Search

[spa] El objetivo principal de esta Tesis es producir estrategias para la productividad, perdurabilidad y calidad mediante el desarrollo de nuevas variedades comerciales de arroz mediterráneo (O. sativa) e introducir alelos de tolerancia a la salinidad y resistencia a herbicidas mediante speed breeding, para proteger el sector del arroz contra el cambio climático, la invasión de malas hierbas y penetración del caracol manzana (P. maculata). En cuanto a los objetivos específicos, son los siguientes: 1. Cruzar líneas de arroz tolerantes a salinidad y resistente a herbicida por hibridación forzada siguiendo un esquema de retro-cruzamiento. 2. Poner a punto una técnica de rescate de embriones (embryo rescue) para optimizar el speed breeding (mejora acelerada de variedades) en el programa de retrocruces. 3. Establecer una selección in vitro de los embriones que presenten tolerancia al herbicida Cicloxidim. 4. Selección por PCR de los descendientes que presenten marcador SSR Saltol. 5. Selección por CAPS de los descendientes que presenten el alelo mutante de resistencia a Cicloxidim. 6. Aplicación de selección de mayor retorno al parental recurrente mediante marcadores KASPar. 7. Evaluación de las líneas Saltol en ensayos de campo en el Delta del Ebro., [eng] Rice (Oryza sativa) is a crop with a major economic interest and the projection of global world growth make the increase of the food production an imminent need. Framed in the gramineous family (Poaceae), this crop is a diploid species with 24 chromosomes, and it is the most important basic harvesting plant in the world, as it satisfies the caloric needs of half of the world’s population. The Oryza genus includes 24 species, but just two of them are cultivated: Oryza sativa and Oryza glaberrima. Firstly, O. sativa is characterized by its length, approximately about 0.4 to 2 meters and its semiaquatic nature. O. sativa cultivars are classified in five subspecies, corresponding to indica, aus, aromatic, temperate japonica and tropical japonica. The aus are minor groups commonly considered subspecies or ecotypes indica (from the Himalayan region), the temperate japonica (from China, Korea, Japan and Europe), tropical japonica (from Malaysia, Indonesia and Philippines) and aromatic (from Pakistan, India and some other countries). Secondly, O. Glaberrima is cultivated in a minority way in west Africa. The japonica subspecies is the most cultivate in Europe due to its adaptation to temperate climates and its use as an ingredient of local typical dishes worldwide known as the Italian risotto or the Spanish paella. The global rice production in 2019 reached the 500.6 millions of tons, a value 0.8% lower than the historical maximum of 2018, with 506.3 millions of tons, due to climatic factors. In Europe, the production of rice only reaches the 0.6% of the global production, with Italy and Spain as the main producers. This Thesis is part of the NEURICE project (New commercial European RICE), a HORIZON 2020 project funded by the European Union. We used two varieties japonicas sensitive temperate salinity provided by Càmara Arrossera of the Montsià a long grain PL12 and one medium grain PM37, were crossed with two Indica donors carrying Saltol: FL478, a salinity-tolerant RIL obtained from the Pokkali x IR29 cross and IR64- Saltol, a salt-tolerant NIL obtained from the cross FL478 x IR64 . The crosses between PL12 and FL478 were called LP, and the crosses between PM37 and IR64- Saltol were called MS. This thesis has managed to evaluate, for the first time, tolerance to salinity in the new Saltol LP and MS lines from the crosses between the parents and to obtain the new Saltol lines. Therefore, the thesis is divided into three research areas or experiments: 1) The introgression of a QTL Saltol to obtain new lines of rice tolerant to salinity verified through two years of field trials where interesting morphological analogies were found with respect to the number of shoots / plants, number of panicles / plants, length of the plant and panicle fertility percentage to mitigate the adverse impact of salinity and avoid the loss of apple snail production in the Ebro delta. 2) in vitro optimization for six different varieties of Mediterranean template japonica and a tropical indica by the addition of an adjustable concentration design such as 2.50 µM, 3.00 µM, 3.25 µM and 3.50 µM (concentration at the limit of lethality) of the herbicide Cycloxidim to select resistant individuals, 3) the crossing of a herbicide- resistant tropical indica line with six commercial Mediterranean elite lines by forced hybridization following a backcrossing scheme, using an optimized embryo rescue technique to accelerate the process and CAPS selection of the descendants presenting the mutant OsACC2 allele of resistance to the herbicide Cicloxidim.

[eng] It is of strategic importance for Mediterranean agriculture to develop new varieties of durum wheat with greater production potential, together with a better adaptation to adverse environmental conditions and better quality of grain. While durum wheat, which is the most strategic crop in the south Mediterranean agriculture, has benefited as other cereals of the Green Revolution, genetic progress in recent decades has been less evident, partly masked by climate change, and the underlying physiological mechanisms are not evident. For this propose, the objective is to evaluate whether there have been agronomic and physiological changes associated with the genetic improvement of durum wheat grown in Spain after the Green Revolution and the environmental conditions where breeding gains have been higher. The study was based on a collection of 20 commercial varieties, grown in Spain between the beginning of the 70s of the last centuries and the present. The set was readapted during the last two cropping cycles and increased to a total of 23 cultivars, including more recent cultivars, released during the present decade. Cultivars were compared through consecutive years in wide range growing conditions secured by growing in three different sites differing in latitude and temperature, together with the implementation of support irrigation and different planting times. Changes in the genetic gain of the yield were evaluated between 2014 and 2016. Change in the agronomic and physiological parameters related to the genetic progress was evaluated between 2015- 2016, and the changes caused by the improvement in the adaptation patterns through the study of the genotype by environment (GE) interaction was evaluated between 2017 and 2018. It has been observed that the rate of genetic progress in the yield of durum wheat in Spain after the Green Revolution has been low it was estimated on 24 kg ha-1 y-1 (0.44% y-1 in term of relative gain) between 1980 and 2003 and has even stopped during the last decade until 2010. It was mainly due to increases in the number of kernels per spike (117 kernels m-2 y-1), and spikes per unit area (0.24 kernels spike-1 y-1), while no clear trend in some grain quality traits (TKW and grain N concentration). Moreover, areal biomass at harvest and grain nitrogen yield increased with the year of release of the cultivars for the entire period. In addition, it has been observed that the more productive genotypes were characterized by a plant height of around 85 cm, small erect flag leaves, more open stomata, a better balance between N sources and N sinks and a higher capacity to re-fix CO2 respired by the grain. Moreover, in general the non-laminar parts of the plants play a key role in providing assimilates during grain filling. Also, that the high heritability of most of the studied parameters allows their consideration as traits for phenotyping durum wheat better adapted to a wide range of Mediterranean conditions. On the other hand, an improvement in genetic yield has been reported in warm environments and under optimal water conditions, environments similar to those of from where the germplasm provenance release or origin. The adaptation of semi-dwarf durum in Spain has shown a tendency to specific adaptation rather than large-scale adaptation. Two different patterns of selection have been reported due the G×E interaction and change in the ranking of genotypes: in the high yielding environments, plant favors more water uptake, with more transpiration and more open stomata (more negative value of δ13C, whereas, in low yielding environments, plant close stomata and favors more water use efficiency (positive value of δ13C)., [spa] El trigo duro, que es el cultivo más estratégico en la agricultura del sur del Mediterráneo, se ha beneficiado como otros cereales de la Revolución Verde, el progreso genético en las últimas décadas ha sido menos evidente, en parte enmascarado por el cambio climático, y los mecanismos fisiológicos subyacentes no son evidentes. Se ha observado que la tasa de progreso genético en el rendimiento del trigo duro en España después de la Revolución Verde ha sido baja, se estimó en 24 kg ha-1 año-1 entre 1980 y 2003 e incluso se detuvo durante la última década hasta 2010. Se debió principalmente al aumento en el número de granos por espiga, y espigas por unidad de área, aunque no hay una tendencia clara en algunos rasgos de calidad de grano (TKW y concentración de N de grano). Además, la biomasa área en la cosecha y el rendimiento de nitrógeno en grano aumentó con el año de liberación de los cultivares durante todo el período. Además, se ha observado que los genotipos más productivos se caracterizaron por una altura de planta de alrededor de 85 cm, pequeñas hojas de bandera erectas, estomas más abiertos, un mejor equilibrio entre las fuentes de N y los sumideros de N y una mayor capacidad para re-fijar CO2 Respirado por el grano. Además, en general, las partes no laminares de las plantas juegan un papel clave en el suministro de asimilados durante el llenado del grano. Por otro lado, se ha informado una mejora en el rendimiento genético en ambientes cálidos y en condiciones óptimas de agua, ambientes similares a los de donde se origina el germoplasma. La adaptación del durum semi-enano en España ha mostrado una tendencia a la adaptación específica en lugar de la adaptación a gran escala. Se han informado dos patrones diferentes de selección debido a la interacción G × E: en los entornos de alto rendimiento, la planta favorece una mayor absorción de agua, con más transpiración y más estomas abiertos, mientras que, en entornos de bajo rendimiento, planta estomas cercanos y favorece una mayor eficiencia en el uso del agua.

Tesis llevada a cabo para conseguir el grado de Doctor por la Universidad Autónoma de Barcelona--2016-09-02, [CA] La hibridació és un fenomen molt freqüent en plantes, però els híbrids solen ser estèrils. Existeixen barreres reproductives que dificulten l’intercanvi genètic entre espècies, però, no obstant, aquest acaba tenint lloc. Això genera moltes preguntes, com ara les següents. Quines solen ser aquestes barreres i, sobretot, com aconsegueixen ser superades? Quin paper hi té l’aïllament geogràfic? En zones de muntanya, s’ha proposat la vicariància com a procés clau en la diversificació de les plantes, però realment és la vicariància el procés que contribueix majoritàriament a la diversificació de plantes en els hàbitats de muntanya? L’objectiu d’aquesta tesi és trobar respostes a aquestes preguntes i per això tractarem les diferents qüestions en diversos grups de plantes que s’hi ajusten en base a estudis previs. Els grans temes que abordem amb aquesta idea són els següents: i) processos d’especiació per hibridació en un grup citogenèticament complex d’espècies de muntanya, la secció Triplinervium del gènere Saxifraga (Saxifragaceae), ii) híbrids F1 i el seu tractament taxonòmic: caracterització i tipificació de Jacobaea ×mirabilis (Asteraceae), iii) hibridació i introgressió en endemismes de muntanya, una possible amenaça per a la conservació? Estudi sobre les dues espècies del gènere Rhaponticum (Asteraceae) dels Alps: R. heleniifolium i R. scariosum, i iv) diversificació del gènere Artemisia (Asteraceae) a l’alta muntanya europea: quins són els factors que hi han contribuït de manera més decisiva? Els resultats obtinguts en les diferents publicacions d’aquesta tesi mostren que les principals fonts de diversificació en plantes són l’intercanvi genètic (hibridació i introgressió) i les mutacions cromosòmiques (com guanys, pèrdues o reestructuracions de braços cromosòmics, que poden acabar derivant en casos de disploïdia). Per contra, l’aïllament geogràfic per se no genera diversificació, però permet la fixació de noves combinacions cromosòmiques per processos de coll d’ampolla, o bé facilita o impedeix el contacte entre diferents espècies, és a dir, determina quines espècies poden acabar hibridant. En els casos que hem estudiat, i a diferència del que se sol postular, s’ha pogut constatar, a més, que la poliploïdia no és la font més comuna d’origen de noves espècies, sinó que l’especiació sol tenir lloc en el mateix nivell de ploïdia, ja sigui després d’una hibridació (especiació híbrida homoploide o hibridació introgressiva) o bé per canvi del nombre cromosòmic bàsic (disploïdia), [ES] Hybridization is widespread in plants, but only infrequently results in viable or fertile offspring. There are reproductive barriers, which hamper the genetic exchange between species, but, nevertheless, this ends up taking place. This generates many questions such as the following: What are usually these barriers, and, especially, how do plants achieve to overcome them? What role does geographical isolation play? In mountain regions, vicariance has been proposed as a key process on plants diversification, but is it actually vicariance the process that mainly contributes to plant diversification on mountain habitats? The aim of this thesis is to find answers to these questions, and therefore we will deal the different issues with several plant groups according to previous studies. The major topics addressed with this idea are the following: i) hybrid speciation processes in a cytogenetically complex group of mountain species, section Triplinervium of genus Saxifraga (Saxifragaceae), ii) F1 hybrids and their taxonomic treatment: characterization and typification of Jacobaea ×mirabilis (Asteraceae), iii) hybridization and introgression on mountain endemic plants, a possible threat to conservation? Study about the two alpine species of Rhaponticum genus (Asteraceae): R. heleniifolium and R. scariosum and, iv) diversification of European high mountain Artemisia (Asteraceae): what are the factors that have contributed in the most decisive way? The results obtained in the different publications of this thesis show that the main sources of diversification in plants are genetic exchange (hybridization and introgression) and chromosomic mutations (like gains, losses or chromosome arms restructuration, which can end up to dysploidy cases). Conversely, geographical isolation per se does not generate diversification, but it allows the establishment of new chromosomal combinations by bottleneck processes and/or impedes or facilitates contacts between different species, i.e. determining which species can hybridize. In the cases we studied, unlike what is usually postulated, it has been additionally shown that polyploidy is not the most common source of origin of new species, but rather speciation took place on the same ploidy level, either after hybridization (homoploid hybrid speciation or introgressive hybridization) or by changing the basic chromosome number (dysploidy).

