Search

Les infeccions de pròtesi articular són complicacions serioses difícils de tractar, que poden generar seqüeles físiques irreversibles i grans costos econòmics. Staphylococcus epidermidis és un comensal important en la pell humana que ha tingut un gran impacte com a patogen oportunista en les infeccions relacionades amb cossos estranys. S’han descrit gens com a marcadors moleculars que diferencien soques infectives de S. epidermidis de les soques comensals. Fins a la data, no s’ha identificat un marcador únic per distingir les soques infectives de les soques comensals de S. epidermidis. En aquest estudi, es pretén identificar marcadors genètics relacionats amb la patogenicitat de S. epidermidis que permetin discriminar la població de soques d’infecció i comensal. Per arribar a aquest objectiu, s’han estudiat 117 soques de 3 poblacions de S. epidermidis: 50 soques de pacients amb infecció de pròtesi articular (IPA), 50 soques de la pell i fosses nasals de persones sanes (PS), i 17 soques del camp quirúrgic durant una artroplàstia primària (CQ). La població de CQ no havia estat estudiada ni comparada amb les altres poblacions. Els principals objectius van ser determinar la sensibilitat a antibiòtics i detectar els mecanismes de resistència, determinar l’estructura poblacional mitjançant camp pulsat (PFGE) i multilocus sequence typing (MLST), determinar la formació de biofilm i detectar els gens implicats o altres elements. Addicionalment, es va fer un estudi de seqüenciació massiva (WGS) en les soques ST2. L’estudi de sensibilitat antibiòtica va determinar altes taxes de resistència a la majoria dels antibiòtics testats, on les soques d’IPA van ser les més resistents, seguides de les soques CQ i PS. La tècnica de MLST va determinar en 117 soques de S. epidermidis 54 secuenciotipos (STs) diferents, i es van descriure 24 STs i 14 al·lels nous per primera vegada. El ST2 va predominar en les soques d’IPA (44%) i va ser exclusiu en aquesta població, seguit del ST640 i el ST5 (12% ambdós). Les soques PS i CQ van presentar una gran variabilitat de STs, sense cap ST predominant. La majoria de soques (68%) es van agrupar en el CC2. L’anàlisi per PFGE va determinar 6 patrons de PFGE, que van incloure de 2-5 soques i 52 patrons únics de PFGE. Es va realitzar un estudi complementari per WGS per profunditzar en les relacions epidemiològiques a través de l’enfocament per SNPs i es van determinar dos possibles esdeveniments de transmissió de pacient a pacient. No va ser possible confirmar la transmissibilitat ja que no es van trobar relacions clínic-epidemiològiques. Totes les soques van ser productores de biofilm, el que suggereix que la formació de biofilm no és un factor discriminatiu de les soques d’infecció i comensals. El contingut de gens relacionats amb la formació de biofilm va variar entre les diferents poblacions de soques. En les soques d’IPA van predominar els gens sdrF, bhp, l’operó ica i la seqüència d’inserció IS256, i en les soques comensals els gens embp i hld i l’element mòbil ACME. En conclusió, tot i la dificultat de definir les soques de S. epidermidis que causen la infecció, aquest estudi va trobar que l’evidència que les soques infeccioses i comensals no eren equivalents. No s’ha trobat un marcador únic per diferenciar les soques d’infecció de les soques comensals, però una combinació de diversos marcadors ens va permetre establir diferències entre les poblacions. Les soques d’infecció protèsica pertanyien amb més freqüència al clon patogènic ST2 i van adquirir determinants genètics que van promoure la infecció, com l’operó ica, IS256, sdrF, bhp i mecA. Per contra, les soques comensals es van caracteritzar per la presència significativa de embp, hld i ACME. Es recomana WGS per a estudis de filogènia i detecció de de gens en S. epidermidis. Las infecciones de prótesis articular son complicaciones serias difíciles de tratar, que pueden generar secuelas físicas irreversibles y grandes costos económicos. Staphylococcus epidermidis es un comensal importante en la piel humana que ha tenido un grande impacto como patógeno oportunista en las infecciones relacionadas con cuerpos extraños. Se han descrito genes como marcadores moleculares que diferencian cepas infectivas de S. epidermidis de las cepas comensales. Hasta la fecha, no se ha identificado un marcador único para distinguir las cepas infectivas de las cepas comensales de S. epidermidis. En este estudio, se pretende identificar marcadores genéticos relacionados con la patogenicidad de S. epidermidis que permitan discriminar la población de cepas de infección y comensal. Para llegar a este objetivo, se han estudiado 117 cepas de 3 poblaciones de S. epidermidis: 50 cepas de pacientes con infección de prótesis articular (IPA), 50 cepas de la piel y fosas nasales de personas sanas (PS), y 17 cepas del campo quirúrgico durante una artroplastia primaria (CQ). La población de CQ no había sido estudiada ni comparada con las otras poblaciones. Los principales objetivos fueron determinar la sensibilidad a antibióticos y detectar los mecanismos de resistencia, determinar la estructura poblacional mediante campo pulsado (PFGE) y multilocus sequence typing (MLST), determinar la formación de biofilm y detectar los genes implicados u otros elementos. Adicionalmente, se hizo un estudio de secuenciación masiva (WGS) en las cepas ST2. El estudio de sensibilidad antibiótica determinó altas tasas de resistencia a la mayoría de los antibióticos testados, donde las cepas de IPA fueron las más resistentes, seguidas de las cepas CQ y cepas PS. La técnica de MLST determinó en 117 cepas S. epidermidis 54 secuenciotipos (STs) diferentes, y se describieron 24 STs y 14 alelos nuevos por primera vez. El ST2 predominó en las cepas de IPA (44%) y fue exclusivo en esta población, seguido del ST640 y el ST5 (12% ambos). Las cepas PS y CQ presentaron una gran variabilidad de STs, sin ningún ST predominante. La mayoría de cepas (68%) se agruparon en el CC2. El análisis por PFGE determinó 6 patrones de PFGE que incluyeron de 2-5 cepas y 52 patrones únicos de PFGE. Se realizó un estudio complementario por WGS para profundizar en las relaciones epidemiológicas a través del enfoque por SNPs y se determinaron dos posibles eventos de transmisión de paciente a paciente. No fue posible confirmar la transmisibilidad ya que no se encontraron relaciones clínico-epidemiológicas. Todas las cepas fueron productoras de biofilm, lo que sugiere que la formación