Search

[cat] Arrel de la necessitat de garantir la disponibilitat d’aigua en un context d’escassetat i assegurar-ne un bon ús que no suposi un risc microbiològic per la població, aquesta Tesi Doctoral ha estat centrada en l’optimització, el desenvolupament i la validació de noves tècniques pel control de virus contaminants d’aigua. Per una banda, s’han optimitzat i desenvolupat mètodes ràpids, sensibles, metodològicament senzills i adaptables per a la concentració i detecció in situ de virus en diferents contextos; i per una altra, s’ha avaluat l’aplicabilitat i eficiència de desinfecció dels sistemes electroquímics d’oxidació avançada com a tractaments sostenibles per a la reutilització d’aigües. Pel que respecta a mètodes de concentració d’aigua per a la detecció de virus, en primer lloc s’ha adaptat el mètode de floculació orgànica amb llet descremada perquè sigui aplicable a contextos de baixa renda donat el seu baix cost econòmic, o a situacions d’emergència humanitària en què no es disposi d’un laboratori equipat, a més l’equipament s’ha adaptat perquè no es requereixi de corrent elèctrica. Aquest mètode, ha estat validat en dos contextos reals, un camp de refugiats ubicat a Banghi (República Centreafricana) i a la zona de Pedernales (Equador) afectada per un terratrèmol. El mètode i protocol desenvolupats, van demostrar ser metodològicament senzills per tal de ser duts a terme per usuaris no experts, demostrant ser un mètode eficient detectant contaminació viral en les mostres d’aigua testades, podent ser una eina útil en la prevenció de brots vírics en els països amb menys recursos, els quals són els més afectats per les malalties de transmissió hídrica donades les limitacions existents de sanejament de l’aigua. La resta de mètodes de concentració avaluats, estan basats en l’ús d’ultrafiltres per a la detecció de virus en aigua. Per una banda, s’ha caracteritzat un mètode ràpid per a l’anàlisi de grans volums d’aigua en aigües superficials i aigua de mar, aplicant la nova tecnologia d’elució d’escuma humida amb la que es redueix el temps de processat de la mostra així com la simplificació metodològica del mètode. A més, s’ha adaptat perquè sigui realitzable en el mateix punt de presa de la mostra, sent validat en dos contextos diferents, un on es va realitzar la concentració completa de mostres in situ, i l’altre on es va realitzar la filtració i posterior enviament del filtre al laboratori per a la seva anàlisi, demostrant la versatilitat del mètode. Finalment, el mètode es va optimitzar amb un segon pas de concentració utilitzant un dispositiu d'ultrafiltració centrífuga (Centricon® Plus-70) per tal d’augmentar-ne la sensibilitat. El mètode ha estat testat mitjançant diverses tècniques, permetent la detecció de virus mitjançant mètodes tan d’infectivitat com moleculars, incloent la detecció per qPCR i tècniques de seqüenciació massiva, com són l’enriquiment per dianes i posterior seqüenciació massiva d’amplicons. Amb l’arribada de la pandèmia de la COVID-19, i arrel de l’escassetat de subministraments de material necessaris per a l’anàlisi del SARS-CoV-2 en aigües residuals, es van caracteritzar dos mètodes ràpids de concentració d’aigües residuals per la detecció de virus embolcallats. Així doncs, es va validar un dispositiu d'ultrafiltració centrífuga (Centricon® Plus-70) i la pipeta concentradora automatitzada CP-Select™, com a mètodes ràpids, i el cas de la pipeta concentradora, factible per a treballar en vitrines de bioseguretat. Validant així, mètodes d’anàlisi d’aigües residuals perquè puguin ser implementats en laboratoris d’anàlisi rutinaris sense requerir de personal altament especialitzat. En la segona part de la tesi, s’ha avaluat l’aplicabilitat i eficiència de desinfecció dels sistemes electroquímics d’oxidació avançada com a tractaments sostenibles per a la reutilització d’aigües, testant dos tipus de materials, un ànode de Ruteni i un ànode de BDD en matrius naturals. Els assajos realitzats, han estat centrats en la inactivació de microorganismes patògens amb un focus especial en els virus, així com en l’avaluació de la idoneïtat dels microorganismes índex utilitzats clàssicament en els tractaments de desinfecció, la determinació dels subproductes tòxics i els requeriments energètics del sistema. Amb tot, s’ha demostrat que els sistemes electroquímics poden ser aplicats com a pas final de desinfecció d’aigües naturals, encara que els microorganismes índex han de ser revisats, donada la major sensibilitat de bacteris i bacteriòfags, en relació a altres microorganismes, però demostrant ser efectius per tal d’assolir un logaritme de reducció de virus humans amb baixos requeriments energètics, tenint potencial per