This PhD thesis represents an advance in the present understanding of the spatiotemporal control of model plant Arabidopsis thaliana root growth and development. The size and structure of a living organism are tightly controlled by the coordination between several highly dynamic molecular and cellular processes, such as cell division, movement, growth and deformation. At tissue level, a mesoscopic description of the system and these processes can be used, in terms of mechanical forces and energy minimization (see (Hamant & Traas, 2010) for a review focused on plants). How cells decide to switch from a cellular process to another is a fundamental question to understand the growth and shape of an organ. Because of the thermal fluctuations and finite number of molecules involved in the molecular reactions, cells take presumably these decisions in a stochastic manner, which makes it challenging to understand how morphogenesis generates organs with characteristic shapes and sizes. Plant roots grow due to cell division in the meristem and subsequent cell elongation up to terminal differentiation. The pleiotropic phenotypes of the short-root mutants available make it difficult to univocally assess which mechanism sets the transition from elongation to final differentiation. To elucidate it, in this thesis we use a novel approach based on the quantitative information associated to the phenotypic variability of wild type roots together with computational modeling of different mechanisms. In Chapter 1 we introduced the already published work in the field of root and meristem growth, at experimental and computational level. In Chapter 2 we have employed theoretical and computational models to analyze individual isogenic Arabidopsis seedlings and to quantify their heterogeneity, which we have quantified, together with their mean values. The quantification of heterogeneity has been crucial since it allowed the identification of dynamical mechanisms involved in Arabidopsis root growth. By analyzing these mechanisms in WT plants and Brassinosteroids (BRs) mutants, we found that growth defects in the BRs loss of function mutant are generated by defects related to cell differentiation. To deepen into this result, in Chapter 3 we investigated the mechanism through which cells decide to differentiate and achieve their final length. In this sense, we adopted a computational approach, combined with plant variability analysis, to test three putative mechanisms: Ruler (Band et al, 2012; De Vos et al, 2014), Timer (De Vos et al, 2014; Mähönen et al, 2014) and Sizer (Grieneisen et al, 2012). We compared the simulated data, based on the values extracted in Chapter 2, with experiments, and we found that Arabidopsis thaliana primary root uses a Sizer mechanism based on measuring cell sizes for final cell differentiation. We show this mechanism translates into specific correlations among phenotypic traits and explains why root growth is proportional to the meristem activity and displays mature cells of stereotyped length. We challenged our model by evaluating such correlations in a well-known BR signaling short-root mutant. We further show that BR signaling at the meristem is sufficient to recover some of the correlation slopes and hence root growth, yet it alters the mechanism. Together, our results establish a theoretical quantitative framework for stationary root growth and underscore the value of using computational modeling together with quantitative data. In Chapter 4 we analyzed the coupling between meristematic activity and telomere length by applying a novel quantitative fluorescence in situ hybridization to measure telomere length with tissue resolution in the primary root. The implementation of a new image analysis protocol contributed to revealing a telomere distribution map, with telomere length gradients along the meristem, and the longest telomeres localized in the stem cell niche (Gonzalez-Garcia et al, 2015). We applied this method to WT plants, several generations of telomerase deficient mutants, mutants with larger telomeres and cell differentiation mutants. Furthermore, we generated transgenic plants to check the localization of telomerase and we evaluated the relationship between telomere length and resistance to DNA damage. We also evaluated computationally the telomere distributions observed in WT and telomerase deficient mutants and we simulated the telomere dynamics which can generate such distributions. The conclusions of this thesis were contextualized in Chapter 5., El tamaño y la estructura de un organismo vivo son el resultado de una coordinación entre procesos moleculares y celulares, altamente dinámicos, como la división, el movimiento, el crecimiento y la deformación. A nivel de tejido se puede usar una descripción mesoscópica del sistema y estos procesos, habitualmente en términos de fuerzas mecánicas y minimización de la energía (dirigirse a (Hamant & Traas, 2010) para una revisión sobre plantas). Por tanto, la morfogénesis y formación de órganos en Eucariotas son investigadas tanto por la Biología de desarrollo, como por la Física de la materia blanda (Cross & Greenside, 2009; Cross & Hohenberg, 1993; Murray, 2002). El crecimiento global de una planta es fuertemente relacionado con el crecimiento y desarrollo de su raíz. Las raíces crecen debido a sucesivas divisiones celulares en el meristemo, seguidas por elongación y diferenciación celular. Para poder estudiar el desarrollo de la raíz es imprescindible conocer qué determina a las células tomar las decisiones de parar de dividir y elongarse o parar de elongarse y diferenciarse. Debido a las fluctuaciones térmicas y el número finito de moléculas que participan en las reacciones moleculares, es de esperar que estas decisiones no son tomadas por todas las células a la vez, sino de una manera estocástica, lo que hace dificil entender cómo la morfogénesis basada en un comportamiento celular estocástico puede generar formas y tamaños característicos de órganos. En este contexto, esta tesis usa modelos matemáticos para cuantificar y generar predicciones sobre la dinámica de crecimiento de la raíz de Arabidopsis thaliana, que han sido testeadas mediante un abordaje experimental. En el Capítulo 2 de esta tesis hemos diseñado un marco teórico para describir el crecimiento estacionario de la raíz y hemos analizado la variabilidad existente entre raíces isogénicas. En el Capítulo 3 hemos usado un modelo matemático para investigar el mecanismo que las células usan para decidir cuándo parar de elongarse y adquirir su tamaño final. Basándonos en las predicciones de este modelo, hemos analizado la variabilidad intrínseca de las plantas silvestres y hemos identificado relaciones específicas entre los parámetros de crecimiento, que nos ayudaron a descartar posibles modelos. En el Capítulo 4 hemos cuantificado la longitud telomérica en las células de la raíz y evaluado funcionalidades biológicas. Nuestro análisis mostró una distribución heterogénea, que impulsó la modelización matemática de la dinámica telomérica, basada en las fluctuaciones y el comportamiento dinámico de la longitud telomérica.

The general objective of this PhD thesis is to investigate the mechanistic bases for plant hormones Brassinosteroids (BRs) action in plant vascular development. To this end, we have used a multidisciplinary approach by combining mathematical modeling with exhaustive analysis of the BRs mutants vascular phenotypes. Furthermore, high throughput proteomic techniques with accurate confocal microscopy to identify new components of the BR signaling pathway with cellular resolution have been performed. Our work describes for the first time the composition of BRI1 and BRL3 receptor protein complexes in Arabidopsis. These results represent a conceptual advance for the molecular understanding of BR signaling pathway in plant development, as disclose several key points beyond the current state of the art. Despite their cellular specificity and their role as functional BR receptors the study of BRL receptors has been neglected and no reports have been published on them. Several barriers may have hampered the study of BRL pathways in the plant. Despite BRL being functional BR receptors, obstacles in: (i) the visualization of vascular inner tissues, (ii) the biological variability that exists within the shoot stem vasculature where BRL proteins are localised, and (iii) the lack of an apparent phenotype for the brl mutants, altogether might have hampered the study of these receptors. This PhD thesis challenges the study of the functional role of BRL receptors by using multidisciplinary approaches ranging from systems biology to quantitative biochemistry and high-resolution microscopy. The purification and identification of BRL3-receptor protein complex has permitted to assign a specific role for BRL3 receptor in planta, independently from the BRI1 main receptor (also reported in this study). To better understand the function of the BRL receptors in planta and to investigate novel BR specific functions in distinct cell-types, we have carried different approaches: 1. Investigate the contribution of BRs to the vascular development in the shoot of Arabidopsis plants by comprehensive phenotypic analysis of vascular-patterning defects in BR-signaling and synthesis mutants. 2. Biochemical characterization of BRI1 and BRL3 signalosome complexes by MS- analysis. 3. Functional characterization of BRL3 signalosome in plant growth and development by genetic analysis of candidate interactors identified by MS analysis. First, a role for BRs in regulating vascular development in the shoot inflorescence stem of Arabidopsis has been demonstrated. Based on our experimental results, mathematical modeling (in collaboration with Physicists at the group of Dr. Ibañes, UB) was mutually beneficial to jointly establish the role of auxin in plant vascular patterning. Our initial experimental approach accounted for exhaustive analysis of BRs mutants while did not concern auxin hormone action. Through computational and modeling predictions, it was found that BRs alone were not sufficient to create the VB patterning, suggesting the requirement of auxin transport for the VB formation. Thus, our results unveil coordinated roles for auxin and BRs in establishing the vascular patterning within Arabidopsis shoots. Second, experimental evidence for two different BR perception complexes, BRI1 and BRL3 complexes, operating at distinct and specific cell types is provided. Several BRI1 interactors and downstream signaling components have been identified by extensive proteomic studies while no evidence for the composition of the native BRI1 receptor complex has been reported. Additionally, BRL receptors have been described to be active BR receptors that play specific roles in Arabidopsis yet no study on BRL receptor complexes composition nor downstream signaling components has been shown. Here we disclose the composition of both BRI1 and BRL3 receptor complexes providing novel candidate interactors and components to the BR signaling field. Of note, identification of the BRL3 receptor complex composition in combination with high-resolution microscopy and genetic analysis reveals a novel function for BAK1 and BRL1 proteins through interaction with BRL3 in BR-mediated root development. Collectively, these results highlight the power of using multidisciplinary approaches for the study of signaling pathways within specific cellular domains in the plant., Aquesta tesis doctoral té com a objectiu principal investigar noves funcions de les hormones vegetals esteroides, Brassinoesteroides (BRs), en el desenvolupament del teixit vascular de la planta. Per tal d’assolir aquest objectiu hem utilitzat una aproximació multidisciplinària, combinant models matemàtics i computacionals amb anàlisis exhaustius dels fenotips vasculars de plantes mutants en BRs, en la planta model Arabidopsis thaliana . A més, hem combinat tècniques de proteòmica amb microscopia confocal, amb l’objectiu d’identificar nous components de senyalització de BRs amb una resolució cel•lular. Els nostres resultats indiquen l’inici d’una ruta alternativa a la visió clàssica de la ruta de senyalització dels BRs descrita fins al moment. Tot i que els principals components del senyal ja han estat identificats pel seu homòleg més pròxim, el receptor BRI1, els complexes de BRL1 i BRL3 juntament amb els candidats co-receptors així com els components de la ruta de senyalització encara no s’han descrit. Per tal d’entendre millor la funció d’aquests receptors de BRs i d’investigar funcions de BRs específiques pels diferents tipus cel•lulars, vam plantejar diferents aproximacions: 1. Estudi de la contribució dels Brassinoesteroides en la formació del patró vascular de la tija d’Arabidopsis 2. Identificació de nous components de senyalització del receptor BRL3, involucrats en la regulació del desenvolupament vascular. 3. Caracterització funcional del signalosoma de BRL3 en el creixement i en el desenvolupament de la planta. Aquest estudi demostra que el transport polar de l’auxina i la senyalització de BRs determinen el patró radial dels feixos vasculars de la tija principal de les plantes d’Arabidopsis. Les nostes dades experimentals juntament amb l’elaboració d’un nou model matemàtic ens va permetre entendre com s’elabora el patró radial de la tija d’Arabidopsis, i els resultats es van publicar a la revista PNAS (Ibañes et al., 2009). A més, el nostre estudi demostra la formació de complexes receptors de BRs específics de tipus cel•lular, els quals participen en diferents activitats cel•lulars durant el creixement i desenvolupament de l’arrel. També revela funcions noves i específiques per a la senyalització de BRs a través dels receptor BRL3 en el nínxol de cèl•lules mare de l'arrel d'Arabidopsis.