de biofilm no es un factor discriminativo de las cepas de infección y comensales. El contenido de genes relacionados con la formación de biofilm varió entre las diferentes poblaciones de cepas. En las cepas de IPA predominaron los genes sdrF, bhp, el operón ica y la secuencia de inserción IS256, y en las cepas comensales los genes embp y hld y el elemento móvil ACME. En conclusión, a pesar de la dificultad de definir las cepas de S. epidermidis que causan la infección, este estudio encontró que la evidencia de que las cepas infecciosas y comensales no eran equivalentes. No se encontró un marcador único para diferenciar las cepas de infección de las cepas comensales, pero una combinación de varios marcadores nos permitió establecer diferencias entre las poblaciones. Las cepas de infección protésica pertenecían con mayor frecuencia al clon patogénico ST2 y determinantes genéticos adquiridos que promovieron infección, como el operón ica, IS256, sdrF, bhp y mecA. Por el contrario, las cepas comensales se caracterizaron por la presencia significativa de embp, hld y ACME. Se recomienda WGS para estudios de filogenia y detección de genes. Prosthetic joint infections are serious complications that are difficult to treat, which can generate irreversible physical sequelae and high economic costs. Staphylococcus epidermidis is an important commensal in human skin that has had a great impact as an opportunistic pathogen in foreign body related infections. Genes have been described as molecular markers that differentiate infective strains of S. epidermidis from commensal strains. To date, no single marker has been identified to distinguish infective strains from commensal strains of S. epidermidis. In this study, the aim is to identify genetic markers related to the pathogenicity of S. epidermidis that allow discriminating the population of infection and commensal strains. To achieve this objective, 117 strains from 3 populations of S. epidermidis have been studied: 50 strains from patients with joint prosthesis infection (IPA), 50 strains from the skin and nasal swabs of healthy people (PS), and 17 strains of the surgical field during a primary arthroplasty (CQ). The CQ population had not been studied or compared with the other populations. The main objectives were to determine the susceptibility to antibiotics and detect the resistance mechanisms, determine the population structure using pulsed field (PFGE) and multilocus sequence typing (MLST), determine the biofilm formation and detect the genes involved or other elements. Additionally, a whole genome study (WGS) was performed on the ST2 strains. The antibiotic susceptibility study determined high rates of resistance to most of the antibiotics tested, where the IPA strains were the most resistant, followed by the CQ and PS strains. The MLST technique determined in 117 S. epidermidis strains 54 different sequence-type (STs), and 24 STs and 14 new alleles were described for the first time. The ST2 predominated in IPA strains (44%) and was exclusive in this population, followed by ST640 and ST5 (12% both). The PS and CQ strains presented a great variability of STs, without any predominant ST. Most of the strains (68%) were grouped in CC2. The PFGE analysis determined 6 PFGE patterns that included 2-5 strains and 52 unique PFGE patterns. A complementary study was performed by WGS to study the epidemiological relationships through the SNP approach and two possible transmission events from patient to patient were determined. It was not possible to confirm the transmissibility because no clinical-epidemiological relationships were found. All strains were biofilm-producing, suggesting that biofilm formation is not a discriminatory factor for infecting and commensal strains. The genetic content related to biofilm formation varied between different populations of strains. In the IPA strains the sdrF, bhp, the ica operon and the IS256 predominated, and in the commensal strains the embp and hld genes and the mobile element ACME. In conclusion, despite the difficulty of defining the S. epidermidis strains that causing the infection, this study found that the evidence that infectious and commensal strains were not equivalent. No single marker was found to differentiate infection strains from commensal strains, but a combination of several markers allowed us to establish differences between populations. The prosthetic infection strains most frequently belonged to the pathogenic clone ST2 and acquired genetic determinants that promoted infection, such as the ica operon, IS256, sdrF, bhp and mecA. In contrast, commensal strains were characterized by the significant presence of embp, hld, and ACME. WGS is recommended for gene detection and phylogeny studies. Universitat Autònoma de Barcelona. Programa de Doctorat en Microbiologia

Campylobacter jejuni es considerado uno de los principales patógenos entéricos a nivel mundial. Nuestro estudio, realizado con cepas aisladas de muestras de humanos, pollos de engorde y aves salvajes, mostró que existe una elevada variabilidad genética en las tres poblaciones. La población de aves salvajes fue la que mayores rasgos distintivos mostró en relación a las poblaciones de humanos y de pollos. Mediante la técnica del campo pulsado, sólo se identificaron 4 clones, los cuales se componían de entre 2 y 6 cepas aisladas de muestras de aves salvajes en tres clones y en un clon de cepas aisladas de muestras de pollos. No fue identificado ningún clon conformado por cepas aisladas de muestras de humanos pues se escogieron pacientes no relacionados con ningún brote. Mediante la técnica del MLST, se identificaron 64 secuencias tipos (ST); de las cuales sólo 3 se compartían entre todas las poblaciones de estudio, 10 entre la población humana y de pollos, y ninguna entre aves salvajes y humanos o aves salvajes y pollos. Por otra parte, se observó un elevado porcentaje de resistencia a tetraciclina (71.3%), ciprofloxacina (67.3%), ácido nalidíxico (64.6%) y ampicilina (63.3%), mientras que en menor medida a aminoglucósidos (7.3%). La población que mostró mayores valores de resistencia frente a estos antimicrobianos fueron las cepas aisladas de muestras de pollos, seguidas por las cepas aisladas de muestras de humanos y menor medida en la población de cepas aisladas de muestras de aves salvajes. Más de la mitad de las cepas estudiadas (58.2%) presentaron multiresistencia, principalmente, a ampicilina, ciprofloxacina y