ser sistemes descentralitzats de depuració d’aigües, tot i que han de ser adaptats per evitar la formació de subproductes tòxics., [eng] Given the need to guarantee the availability of water in a context of scarcity and ensure a good use that does not pose a microbiological risk to the population, this Thesis has been focused on developing and validating new techniques for the control of viruses contaminants of water. Firstly, fast, sensitive, methodologically simple, and adaptable methods have been developed for their application in situ for the detection of viruses in different contexts; and secondly, the applicability and disinfection efficiency of advanced oxidation electrochemical systems have been evaluated as sustainable treatments for water reuse. Regarding the development of water concentration methods for the detection of viruses, in the first place the skimmed milk organic flocculation method has been adapted so that it is applicable to low-income situations given its low economic cost, or to situations of a humanitarian emergency in which there is no equipped laboratory, in addition, the equipment has been adapted so that no electricity is required. This method has been validated in two real contexts, a refugee camp located in Banghi (Central African Republic) and in Pedernales (Ecuador) affected by an earthquake. The method and protocol developed proved to be methodologically simple to be carried out by non-expert users, proving to be an efficient method for detecting viral contamination in the tested matrices, being a useful tool in the prevention of viral outbreaks in countries with fewer resources, which are the most affected by water-borne diseases given the lesser sanitation of the water sources. The rest of the concentration methods evaluated are based on the use of ultrafilters for the detection of viruses in water. Firstly, a fast method has been characterized for the analysis of large volume water samples in surface water and seawater, applying the new wet foam elution technology with which the processing time of the sample is reduced as well as the methodological simplification of the method. In addition, it has been adapted so that it can be carried out at the same sampling point, being validated in two different contexts, one where the complete concentration of samples was carried out in situ, and the other where the filtration was carried out and later sending the filter to the laboratory for analysis, demonstrating the versatility of the method. Finally, the method was optimized with a second concentration step using a centrifugal ultrafiltration device (Centricon® Plus-70) to increase sensitivity. The method has been tested using various techniques, allowing the detection of viruses using infectivity and molecular techniques, including detection by qPCR and new generation sequencing techniques, such as target enrichment and amplicon deep sequencing. With the advent of the COVID-19 pandemic, and due to the shortage of material supplies necessary for the analysis of SARS-CoV-2 in wastewater, two rapid methods of wastewater concentration were characterized for the detection of enveloped viruses. Thus, a centrifugal ultrafiltration device (Centricon® Plus-70) and the CP-Select™ automated concentrator pipette were validated as fast methods, methodologically simple and in the case of the concentrator pipette, allowing to work under biosafety conditions. Thus, wastewater analysis methods have been validated, so they can be implemented in routine analysis laboratories without requiring highly specialized personnel. In the second part of the thesis, the applicability and disinfection efficiency of advanced oxidation electrochemical systems have been evaluated as sustaining treatments for water reuse, testing two types of materials, a Ruthenium anode, and an anode of BDD in natural matrices. The disinfection trials carried out have been focused on the inactivation of bacteria, viruses, bacterial spores and protozoa, as well as on the evaluation of the suitability of the index microorganisms classically used in disinfection treatments, the determination of toxic by-products and energy requirements of the system. The main results of these studies have shown that electrochemical systems can be applied as a final step in the disinfection of natural waters, although the index microorganisms must be reviewed, given the greater sensitivity of bacteria and bacteriophages, but proving to be effective to achieve a one logarithm reduction of virus with low energy requirements, having the potential to be implemented as decentralized water purification systems, although they must be adapted to avoid the formation of toxic by-products.

