Search

Treball de Fi de Màster Universitari en Tècniques Cromatogràfiques Aplicades (Pla de 2013). Codi: SIY009. Curs 2019/2020 Se conoce como microbiota intestinal (MI) a la población de microorganismos que habitan en los intestinos humanos. Está formada por más de mil especies de bacterias, además de virus y hongos, que llevan a cabo funciones esenciales para el organismo. El desequilibrio en la composición de la MI se define como disbiosis intestinal y está relacionada con un gran número de patologías. Los ácidos orgánicos (AO) en orina pueden reflejar el estado de la MI y ayudar al diagnóstico de disbiosis. En el presente estudio, se proponen dos métodos para la determinación de AO en muestras de orina mediante cromatografía de gases acoplada a espectrometría de masas (GC-MS). Uno de ellos basado en una extracción líquido-líquido de la orina seguido de una trimetilsilil-derivatización, En la otra metodología, la muestra de orina se evapora bajo corriente de gas nitrógeno, y posteriormente el residuo seco se derivatiza de forma análoga al anterior. Se han realizado diferentes pruebas de optimización con 5 compuestos AO seleccionados del perfil de disbiosis que se utilizan en el laboratorio clínico para evaluar cada método propuesto. Los resultados obtenidos hasta el momento no han permitido encontrar la mejor metodología, aunque el método de evaporación presenta la ventaja de ser más práctico para un laboratorio que realice análisis de rutina. La aplicación de la metodología a muestras reales de orina, ha permitido identificar 38 metabolitos de importancia clínica. Alternativamente, también se han realizado experiencias de AO en orina mediante una determinación basada en cromatografía líquida acoplada a espectrometría de masas (LC-MS). Sin embargo, el método no resultó satisfactorio para los 5 analitos seleccionados. El presente trabajo queda abierto, teniendo que realizar mayor número de pruebas para optimizar la metodología propuesta y lograr la determinación conjunta de todos los analitos “target”.

En la presente tesis se han desarrollado nuevas metodologías de análisis aprovechando los avances en la cromatografía acoplada a la espectrometría de masas, con el fin de facilitar la determinación de ciertos contaminantes orgánicos emergentes en muestras de interés alimentario, biológico y ambiental para su utilización en salud pública, es decir, en la evaluación de la exposición humana externa (aire) e interna (leche materna) y en el control de la cadena alimentaria (pescados). Además del desarrollo y optimización de la fase instrumental de los nuevos métodos, se han estudiado diferentes técnicas de extracción, y se han utilizado como herramienta para las etapas optimizadas el análisis multivariante o diseño de experimentos. In the present thesis, new analysis methodologies have been developed taking advantage of advances in chromatography coupled to mass spectrometry, in order to facilitate the determination of certain emerging organic contaminants in food, biological and environmental samples interesting for their use in public health, such as, in the evaluation of external (air) and internal human exposure (maternal milk) and in the control of the food chain (fish). In addition to the development and optimization of the instrumental phase of the new methods, different extraction techniques have been studied, and multivariate analysis or design of experiments have been used as a tool for the optimized steps. Programa de Doctorat en Ciències

Treball Final de Grau en Química. Codi: QU0943. Curs: 2015/2016 Pharmaceuticals and drugs of abuse are emergent pollutants which, together with its metabolites and TPs, are subject of concern, and affect water quality and aquatic life. These enter into the water body after consumption and excretion by humans and animals. In addition to these emerging contaminants, pesticides are of concern because of their wide use in agriculture. Many of these contaminants and their metabolites are not removed after conventional treatments in wastewater treatment plants (WWTP), which have to apply additional treatments (e.g. advanced oxidation) to ensure that the treated water is of sufficient quality for its use. In this work, we used MS QTOF coupled to UHPLC for screening various target compounds in different types of water samples, including influent and effluent wastewater, and surface water. We have found 17 pharmaceutical compounds of different types (e.g. telmisartan, 2 drugs of abuse (e.g. cocaine), 3 herbicides (e.g. atrazine), and one TPs in the water samples:two from Colombia, one from Athens and one effluent wastewater from a WWTP Sample treatment was not a part of this work, which was focussed only on data treatment in order to find these compounds in the spectrum manually, through databases of exact mass spectra online and using the instrument software. Getting 6 negative and 17 tentatively detected or identified by MS QTOF, since reference standards were not available.