tetraciclina. Los mecanismos involucrados en la resistencia a ampicilina y tetraciclina no fueron exclusivamente debido a la presencia de los genes blaOXA, tetO/tetA, sino que la mutación en Thr86Ile en el gen gyrA, fue la responsable de la resistencia a ciprofloxacina. Además la presencia de las enzimas que modifican aminoglucósidos fueron las responsables, en la mayoría de los casos, de la resistencia a gentamicina, kanamicina y estreptomicina. Mediante el análisis de algunas cepas Whole Genome Sequencing y la determinación del cgMLST y wgMLST, se logró establecer un punto de corte que definió de una manera más exacta, las relaciones epidemiológicas. Además, con el uso de esta herramienta y mediante el análisis con diferentes softwares, se lograron identificar los genes y las mutaciones puntuales responsables de la resistencia a antibióticos, lo cual permitió comprobar o corroborar la información obtenida mediante las técnicas convencionales anteriormente utilizadas en el estudio. Con todos los datos obtenidos en este estudio se confirma que la campilobacteriosis es causada en humanos por el consumo de carne de pollo contaminada, y que esta contaminación puede ocurrir más allá de las granjas de cría, donde juega un papel importante la transportación y el manejo en los mataderos. También pudimos observar que la presencia de C. jejuni en aves salvajes presenta una elevada especificidad hospedador-patógeno, y que la presencia de estas aves en zonas urbanas propicia la diseminación del patógeno, lo cual representa un riesgo potencial de contaminación para los humanos. Campylobacter jejuni is considered one of the main enteric pathogens worldwide. In our study, a high genetic variability was observed in C. jejuni strains isolated from human, broiler and wild bird samples. Comparatively wild birds showed the most distinctive features among the three populations. Using pulsed field gel electrophoresis, only 4 clones were identified, each consisting of between 2 and 6 strains; 3 clones included wild bird strains and 1 clone included broiler strains. No clone was identified from strains isolated from human samples because the patients selected for this study were not associated with any outbreak. Using the MLST technique, 64 sequence types (ST) were identified, only 3 of which were found in all three study populations, 10 in both human and broiler samples, and no ST was shared between wild birds and humans, or wild birds and broilers. Among the strains, a high percentage of resistance was observed to tetracycline (71.3%), ciprofloxacin (67.3%), nalidixic acid (64.6%) and ampicillin (63.3%), and to a lesser extent to aminoglycosides (7.3%). Strains isolated from broiler samples showed the highest resistance to these antimicrobials, followed by those isolated from humans and finally from wild bird samples. More than half of the strains studied (58.2%) presented multidrug resistance, principally, to ampicillin, ciprofloxacin and tetracycline. The mechanisms involved in ampicillin and tetracycline resistance were not exclusively due to the presence of the blaOXA, tetO / tetA genes, but the Thr86Ile mutation in the gyrA gene was responsible for the resistance to ciprofloxacin. Also, in most cases, enzymes that modify aminoglycosides were responsible for the resistance observed to gentamicin, kanamycin and streptomycin. Strains analysis by Whole Genome Sequencing and the determination of cgMLST and wgMLST, enabled the establishment of a cut-off point to define the epidemiological relationships between strains more precisely. Moreover, the use of this tool together with analysis with different software allowed genes and point mutations responsible for antimicrobial resistance to be identified, which permitted the information obtained by more conventional techniques in this study to be verified or corroborated. The data obtained in this study, confirms that campylobacteriosis in humans is caused by the consumption of contaminated broiler meat, and that this contamination can occur outside of breeding farms, and is associated with transportation and slaughterhouse management. We also observed that C. jejuni in wild birds has high host-pathogen specificity, and that the presence of these birds in urban areas favors the dissemination of the pathogen, which represents a potential contamination risk for humans.

En aquesta tesis s’ha determinat l’epidemiologia dels principals virus respiratoris circulants en el nostre medi i s’ha avaluat l’aportació de la tecnologia molecular al diagnòstic de rutina de les infeccions respiratòries víriques. Es van recollir les dades dels virus respiratoris detectats entre gener de 1997 i desembre de 2013, a l’Hospital de la Santa Creu i Sant Pau. Es va analitzar la freqüència, la distribució estacional i la relació entre els virus detectats amb l’edat i el sexe dels pacients. Les mostres incloses van ser mocs nasofaringis, exsudats nasals i faringis, rentades broncoalveolars i biòpsies pulmonars i es van analitzar mitjançant tècniques d’immunocromatografia, immunofluorescència (IF), cultiu cel·lular (CC) i detecció d’àcids nucleics dels virus gripals. De les 36.744 mostres estudiades, 13.201 (35,9%) van resultar positives per un o més virus. En total es van detectar 13.630 virus respiratoris, dels quals el RSV (29,4%) va ser el virus més detectat, el FLUAV (28,7%) el segon i l’AdV (14,7%) el tercer. La resta de virus respiratoris es van detectar amb una freqüència inferior al 10%: EV (9,3%), FLUBV (6,7%), hMPV (5,1%), RV (4,4%), PIV-3 (3%), PIV-1 (1,1%) i PIV-2 (, The present thesis aimed to determine the epidemiology of the main respiratory viruses circulating in our geographical area. The contribution of molecular techniques to the routine diagnosis of the infections caused by these viruses was also evaluated. Data of the respiratory viruses detected at Hospital de la Santa Creu i Sant Pau between January 1997 and December 2013 were collected. The circulation of respiratory viruses, including frequency and seasonal distribution, was analysed. The relationship between the viruses detected and the age and sex of the patients was also evaluated. The clinical specimens analysed included nasopharyngeal aspirates, nasal and pharyngeal exudates, bronchoalveolar lavages and lung biopsies. The virological studies were performed by cell culture (CC), immunochromatography and immunofluorescence (IF); a nucleic acid amplification technique (NAAT) for detection of Influenza viruses was also used. A total of 36,744 clinical specimens were studied. Of these, 13,201 (35.9%) were positive for one virus or more than one. Overall 13,630 respiratory viruses were identified: RSV (29.4%) was the most frequently detected, followed by FLUAV (28.7%) and AdV (14.7%). The other viruses were detected in a frequency under 10%: EV (9.3%), FLUBV (6.7%), hMPV (5.1%), RV (4.4%), PIV-3 (3%), PIV-1 (1.1%) and PIV-2 (