[spa] Las especies de amplia distribución han recibido tradicionalmente poca atención, a pesar de su importancia para la estructura y el funcionamiento de los ecosistemas. En esta tesis, se analiza la variabilidad demográfica, de historia vital y genética en una planta de amplia distribución en Europa y el norte de África (Plantago coronopus), en un total de 22 poblaciones a lo largo de gran parte del rango latitudinal de la especie (centro y periferia norte). Se pretende analizar la magnitud y las causas de esta variabilidad intraespecífica en relación con la posición de las poblaciones dentro del rango y con los principales factores medioambientales. Las poblaciones periféricas mostraron una menor diversidad genética, pero no mostraron en general un peor o más variable comportamiento demográfico en cuanto a densidad o tasa de crecimiento poblacional, contradiciendo así las hipótesis clásicas centro-periferia. Se encontró un mismo patrón de diferenciación demográfica dentro de las regiones tanto central como periférica, en relación con la variación en el régimen de precipitaciones. La tasa de reclutamiento de nuevos individuos fue el proceso del ciclo vital con mayor importancia para el funcionamiento de las poblaciones. Se encontró también una gran variación entre poblaciones en las características de las semillas (número, tamaño, mucílago y proporción de dos tipos de semilla dimórficos) en relación con el gradiente de estrés ambiental. Finalmente, la variación fenotípica dentro de las poblaciones se relacionó con la variabilidad ambiental, mientras que la diversidad genética se correlacionó con la posición central vs. periférica de las poblaciones y posiblemente con la historia demográfica de la especie. Globalmente, este estudio muestra la importancia de distinguir entre periferia geográfica y marginalidad ecológica, y sugiere que el éxito de las plantas de amplia distribución reside en una gran variabilidad demográfica y de historia vital a diferentes escalas espaciales., [eng] Widespread species have traditionally received much less attention than rare and endemic ones. However, they are crucial in macroecological patterns and in ecosystem structure and functioning. Thus, understanding the characteristics that allow widespread organisms to extend over large areas has a high interest from both theoretical and applied perspectives. One of the most frequent hypotheses to explain the success of widespread plants is that they show much wider ecological niches, and thus a high life-history and demographic variability. However, studies are often very specific and carried out over small spatio-temporal scales, which hinders a general understanding of intraspecific variation in widespread taxa. In this thesis, we span a large spatio-temporal scale and a large environmental gradient to analyze the magnitude and the possible causes of natural variation in the in the range centre and the northern periphery of the widespread herb Plantago coronopus. More precisely, we analyze variability in population dynamics, life-history traits, and genetic diversity in up to 22 populations in Europe and North Africa. We aim to explore the relation of such variability with the position of populations within the species’ range, since peripheral populations are traditionally expected to show a lower and more variable performance with respect to central populations. Additionally, we aim to analyze the effects of the most relevant environmental factors in population and individual performance at different spatial scales. In the first chapter, we found higher values in central populations in some vital rates, such as fecundity and growth, but recruitment and density were higher in northern peripheral populations, and there were no clear differences between regions in temporal variability of vital rates. Differences in population performance across the species’ range seemed to be correlated with local precipitation and intraspecific competition. In the second chapter, differences in mean values and variability of vital rates between central and peripheral areas led to no differences in stochastic population growth rates. In addition, recruitment was the most influential vital rate for population growth rates at different spatial scales, and we found the same pattern of differentiation in population dynamics in response to environmental conditions within central and peripheral regions. In the third chapter, we reported high variation among populations in seed traits along a steep environmental stress gradient. Moreover, patterns in seed production were opposite at the fruit and the individual scale, as a strategy of populations to maximize fitness in each set of local conditions. Finally, in the fourth chapter, we found no relationship within populations between phenotypic variability and genetic diversity. Phenotypic variation was mainly shaped by precipitation variability, suggesting adaptive variation, whereas genetic diversity was correlated with the central vs. peripheral position, probably in close relation with some random demographic processes experienced by populations in the past. Despite genetic diversity was higher in central populations, our results contradicted classical hypotheses predicting a lower demographic performance towards species’ range edges. In fact, environmental conditions seemed to have a higher influence on plant performance than the position of populations within the species’ range, which calls for the necessity of distinguishing between geographical periphery and ecological marginality in demographic studies. Overall, our study highlights the versatility of P. coronopus at different spatial scales in response to varying environmental conditions, complementing similar findings of previous research on the same taxon at smaller spatial scales. Such life-history variability seems to be a key factor for widespread plants to extend over large and heterogeneous ranges.

En esta tesis se describen los resultados obtenidos en la clonación y caracterización de una nueva transglutaminasa (TGasa) vegetal aislada en arroz (Oryza sativa), la segunda transglutaminasa clonada en plantas y la primera en plantas C3. Las TGasas (E.C.2.3.2.13) son una familia de enzimas que promueven modificaciones postraduccionales de proteínas. Tienen especial importancia debido a sus implicaciones en enfermedades humanas y a sus aplicaciones biotecnológicas de interés industrial. Su investigación en plantas es aún incipiente y hasta la fecha, solo se ha clonado la TGasa cloroplástica de maíz (TGZ), a partir de una librería de ADN copia (ADNc) de plántulas de maíz. El aislamiento de la nueva transglutaminasa de arroz, descrita en esta tesis, se ha realizado a partir de ADNc y genómico. Utilizando cebadores diferenciales se realizó la clonación del gen (tgo), su inserción en un vector de expresión y su caracterización. Los análisis de la secuencia de tgo han permitido deducir que este nuevo gen está constituido por una secuencia de 1605 pb y que codifica para una proteína (TGO) de 352 aminoácidos. El análisis de la secuencia de TGO ha permitido detectar diferentes dominios relacionados con la actividad TGasa, como son la triada catalítica (Cys-His-Asp), secuencias repetidas en tándem y varios sitios de N-miristoilación. Además, otros dominios detectados, como los leucine-zipper, no eran conocidos en TGasas vegetales. La expresión de la proteína TGO en E. coli ha permitido realizar la caracterización de la enzima con respecto a diferentes parámetros. Así, mediante ensayos de actividad se ha podido confirmar la preferencia de la enzima frente a diferentes sustratos, así como su dependencia de calcio y la inhibición de su actividad frente a conocidos inhibidores de la actividad TGasa. Igualmente, la enzima fue capaz de polimerizar un sustrato in vitro y se comprobó su dependencia de la luz utilizando proteínas tilacoidales como sustrato. Éstas y otras características relevantes han permitido identificar a esta enzima como una verdadera TGasa. Finalmente, ensayos realizados con plantas de arroz para determinar su localización subcelular, así como su relación con proteínas implicadas en la fotosíntesis y su dependencia de la luz, llevan a sugerir que las funciones de TGO están asociadas a procesos fotosintéticos, probablemente relacionados con fotoprotección, al igual que ya se había descrito para la TGasa de maíz, aunque no se descartan otras funciones relacionadas., This thesis presents the results of cloning and characterization of a novel transglutaminase (TGase) from rice (Oryza sativa). This is the second transglutaminase cloned in plants and the first in C3 plants . TGases (EC2.3.2.13) are a family of enzymes that promote protein post-translational modifications. These enzymes are of particular importance because of their implication in human diseases and their biotechnological applications of industrial interest. Research on plant TGases is still incipient. To date, maize chloroplast TGase (TGZ) cloned from a DNA library is the only cloned TGase. The isolation of a new rice transglutaminase (TGO), described in this thesis, was performed using differential primers designed from both genomic and copy DNA, which has allowed the cloning of the gene (tgo), its insertion into an expression vector, and further characterization. Analysis of both the gene and protein sequences shows that this new gene is comprised of 1605 bp and encodes for a protein (TGO) of 352 amino acids. During sequence analysis different domains associated with TGase activity, such as a catalytic triad (Cys-His-Asp), tandem repeat sequences, and several N-myristoylation sites, were identified. Additionally, other domains not previously reported in plant TGases, such as a leucine-zipper domain, were observed. TGO protein expression in E. coli, allows enzyme characterization with respect to different parameters. Thus, the enzyme preference for different substrates, as well as calcium dependence and activity inhibition in the presence of known TGase inhibitors, was confirmed by these activity assays. The enzyme was able to polymerize in vitro a substrate and was also tested for light dependence using thylakoid proteins as substrate. All of these and other relevant TGO characteristics allowed the identification of this enzyme as a true TGase. Finally, studies with rice plants to determine TGO subcellular localization, as well as its relation to photosynthesis-involved proteins and light dependence, suggested that TGO functionality is associated with photosynthetic processes, probably related to photoprotection, which has already been described for maize TGase. In addition to photoprotection there are possibly additional functions that cannot be excluded.

[spa] Los estudios realizados sobre las proteínas Arv indican que estaría involucrada en la regulación de la homeostasis de esteroles y esfingolípidos. En levadura se observó una posible función en la síntesis de GPI (Kajiwara et al., 2008) y respecto a su topología, posee 3 dominios hidrofóbicos con el extremo N-terminal orientado hacia el citosol (Villasmil y Nickels 2011). En plantas, se caracterizaron los genes AtARV1 y AtARV2 de Arabidopsis thaliana que codifican dos proteínas de RE funcionales, AtArv1 y AtArv2. Estas comparten una identidad del 66% entre sí y poseen un dominio N-terminal AHD muy conservado en diferentes especies. Ambos genes poseen patrones solapantes de expresión en tejidos meristemáticos, excepto en hojas donde AtARV2 no se expresa (Forés et al., 2006). En este trabajo se determinó que AtArv1 posee un número par de dominios hidrofóbicos y que los extremos N- y C-terminales están orientados hacia el citosol. Además, se caracterizaron mutantes simples con pérdida de función (arv1) y dobles (arv1:arv2), que si bien no mostraron alteraciones fenotípicas, la activación de un RNAi en los doble mutantes arv1:arv2 indica que la pérdida de AtArv produce alteraciones fenotípicas en plántulas, que presentan acortamiento de la raíz y de los cotiledones que se vuelven amarillentos y se curvan en forma de « punta de flecha ». Los niveles de esteroles disminuyen y se ven incrementadas algunas BECL (Bases Esfingoides de Cadena Larga). Por otro lado, AtArv1 no parece estar vinculada a la UPR (Unfolded Protein Response) y su pérdida no es capaz de activar esta respuesta. La farnesildifosfato sintasa (FPS) es una enzima dimérica que cataliza la condensación de una molécula de dimetilalildifosfato con dos moléculas de isopentenildifosfato para dar lugar a farnesildifosfato, que es el punto de partida para la síntesis de isoprenoides en el citosol y las mitocondrias. Los genes FPS1 y FPS2 de Arabidopsis thaliana codifican las isoenzimas FPS1L mitocondrial), FPS1S y FPS2. Las secuencias aminoacídicas de FPS1S y FPS2 poseen una identidad del 90.6% y difieren en sólo 32 aminoácidos. El gen FPS1 se expresa de forma generalizada durante todo el desarrollo de la planta, en cambio, FPS2 muestra un patrón de expresión restringido a órganos florales, semillas y estadios tempranos de la germinación. En la caracterización de los mutantes nulos de Arabidopsis fps1 y fps2 se observó que el gen FPS2 es más importante en las semillas y las etapas tempranas de la germinación. La isoenzima FPS2 contribuye entre un 70-80% a la actividad FPS total en semillas maduras. Como consecuencia, las semillas del mutante fps2 presentan niveles reducidos de sitosterol, un aumento de la actividad HMG-CoA reductasa (HMGR) e hipersensibilidad a la mevastatina (Closa et al., 2010). En este trabajo se ha determinado mediante ensayos bioquímicos, que la isoenzima FPS2 es catalíticamente más eficiente, más sensible al efecto inhibitorio del NaCl, y termodinámicamente más estable que FPS1S. También se ha demostrado la localización citosólica de ambas isoenzimas. Los patrones de expresión de los genes FPS1 y FPS2 son complementarios en semilla e indican que el FPP necesario para el desarrollo de las semillas tiene dos posibles orígenes separados en el espacio y en el tiempo. Por último, los estudios de complementación funcional en semillas del mutante fps2 demuestran que en condiciones normales FPS1S y FPS2 son funcionalmente intercambiables., [eng] The previously characterized Arabidopsis thaliana proteins AtArv1 and AtArv2 have been suggested to be involved in the regulation of cellular lipid homeostasis as demonstrated for their yeast and mammalian counterparts. In this study, we established the citosolic orientation of both N- and C-terminal ends of the AtArv1 protein in the yeast ER membrane. Functional complementation assays of an arv1Δ yeast strain with a truncated AtArv1 protein also showed that the C-terminal 31 aminoacids are essential for AtArv1 function. Characterization of single Arabidopsis arv mutants did not reveal any effect on plant phenotype. On the contrary, characterization of loss-of-function Arabidopsis arv1:arv2 double mutants obtained by inducible siRNA-mediated silencing of AtARV genes demonstrated that lack of AtArv function leads to reduced root lenght and pale green curved cotiledons as well as to reduced levels of major sterols and increased levels of some sphingolipid LCBs (Long Chain Bases). In contrast to S. cerevisiae Arv1p, AtArv is not involved in the UPR (Unfolded Protein Response) in Arabidopsis since lack of AtArv1 does not activate this response. Previous results obtained in our laboratory showed that Arabidopsis thaliana contains two genes encoding farnesyl diphosphate (FPP) synthase (FPS), the short-chain prenyl diphoshate synthase that catalyzes the synthesis of FPP from isopentenyl diphosphate (IPP) and dimethylallyl diphosphate (DMAPP). The FPS1 gene is widely expressed in all plant tissues throughout development, whereas FPS2 shows a pattern of expression restricted to specific floral organs, developing and mature seeds. Characterization of fps single knock-out mutants suggested that FPS2 has a major role in seeds and during the early stages of seedling development. Actually, FPS2 provides 70-80% of total FPS activity in mature Arabidopsis seeds, hence lack of FPS2 activity in seeds leads to a marked reduction in sitosterol content and a positive feedback regulatory response of HMG-CoA reductase (HMGR) activity that renders seeds hypersensitive to mevastatin. In this study, we provide evidence that the two Arabidopsis short FPS isozymes FPS1S and FPS2 localize to the cytosol. Biochemical characterization of these recombinant enzymes expressed in E. coli, revealed that, despite FPS1S and FPS2 share more than 90% amino acid sequence identity, FPS2 is more efficient as a catalyst, more sensitive to the inhibitory effect of NaCl, and more resistant to thermal inactivation than FPS1S. Expression analysis of FPS::GUS genes in seeds also showed that FPS1 and FPS2 display complementary patterns of expression particularly at late stages of seed development, which suggests that developping Arabidopsis seeds have two spatially segregated sources of FPP. Functional complementation studies of the fps2 knock-out mutant seed phenotypes demonstrated that at least under normal conditions FPS1S and FPS2 are functionally interchangeable.

