade de biodegradação de [C14] naftaleno, em condições fotoautotróficas e à temperatura de 20 ± 1ºC. Tanto o tratamento misto, quanto o monoclonal mostraram-se capazes de mineralizar prontamente o naftaleno, nas proporções de 28 e 22,5%, respectivamente, num período de quinze dias. Para ambos os tratamentos, o platô de degradação cumulativa do naftaleno foi atingido em torno do quarto dia de tratamento. Duas hipóteses foram consideradas como as mais prováveis para explicar o alcance prematuro do platô de degradação: a primeira, seria por exaustão de naftaleno, em função de perdas não registradas de 14CO2 pelo aparato respirométrico, de caráter rústico, utilizado no experimento; a segunda, seria por depleção de nutrientes, já que não houve correção do solo utilizado no experimento, e a única fonte de nutrientes inorgânicos consistiu no meio de cultura utilizado para ressuspender o inóculo (1 mL). Tanto o biofilme integral, quanto a cultura monoclonal de Phormidium sp. foram considerados potencialmente capazes de biodegradar naftaleno, e indicados para a realização de futuros experimentos de biorremediação de áreas impactadas por hidrocarbonetos. Por outro lado, a cianobactéria Phormidium sp. ANT 01 foi isolada de solos antárticos, sem histórico de contaminação por hidrocarbonetos, e selecionada para a condução de um novo experimento de biodegradação de [C14] naftaleno, sob condições fotoautotróficas, à temperatura de 15 ± 1ºC. Sob as condições testadas, a cultura monoclonal de Phormidium sp. ANT 01 não se mostrou capaz de degradar naftaleno, quando comparada ao tratamento abiótico (controle). Um segundo experimento foi conduzido a fim de monitorar o crescimento de Phormidium sp. ANT 01 sob a presença de naftaleno. A exposição de Phormidium sp. ANT 01 a uma concentração de naftaleno igual a 66,67 μg.L-1 provocou um efeito inibitório sobre o crescimento dos organismos na ordem de 37%. Por apresentar grande distribuição e abundância em solos da Baía do Almirantado, Antártica, e sensibilidade a baixas concentrações de naftaleno, Phormidium sp. ANT 01 possui potencial para ser utilizado como bioindicador de solos contaminados com derivados do petróleo, nesta região.

The purposes of this work were to investigate the formation of biofilms from Pseudomonas fluorescens strains isolated from cold raw milk and proteolytic activity in these biofilms. Viability to detect these cells in milk was also investigated through immunological methods. Potential development of biofilms in AISI 304 stainless steel surface, finishing #4 was evaluated under temperatures of 7 ºC and 22 °C. The number of cells from a mixed culture composed of seven P. fluorescens strains adhered to stainless steel plates increased proportionally to the increase of planktonic cell population reaching about 108 UFC.mL-1 after 72 hours of incubation in 12% reconstituted skimmed milk (RSM) at 22 °C. Proteolytic activity verified in RSM supernatant 12% in the presence of stainless steel with adhered cells was higher than in the absence, which suggests that adhered cells, or in biofilms may secrete enzymes to the external medium. The evaluation of cell growth from pure P. fluoresnces cultures 041 and 097 in tryptone, yeast extract, phosphate (TYEP) medium and in RSM 1%, or 12% has indicated that TYEP medium stimulated growth, but not proteolytic activity at 7 ºC and 22 °C. It was verified that adhesion capacity with the development of biofilms is different among strains from the same species. Adhesion capacity with the development of biofilms and proteolytic activity are independent properties in the bacteria tested. P. fluorescens 041 presented low adhesion capacity to stainless steel plates at 7°C and high proteolytic activity whereas the number of P. fluorescens 097 adhered cells was about109 UFC.mL-1 at 7 ºC and 22°C. Proteolytic activity, however, was lower. Biofilm investigation witth scanning electron microscope made clear that P. fluorescens 097 has formed multilayered cell agglomerates on the surface of stainless steel plates. Polyclonal antisera produced in nine rabbits against mixtures of P. fluorescens strains presented different sensivtivity levels, with the capacity to detect cells in concentrations which vary from 103 UFC.mL-1 to 108 UFC.mL-1. Produced antisera have not presented cross-reaction with other contaminating bacterial species from cold raw milk, with the exception of 2A and 3A antisera which reacted with Aeromonas. P. fluorescens cells were detected at RSM 12% in 103 UFC mL-1 and 105 UFC.mL-1 concentrations when drop agglutination and imunodotblot techniques were applied. These results indicate the potential of these procedures to detect these damaging bacteria at a concentration level which does not affect the quality of the milk. Os objetivos deste trabalho foram investigar a formação de biofilmes por estirpes de Pseudomonas fluorescens isoladas de leite cru refrigerado e a atividade proteolítica nesses biofilmes. Pesquisou-se, também, a viabilidade de detecção dessas células no leite, por métodos imunológicos. O potencial de desenvolvimento de biofilmes em superfície de aço inoxidável AISI 304 acabamento # 4 foi avaliado em temperaturas de 7 oC e 22 oC. O número de células de uma cultura mista constituída de sete estirpes de P. fluorescens, aderidas a placas de aço inoxidável aumentou, proporcionalmente ao aumento da população de células planctônicas, atingindo em torno de 108 UFC-CFU.mL-1, após 72 h de incubação em leite desnatado reconstituído (LDR) a 12%, a 22 oC. A maior atividade proteolítica constatada no sobrenadante de LDR 12% em presença de placas de aço inoxidável com células aderidas que, em ausência, sugere que células aderidas, ou, em biofilmes, podem secretar enzimas para o meio externo. A avaliação da adesão de células de culturas puras de P. fluorescens 041 e 097, em meio triptona extrato de levedura e fosfato (TYEP) e em LDR 1% ou 12%, indicou que o meio TYEP estimulou crescimento, mas, não a atividade proteolítica a 7 ºC e 22 ºC. Constatou-se que a capacidade de adesão com desenvolvimento de biofilmes é diferente entre as estirpes de uma mesma espécie. Adesão, formação de biofilmes e a atividade proteolítica são propriedades independentes, nas bactérias avaliadas. P. fluorescens 041 apresentou baixa capacidade de adesão a placas de aço inoxidável a 7 oC e uma alta atividade proteolítica, enquanto o número de células aderidas de P. fluorescens 097 foi da ordem de 109 UFC.mL-1 a 7 oC e 22 oC, mas apresentou atividade proteolítica menor. A observação dos biofilmes em microscópio eletrônico de varredura evidenciou que P. fluorescens 097 formou aglomerados com multicamadas celulares na superfície das placas de aço inoxidável. Anti-soros policlonais produzidos em nove coelhos contra misturas de estirpes de P. fluorescens apresentaram sensibilidades diferentes, com capacidade de detecção de células em concentrações que variaram de 103 UFC-CFU.mL-1 a 108 UFC.mL-1. Os anti-soros produzidos não apresentaram reação cruzada com outras espécies bacterianas contaminantes do leite cru refrigerado, à exceção dos anti-soros 2A e 3A que reagiram com Aeromonas. Aplicando-se técnicas de aglutinação em gota e de imunodot-blot, foram detectadas células de P. fluorescens em LDR 12% em concentrações de 103 UFCCFU. mL-1 e 105 UFC-CFU.mL-1. Estes resultados indicam o potencial desses procedimentos, para detectar células das bactérias deterioradoras, em uma faixa de concentração não-comprometedora da qualidade do leite.