INTRODUCCIÓN: Los aminoglucósidos han ido perdiendo su lugar en el arsenal terapéutico para combatir las infecciones por enterobacterias, en parte debido al surgimiento de otros antibióticos de mayor espectro y menor toxicidad, como las cefalosporinas de 3a y 4a generación o las fluoroquinolonas, y en parte al incremento de resistencias, debidas fundamentalmente a la presencia de enzimas modificadoras de aminoglucósidos (EMAG). Sin embargo, tras la aparición de cepas multiresistentes para las que las alternativas terapéuticas son muy limitadas, los aminoglucósidos recuperaron importancia en el tratamiento de infecciones, especialmente en el medio hospitalario. En el laboratorio de Microbiología Clínica los aminoglucósidos representan un grupo de antimicrobianos para los que es difícil la interpretación del antibiograma de disco difusión. OBJETIVOS: Conocer la prevalencia de resistencia a aminoglucósidos en Enterobacteriaceae en nuestro medio y la prevalencia de genes de EMAG, así como las características fenotípicas de los halos de inhibición. Determinar la asociación entre la resistencia por técnica de disco difusión, la presencia de genes de EMAG y las características fenotípicas del borde del halo de inhibición, creando reglas que ayuden a la interpretación del antibiograma de disco difusión de aminoglucósidos en Enterobacteriaceae. METODOLOGÍA: Se ha realizado un estudio transversal descriptivo y observacional en el que se han analizado 788 aislados de enterobacterias aisladas entre el 1 de Enero de 2006 y el 31 de Marzo de 2006 en el Hospital de la Santa Creu i Sant Pau de Barcelona, España. Estudio de la sensibilidad a kanamicina, gentamicina, tobramicina, amikacina, netilmicina, neomicina, estreptomicina y espectinomicina por técnica de disco difusión, detección de los genes aph(3")-Ia, aph(3")-Ib, ant(3")-Ia, aph(3')-Ia, ant(2")-Ia, aac(3)-IIa, aac(6')-Ia, aac(6')-Ib, aac(6')-Ic, aac(3)-Ia, aac(3)-Ib, aac(2')-Ia mediante la técnica de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Estudio de relación clonal de los aislados mediante ERIC-PCR y PFGE. RESULTADOS y CONCLUSIONES: La sensibilidad a los antimicrobianos en Enterobacteriaceae entre 2004 y 2006 en el Hospital de la Santa Creu i Sant Pau se ha mantenido estable en el grupo de los betalactámicos, mientras que ha aumentado un 30% la resistencia a las quinolonas y ha aparecido resistencia a amikacina, manteniéndose la resistencia a gentamicina y tobramicina menor al 10%. El patrón de resistencia a aminoglucósidos más prevalente fue el provocado por aph(3’’)-Ib que confiere resistencia a estreptomicina, presente en un tercio de los aislados resistentes a alguno de los aminoglucósidos estudiados. De los patrones que afectan aminoglucósidos de uso clínico, el más prevalente fue el provocado por aac(3)-IIa: resistencia a gentamicina y tobramicina, presente en el 60% de los aislados con resistencias a aminoglucósidos de uso clínico. La presencia de características fenotípicas en los halos de inhibición (halo cortante y salto de colonias) se asoció de manera significativa con la presencia de genes de EMAG en los 8 aminoglucósidos evaluados., INTRODUCTION: Aminoglycosides have been losing their place in the therapeutic arsenal for combating enterobacterial infections, partly due to the emergence of other antibiotics greater spectrum and lower toxicity, such as cephalosporins or 3rd and 4th generation fluoroquinolones, and partly the increase of resistance, mainly due to the presence of aminoglycoside modifying enzymes (AME). However, after the emergence of multi-resistant strains for which therapeutic options are very limited, aminoglycosides regained importance in the treatment of infections, especially in hospitals. In the Clinical Microbiology Laboratory aminoglycoside antibiotics represent a group that is difficult for the interpretative reading of disk diffusion antibiogram. OBJECTIVES: To determine the prevalence of aminoglycoside resistance in Enterobacteriaceae in our area, the prevalence of AME genes and phenotypic characteristics of the inhibition zone edge. To determine the association between resistance by disk diffusion technique, the presence of AME genes and phenotypic features of the inhibition zone edge, creating rules to assist the interpretative reading of disk diffusion antibiogram of aminoglycosides in Enterobacteriaceae METHODS: We performed an observational descriptive study which analyzed 788 isolates of Enterobacteriaceae isolated between January 1, 2006 and March 31, 2006 at the Hospital de la Santa Creu i Sant Pau, Barcelona, Spain. Study of sensitivity to kanamycin, gentamicin, tobramycin, amikacin, netilmicin, neomycin, streptomycin and spectinomycin by disk diffusion technique, detection of genes aph (3")-Ia, aph (3")-Ib, ant (3")-Ia, aph (3')-Ia, ant (2")-Ia, aac (3)-IIa, aac (6')-Ia, aac (6')-Ib, aac (6')-Ic , aac (3)-Ia, aac (3)-Ib, aac (2')-Ia by the technique of polymerase chain reaction (PCR). Study of clonal relationships of isolates by ERIC-PCR and PFGE. RESULTS AND CONCLUSIONS: The antimicrobial susceptibility in Enterobacteriaceae between 2004 and 2006 in the Hospital de la Santa Creu i Sant Pau, Barcelona, Spain has remained stable in the beta-lactam group, while resistance to fluoroquinolones increased up to 30%, and has appeared amikacin resistance, while resistance to gentamicin and tobramycin continued below 10%. The most prevalent aminoglycoside resistance pattern was caused by aph (3'')-Ib conferring resistance to streptomycin, present in one third of the isolates resistant to one of the aminoglycosides studied. Of patterns affecting aminoglycosides in clinical use, the most prevalent was caused by aac (3)-IIa: resistance to gentamicin and tobramycin, present in 60% of isolates with resistance to aminoglycosides in clinical use. The presence of phenotypic features in the inhibition zone edge (sharper zone and colonies inside inhibition zone) was significantly associated with the presence of AME genes in the 8 aminoglycosides tested.