[cat] L’objectiu principal de la present tesi doctoral ha estat l’optimització i aplicació de procediments basats en la seqüenciació massiva per a la descripció del viroma associat a l’aigua residual i a altres mostres d’interès epidemiològic. Els objectius específics han estat: 1. Optimitzar i aplicar diferents tècniques de seqüenciació massiva per a l’anàlisi de mostres ambientals i biològiques. 2. Caracteritzar el viroma de l’aigua residual amb focus en els patògens humans. 3. Avaluar l’ús del la seqüenciació massiva, amb i sense enriquiment de dianes, i de la seqüenciació d’amplicons per a l’estudi i monitoreig de brots infecciosos d’origen viral. 4. Aplicar la seqüenciació massiva a mostres de pacients amb gastroenteritis d’etiologia desconeguda per conèixer la presència d’espècies virals no detectades pels mètodes de diagnòstic clàssics. 5. Estudiar el viroma de diverses espècies de peixos Atlàntics amb potencials implicacions comercials i de seguretat alimentària., [eng] Next generation sequencing (NGS) techniques have emerged in the last decade as keystone for the thorough study of microorganisms in a wide variety of samples and settings, replacing traditional molecular methods. In the field of virology, the constant evolution of sequencing platforms and applications enabled the improvement of virome studies. The main limitation when analysing the virome from any type of sample is the low proportion of viral sequences identified compared with the total number of sequences, especially critical for human viruses. In this work we aimed to evaluate the use of different sequencing approaches, target enrichment (TES) and amplicon deep sequencing (ADS), for the characterization of the virome and specific viral pathogens in sewage and as tools for efficient wastewater-based epidemiology in outbreak scenario. The application of TES has proved to be a very successful strategy for the study of vertebrate viruses in sewage samples providing a higher number of detected families, a higher number of members within these families, more reads and larger genome coverage than conventional untargeted viral metagenomics. Additionally, allowed the obtention of SARS-CoV-2 sequences as part of sewage virome in a COVID-19 pandemic context, retrieving also other relevant human and animal coronavirus sequences, shedding light on the co-circulation of different strains in a determined population. In contrast, ADS proved to a very sensitive technique for the description of the diversity within a viral family, enabling the subtyping of sequences belonging to Enterovirus A71 C1 in sewage, while an encephalitis outbreak caused by this strain was happening during sampling period. NGS, with and without TES panels, was also evaluated for the study of viral etiological agents of acute gastroenteritis in a collection of samples tested negative for the commonly associated pathogens. Its application resulted in the detection of emergent viral variants, like Norovirus GIV, and viruses not traditionally tested, like sapoviruses and astroviruses. These results highlighted the need of the incorporation of these viruses in clinical testing and the potential use of viral metagenomics as a diagnostic tool. Lastly, to evaluate the use of enrichment panel in animal virology, TES was applied for the virome study of two economically important fish species from the Portuguese Atlantic coast. Pathogens causing viral nervous necrosis and infectious pancreatic necrosis in fishes were detected, demonstrating the utility of NGS techniques for the study of infections that may cause an economic impact in fish industry. Also, the identification of human noroviruses sequences in one of the fish samples suggested that fish virome studies can be used for evaluating potential threats regarding food safety.

[cat] L’objectiu global plantejat en aquesta tesi ha estat l’anàlisi dels patògens virals que a través de l’aigua residual, poden contaminar l’aigua de reg i els aliments. Les aigües regenerades i les aigües de riu són importants fonts de reg i per tant, una possible via d’entrada de patògens a la cadena alimentària. En un primer capítol, la tesi doctoral s’ha centrat en l’avaluació de la qualitat microbiològica de l’aigua regenerada produïda en un sistema de llacunatge mitjançant l’estudi de la reducció de les concentracions de múltiples patògens, posant èmfasi en l’estudi de virus indicadors de contaminació fecal humana (adenovirus humans i poliomavirus JC) i patògens estretament relacionats amb el consum d’aigua i aliments contaminats (norovirus humans i hepatitis E). De forma paral·lela s’ha estudiat també la reducció dels indicadors bacterians de contaminació fecal (E.coli i enterococs fecals) inclosos en la legislació d’aigües regenerades. Conèixer el viroma present a l’aigua residual pot oferir informació important des d’una perspectiva ecològica, però també de salut pública, ja que un dels principals inputs de l’aigua residual urbana són els virus excretats per la població a partir de les seves femtes, orina o descamació epitelial. Les tècniques de seqüenciació massiva aplicades a l’estudi de virus permeten, sota un únic anàlisi, conèixer totes les espècies víriques presents en una mostra. En la present tesi s’ha avaluat