[cat] En els darrers anys, la important reconversió varietal ha permès una millor qualitat, més adaptada tan a les exigències de la producció com de la distribució i del consumidor. La primera generació de milloradors van posar tot el seu èmfasi en millorar les característiques comercials de la fruita com el color, la fermesa i el sabor. Tanmateix el mercat actual exigeix altres atributs de tipus organolèptic i nutricional, addicionals als anteriors. Entendre la base genètica que controla cadascun dels caràcters determinarà la nostra capacitat per obtenir uns fruits més atractius i sans per al consumidor. A la població 'Texas' × 'Earlygold' (T×E) s'han mapat 206 gens candidats (GCs) relacionats amb l'expressió dels caràcters de qualitat de la fruita (creixement i maduració del fruit, textura, color, contingut de sucres i àcids orgànics i aroma) i 18 gens al·lergògens de presseguer i/o ametller responsables de l'aparició de reaccions al·lèrgiques. La comparació entre la posició dels GCs mapats i la dels QTLs detectats ha permès trobar algunes co-localitzacions. Addicionalment, l'anàlisi comparativa entre la seqüència dels marcadors mapats a Prunus amb el mapa de la maduixa diploide i la seqüència completa de la pomera mostra elements comuns. La presència de blocs sintènics facilitarà la transferència del coneixement genètic entre les tres espècies i, a la vegada, permetrà proposar un hipotètic genoma ancestral per la família Rosaceae.||RESUMEN En los últimos años, la importante reconversión varietal ha permitido una mejor calidad, más adaptada tanto a las exigencias de la producción como de la distribución y del consumidor. La primera generación de mejoradores puso todo su énfasis en mejorar las características comerciales de la fruta como el color, la firmeza y el sabor. Sin embargo el mercado actual exige otros atributos de tipo organoléptico y nutricional, adicionales a los anteriores. Entender la base genética que controla cada uno de los caracteres determinará nuestra capacidad para obtener unos frutos más atractivos y sanos para el consumidor. En la población 'Texas' × 'Earlygold' (T×E) se han mapeado 206 genes candidatos (GCs) relacionados con la expresión de los caracteres de calidad de la fruta (crecimiento y maduración del fruto, textura, color, contenido de azúcares y ácidos orgánicos y aroma) y 18 genes alérgenos de melocotonero y/o almendro responsables de la aparición de reacciones alérgicas. La comparación entre la posición de los GCs mapeados y la de los QTLs detectados ha permitido encontrar algunas co-localizaciones. Adicionalmente, el análisis comparativo entre la secuencia de los marcadores mapeados a Prunus con el mapa de la fresa diploide y la secuencia completa del manzano muestra elementos comunes. La presencia de bloques sinténicos facilitará la transferencia del conocimiento genético entre las tres especies y, a la vez, permitirá proponer un hipotético genoma ancestral para la familia Rosaceae., [eng] Fruit quality is a very important trait in breeding programs of rosaceous crops. In addition to attributes such as appearance, flavour, scent and texture, breeders focus more and more on crucial aspects like nutritional quality and the absence or significant reductions of allergenic compounds for fruit health and safety. Understanding the genetic basis that controls each character determines our ability to obtain more attractive and healthy fruit to consumers. In the present study 206 candidate genes (CGs) associated with the expression of the characteristics of fruit quality (growth and fruit ripening, texture, colour, sugar content and organic acids and aroma) and 18 genes peach and / or almond allergens responsible for allergic reactions have been mapped in the Prunus reference map. The comparison between the position of the CGs and the QTLs previously detected allow us to find some co-localizations. Additionally, the comparative analysis between the sequences of molecular markers that are anchored into the Prunus and Fragaria reference maps and the Malus genome sequence shows common features. The presence of syntenic blocks facilitates the transference of genetic information between the three species and, in turn, would propose a hypothetical ancestral genome for Rosaceae family., [spa] En los últimos años, la importante reconversión varietal ha permitido una mejor calidad, más adaptada tanto a las exigencias de la producción como de la distribución y del consumidor. La primera generación de mejoradores puso todo su énfasis en mejorar las características comerciales de la fruta como el color, la firmeza y el sabor. Sin embargo el mercado actual exige otros atributos de tipo organoléptico y nutricional, adicionales a los anteriores. Entender la base genética que controla cada uno de los caracteres determinará nuestra capacidad para obtener unos frutos más atractivos y sanos para el consumidor. En la población 'Texas' × 'Earlygold' (T×E) se han mapeado 206 genes candidatos (GCs) relacionados con la expresión de los caracteres de calidad de la fruta (crecimiento y maduración del fruto, textura, color, contenido de azúcares y ácidos orgánicos y aroma) y 18 genes alérgenos de melocotonero y/o almendro responsables de la aparición de reacciones alérgicas. La comparación entre la posición de los GCs mapeados y la de los QTLs detectados ha permitido encontrar algunas co-localizaciones. Adicionalmente, el análisis comparativo entre la secuencia de los marcadores mapeados a Prunus con el mapa de la fresa diploide y la secuencia completa del manzano muestra elementos comunes. La presencia de bloques sinténicos facilitará la transferencia del conocimiento genético entre las tres especies y, a la vez, permitirá proponer un hipotético genoma ancestral para la familia Rosaceae.

[cat] L'activació de SUMO està catalitzada per l'heterodímer SAE2/SAE1 en una reacció depenent d'ATP. La subunitat SAE2 està organitzada en tres dominis funcionals: el domini d'adenilació, on SUMO és adenilat, el domini Cys que conté la cisteïna catalítica involucrada en la formació del tioéster amb l'extrem C-terminal de SUMO, i el domini UBL que s'ha descrit el seu paper en el reclutament de E2 per E1. La subunitat petita SAE1 presenta una contribució menor a la formació del domini d'adenilació i aparentment no estableix contacte amb SUMO. Arabidopsis expressa dues isoformes de SAE1, SAE1a i SAE1b i en aquesta tesi s'ha estudiat la rellevància biològica d'aquestes. Els nostres resultats indiquen que AtSAE1a és més estable que AtSAE1b tan in vitro com in vivo, i la taxa de conjugació de SUMO és depenent de la isoforma AtSAE1 present en la barreja de reacció, suggerint que l'activació de SUMO pot ser regulada pels nivells relatius de les isoformes de AtSAE1 presents in vivo. Per altra banda, s'ha descrit la capacitat de SUMO per interaccionar de manera no covalent amb el seu corresponent E2. Els determinants estructurals responsables d'aquesta interacció estan conservats a humans i llevat, suggerint que és un mecanisme conservat. A Arabidopsis s'ha detectat expressió de 5 isoformes de SUMO (AtSUMO1, 2, 3 i 5), de les quals només AtSUMO1 i 2 són capaços d'establir aquestes interaccions no covalents amb E2. Posteriorment, s'ha avaluat si aquestes diferències comporten una conseqüència a l'hora de ser conjugades a un substrat in vitro. Com a molècula acceptora de SUMO s'ha utilitzat el domini C-terminal de la catalasa 3 d'Arabidopsis. S'ha observat que AtSUMO1, 2 i 3 són capaços de ser conjugats al substrat, tot i que AtSUMO3 es conjugat d'una manera més ineficient, amb una taxa fins a quatre vegades inferior que AtSUMO1 i 2. En canvi, AtSUMO5 no es conjugat en nivells que es puguin detectar en cap de les situacions estudiades. Paral·lelament, durant aquesta tesi s'ha descrit que el domini AtE1 UBL disminueix l'eficiència de la conjugació de SUMO in vitro. S'han generat plantes transgèniques que expressen el domini AtE1 UBL i s'ha observat que l'expressió d'aquest domini in vivo provoca un fenotip de nanisme i floració primerenca. A més, en situacions d'estrès, aquestes plantes són incapaces d'acumular el mateix nivell de conjugats de SUMO que plantes silvestres. Amb tots aquests anàlisis es dedueix que la maquinària de sumoilació a Arabidopsis presenta una gran complexitat en quant a nombre de components, entre els quals podria existir una especificitat de funció. A més, la sumoilació es un procés essencial i està regulant processos tan importants com la floració, el creixement i el desenvolupament de les plantes., [eng] SUMO activation is catalyzed by the heterodimer SAE2/SAE1 in an ATP-dependent reaction. The SAE2 subunit is organized into three functional domains: the adenylation domain, where SUMO is adenylated, the Cys domain containing the catalytic cysteine involved in the thioester formation with SUMO Ct, and the UBL domain which has been involved in E2 recruitment. To E1. The small subunit SAE1 has a minor contribution to the adenylation domain formation and apparently it does not establish direct contacts with SUMO. Surprisingly, Arabidopsis expresses two SAE1 isoforms, AtSAE1a and AtSAE1b and we have investigated the biological relevance of this. Our results indicate that AtSAE1a is more stable than AtSAE1b both in vivo and in vitro, and that SUMO conjugation rate is dependent on the AtSAE1 isoform present in the reaction mixture, suggesting that SUMO activation could be regulated by the relative levels of AtSAE1 isoforms present in vivo. Together, our results suggest that SUMO activation could be a rate limiting step in the conjugation cascade in vivo.

[cat] En plantes, els fotoreceptors que han estat millor caracteritzats són els fitocroms (phys), que capten llum roja (R, de l'anglès red), y roja llunyana (FR, de l'anglès far red). Entre tots els processos regulats pels fitocroms, la síndrome de fugida de l'ombra o SAS (de l'anglès shade avoidance syndrome) és probablement el més important en les plantes crescudes en llum. La SAS fa referència a un grup de respostes induïdes quan plantes completament desetiolades creixen en alta densitat, és a dir, en proximitat d'altres plantes veïnes. Malgrat la complexitat d'aquestes respostes, la SAS s'indueix per un sol senyal ambiental, la disminució de la raó de llum R:FR. La percepció d'aquest senyal pels fitocroms inicia una complexa xarxa transcripcional. Per identificar nous components de la SAS, ens hem centrat en un grup de gens l'expressió dels quals està ràpidament afectada per llum de baixa raó R:FR. En aquesta tesi hem caracteritzat funcionalment dos nous gens d'aquest grup: PAR1 i PAR2 (de l'anglès phy rapidly regulated), que codifiquen factors de transcripció bHLH atípics. Plantes transgèniques amb nivells reduïts d'aquests gens mostren una resposta incrementada a l'ombra simulada, mentre que plantes de sobreexpressió de PAR1 i PAR2 presenten un fenotip nan i un color verd fosc, oposat a la SAS. Aquestes dades suggereixen que PAR1 i PAR2 regulen negativament les respostes de la SAS. A més, anàlisis de micromatrius ens han permès identificar un grup de gens reprimits per PAR1 de la família dels SAUR (de l'anglès small auxin up RNAs). L'expressió d'aquests SAURs s'indueix tant per auxines com per brassinosteroides de manera dosi-dependent, però també la llum de baixa raó R:FR els indueix transitòriament. L'anàlisi d'expressió dels gens SAUR15 i SAUR68 en tractaments combinats de llum i hormones (auxines i brassinosteroides) en plantes silvestres així com en línies amb nivells alterats de PAR1 suggereixen que aquest factor podria actuar com a repressor de la transcripció d'aquests dos gens SAUR. Els resultats obtinguts en aquesta tesi suggereixen que PAR1 modularia el desenvolupament integrant senyals de llum i d'hormones., [eng] The best characterized photoreceptors in plants are the phytochromes (phys), which perceive red (R) and far-red (FR) light. Among all the processes regulated by phys, the shade avoidance syndrome (SAS) is probably the most important for light-grown plants. The SAS refers to a group of responses induced when fully de-etiolated plants grow in close proximity of neighbouring vegetation. Despite the complexity of these responses, the SAS is induced by a single environmental signal, which is the decrease in the R: FR ratio. The perception of this signal by the phytochromes initiates a complex transcriptional network. In order to identify new components of the SAS, we have focused in a group of genes which expression is rapidly affected by low R: FR ratio light. We show functional data about two new genes of this group, PAR1 and PAR2 (from phy rapidly regulated), which encode atypical bHLH transcription factors. Transgenic plants with reduced levels of these genes show an increased response to simulated shade, while PAR1 and PAR2 overexpression plants show a dwarf phenotype and a dark green colour, opposite to the effect of the SAS treatment. These data suggest that PAR1 and PAR2 negatively regulate the SAS responses. Moreover, microarray analyses allow us to identify a group of genes repressed by PAR1 belonging to the SAUR (small auxin up RNAs) family. The expression of these genes is induced by auxins as well as brassinosteroids in a dose-dependent manner, but it is also transiently induced by low R:FR ratio light. The expression analysis of SAUR15 and SAUR68 genes in treatments combining light and hormones (auxins and brassinosteroids) in wild type plants as well as plants with altered PAR1 levels suggest that this factor could act as a repressor of the transcription of these two SAUR genes. The results obtained in this thesis suggest that PAR1 might modulate development integrating light and hormonal signalling pathways.