Les betalactamases AmpC plasmídiques (pACBL) es varen descriure a finals de la dècada dels 80 i es caracteritzen per presentar un patró fenotípic indistingible a la hiperproducció d’una betalactamasa AmpC cromosòmica, sent per tant resistents a les penicil·lines, cefalosporines de primera, segona i tercera generació, monobactàmics i combinacions amb inhibidors, mantenintse únicament sensibles a cefalosporines de quarta generació i carbapenèmics. La detecció de les pACBL suposa tot un repte per als laboratoris de microbiologia clínica degut a la falta de mètodes fenotípics estandarditzats. En l’estudi nacional de control de qualitat que hem realitzat, s’observa que la capacitat dels centres espanyols per a detectar i informar la producció de betalactamases d’espectre ampliat (BLEA) en aïllats de Klebsiella pneumoniae i Escherichia coli és molt superior a la capacitat per a detectar i informar la producció d’enzims AmpC en aquestes espècies. Recentment s’han desenvolupat mètodes comercials per a la detecció fenotípica de pACBL al laboratori. El problema és que aquests mètodes no són vàlids per a detectar pACBL en microorganismes productors d’una AmpC cromosòmica natural. No obstant, la presència de colònies situades a la proximitat dels halos d’inhibició de cefoxitina, cefotaxima, ceftazidima i aztreonam s’ha descrit com un possible indicador de la presència d’aquests enzims en Escherichia coli. Aquesta va ser l’única eina fenotípica que ens ha permès sospitar la presència d’una pACBL en una soca productora d’una AmpC cromosòmica natural, descrivint per primer cop una pACBL en una soca de Serratia marcescens. En aquest estudi, s’ha suggerit també la transferència horitzontal in vivo d’un plasmidi de 70 kb portador dels gens blaDHA-1 i qnrB entre aïllats de S. marcescens i d’E. coli. L’increment del nombre de soques productores de pACBL i els escassos estudis de prevalença d’aquests enzims a l’Estat Espanyol va propiciar la realització d’un estudi per a determinar la prevalença de pACBL en enterobacteris sense AmpC cromosòmica induïble. Les soques d’estudi foren aïllades entre 1999 i 2007 a l’Hospital de la Santa Creu i Sant Pau. Encara que la prevalença global ha estat del 0,4%, s’observa un increment significatiu del 0,06% el 1999 a l’1,3% el 2007. Proteus mirabilis ha sigut l’espècie productora de pACBL més prevalent (1%). Del total de 117 pACBL caracteritzades durant aquest període, CMY-2 és l’enzim majoritari (67%), seguit de DHA-1 (26%). Altres pACBL aïllades amb menor proporció són ACC-1, CMY-4, CMY-25, CMY-27 i CMY-40, sent les tres últimes variants de CMY-2 descrites per primer cop. El continu augment de la prevalença d’aquests enzims es deu principalment a la disseminació dels gens ampC per transferència horitzontal. A dia d’avui, encara existeix poca informació disponible sobre el tipus de vectors implicats en la seva expansió. És per aquest motiu que es va procedir a la caracterització dels vectors que mobilitzen els gens ampC en la col·lecció de soques del present estudi. Els resultats han mostrat que els gens ampC estan mobilitzats per plasmidis en el 84% (98/117) de les soques mentre que en el 6% (7/117) dels casos es mobilitzen via Integrative conjugative elements (ICE) de la família SXT/R391. L’anàlisi plasmídica mostra una estreta relació entre el gen ampC i el plasmidi implicat. En el 6% dels casos on els gens ampC han estat mobilitzats per ICE, es tracta de soques de P. mirabilis productores de blaCMY-2. El fet que un ICE sigui el responsable de la mobilització dels gens blaCMY-2 en el 37% de les soques de P. mirabilis i que recentment s’hagi aïllat una soca de P. mirabilis portadora de blaCMY-2 al Japó fa pensar que aquests elements juguen un paper molt important en la disseminació de blaCMY-2, almenys en aquesta espècie en els darrers anys. El transposó Tn10 sembla ser el responsable de la mobilització de blaCMY-2 a l’interior de l’ICE. Els entorns genètics dels gens blaCMY-2,-4,-25,-27 i -40 i blaACC-1 explorats són molt conservats, relacionant-se en tots els casos amb l’element mòbil ISEcp1. En canvi, els entorns genètics dels gens blaDHA-1 presenten una major variabilitat, relacionant-se principalment amb els gens conservats de l’extrem 3’CS d’un integró de classe 1, qacEΔ1 i sul1, i l’element mòbil IS26. De la mateixa manera que ocorre amb les soques portadores de BLEA, els plasmidis que vehiculen els gens ampC solen contenir altres gens que confereixen resistència a altres famílies d’antibiòtics, limitant encara més les opcions terapèutiques. L’estudi de sensibilitat mostra un elevat grau de resistència a la majoria dels antibiòtics no betalactàmics testats en les soques clíniques. La resistència a àcid nalidíxic s’ha transferit per conjugació en el 62% de les soques productores de DHA-1. Des de fa uns anys s’ha constatat una clara associació entre blaDHA-1 i els gens qnr (gens que confereixen resistència de baix nivell a quinolones). En la majoria de casos ambdós gens s’han trobat al mateix plasmidi, associats a integrons o transposons compostos. La co-localització dels gens qnrB i blaDHA-1 en plasmidis d’ampli rang d’hostatger, principalment IncL/M, s’ha demostrat en totes les soques estudiades. L’anàlisi de l’entorn d’una d’elles revela que ambdós gens es troben mobilitzats per un transposó IS26 compost, sent el primer cop que es detalla aquesta estructura en una soca d’E. coli., Plasmid-mediated AmpC -lactamases (pACBL) were first described in the late 1980s. The phenotype of these enzymes is indistinguishable from the phenotype of hyperproducing chromosomal AmpC -lactamases. Thus, pACBL confer resistance to penicillins, first, second and third generation cephalosporins, monobactams and -lactamase inhibitors, and they are only susceptible to fourth generation cephalosporins and carbapenems. Detecting pACBL is a great challenge for microbiological laboratories because standardised phenotypic methods are lacking. The results of a proficiency study that we developed and conducted in Spain showed that the ability of microbiological laboratories to detect and report extended-spectrum -lactamases (ESBL) in Klebsiella pneumoniae and Escherichia coli was greater than the ability to detect and report AmpC enzymes in these isolates. Commercial methods have recently been developed to detect the pACBL phenotype in the laboratory. Their main problem is that they do not allow differentiation between chromosomal and acquired AmpC enzymes. Nevertheless, the presence of scattered colonies near the edge of the inhibition zones of cefoxitin, cefotaxime, ceftazidime and aztreonam has been described as a possible indicator of the presence of these enzymes in Escherichia coli. This was the only phenotypic tool that led us to suspect the presence of a pACBL in a chromosomal AmpC producer, thus, allowing