l’efecte que tenen en la composició de les poblacions virals diferents mètodes de concentració i extracció d’àcids nucleics, utilitzant com a matriu l’aigua residual urbana. Amb la finalitat de caracteritzar els riscos virològics associats a l’aigua residual i a la producció d’aigües regenerades, s’ha desenvolupat un protocol eficient per a l’estudi del viroma. La contribució de l’orina en el viroma de l’aigua residual demostra que el nombre de virus excretats per orina queda restringit majoritàriament a famílies de virus ADN: Polyomaviridae i Papillomaviridae. Les tècniques de metagenòmica de virus permeten l’estudi del viroma de l’aigua residual, caracteritzant simultàniament sota un únic assaig, les diferents famílies víriques presents en aquestes matrius. Com a resultat de la tesi s’han pogut detectar importants patògens humans de les famílies Caliciviridae, Picornaviridae, Adenoviridae, Polyomaviridae, Papillomaviridae, Picobirnaviridae, Circoviridae, Anelloviridae, Parvoviridae, Hepeviridae i Astroviridae. En el quart capítol de la tesi, s’ha avaluat el potencial que tenen les tècniques de seqüenciació massiva com a eina de monitorització en el camp de la seguretat alimentària. Amb aquesta finalitat, s’han analitzat els virus presents tant a la superfície dels vegetals (juliverts) com en l’aigua de reg (aigua del riu Besòs, amb un cabal principalment generat pels efluents secundaris de les EDAR de la conca). En total s’han detectat 18 famílies víriques diferents de la superfície del julivert incloent membres de les famílies Astroviridae, Caliciviridae, Hepeviridae, Picornaviridae i Parvoviridae. A la mateixa aigua de riu s’han detectat 26 famílies víriques diferents incloent patògens vírics com adenovirus, rotavirus, astrovirus o picornavirus., [eng] The overall objective of the present thesis has been to analyze the viral pathogens that can be transmitted through contaminated water or food. Reclaimed and river water are important irrigation sources. Therefore, these water matrices can represent an important entrance of pathogens into the food chain. The first chapter of the present thesis has focused in the evaluation of the microbiological quality of reclaimed water produced in a lagoon system by studying the concentration reduction of multiple pathogens including human adenoviruses, noroviruses, polyomaviruses and hepatitis E virus. The reduction of fecal indicator bacteria, included in the reclaimed water legislations, has been studied simultaneously. The effect of the concentration and extraction methods on the viral community composition has been evaluated in urban sewage. A sensitive protocol has been developed to characterize the different pathogenic viruses that can be present in these water matrices, representing a potential threat if contamination of water or food occurs. These methodologies have allowed the identification of important viral pathogens from Caliciviridae, Picornaviridae, Adenoviridae, Polyomaviridae, Papillomaviridae, Picobirnaviridae, Circoviridae, Anelloviridae, Parvoviridae, Hepeviridae and Astroviridae families. The contribution of urine to the metavirome of urban sewage is restricted, mainly, to double strand DNA viruses from Polyomaviridae and Papillomaviridae families. Finally, the applicability of next generation sequencing as a surveillance tool for food safety porpoises has been evaluated by using fecally contaminated river water to irrigate fresh vegetables. River water contained 26 different viral families including important pathogens such as adenoviruses, rotaviruses, astroviruses and picornaviruses. At the surface of irrigated vegetables other important human viral pathogens from 18 different viral families, including Astroviridae, Caliciviridae, Hepeviridae, Picornaviridae and Parvoviridae were detected.

[cat] Aquesta Tesi Doctoral ha estat pensada per avaluar, mitjançant l’estudi de virus contaminants, l’origen de la contaminació fecal i l’avast de la disseminació a l’aigua. Amb aquesta finalitat s’han utilitzat eines moleculars per a la detecció i quantificació de virus especifics humans, bovins i porcins i a més a més s’ha desenvolupat una nova eina per traçar la contaminació ovina a l’ambient. Els principals agents virals amb risc per als humans són d’origen humà però les femtes animals, amb potencials patògens zoonòtics, representen també un risc per a la salut humana. La intensificació de la producció animal o l’increment de plujes torrencials previst amb els escenaris proposats per al canvi climàtic presenten nous reptes per al control de la contaminació fecal a l’aigua. Bona part de la Tesi, ha anat lligada al projecte europeu VIROCLIME permetent dur a terme estudis a nivell internacional. S’ha caracteritzat la disseminació de virus humans contaminants a l’aigua d’un riu situat en una conca Mediterrània. Mitjançant el registre de variables hidro-climàtiques, la recollida de mostres d’aigua de riu, aigua de mar i aigua residual, i l’anàlisi de FIB i virus indicadors de contaminació fecal humana (HAdV i JCPyV), virus patògens (NoVGII, HEV), i un virus emergent (MCPyV), s’ha estudiat durant un any, l’impacte que l’aigua residual crua o els efluents de les depuradores tenen en la qualitat microbiològica del riu. En un segon