Les farnesildifosfat sintases (FPS) catalitzen la condensació de dues molècules d'isopentenildifosfat (IPP) amb una molècula de dimetilal.lildifosfat (DMAPP) per produir farnesildifosfat (FPP; C15). Tant els substrats com el producte de la reacció catalitzada per les FPS ocupen una posició molt important en la via del mevalonat de síntesi d'isoprenoides, ja que són punt de partida de nombroses ramificacions cap a la síntesi de diversos productes finals. A Arabidopsis thaliana existeix una petita família multigènica integrada pels gens FPS1 i FPS2, que codifiquen tres isoenzims FPS: FPS1S, FPS1L i FPS2. L'isoenzim FPS1L conté un pèptid de trànsit que li confereix una localització mitocondrial, mentre que FPS1S i previsiblement FPS2, tenen una localització citosòlica. A l'inici d'aquest treball, s'havien clonat els gens FPS1 i FPS2, i s'havien definit els seus patrons d'expressió espaial i temporal mitjançant l'anàlisi de plantes transgèniques portadores de gens quimèrics formats pels promotors d'ambdós gens fusionats al gen reporter uidA d'E. Coli. També s'havia estudiat el paper dels isoenzims FPS1S i FPS1L en la via del mevalonat a través de la caracterització de plantes transgèniques que sobreexpressaven aquests isoenzims. La localització de l'isoenzim FPS1L a les mitocòndries ja és, en sí mateixa, una evidència d'especialització funcional. En el cas dels isoenzims FPS1S i FPS2, el fet de pensar en l'existència d'una especialització funcional deriva dels seus patrons d'expressió diferencials.Amb l'objectiu d'analitzar el paper de l'isoenzim FPS2 en la via del mevalonat, i obtenir evidències de l'especialització funcional dels isoenzims FPS1S i FPS2, en aquesta tesi es duen a terme diferents abordatges experimentals basats en l'obtenció i caracterització de mutants d'A. Thaliana amb guany i pèrdua de funció dels gens FPS1 i FPS2. Per una banda, mitjançant l'estudi dels efectes de la sobreexpressió de l'isoenzim FPS2 i de la sobreexpressió simultània dels isoenzims FPS1S i FPS2. D'altra banda, a través de l'anàlisi de mutants amb pèrdua de funció dels gens FPS1 i FPS2 i del doble mutant fps1:fps2. Aquests abordatges es complementen amb l'estudi dels efectes de la sobreexpressió en A. Thaliana de proteïnes quimèriques FPS1S/FPS2 (domain swapping), l'elaboració de models estructurals tridimensionals dels isoenzims FPS1S i FPS2 i l'anàlisi dels perfils d'expressió gènica en mutants amb pèrdua de funció dels isoenzims FPS.En aquest treball es demostra que els isoenzims FPS1S i FPS2, tot i catalitzar la síntesi del mateix producte, tenir la mateixa localització subcel.lular i uns paràmetres cinètics similars, produeixen efectes molt diferents quan són sobreexpressats en A. thaliana. La presència d'un únic isoenzim FPS és suficient per garantir la viabilitat de les plantes, ara bé, la pèrdua de funció de l'isoenzim FPS2 desencadena una resposta metabòlica compensatòria a les llavors. En conjunt, tots els resultats indiquen que els isoenzims citosòlics FPS1S i FPS2 desenvolupen funcions majoritàriament redundants, tot i que presenten una certa especialització funcional que sembla derivar del patró d'expressió especialitzat de cadascun dels gens FPS., Farnesyldiphosphate synthases (FPS) catalyze the condensation of two molecules of isopentenyldiphosphate (IPP) with its isomer dimethylallyldiphosphate (DMAPP) to produce farnesyldiphosphate (FPP; C15). FPS is located at a key position in the mevalonic acid pathway (MVA), as both the substrates and the reaction product are precursors of a variety of isoprenoid end-products. Arabidopsis thaliana contains a small FPS gene family consisting of two genes, FPS1 and FPS2, encoding three FPS isoforms: FPS1S, FPS1L and FPS2. FPS1L isoform is located in the mitochondria, whereas FPS1S and likely FPS2, are both localized in the cytosol. The differential patterns of expression of FPS1 and FPS2, strongly suggest a functional specialization of the encoded FPS1S and FPS2 isoforms.The aim of this thesis is to analyze the role of FPS2 isozyme in the MVA pathway and to obtain evidence of a functional specialization of FPS1S and FPS2 isozymes. Different experimental approaches have been undertaken using A. thaliana mutants with gain and loss of function of FPS1S and FPS2. We have investigated the effects of FPS2 overexpression and the effects of the overexpression of both FPS isozymes simultaneously. We have also characterized A. thaliana knock-out mutants in both FPS genes and the double knock-out mutant fps1:fps2. Analysis of the effects caused by the overexpression of chimeric FPS1S/FPS2 proteins in A. thaliana, 3D modelling of FPS isozymes, and microarray analysis of FPS knock-out mutants are also included in this study.Results demonstrate that, although FPS1S and FPS2 isozymes synthesize the same reaction product, have the same subcellular localization and have similar kinetic parameters, its overexpression produce different effects in A. thaliana. The existence of a single FPS isozyme is enough to assure plant viability. However, FPS2 loss of function triggers a compensatory metabolic response in A. thaliana seeds. All these results indicate that FPS1S and FPS2 play redundant functions in the MVA pathway, although they also show a certain level of functional specialization.

SNF1/AMPK/SnRK1 es un complejo quinasa hetrotrimérico altamente conservado en todos los eucariotas estudiados, que regula respuestas celulares ante diferentes situaciones de estrés ambiental y nutricional. En levaduras y mamíferos, la subunidad quinasa (SNF1 y AMPK, respectivamente) interacciona con dos subunidades no catalíticas (beta y gamma) implicadas en la especificidad de sustrato, localización subcelular y regulación de la actividad catalítica. La identificación en plantas de la subunidad atípica AKIN-beta-gamma sugirió un nuevo modelo alternativo al clásico complejo heterotrimérico. Las subunidades AKIN-beta-gamma presentan en su extremo N-terminal un dominio KIS (Kinase Interacting Sequence) caracterísitico de las subunidades beta, fusionado a un dominio con similitud a las subunidades gamma. La existencia en plantas de otras subunidades del complejo SnRK1 atípicas, pone de manifiesto la diversidad y complejidad existente respecto a esta familia de proteínas. Esta tesis doctoral tiene como objetivo principal la caracterización del complejo SnRK1 de maíz a través de la caracterización de la subunidad ZmAKIN-beta-gamma y de la identificación de nuevas subunidades del complejo.En la primera parte de este trabajo se ha abordado la caracterización estructural del dominio conservado KIS de la proteína ZmAKIN-beta-gamma. La expresión en E.coli ha permitido la obtención de cantidades suficientes para realizar diversos ensayos de cristalización. Aunque no se ha conseguido la cristalización, la purificación de este dominio reveló la tendencia a la formación de dímeros más estables que la forma monomérica. Mediante experimentos de pull down se ha demostrado que la interacción entre el dominio KIS de ZmAKIN-beta-gamma es específica. La expresión de ZmAKIN-beta-gamma tanto a nivel de mRNA como de proteína se induce en condiciones de estrés osmótico en plántulas de maíz. Experimentos de inmunoprecipitación muestran la asociación de ZmAKIN-beta-gamma con subunidades catalíticas SnRK1, sin embargo el aumento de expresión ZmAKIN-beta-gamma no correlaciona con una aumento en la actividad SnRK1 inmunoprecipitada. Por otra parte, in vitro, ZmAKIN-beta-gamma es capaz de activar otra proteína de la subfamilia SnRK2.Se han identificado y clonado diferentes subunidades del complejo SnRK1 de maíz: 2 subunidades catalíticas (ZmSnRK1a y ZmSnRK1b), 1 subunidad del tipo beta (Zm-beta-1) y dos subunidades  (Zm-gamma-1 y Zm-gamma-2). Ambas subunidades catalíticas complementan a los mutantes snf1 y snf4, indicando así su conservación funcional con la proteína SNF1. Estudios de actividad en E.coli indican además que el dominio catalítico de ZmSnRK1b presenta per se actividad quinasa in Vitro. Se han realizado ensayos de doble híbrido para determinar las asociaciones entre las diferentes subunidades aisladas, sin embargo, ninguna de las subunidades catalíticas identificadas interacciona con las subunidades reguladoras. Con el objetivo de identificar nuevas subunidades que interaccionaran con la subunidad ZmSnRK1b se ha llevado a cabo un rastreo de doble híbrido utilizando una librería de embrión joven. Así, se han identificado diferentes proteínas que se han clasificado en grupos funcionales. Una de las proteínas identificadas, y con interacción específica para la subunidad ZmSnRK1b es la MnSOD. La interacción entre ambas proteínas tiene lugar a través del dominio regulador de la quinasa, según experimentos de doble híbrido en levadura. La sobreexpresión de ZmSnRK1b provoca la acidificación de la proteína MnSOD cuando ambas proteínas son cotransformadas en protoplastos de A. thaliana, sugiriendo un cambio en la modificación postraduccional de MnSOD, provocado por ZmSnRK1b., SNF1/AMPK/SnRK1 is a highly conserved kinase complex involved in the regulation of cellular responses to environmental and nutritional stress. In yeast and mammals, the kinase subunit (SNF1 and AMPK, respectively) interacts with two other non catalytic subunits (beta and gamma) involved in substrate specificity, subcellular localization and regulation of the kinase activity. In plants, the identification of the atypical AKIN-beta-gamma subunit of the SnRK1 complex similar to SNF4/AMPKg proteins suggest the possible existence of several SnRK1 complex (dimeric and trimeric) formed by different regulatory subunits as a mechanism of flexibility in plants. The major aim of this PhD work is the characterization of maize SnRK1 complex. For this purpose we have focused on two main objectives: the study of ZmAKIN-beta-gamma subunit and the identification of new SnRK1 components. Thus, protein expression in "E.coli" has demonstrated that the conserved KIS domain, present in ZmAKIN-beta-gamma associates into dimeric forms more stable than monomeric forms. "Pull down" experiments have shown the specificity of this interaction. Expression studies, at mRNA and protein level, have demonstrated ZmAKIN-beta-gamma induction under osmotic stress conditions in maize seedlings. Moreover, inmunoprecipitation experiments have showed that ZmAKIN-beta-gamma is associated with SnRK activity.For the second part, two catalytic subunits (ZmSnRK1a and ZmSnRk1b ), one scaffold subunit (Zm-beta-1) and two regulatory subunits (Zm-gamma-1 and Zm-gamma-2) have been isolated. Complementation analyses of yeast "snf1" and "snf4" mutants have demonstrated the conserved functionality of ZmSNRK1a and ZmSnRK1b with their yeast counterparts. By yeast two hybrid analyses we have studied interactions between the different subunits. However, none of the catalytic subunits interacted with the isolated regulatory subunits. To get more insight into ZmSnRK1b partners, a yeast- two hybrid screening was performed using a maize embryo library. Different proteins were isolated and we have focused on the study of the specific ZmSnRK1b interaction with a MnSOD, an important protein involved in the oxidative metabolism.