the detection of a pACBL in a S. marcescens for the first time. Findings in this study also suggested in vivo horizontal transfer of a 70 kb IncL/M plasmid coharbouring blaDHA-1 and qnrB resistance genes between S. marcescens and E. coli isolates. The increasing number of pACBL-producing isolates and the few studies of prevalence based on these enzymes in Spain led us to conduct a study to determine the prevalence of pACBL in Enterobacteriaceae isolates lacking inducible chromosomal ampC genes. These isolates were collected from 1999 to 2007 at Hospital de la Santa Creu i Sant Pau in Barcelona, Spain (Annex III). Although the overall prevalence was 0.4%, we observed a significant increase, from 0.06% in 1999 to 1.3% in 2007. Proteus mirabilis showed the highest prevalence (1%). Among the 117 pACBL characterised during this period, CMY-2 was the most predominant enzyme (67%), followed by DHA-1 (26%). Less commonly found enzymes were ACC-1, CMY-4, CMY-25, CMY-27 and CMY-40. The latter three CMY-2-variants mentioned are reported in this study for the first time. The continuous increase in the prevalence of AmpC enzymes is mainly due to the spread of ampC genes by horizontal transfer. Nowadays, there is little information available among the kind of vectors involved in their spread. For this reason, we characterized vectors mobilising ampC genes. Results show that ampC genes were mobilised by plasmids in 84% (98/117) of the strains, whereas 6% (7/117) of cases were mobilised through integrative conjugative elements (ICE) belonging to the SXT/R391 family. Plasmid analyses revealed a close relationship between the plasmid-mediated ampC gene and the specific plasmid family involved. In six percent of the cases in which ampC genes were mobilised by an ICE, all of them were CMY-2 producing P. mirabilis. The fact that an ICE was responsible for mobilising blaCMY-2 genes in 37% of P. mirabilis isolates and that a CMY-2 producing P. mirabilis strain was recently described in Japan suggests that these elements play an important role in the dissemination of blaCMY-2, at least in this species in recent years. The Tn10 transposon seems to be responsible for mobilising blaCMY-2 inside the ICE. The regions surrounding blaCMY-2,-4,-25,-27,-40 and blaACC-1 were highly conserved. In all cases they were associated with the ISEcp1 mobile element. The regions surrounding blaDHA-1 were more variable and mainly associated with the conserved genes of the 3’CS of class 1 integrons, qacEΔ1 and sul1, and the IS26 mobile element. As occurs for ESBL-producing strains, plasmids carrying ampC genes usually contain other genes that confer resistance to other antibiotic families. This limits the therapeutic options even further. Susceptibility testing results displayed a high level of resistance to most non--lactam agents tested in clinical isolates. The nalidixic acid resistance determinant was transferred by conjugation in the 62% of DHA-1-producing Enterobacteriaceae. A clear association between blaDHA-1 and qnr genes (genes that confer a low level resistance to quinolones) have been reported in recent years. In most cases both genes are located on the same plasmid, associated with integrons or composite transposons. Co-localization of qnrB and blaDHA-1 genes on broadhost- range plasmids, all but one belonging to the IncL/M group, was demonstrated in all the studied isolates. Analysis of the genetic environment of one of the isolates revealed that both genes were mobilised through an IS26 composite transposon. This is the first time that this genetic structure is detailed in an E. coli strain.

Las betalactamasas de espectro extendido (BLEE) descritas frecuentemente en Escherichia coli y Klebsiella pneumoniae confieren resistencia a cefalosporinas de espectro extendido y monobactámicos. En un inicio, la descripción de BLEE abarcaba en su mayoría brotes hospitalarios que frecuentemente implicaban K. pneumoniae y BLEE derivadas de SHV-1 o de TEM-1. En los últimos años se ha detectado el incremento de las BLEE de tipo CTX-M. Su difusión en bacterias de la misma o de diferente especie se ha asociado a ciertos elementos genéticos como las secuencias de inserción, transposones y plásmidos. En los últimos años, son muchos los hospitales españoles que han observado un cambio en la prevalencia de las diferentes enzimas detectadas. Por esto, en la “Red Española para la Investigación en Patología Infecciosa” (REIPI) se planteó un estudio multicéntrico que ha permitido conocer y actualizar la evolución y el tipo de BLEE en E. coli y K. pneumoniae en diferentes hospitales de España y descartar, mediante estudios moleculares, la posible expansión clonal de los microorganismos portadores de estas betalactamasas. El presente trabajo formó parte del proyecto Nº 3 (Estudio de la epidemiología clínica y molecular de enterobacterias productoras de BLEE) de la REIPI, en el cual participaron cuatro centros: el Hospital Ramón y Cajal, el Hospital Universitario Son Dureta, el Centro Nacional de Microbiología y el Hospital de la Santa Creu i Sant Pau. Se estudiaron un total de 92 cepas de E. coli y 32 de K. pneumoniae aisladas en el primer trimestre del año 2004 en 11 hospitales españoles. La relación clonal entre las cepas se descartó mediante estudios de macrorestricción genómica con la enzima de restricción XbaI. Las BLEE se caracterizaron mediante isoelectroenfoque, PCR y secuenciación. En las cepas de E. coli se observó una gran diversidad clonal en los patrones de restricción obtenidos por PFGE, y un predominio de las betalactamasas CTX-M-14 (45,7%), CTX-M-9 (20,6%) y SHV-12 (21,7%); en cambio, en las cepas de K. pneumoniae se observó una menor diversidad clonal con un predominio de betalactamasas de tipo CTX-M (62,5%) que incluían CTX-M-1, CTX-M-9, CTX-M-14 y CTX-M-15. Se estudiaron los entornos genéticos y perfiles plasmídicos de 58 cepas de E. coli y K. pneumoniae y se determinó el grupo de incompatibilidad de los plásmidos mediante rep typing-PCR, digestión con la enzima S1, campo pulsado, Southern-blot e hibridación con sondas específicas. Se observó gran variabilidad de plásmidos que contienen genes blaBLEE asociados a diferentes entornos genéticos. Los genes bla asociados a una mayor variabilidad plasmídica fueron los blaCTX-M-9, encontrándose en plásmidos de los grupos Inc I1, HI2, FIB y K. Los genes blaSHV-12 se encontraron en plásmidos de los grupos Inc I1, FII, K y HI2. Por otro lado, blaCTX-M-14 se encontró sólo en plásmidos del grupo Inc K. Finalmente, se realizó el estudio epidemiológico mediante Multi Locus Sequence Typing (MLST) y la determinación de los grupos filogenéticos de las cepas de E. coli para determinar la posible asociación entre los diferentes ST, grupos filogenéticos y BLEE. Se observó una gran diversidad de ST, siendo los más