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A pitaya é uma cactácea originária das florestas tropicais americanas que produz frutos exóticos bem apreciados e comercializados, principalmente no continente asiático. Contudo, ainda é uma espécie vegetal que demanda informações técnicas de cultivo nas áreas agrícolas brasileiras, motivando pesquisas em várias áreas do conhecimento. Objetivou-se avaliar diferentes substratos no enraizamento de cladódios imersos e não imersos no regulador de crescimento, ácido naftalenacético (ANA), na formação e desenvolvimento inicial de raízes em estacas de Hylocereus undatus, resultando em mudas mais vigorosas e de melhor qualidade. O experimento foi conduzido sob ripado no Departamento de Produção Vegetal - setor de Horticultura da Faculdade de Ciências Agronômicas no campus de Botucatu - UNESP. O delineamento experimental foi o inteiramente aleatorizado em esquema fatorial 4 x 2 (substratos x condições) com quatro repetições. Após 60 dias da instalação do experimento foram avaliados: massa fresca e seca da parte aérea, massa fresca e seca das raízes e o comprimento da maior raiz. O crescimento e desenvolvimento radicular inicial de mudas não são influenciados pelo regulador vegetal ANA. Os substratos com a presença de areia são os mais adequados para a formação de mudas vigorosas e de boa qualidade. A mistura areia + esterco bovino proporciona maior acúmulo de fitomassa no sistema radicular de pitaya (H. undatus).The pitaya, a cactaceous species native to American tropical forests, produces well-appreciated and commercialized exotic fruits, mainly in the Asian continent. However, this plant species still requires technical information regarding cultivation in Brazilian agricultural areas, encouraging thus studies in several knowledge areas. This work aimed to evaluate the effect of different substrates on the rooting of cladodes immersed or not in the plant growth regulator naphthaleneacetic acid (ANA), as well as on root formation and initial development of Hylocereus undatus cuttings, which provides more vigorous and higher-quality seedlings. The experiment was carried out in a lath house of the Department of Plant Production - Horticulture Sector, College of Agronomical Sciences, Botucatu Campus, São Paulo State University (UNESP). Experimental design was completely randomized, in a 4x2 (substrates x conditions) factorial arrangement, with four replicates. At 60 days after the experiment establishment, shoot fresh and dry matter, root fresh and dry matter, and the highest root length were evaluated. The initial root growth and development of seedlings were not influenced by ANA. Substrates containing sand were the most suitable to produce vigorous and high-quality seedlings. Sand+manure bovine mixture provided higher phytomass accumulation in the root system of pitaya (H. undatus).