Las plantas están constantemente sometidas a estreses ambientales y los hongos son sus principales patógenos. Actualmente, el control de las enfermedades que causan se realiza utilizando compuestos químicos, generando impacto en el medio ambiente. Una alternativa es la obtención de plantas transgénicas resistentes. En un principio, la mayoría de los transgenes provenían de las propias plantas (genes involucrados en las respuestas de densa). Actualmente, y dada su reducida efectividad, se están identificando genes de defensa de otros organismos, como bacterias, insectos, animales y hongos. En este trabajo se ha evaluado la utilidad de la proteína AFP ("antifungical protein"), producida por el hongo del suelo Aspergillus giganteus, para actuar como agente antifúngico frente a fitopatógenos de geranio y arroz. Es una proteína con una estructura compacta y muy básica, que se secreta al espacio extracelular. Estudios anteriores ya habían demostrado su actividad antifúngica frente al hongo Botrytis cinerea, responsable de la enfermedad "podredumbre gris" en muchas plantas, especialmente las ornamentales. Los resultados revelan una fuerte actividad antifúngica, con inhibición tanto del desarrollo de las hifas como de la germinación de las esporas. Cuando se utiliza en combinación con la proteína cecropina A de lepidóptero, se observa un efecto aditivo entre ambas, lo que puede ser útil para desarrollar estrategias de expresión simultánea de ambos genes en plantas transgénicas. Además, la AFP inhibe el crecimiento de B. cinerea tanto in vitro como in vivo, en plantas de geranio.Por otra parte, el hongo Magnaporthe grises causa la enfermedad piricularosis en arroz. En este trabajo se ha desarrollado una estrategia para expresar el gen afp de manera inducible en plantas transgénicas de arroz con el fin de obtener plantas resistentes y evitar los posibles efectos negativos de una expresión constitutiva, como gasto metabólico y aceptación por los consumidores. Nuestros estudios indicaron que el promotor de un gen PR de maíz, el gen ZmPR4, es funcional e inducible por el hongo M. grisea en plantas de arroz. Este promotor controla la expresión del gen afp en niveles suficientes para conferir resistencia a la infección por este hongo en plantas transgénicas. Además este promotor no es activo en el endospermo de la semilla del arroz (órgano destinado al consumo), con lo que se evita que el producto del transgén se acumule en este tejido. Dado el potencial del gen afp para aplicación biotecnológica, se hacía necesario determinar su mecanismo de acción, así como sus posibles efectos sobre células animales o vegetales. Para eso, se han realizado diferentes estudios utilizando el hongo M. grisea. Mediante microscopía electrónica de transmisión y confocal, s eha observado que esta proteína es capaz de formar poros en la membrana del hongo, penetrando en la célula y acumulándose en el núcleo. Además, tiene la propiedad de interaccionar con ácidos nucleicos (DNA o RNA). Estros resultados sugieren que su mecanismo de acción se basa en una combinación de dos actividades: formación de poros en la membrana, e interacción con ácidos nucleicos. Se realizaron también ensayos con células vegetales (protoplastos de arroz) y humanas (células HeLa), que han permitido determinar que la proteína AFP no ejerce efecto nocivo significativo sobre ellas. Los resultados obtenidos permiten concluir que el gen afp es un buen candidato para ser utilizado como transgén en la protección de plantas de geranio y de arroz frente a los hongos Botrytis cinerea y Magnaporthe grisea, respectivamente. El promotor del gen ZmPR4 representa una buena opción para dirigir la expresión de genes antifúngicos en plantas transgénicas de arroz., The mold "Aspergillus giganteus" produces the antifungal (AFP) protein. In this work we have analysed the biotechnological applications of this protein against phythopathogenic fungus ("Botrytis cinerea" and "Magnaporthe grisea"). We also studied mechanism of action of AFP against this last fungus. The results are presented in 3 chapters. 1) "Botrytis" blight caused by "Botrytis cinerea" is one of the most widely distributed disease of ornamental plants, especially geranium. Here, the antifungal properties of AFP against various "B. cinerea" isolates were investigated. AFP showed a strong inhibition of mycelial growth and conidial germination by a fungicidal activity. Microscopic observations revealed reduced hyphal elongation and swollen tips. AFP directly protects geranium leaves against "Botrytis". These results are discussed in relation to the potential of the "afp" gene to enhance crop protection against "B. cinerea". 2) Rice blast, caused by "Magnaporthe grisea", is the most important fungal disease of cultivated rice. We have developed a strategy for creating disease resistance to "M. grisea" by pathogen-induced expression of the "afp" gene in transgenic rice plants. Plants expressing the "afp" gene under the control of the maize "ZmPR4" promoter were generated. Transformants showed resistance to "M. grisea". Our results suggest that pathogen-inducible expression of the "afp" gene in rice plants may be a practical way for protection against the blast fungus. 3) The mechanism of action of AFP against "Magnaporthe grisea" was investigated. AFP was able to produce membrane permeabilization on fungal cells but not on rice or HeLa cells. TEM studies revealed cellular degradation and damage of plasma membranesin AFP-treated fungal cells. AFP was found in the nucleus and gel-retardation experiments confirmed that AFP binds nucleic acids. Together, our results suggest that the combination of fungal cell permeabilization, cell-penetrating ability and nucleic acid-binding activity of AFP determines its antifungal activity.

En este trabajo se han obtenido múltiples secuencias de dominios relevantes de los dos tipos de retrotranspones (RTN) con LTR: Ty1-copia y Ty3-gipsy, mediante amplificación por PCR con cebadores degenerados del DNA genómico de Citrus sinensis (naranjo dulce) de la variedad "Valencia late". Del análisis de las secuencias obtenidas se han podido identificar, en base a estudios filogenéticos, 7 familias de tipo copia (CIRE1-CIRE7) y 6 familias de gipsy (GySiA-GySiF) diferentes. Por reconstrucción genómica se ha estimado en 10.000 y 5.000 el número total de RTN tipo copia y gipsy, respectivamente, presentes en el genoma haploide del naranjo, los cuales ocuparían alrededor del 23% del genoma de C. sinensis.Se ha determinado la secuencia entera de un nuevo RTN copia CIRE1 (de aproximadamente 5 kb y con 2 LTR de alrededor de 460 pb), a partir de una secuencia parcial de la región de la transcriptasa inversa, combinando PCR inversa y PCR directa sobre DNA genómico. Este elemento (Nº Acc.: AM040263) presenta una pauta de lectura sin interrupciones por codones parada y la traducción conceptual a aminoácidos se realiza sin ningún cambio de pauta de lectura. Los motivos estructurales y funcionales están conservados comparando su secuencia con otros RTN copia caracterizados. CIRE1 representa el 2,9% del genoma del naranjo con aproximadamente 2.200 copias por genoma haploide. Se concluye que la mayoría de las copias de CIRE1 en C. sinensis están completas. Se ha descartado también una presencia significativamente importante de solo-LTR de CIRE1. Se ha comprobado, por PCR específica y Southern blot, que CIRE1 está presente en diferentes especies de cítricos así como en otras rutáceas como Fortunilla o Poncirus, sugiriendo que el RTN estaba presente en estadios tempranos de la especiación de la familia Rutaceae. En cambio, CIRE1 no se ha detectado en otras especies de monocotiledóneas o dicotiledóneas fuera de las rutáceas. La secuencia de la LTR5' de CIRE1 presenta cajas típicas de los promotores eucariotas, así como hipotéticos elementos reguladores, entre ellos motivos descritos de respuesta a auxinas, ácido jasmónico y asociados a la expresión específica en raíz. La LTR5' de CIRE1 es capaz de dirigir la actividad GUS en experimentos de transformación de sistemas heterólogos, asimismo se observa un incremento de la actividad GUS al aplicar exógenamente la auxina ácido naftalenacético (NAA). Además, CIRE1 es activo transcripcionalmente. En condiciones normales, se detectan transcritos de CIRE1 en raíz aunque no en hoja. El nivel de transcritos se incrementa considerablemente en el tejido foliar en respuesta a herida y tras la adición de las fitohormonas ácido jasmónico y naftalenacético. Por otra parte, el estudio de los RTN copia en diez especies del género Citrus y tres especies de géneros próximos de la familia Rutaceae, revela 7 nuevas familias (CIRE8-CIRE14), además de las 7 ya descritas en C. sinensis. Parte de estas secuencias han sido depositadas en la base de datos del EMBL (Nº acc.: AM117724-AM117758). Se concluye que el ancestro común de estas especies vegetales contenía ya una población heterogénea de RTN copia que se expandieron y diversificaron antes de la separación del género Citrus. Por otra parte, se ha estimado el número de elementos copia en dichas especies en el rango de 4.000 - 15.000 copias por genoma haploide, llegando a representar cerca del 22% del genoma en C. clementina. Asimismo, se ha puesto a punto la técnica de SSAP (Polimorfismo de Amplificación Específica de Secuencia) con una secuencia de la LTR de CIRE1 en cítricos. Nuestros resultados muestran polimorfismos entre las trece especies del estudio y los árboles filogenéticos derivados reflejan bien las taxonomías ya publicadas del género basadas en otros marcadores moleculares como RFLP o RAPDs. La técnica SSAP también se ha aplicado para la detección de polimorfismos de inserción de CIRE1 in planta, mostrando patrones de bandas SSAP diferentes en hoja y raíz, sugiriendo mayor transposición de CIRE1 en raíz., We performed an analysis of Ty1-"copia" retrotransposons (RTN) of different commercial citrus species genome. Sequences from "copia"-like RTN have been cloned by PCR amplification using degenerate primers corresponding to the reverse transcriptase (RT) domain for copia [Data deposited as: EMBL accession numbers AM117724-AM117758]. Phylogenetic analysis revealed lack of concordance between phylogenetic tree obtained from RT sequences and taxonomic tree suggesting that different families of Ty1-"copia" existed before "Citrus" speciation. In fact, these elements could be divided into fourteen different families (CIRE1-CIRE14) by their RT similarity. Copy number determination also revealed that copia elements are so abundant throughout the "Citrus" genus, representing around a 22% of the genome in "C.clementina". Particularly, total LTR-RTN represent approximately 23% of the "C.sinensis" (sweet orange) genome, and "copia" (13%) are more abundant than gypsy ones (10%). "Copia" and "Gypsy" elements were divided into seven (CIRE1-CIRE7) and six (GySiA-GySiF) different families, respectively, in this specie. At least, three transcriptionally active copia families were detected by RT-PCR in roots of healthy sweet orange plants but not in leaves. Furthermore, both wounding and some hormones treatment could induce the expression of CIRE1 RTN in leaves. Moreover, complete sequence of CIRE1, which is 5 kb long and has all the features typical of a "copia"-like RTN, has been determined [EMBL accession number AM040263]. CIRE1 elements are conserved in length and have an LTR:internal domain ratio of about 2:1. On average CIRE1 contributes 2.200 full length copies, amounting to 2.9% of the "C. Sinensis" genome and representing 22% of total "copia" group. Furthermore, the LTR5' of CIRE1 can promote the expression of translational LTR-GUS fusion in transient expression assays and preliminary analysis of CIRE1 mobility by SSAP strategy suggest a possible transposition activity in roots.On the other hand, CIRE1 was used to develop retrotransposon-based molecular markers using the technique sequence-specific amplification polymorphism (SSAP), in order to asses biodiversity within "Citrus" and related genera as "Poncirus", "Fortunella" and "Microcitrus". SSAP polymorphic bands have been already observed among thirteen DNA accessions corresponding to those genera. The SSAP markers were used for phylogenetic studies among citrus species, well reflecting the established species phylogeny.

L'enzim HMG-CoA reductasa (HMGR) catalitza la primera etapa limitant en la síntesi d'isoprenoides citosòlics. En plantes, és un enzim de membrana i la seva primera destinació subcel·lular és el reticle endoplasmàtic. Estructuralment, està formada per un domini amino-terminal (que inclou una regió amino-terminal citosòlica i dos fragments transmembrana) i un domini catalític altament conservat en tota l'escala evolutiva. En totes les espècies de plantes conegudes fins al moment, existeixen isoformes de l'HMGR codificades per diferents gens. Concretament, en Arabidopsis thaliana el gen hmg1 (expressat de forma majoritària) codifica per a les isoformes HMGR1S i HMGR1L, i el gen hmg2 (expressat a arrels, plàntules i inflorescències) codifica per a la isoforma HMGR2. A nivell d'estructura primària l'HMGR1L difereix de l'HMGR1S per la presència d'una regió extra de 50 residus aminoacídics a l'extrem amino-terminal. El domini amino-terminal confereix diferents destinacions de localització subcel·lular a la proteïna. En un treball anterior, es van identificar tres proteïnes que interaccionen amb les isoformes derivades del gen hmg1: AtB"α, AtB"β i AtKLC-1. Les dues primeres interaccionen específicament amb la regió amino-terminal de les isoformes HMGR1S i HMGR1L. Les proteïnes AtB"α i AtB"β són isoformes de la subunitat B" reguladora del complex proteïna fosfatasa 2A (PP2A). En el genoma d'A. thaliana hi ha cinc seqüències que codifiquen per a isoformes de la subunitat B" que comparteixen una gran homologia. En l'estructura primària de la subunitat B" s'han identificat motius EF-Hand (implicats en la unió a calci). S'ha demostrat que tant AtB"α com AtB"β uneixen calci. La tercera proteïna identificada, AtKLC-1, interacciona específicament amb la regió amino-terminal de l'HMGR1L. S'ha determinat per assaigs de doble híbrid en llevat i, posteriorment confirmats in vitro, que la PR65, proteïna estructural del complex PP2A, interacciona específicament amb l'AtKLC-1. La regió de la PR65 suficient per a la interacció amb la subunitat B" reguladora, AtB"α, i amb l'AtKLC-1 comprèn la mateixa seqüència aminoacídica. Per tant, l'AtB"α i l'AtKLC-1 podrien competir per a l'associació amb la PR65. Així, en la cèl·lula, la PP2A podria regular d'una forma particular les isoformes HMGR1S i HMGR1L. Assaigs in vivo i in vitro demostren que la PP2A és un regulador negatiu de l'enzim HMGR. Els ions calci inhibeixen també l'activitat HMGR. Per a què es dugui a terme la repressió de l'activitat HMGR tant per calci com per PP2A, es requereix el domini amino-terminal de la proteïna. Per tant, els resultats són consistents amb què les subunitats AtB" i/o AtKLC-1 duen a terme un paper mediador en la modulació de l'HMGR per la PP2A. El domini amino-terminal de l'HMGR1S està implicat en la morfogènesi de vesícules derivades del reticle endoplasmàtic. La subunitat AtB"α i la resta del complex PP2A participen en aquest procés. El domini amino-terminal de l'HMGR1L dirigeix la proteïna a la trama de reticle endoplasmàtic. La PP2A participa també en la localització subcel·lular d'aquesta isoforma.S'ha caracteritzat una línia mutant en el gen hmg1 d'A. thaliana que mostra absència del transcrit hmg1 i una reduïda activitat HMGR. Les plantes d'aquest mutant creixen normalment en un medi de cultiu estèril i manifesten severes alteracions del desenvolupament quan són cultivades en terra. L'addició de mevalonat, producte de la reacció catalitzada per l'HMGR, no reverteix el fenotip. Les dades indiquen que el gen hmg1 duu a terme una funció no metabòlica relacionada amb l'adaptació al medi. En aquestes condicions de creixement, les estructures vesiculars induïdes per l'HMGR1S podrien tenir alguna funció essencial relacionada amb la resposta a estrès., "ROLE OF THE PROTEINS AtKLC-1 AND AtB" IN THE REGULATION OF HMG-CoA REDUCTASE IN ARABIDOPSIS THALIANA".TEXT: The enzyme HMG-CoA reductase (HMGR) catalyses the formation of mevalonate in the first rate-limiting step of the mevalonate pathway for isoprenoid biosynthesis. All known plant HMGR isoforms are primarily targeted to the endoplasmic reticulum (ER).These proteins contain two domains: an N-terminal domain (which includes an N-terminal cytosolic region and two membrane-spanning sequences) and a conserved catalytic domain. In all plant species, there are a variety of HMGR isoforms encoded by a multigene family. In Arabidopsis thaliana, two genes (hmg1 and hmg2) encode three HMGR isoforms (HMGR1S, HMGR1L and HMGR2). Isoforms HMGR1S and HMGR1L are identical in sequence but HMGR1L is extended 50 amino acid residues at the N-terminal end. In a previous study, three proteins had been identified which specifically interact with the HMGR1L N-terminal end. Two of these proteins, designed AtB" and AtB", are regulatory B" subunits of protein phosphatase 2A (PP2A). They bind the N-terminal region of HMGR1S and HMGR1L. The third one, AtKLC-1, exclusively interact with the N-terminal region of HMGR1L. In vitro assays have revealed that PR65, PP2A scaffolding subunit, specifically interact with AtKLC-1. Genetic and pharmacological approaches demonstrate that PP2A exerts an inhibitory control over HMGR. These results indicate that AtB" or AtKLC-1 could have a mediating role in the HMGR regulation carried out by PP2A. The N-terminal domain of the HMGR1S isoform is involved in the biogenesis of vesicle structures derived from the ER membranes. The PP2A complex is concerned in this process and the subunit AtB" acts as an interceding factor. Furthermore, we have characterized an Arabidopsis thaliana insertion mutant for hmg1. This mutant exhibits no visible phenotype under sterile growth conditions but shows dwarfing and sterility when it is grown in a soil substrate. The addition of mevalonate doesn't rescue this phenotype. These data suggest that hmg1 performs a no-metabolic function related with environment adaptation. In this context, ER derived vesicles induced by HMGR1S could play an essential role related with stress response.