comunes el patrón ST131 y los complejos ST10 y ST23; además, las cepas de E. coli pertenecientes al ST131 fueron portadoras de una gran variedad de betalactamasas (CTX-M-15, CTX-M-9, CTX-M-10, CTX-M-14, SHV-12 y CTX-M-1). Por lo tanto, en este estudio se observó una mayor diversidad de BLEE que en un estudio multicéntrico del año 2000, siendo estas BLEE vehiculadas por elementos genéticos como plásmidos y secuencias de inserción, ambos muy diversos dentro del grupo de cepas estudiadas. Por otro lado no se observó asociación entre los diferentes tipos de MLST, los grupos filogenéticos hallados y las BLEE que portaban las cepas de E. coli. Extended-spectrum beta-lactamases (ESBL), described frequently in Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae confer resistance to extended spectrum cephalosporins and monobactams. ESBL are a heterogeneous group of enzymes that were initially described in hospital outbreaks of K. pneumoniae, and derivates of the SHV-1 and TEM-1 were the most common. In recent years, detection of the the CTX-M type has become more frequent. The spread of ESBL in bacteria of the same or different species has been associated with genetic elements such as insertion sequences, transposons and plasmids. The increase in the prevalence of ESBL-producing microorganisms has been reported by several authors, both in Spain and internationally. For this reason, the Spanish Network for Research on Infectious Pathology (REIPI) recognized the need for a multicenter study. Based on the findings, it was possible to identify and update the progress and the type of ESBL in E. coli and K. pneumoniae in several Spanish hospitals. Furthermore, molecular studies ruled out the possible clonal spread of ESBL-producing microorganisms. The present study was conducted as Project No. 3 (Clinical epidemiology and molecular characterization of ESBL-producing enterobacteria) of the REIPI. It involved four centers: Hospital Ramon y Cajal, Hospital Universitario Son Dureta, National Center for Microbiology and Hospital de la Santa Creu i Sant Pau. A total of 92 strains of E. coli and 32 K. pneumoniae isolated from 11 Spanish hospitals in 2004 were analyzed. The clonal relationship between strains was ruled out by genomic studies comparing the XbaI-PFGE patterns. The ESBL were characterized by isoelectric focusing, PCR and sequencing. E. coli showed a high clonal diversity in the restriction patterns obtained by PFGE, and a predominance of the enzymes CTX-M-14 (45.7%), CTX-M-9 (20.6%) and SHV-12 (21.7%), whereas K. pneumoniae had a lower clonal diversity with a predominance of the enzymes CTX-M type (62.5%) involving CTX-M-1, CTX-M-9, CTXM- 14 and CTX-M-15. We then studied the genetic environments and plasmid profiles of 58 strains of E. coli and K. pneumoniae and determined the incompatibility group of plasmids by rep typing, S1 enzyme digestion, pulsed field gel electrophoresis, southern-blot and hybridization with specific probes for each incompatibility group. As a result there was a large variability of plasmids containing blaESBL genes associated with different genetic environments. The gene with the greatest plasmid variability was blaCTX-M-9, associated to Inc groups I1, HI2, FIB and K. The blaSHV-12 gene was found in plasmids of groups Inc I1, FII, K and HI2. However, blaCTX-M-14 was found only on IncK plasmids. In a third phase of the study, the National Microbiology Center in Spain performed the Multi Locus Sequence Typing (MLST) and determined the phylogenetic groups of strains of E. coli to determine the possible association between ST, phylogenetic groups and ESBL. A wide variety of MLST were detected, and the most common patterns were ST131 and ST10 and ST23 complexes. In addition, strains of E. coli ST131 carried a variety of betalactamase (CTX-M-15, CTX-M-9, CTX-M-10, CTX-M-14, SHV-12 and CTX-M-1). Regarding the phylogenetic groups, we found that ST10 and ST23 complexes were linked to phylogenetic group A, whereas the pattern ST131 was related to the virulent extraintestinal group B2. In conclusion, this study identified a greater variety of ESBL than observed in the multicenter study of 2000. These ESBL were transported by genetic elements such as plasmids and insertion sequences which were very diverse within the group of strains studied. We did not detect an association between the different types of MLST, the filogenetic groups and the ESBL-producing E. coli.

Streptococcus pyogenes és un patogen humà responsable d'un ampli ventall d'infeccions que varien des d'infeccions superficials com faringitis i impetigen a formes sistèmiques greus com fascitis necrosant (FN) i síndrome del xoc tòxic estreptocòccic (SSTS). El ressorgiment i persistència de formes invasives greus descrit des de mitjans dels anys 1980 ha motivat una intensa recerca sobre els aspectes epidemiològics, microbiològics i clínics d'aquestes infeccions. S'ha realitzat un estudi retrospectiu de base hospitalària que inclou 126 soques de S. pyogenes (27 procedents d'infeccions invasives i 99 d'infeccions no invasives) aïllades entre gener de 1999 i juny de 2003. Les soques de S. pyogenes es van caracteritzar en base a la distribució de tipus i subtipus emm i els perfils genètics de superantígens (SAgs) (speA-C, speF-J, speL, speM, ssa i smeZ). Tanmateix, es va determinar la prevalença i els mecanismes de resistència a macròlids, tetraciclina i levofloxacino. Les formes clíniques més freqüents d'infecció invasiva van ser les infeccions de la pell i teixits tous (40,7%). La SSTS es va registrar en quatre (14,8%) dels casos invasius i es va associar a FN en la meitat dels casos. La majoria dels pacients afectats de quadres invasius eren adults, en particular d'edat avançada i de mitjana edat, i una elevada proporció presentaven factors predisposants, destacant l'alteració de la barrera cutània, la infecció per HIV, l'ús de drogues per via parenteral, i les neoplàsies. En la col·lecció de 126 soques analitzada es van identificar un total de 29 tipus emm amb una distribució encapçalada pel tipus emm1 (17,5%), seguit d'emm3 (8,7%), emm4 (8,7%), emm12 (7,1%), emm28 (7,1%), emm11 (6,3%) i emm77 (6,3%). Aquests set tipus van constituir el 61,9% del total de soques. No es van observar diferències significatives en la distribució de tipus emm entre soques aïllades d'infeccions invasives i no invasives amb l'única excepció del tipus poc freqüent emm25 que es va trobar associat a infeccions invasives en addictes a drogues per via parenteral. Es va trobar una forta correlació entre el patró de SAgs i el tipus emm independentment del tipus d'infecció. La resistència a eritromicina va mostrar un increment anual progressiu del 16,6% (1999) al 38,8% (2003) i va estar causada per soques pertanyents a 11 tipus emm. Les soques mef(A) positives dels tipus