estudi realitzat conjuntament amb laboratoris de Suècia, Grècia, Hongría i Brasil, s’ha pogut estandarditzar el mètode de floculació amb llet descremada, per a la concentració de virus, i els assajos de qPCR per identificar i traçar l’origen de la contaminació fecal a l’aigua. Durant 18 mesos de mostrejos a conques de rius situats a les regions Mediterrània, Àrtica, Continental i Tropical, s’han identificat virus humans (HAdV i JCPyV), bovins (BPyV) i porcins (PAdV), demostrant que aquestes eines virals són fiables i útils per a qualsevol àrea geogràfica o matriu d’aigua. Fins al principi d’aquesta tesi, només es disposava de marcadors virals de contaminació fecal porcina i bovina. Analitzant mostres de femta i orina d’ovella, amb un assaig de PCR d’ample espectre per a la detecció de poliomavirus, es van obtenir per primera vegada seqüències d’un putatiu nou poliomavirus oví. A partir d’aquí, s’han dissenyat dos assajos de PCR específics per poder traçar la contaminació fecal ovina a l’ambient. Arrel d’aquest treball, durant l’últim any de la tesi, es va plantejar una estada a Nova Zelanda perquè es tracta del país amb més ovelles per càpita i representa bona part de la indústria ramadera del país. Traçar i identificar l’origen de la contaminació fecal animal a l’aigua és doncs bàsic, tant per la gestió dels residus com per l’avaluació dels riscos per a la salut humana. El quart estudi inclòs a la tesi, es va dissenyar per identificar les fonts principals de contaminació fecal i avaluar, al mateix temps, les diferents eines de MST utilitzades a Nova Zelanda i al laboratori de la doctoranda. S’han recollit mostres de riu als territoris ramaders més importants de l’illa del sud, i s’han analitzat E. coli, virus específics indicadors de contaminació fecal humana (HAdV, JCPyV) bovina (BPyV) i ovina (OPyV), marcadors bacterians específics d’humans (BacH, BacHum-UCD, BiAdo) i de remugants (BacR) i esterols i estanols indicadors de contaminació fecal humana o de remugant., [eng] This thesis was designed to evaluate, through the study of viruses, the source of the fecal contamination and its spread in water matrices. For this purpose molecular tools have been used for the detection and quantification of specific human porcine and bovine viruses, and a new tool has been developed to trace ovine pollution in the environment. Human waterborne viruses pose the main risk to humans, but animal feces, with potential zoonotic pathogens, also represent a risk to human health. The intensification of animal production and the predicted scenarios for climate change, with increase of torrential rains, present new challenges for the control of fecal contamination in water . Much of this work has been linked to the European project VIROCLIME allowing studies conducted worldwide. We characterized the spread of contaminant human viruses in a Mediterranean river basin . By recording hydro-climatic variables, collecting samples of river water, sea water and wastewater, and analysing FIB and human virus indicators of fecal pollution (HAdV and JCPyV), pathogenic viruses (NoVGII , HEV) and an emerging virus (MCPyV) we have studied, thoughouth a year, the impact of raw wastewater and efluents from the wastewater treatment plants the microbiological quality of the river. In a second study, conducted with laboratories in Sweden, Greece, Hungary and Brazil, we standardized the viral concentration method, Skimmed Milk Flocculation, and specific qPCR assays to identify and trace the origin of contamination in water. During an 18 months sampling period, in river basins located in the mediterranean region, arctic, continental and tropical regions, we identified human (HAdV and JCPyV), bovine (BPyV ) and porcine viruses (PAdV), demonstrating that these tools are reliable and useful for any geographic area or water matrix. At the beginning of this thesis, only porcine and bovine viral fecal indicators were available to trace fecal pollution. Since no ovine viral indicator was described before the present work, we designed a study to develop a new tool to trace sheep fecal contamination. Firstly we analyzed urine and stool samples from sheep, with a broad spectrum PCR assay for the detection of polyomavirus. We obtained sequences of a putative new ovine polyomavirus and designed two PCR assays specific for the new ovine virus. During the last year of the thesis raised a stay in New Zealand because it is the country with more sheep per capita and represents much of the livestock industry in the country. Trace and identify the source of animal fecal contamination in water is therefore essential for both waste management for the evaluation of risks to human health. The fourth study included in this thesis was designed to identify the main sources of fecal contamination and evaluate the same time , the different tools used MST in New Zealand and the student laboratory. River samples were collected at major livestock areas south of the island , and analyzed E.coli , viruses specific indicators of human fecal contamination (HAdV, JCPyV) bovine (BPyV) and sheep (OPyV) specific bacterial markers in humans (BacH, BacHum-UCD, BiAdo) and ruminants ( BacR) and sterols and stanols indicators of human fecal contamination or ruminants.