La diversitat genètica és un dels tres nivells que componen la Biodiversitat, i té implicacions molt directes pel que fa a la capacitat evolutiva dels organismes i la seva supervivència. El coneixement dels nivells de diversitat genètica en els vegetals i dels efectes que comporten les activitats humanes sobre aquesta variabilitat, és un camp encara poc estudiat. El plantejament d'aquest treball és l'aprofundiment en el coneixement de la caracterització de la diversitat genètica de les espècies vegetals de la Mediterrània Occidental, en especial d'aquelles que són endèmiques i/o de les què es troben en una situació d'amenaça, per tal de discernir possibles patrons o pautes de variabilitat genètica i les seves possibles aplicacions en gestió i conservació de recursos naturals.S'han seleccionat una sèrie de tàxons vegetals representatius de diferents processos i situacions: endèmics d'àrea molt restringida ("Seseli farrenyi", "Silene sennenii"), d'àmplia distribució però en procés de rarificació progressiu ("Stachys maritima"), diploides i poliploides ("Thymus loscosii", "Delphinium montanum"), exclusivament insulars ("Delphinium pentagynum" subsp. "formenteranum"), i d'hàbitat molt específic, com ara les roques calcàries ("Erodium rupestre", "Petrocoptis montsicciana", "P. pardoi"). De cada tàxon, hem seleccionat una sèrie de poblacions que, un cop mostrejades, s'han sotmès a electroforesi d'isoenzims (en gels de midó) per tal de determinar els nivells de variabilitat genètica i la seva distribució (intra- i inter-poblacional). En total, s'han analitzat al voltant de 2.000 individus corresponents a 41 poblacions naturals, i s'han assajat fins a 28 enzims diferents.Els nivells de diversitat genètica obtinguts han estat força variables: des de valors elevadíssims, com és el cas de "Seseli farrenyi" (P = 83,30%, A = 3,00, He = 0,297) o per al tetraploide "Thymus loscosii" (P = 85,00%, A = 3,00, He = 0,422), fins a nivells extremadament petits, com ara els obtinguts per a "Stachys maritima" (P = 14,00%, A = 1,16, He = 0,066) i per a "Erodium rupestre" (P = 7,10%, A = 1,07, He = 0,025). De la mateixa manera, la distribució de la diversitat entre poblacions també ha resultat ésser força variable: des de casos on pràcticament les poblacions són genèticament idèntiques entre sí, com ara "Thymus loscosii" (GST = 0,033), fins a casos on la divergència entre poblacions arriba a valors propers al 40%, com són els casos de "Petrocoptis montsicciana" (GST = 0,376), "P. pardoi" (GST = 0,354) o "Erodium rupestre" (FST = 0,372). Quan unim les nostres dades amb les de la resta dels tàxons vegetals estudiats electroforèticament dels Països Catalans, obtenim globalment uns nivells relativament elevats de diversitat genètica (P = 26,70%, A = 1,44, He = 0,118), interpretables, entre d'altres raons, pel paper jugat per les nostres contrades com a refugi de flora durant les glaciacions del Pleistocè. Aquestes espècies també es caracteritzen perquè presenten una elevada divergència genètica entre les poblacions (mitjana de FST = 0,224), que pot explicar-se per raons històriques (aïllament dels nuclis poblacionals des de les glaciacions del Quaternari) i per la gran diversitat climàtica i topogràfica d'aquesta regió, però també per la fragmentació dels seus hàbitats naturals. Finalment, es revisa l'estat de conservació de cada un dels 9 tàxons analitzats electroforèticament i se'ls hi assigna la categoria d'amenaça segons els darrers criteris de la UICN del 2001. D'aquests, sis cal llistar-los dins d'alguna de les categories d'amenaça (CR, EN o VU), mentre que la resta no pateixen cap amenaça seriosa que posi en compromís la seva supervivència. Per a la majoria dels tàxons estudiats, es proposa la conservació in situ de les poblacions de major significació genètica i/o ecològica i la recol·lecció de granes per al seu emmagatzemament en bancs de germoplasma (amb selecció de poblacions i nombre d'individus derivats de l'anàlisi genètica prèvia)., Genetic diversity has direct implications on the evolutionary capability of organisms and their survival. The knowledge of its levels in plants and the effects of human activities on this variability is still poorly studied. The aim of this work is to advance in the characterization of genetic diversity of plants of the Western Mediterranean Basin, specially those endemic and/or threatened, in order to ascertain patterns of genetic variability and their implications on management and conservation of natural resources. A series of plant taxa, representing several processes and situations, have been selected: narrow endemics (Seseli farrenyi, Silene sennenii), widespread but currently suffering from a rarefaction process (Stachys maritima), polyploids (Thymus loscosii, Delphinium montanum), island endemics (Delphinium pentagynum subsp. formenteranum), or with a very specialized habitat, e.g. limestone (Erodium rupestre, Petrocoptis montsicciana, P. pardoi). From each taxon, a series of populations have been selected, sampled and subjected to allozyme electrophoresis (on starch gels) in order to determine the levels of genetic variation and its distribution (within and among populations). Summarizing, about 2.000 individuals belonging to 41 populations have been analyzed, and up to 28 enzyme systems have been assayed. Levels of genetic diversity for the surveyed taxa are rather variable, ranging from extremely high values, e.g. Seseli farrenyi, to very scarce ones, e.g. Stachys maritima and Erodium rupestre. The distribution of genetic variation also shows a great dispersion of values, and most populations exhibit significant deficits of heterozigotes, because of their subdivision in genetic neighborhoods or high levels of inbreeding. If we combine our data with those of other electrophoretically surveyed plant taxa in the Catalan Countries, relatively high levels of genetic diversity but significant genetic divergence among their populations are globally obtained, mainly due to the role of glacial refugia played by this region.The conservation status of each of the 9 electrophoretically analyzed taxa is widely revised, assigning the threat category which best fits following the most recent criteria of IUCN of 2001. In addition, on the basis of genetic data obtained, both in situ and ex situ conservation measures are proposed.

En aquesta tesi s'ha estudiat el procés d'organogènesi adventícia de brots i rels en el clavell.D'una banda s'ha demostrat l'efecte de genotip en aquest procés, tot sent el cultivar White Sim el més regeneratiu. Prèviament s'havien estudiat les relacions genètiques entre els vuit cultivars de clavell estudiats, mitjançant anàlisis RAPDs. També s'ha trobat un efecte de l'explant en aquest procés morfogènic, tot sent les fulles lleugerament més regeneratives que els pètals. I també un efecte del tipus, balanç i concentració dels reguladors del creixement exògens (l'auxina NAA i les citocinines BA i TDZ). Cal destacar el gran efecte morfogènic del thidiazuron (TDZ), comparat amb la benziladenina (BA), i la sinèrgia trobada entre el TDZ i l'àcid naftalenacètic (NAA) en la regeneració de brots. El TDZ ha tingut un efecte organogènic tant directe, com indirecte a través de promoure un increment en determinades citocinines endògenes. Aquestes s'han trobat localitzades (mitjançant la tècnica de la immunolocalització) en els meristemes apicals dels primordis caulinars adventicis en formació.La concentració d'agar del medi i la humitat relativa del cultiu han influït també en la capacitat organogènica dels explants estudiats i en el grau d'hiperhidricitat dels brots regenerats.La presència del gen rolC d'Agrobacterium rhizogenes en plantes de clavell ha incrementat la capacitat organogènica, tant de brots com de rels, dels explants de clavell, mostrant un efecte similar al de les citocinines i al de les auxines, respectivament. Quantificacions de citocinines endògenes en les diferents línies estudiades han demostrat que les fulles transgèniques presenten nivells més elevats de citocinines tipus zeatina que les fulles control, mentre que els pètals transgènics tenen més concentració de citocinines tipus isopenteniladenina (iP). La concentració d'iP ens els pètals de les diferents línies transgèniques estudiades s'ha correlacionat amb la capacitat de regeneració dels pètals. D'altra banda, donat que els nivells d'auxines de les plantes rolC són similars als de les plantes no transgèniques, l'efecte d'auxina del gen rolC s'explicaria per un increment de la sensibilitat a las auxines.Finalment, l'estudi de la influència dels gens rol d'Agrobacterium rhizogenes en plantes ornamentals amb flor ha mostrat que el fenotip obtingut pot ser de gran interès comercial, donat que promouen hàbits de creixement compactes, una major ramificació lateral, millor arrelament i un increment en la floració, la qual, en alguns casos, pot fins i tot avançar-se. La disminució de la fertilitat masculina, obtinguda en la major part de transformacions, seria pràcticament l'única característica negativa. D'entre els gens rol, el rolC seria el més recomanable, donat que els seus efectes són els més avantatjosos pel que fa a la millora de trets ornamentals i horticulturals., In this thesis we have studied the adventitious organogenesis of shoots and roots in carnation.On one hand, we have found an effect of the genotype in this process, the White Sim cultivar being the most regenerative among the studied cultivars. Previously, we analyzed the genetic relatedness among the eight carnation cultivars. We have also found an effect of the explant in this morphogenic process: leaves were found to be more regenerative than petals. And finally, we have shown an effect of the type, balance and concentration of exogenous plant growth regulators (auxins and cytokinins). It is worth noting the great morphogenic effect of thidiazuron (TDZ), compared with benzyladenine, and the synergy found with TDZ acting together with naphthaleneacetic acid in the adventitious shoot regeneration. TDZ showed a direct effect on the shoot organogenesis, but also an indirect effect by promoting an increase in specific endogenous cytokinins. The cytokinins have been located in the apical meristems of the adventitious shoot primordia formed on the petal surface. The agar concentration of the media and the relative humidity of the culture atmosphere have also influenced the organogenic capacity of the studied explants and the hyperhydricity of the regenerated shoots. The introduction of the rolC gene of Agrobacterium rhizogenes in carnation plants have improved both shoot and root organogenesis of the explants, thus showing a cytokinin-like but also an auxin-like activity. By quantifying the endogenous cytokinins, rolC-transgenic leaves have been found to have higher levels of zeatin-type cytokinins, whereas rolC-transgenic petals have shown higher levels of isopentenyladenine-type cytokinins. On the other hand, since auxin levels of rolC-transgenic plants have not differed from those of non-transgenic plants, the auxin-like effect of the rolC gene could be explained by an increase in auxin sensitivity in transgenic tissues. Finally, the study of the influence of rol genes in floriculture have shown that the obtained phenotype by transforming ornamental flowering plants with rol genes can be commercially desirable, since these genes promote dwarf and bushy phenotypes, promote better rooting and improve flowering, both by increasing the number of flowers and advancing the flowering time. Among rol genes, the rolC gene is the most recommendable.