emm4, emm12 i emm75 i erm(B) positives dels tipus emm11 i emm25 constituïren el 80% de les soques resistents. La freqüència de resistència a tetraciclina va fluctuar durant el període estudiat (màxim 34,6% el 2002 i mínim 15,8% el 2001) i va ser superior en les soques resistents a eritromicina que en les soques sensibles (42,8% vs 18,7%). En les soques resistents a tetraciclina el gen tet(M) va ser el predominant i es va trobar en soques pertanyents a 14 tipus emm, mentre que el gen tet(O) només es va trobar en soques emm77. No es van observar diferències significatives en la prevalença de resistència a eritromicina ni a tetraciclina en el grup invasiu respecte del no invasiu. La prevalença de resistència a levofloxacino fou del 3,2%, incloent quatre soques amb sensibilitat reduïda o resistència intermèdia (CIM 2-4 µg/ml) i dues soques amb resistència d'alt nivell (CIM >32 µg/ml). La resistència de baix nivell es va associar a substitucions únicament en ParC (Ser80Pro, Ser79Ala, Ser79Phe i Ala121Val), mentre que la resistència d'alt nivell es va relacionar amb mutacions en ParC (Ser79Phe i Ala121Val) i GyrA (Ser81Tyr)., Streptococcus pyogenes (GAS) is a human pathogen responsible for a wide array of infections, ranging from pharyngitis and impetigo to severe invasive infections such as necrotizing fasciitis (NF) and streptococcal toxic shock syndrome (STSS). The resurgence and persistence of severe forms of GAS diseases reported since the mid 1980s have motivated intensive research on epidemiological, microbiological and clinical aspects of these diseases. A retrospective hospital-based study was conducted including 126 GAS isolates (27 from invasive infections and 99 from non-invasive infections) collected from January 1999 to June 2003. GAS isolates were characterized by emm type and subtype and superantigen (SAg) gene profile (speA-C, speF-J, speL, speM, ssa and smeZ). The prevalence and mechanisms of macrolide, tetracycline and levofloxacin resistance were also determined. The most common clinical presentations of invasive cases were skin and soft-tissue infections (40.7%). SSTS occurred in four cases (14.8%) and was associated to NF in half of the cases. Most invasive cases were found in adults, in particular among the elderly and the middle-aged, and a large proportion had underlying conditions, the most frequent being skin lesions, HIV infection, injection drug use, and malignancy. A total of 29 emm types were identified among the 126 isolates; the most prevalent were emm1 (17.5 %), followed by emm3 (8.7 %), emm4 (8.7 %), emm12 (7.1 %), emm28 (7.1 %), emm11 (6.3 %) and emm77 (6.3 %). These seven emm types accounted for 61.9 % of isolates. There were no differences in the emm type distribution between invasive and non-invasive infections, except for emm25 isolates, which were associated with invasive infections in injecting drug users. The SAg gene profiles were closely associated with the emm type and were independent of the disease type. The prevalence of erythromycin resistance showed an annual progressive increase from 16.6% (1999) to 38.8% (2003) and was caused by isolates belonging to 11 emm types. mef(A)-positive emm types 4, 12 and 75, and erm(B)-positive emm types 11 and 25 were responsible for up to 80% of the erythromycin-resistant isolates. The prevalence of tetracycline resistance fluctuated over the period studied (maximum 34.6% in 2002 and minimum 15.8% in 2001) and was higher in erythromycin-resistant isolates than in susceptible isolates (42.8% vs 18.7%). Among the tetracycline-resistant isolates, the tet(M) determinant was the most prevalent and was distributed in isolates belonging to 14 emm types, whereas tet(O) was only found in emm77 isolates. No significant differences in resistance rates to erythromycin or tetracycline were found between invasive and non-invasive isolates. The rate of resistance to levofloxacin was 3.2%, encompassing four isolates with reduced susceptibility or intermediate resistance (MIC 2-4 µg/ml) and two isolates with a high level of resistance (MIC >32 µg/ml). Low-level resistance was associated with alterations in ParC (Ser80Pro, Ser79Ala, Ser79Phe and Ala121Val), while high-level resistance was associated with alterations involving both ParC (Ser79Phe and Ala121Val) and GyrA (Ser81Tyr).

All clinically relevant Enterobacteriaceae strains isolated between 1994 and 1996 without inducible chromosomal b-lactamase, that showed decreased susceptibility to broad-spectrum cephalosporins and/or aztreonam, were selected. The mechanism implicated in the decreased susceptibility was determined by analytical isoelectric focusing, PCR and/or sequenciation. The results obtained showed that the most frequent mechanism implicated in the decreased susceptibility to broad-spectrum cephalosporins and/or aztreonam in E. coli and K. oxytoca was the hyperproduction of the chromosomal b-lactamase, followed by the SHV-1 hyperproduction in E. coli and K. pneumoniae. In our hospital, the incidence of plasmid-mediated extended-spectrum b-lactamases (ESBLs) between 1994 and 1996 was low (0.14%). The b-lactamase that couldn't be identified by the techniques previously described, was characterised by conjugation studies, clonation, and sequenciation experiments, allowing us to describe a new b-lactamase, CTX-M-9, that was the most frequent ESBL detected in our laboratory. The CTX-M-type b-lactamases has been described in various species of the family Enterobacteriaceae in geographically and temporally widely distant areas, most of them being plasmid-encoded. To know more about the dissemination of these enzymes around the world, we decided to study the environment of blaCTX-M-9. This study suggested us that blaCTX-M-9 is contained in a new complex integron, In60. This integron has the common 5'-CS and 3'-CS conserved sequences of class 1 integron and two gene cassettes encoding for a dihydrofolate reductase (dfrA16) and aminoglycoside-adenylytransferase (aadA2). Downstream of the first sul1 gene is present the orf513. Following this region there is the blaCTX-M-9 and an orf3-like region showing both about 80% identity with blaKLUA-1 and orf3 of K. ascorbata, respectively. Downstream of the orf3-like region, a new insertion sequence designated IS3000, is found. This IS is flanked by two imperfect inverted repeats and its deduced amino acid sequence presents the DD(35)-E motif highly conserved in the transposases. Close to the downstream IS3000 inverted repeat the second 3'-CS, is found. The presence of In60 was evaluated in a total of 37 enterobacteria isolated between 1994 and 1999 carrying a b-lactamase compatible with CTX-M-9. The results obtained showed that 33 strains had the environment compatible with In60 and four strains showed modifications or did not share this environment.