En el context europeu actual l'ampliació en l'oferta de cultius i tipus varietals és una eina important per a l'agricultor. Les varietats tradicionals bé poden ocupar un lloc significatiu dins del panorama agrícola actual si són correctament avaluades i sotmeses a un procés de selecció i millora genètica que permeti el seu millor cultiu i comercialització. A més, els consumidors demanen cada cop més qualitat front a quantitat, variació i valor organolèptic als productes alimentaris. A Catalunya persisteixen una desena de tipus varietals tradicionals de mongeta per a consum en gra d'entre les quals la mongeta Ganxet és la que té una importància econòmica més significativa. Pertany a l'espècie Phaseolus vulgaris L. i és fàcilment reconeixible per la forma ganxuda de la llavor fins i tot després de ser cuinada, ja que es consumeix com a llegum gra, sec i cuit. L'objectiu general de la tesi era definir els límits com a possible nova classe comercial i seleccionar línies pures prototípiques del tipus varietal mongeta Ganxet, com a cultivars homogenis i estables. S'ha constituït una col·lecció de 69 entrades de germoplasma cultivat i comercialitzat sota la denominació Ganxet, presentant un ventall considerable de morfologies, amb llavors que van de lleugerament a molt ganxudes. Les entrades inequívocament reconeixibles com a Ganxet presenten plantes tardanes, amb hàbit de creixement indeterminat enfiladís de tipus IV, entrenusos llargs, fulles i tavelles verd fosc i flors blanques. Presenten tavelles de 13,9 a 17 cm de longitud amb 3,7 a 5,8 llavors per tavella i produccions de 36,3 a 51,9 g/planta. Les llavors són de mida mitjana-gran (38,8 a 61,9 g/100 llavors), aplanades i ronyonades (grau de ganxo entre 1,5 i 2,8 sobre 3) amb un 23,26% a 27,63% de proteïna, 1,48% a 2,10% de greix i 7,45% a 8,90% d'episperma. Les llavors absorbeixen entre un 42,73% a 48,12% d'aigua durant el remull. S'han seleccionat set línies pures prototípiques del tipus varietal Ganxet amb produccions acceptables, excel·lents característiques organolèptiques i nutricionals, i fàcilment identificables com a classe comercial. El nivell de polimorfisme entre les línies és equivalent al que es troba dins de classe comercial. Presenten tavelles de 14,7 a 15,7 cm de longitud amb 4 a 4,6 llavors per tavella i produccions de 57,7 a 65,9 g/planta. Les llavors són de mida gran (50,3 a 52,3 g/100 llavors), aplanades i ronyonades (grau de ganxo entre 2,1 i 2,9 sobre 3) amb un 27,14% a 29,32% de proteïna, 21,77% a 23,41% de fibra dietètica, 0,067% a 0,082% de glucosa, 24,72% a 27,50% de midó i 8,9% a 9,6% d'episperma. La línia pura seleccionada L67 ha estat posada a disposició dels agricultors i es troba en fase de registre sota el nom de Montcau. El germoplasma Ganxet, avaluat mitjançant marcadors RAPD, probablement és d'origen mesoamericà de la raça Mesoamèrica amb introgressions, almenys, de la raça Durango.

Les plantes sintetitzen una gran varietat de compostos isoprenoides a través d'una ruta metabòlica complexa i ramificada. L'enzim HMG-CoA reductasa (HMGR) catalitza la conversió d'HMG-CoA en mevalonat, una etapa limitant de flux per la biosíntesis d'isoprenoides en el citosol-reticle endoplasmàtic (RE). En totes les espècies de plantes analitzades existeixen vàries isoformes d'HMGR codificades per petites famílies multigèniques. En el cas d'Arabidopsis, existeixen dos gens (HMG1 i HMG2) que codifiquen per tres isoformes de l'enzim: HMGR1L, HMGR1S i HMGR2. Múltiples estudis suggereixen que les isoformes d'HMGR de plantes estarien implicades en la síntesi d'isoprenoides particulars. Aquest model d'especialització funcional de les isoformes d'HMGR està basat en estudis d'expressió gènica en diferents estadis del desenvolupament o en resposta a diferents estímuls. Tot i així, a l'inici d'aquesta tesi, no es tenien dades contrastades de la distribució de les isoformes d'HMGR en diferents teixits ni de la seva distribució subcel·lular. Aquest darrer aspecte era particularment interessant, doncs s'havia suggerit que l'especialització funcional de les isoformes d'HMGR podria venir determinada, en part, per diferències en la seva localització subcel·lular. Amb aquests antecedents, es va iniciar un estudi de la distribució tissular i subcel·lular de les diferents isoformes d'HMGR d'Arabidopsis. Mitjançant assaigs de western blot utilitzant anticossos generats contra el domini catalític de l'enzim, es va comprovar que les isoformes HMGR1S i HMGR1L es distribuïen de manera diferencial en teixits d'Arabidopsis, fet que es correlacionava amb els estudis previs d'expressió dels gens corresponents. Tanmateix, estudis de fraccionament subcel·lular a partir de cèl·lules de la línia T87 van demostrar que aquestes isoformes es trobaven en fraccions diferents: si bé l'HMGR1S es trobava bàsicament en una fracció que sedimenta a 16.000xg, l'HMGR1L s'enriquia en una fracció que sedimenta a 105.000xg. Estudis de localització subcel·lular emprant fusions amb la proteïna fluorescent verda (GFP) van determinar que, si bé la isoforma HMGR1S es localitza principalment en estructures vesiculars de 0.5-2 mi/m, la isoforma HMGR1L es troba exclusivament en el RE. Aquesta localització subcel·lular diferencial entre ambdues isoformes ve determinada per la presència d'una extensió N-terminal de 50 aminoàcids (1Lextra) en la isoforma HMGR1L. Per tant, la regió N-terminal citosòlica constitueix una regió que determina la localització subcel·lular de l'enzim, funció que ha de venir mediada per proteïnes que hi interaccionin específicament. Amb l'objectiu de cercar proteïnes que interaccionin amb la regió N-terminal citosòlica de l'HMGR1L, es va realitzar un crivellatge per doble híbrid d'una genoteca d'expressió d'Arabidopsis. D'aquesta manera, es van identificar les proteïnes PR2A1, PR2A2 i KLC1, i es va procedir a la seva caracterització. D'una banda, es va verificar que PR2A1 i PR2A2 eren subunitats reguladores B'' de la proteïna fosfatasa 2A (PP2A). Tanmateix, es va determinar que PR2A1 i PR2A2 interaccionaven selectivament amb la regió N-terminal citosòlica de les isoformes HMGR1L i HMGR1S, però no amb la de l'HMGR2. Finalment, es va constatar que la interacció de les isoformes HMGR1L i HMGR1S amb la PR2A1 és modulada per calci. Les dades suggereixen que la PP2A podria formar part de la cascada de senyalització subcel·lular que permetria ajustar l'activitat HMGR als estímuls ambientals i de desenvolupament. D'altra banda, es va constatar que KLC1 presentava similitud amb la cadena lleugera de quinesina de tipus I, i en conservava una estructura modular equivalent. A més, es va determinar que KLC1 interacciona amb la regió N-terminal citosòlica de la isoforma HMGR1L, però no amb la de l'HMGR1S ni l'HMGR2. També es va comprovar que la regió 1Lextra, que determina la localització de l'HMGR1L en el RE, és imprescindible per aquesta interacció. Aquest fet suggereix que KLC1 podria jugar un paper en la localització subcel·lular de la isoforma HMGR1L.En conjunt, les dades de localització subcel·lular i d'interacció amb les proteïnes PR2A1, PR2A2 i KLC1, permeten postular un model d'especialització funcional de les isoformes HMGR1S i HMGR1L en el qual la biosíntesis de mevalonat es produiria segregada en dos compartiments subcel·lulars: el RE i les estructures vesiculars, les quals constituirien un nou compartiment de biosíntesis d'isoprenoides en plantes.

La fitohormona Acido Abscisico (ABA) es una reguladora de procesos importantes como son el desarrollo de la semilla, dormancia y posterior germinación y también interviene en la respuesta adaptativa de tejidos vegetativos frente a estreses ambientales de sequía, salinidad y frío. Muchos de los efectos del ABA están mediados por cambios en la expresión génica principalmente a nivel de transcripción. Entre estos genes se encuentran los denominados lea (late embryogenesis abundant), como el rab28. Este gen contiene en su promotor 2 elementos ABRE (ABA responsive element) necesarios para su inducción durante la embriogénesis y en respuesta al ABA. Estudios de footprinting in vivo han mostrado que a estos elementos se unen factores de la familia bZIP.En este trabajo presentamos el aislamiento y la caracterización de dos factores de transcripción de la familia de las bZIP, denominados EmBP-2 y ZmBZ. Se ha analizado la expresión de los factores a nivel de mRNA y de proteína, su interacción in vitro con los elementos ABRE del gen rab28, su actividad in vivo sobre la expresión del gen rab28 en tejidos embrionarios y vegetativos y los mecanismos que pueden modificar su actividad, como el estado de fosforilación y su localización subcelular. Nuestros resultados apuntan a que estos factores tienen un papel regulador de la expresión del gen rab28 a través del elemento ABRE.

Les plantes produeixen una gran varietat de compostos isoprenoides que són essencials tant pel seu creixement i desenvolupament com per la seva relació i adaptación amb l'entorn. La biosíntesi d'isoprenoides en plantes té lloc a través d'una via metabòlica molt complexa en la que Facetil-CoA, via mevalonat, o bé el gliceraldèhid-3-fosfat i el piruvat, via metileritritolfosfat, són convertits en isopentenildifosfat, que posteriorment és utilitzat per produir prenildifosfats de diferents longituds. Aquests intermediaris són els punts de partida de múltiples ramificacions que condueixen a la síntesi de la gran diversitat d'isoprenoides finals. Encara que s'accepta que la biosíntesis d'isoprenoides ha d'estar estrictament regulada per tal de mantenir el balanç adequat d'isoprenoides en condicions fisiològiques canviants, els mecanismes que controlen aquesta via són poc coneguts. No obstant, la complexitat de la via metabòlica suggereix l'existència de múltiples punts de control a fi d'assegurar la producció dels isoprenoides adequats en diferents parts de la planta durant el seu desenvolupament.L'enzim famesildifosfat sintasa (FPS) catalitza la condensació seqüencial de dues molècules d'isopentenildifosfat, una amb dimetilal.lildifosfat i l'altra amb l'intermediari de 10 carbonis geranildifosfat, per produir el compost de 15 carbonis famesildifosfat. En plantes, el famesildifosfat és el punt de partida d'un gran nombre de ramificacions de la via que condueixen a la síntesi de tota una sèrie de derivats isoprenoides com són, per exemple, els fitoesterols, els brassinoesteroides, els dolicols, les ubiquinones, el grup hem a i les fitoalexines sesquiterpèniques. A més, el famesildifosfat és utilitzat per la prenilació de proteïnes. En conseqüència, canvis en l'activitat FPS poden alterar el flux d'isoprenoides a través de les diverses ramificacions de la via i, per tant, desenvolupar un paper clau en la regulació de tota una sèrie de funcions essencials per les plantes.En el moment d'iniciar el treball que constitueix aquesta Tesi Doctoral, es disposava de molt poca informació relativa a la FPS de plantes, i únicament havia estat clonat un cDNA codificant per la FPS d'Arabidopsis thaliana. A més, tot i que estava acceptat que hi havia síntesi d'isoprenoides específics a partir d'IPP en tres compartiments subcel.lulars, citosol-reticle endoplasmàtic, cloroplastes i mitocòndries, només s'havia detectat activitat FPS en el citosol-reticle endoplasmàtic. Amb la finalitat d'aprofundir en el coneixement de la regulació, l'organització i la compartimentació de la via de síntesi d'isoprenoides en plantes, es va iniciar el treball que es presenta a continuació, centrat en la caracterització molecular de l'enzim farnesildifosfat sintasa d'Arabidopsis thaliana. En concret, els objectius proposats van ser els següents:1. Determinar el número de gens que codifiquen FPS a Arabidopsis thaliana i clonar-los per procedir a la seva caracterització.2. Determinar els patrons d'expressió dels gens FPS mitjançant experiments de Northern blot i mitjançant la generació í anàlisi d' Arabidopsis transgèniques portadores de construccions que continguin les regions 5'-fianquejants dels gens FPS fusionades al gen marcador uidA d' Escherichia coli.3. Identificar les regions del promotor implicades en el control de l'expressió dels gens FPS mitjançant l'expressió transitòria en protoplastes i l'expressió estable en Arabidopsis transgèniques de construccions que continguin fragments progressivament delecionats per l'extrem 5' de les regions 5'-flanquejants dels gens FPS fusionats al gen marcador uidA d' Escherichia coli.A més, durant el desenvolupament dels objectius proposats inicialment, es va plantejar un objectiu addicional: Estudiar l'existència d'un segon mRNA producte de l'expressió del gen FPS1, i si la isoforma FPS codificada per aquest mRNA correspon a una FPS de localització mitocondrial.