Treball Final de Grau en Química. Codi: QU0943. Curs: 2015/2016 In this work, a gas chromatography coupled to mass spectrometry (GC-EI-Q(MS)) has been used for markers identification for a metabolomics approach. It has been carried out in order to create a statistical model to perform a correct classification between different quality olive oils (extra, virgin and lampante). A dynamic headspace purge and trap (DHS-P&T) was used to the extraction of volatile organic compounds (VOCs) responsible for olive oil flavours and they were eluted from the SPE cartridges with a mixture of hexane:diethyl ether (50/50, v/v). The methodology is based on the application of P&T extraction followed by gas chromatography coupled to mass spectrometry in full-spectrum acquision mode. The data acquired by this equipment was pre-treated by a new program called PARAFAC. After that these acquired data was normalized and the differentiation between the different groups of olive oil has been carried out with a multivariate analysis using Ez-Info. This methodology was applied to process 47 olive oil samples (11 extra, 19 virgin, 17 lampante) in order to create and check the classification model. The different models were performed with 37 samples. Finally, the whole developed method was correctly validated by the other 10 samples which were kept for the validation. Four of the seven evaluated model achieved around a 60% of correct classification. And with one of the studied models was obtained a classification of 90%. So with that result, it can be said that with this methodology and with these markers the PANEL TEST could be substituted.

En la presente Tesis Doctoral se han evaluado nuevas herramientas analíticas; instrumentales, metodológicas y de tratamiento de datos, para mejorar la detección del consumo de sustancias dopantes en el deporte. Se trata, con todo esto, de reducir los límites de cuantificación, aumentar el tiempo de detección posible o del descubrimiento de nuevos metabolitos o marcadores del abuso de una sustancia en concreto.

El análisis por dilución isotópica y espectrometría de masas (IDMS) es reconocido como una de las técnicas más potentes para obtener resultados altamente fiables y de gran calidad metrológica en el campo de la química analítica. IDMS destaca como la forma de cuantificación más adecuada ante determinaciones realizadas en matrices de alta complejidad, siendo por ello ampliamente utilizado durante el acoplamiento de las técnicas de cromatografía a la espectrometría de masas. Además IDMS también permite corregir variaciones de la señal en el detector así como las interconversiones o pérdidas de analito durante todo el tratamiento de muestra. IDMS permite, por tanto, corregir problemas que pueden aparecer a lo largo de todo el proceso analítico. La presente tesis versa sobre el desarrollo de metodología analítica basada en IDMS haciendo uso de la herramienta matemática de Deconvolución de Perfiles Isotópicos (IPD) para la cuantificación de los analitos. A pesar de que este tipo de cuantificación evita el uso de curvas de calibrado metodológico y permite el solapamiento espectral entre compuestos de composición natural y enriquecidos, su aplicación en métodos de rutina todavía se encuentra en pleno desarrollo. La técnica IPD permite la cuantificación mediante una sola inyección, reduciendo de forma considerable el tiempo total de análisis. En todas las metodologías desarrolladas a lo largo de esta tesis se ha hecho uso del acoplamiento de la cromatografía líquida a la espectrometría de masas, ya sea simple o en tándem. Para ello se han seleccionado distintas combinaciones matriz-analito en determinaciones con conocida dificultad analítica, tanto de naturaleza inorgánica como orgánica. El trabajo realizado se ha estructurado en tres bloques. En el primero, se ha desarrollado un método para la cuantificación de cromo hexavalente (Cr(VI)) en suelos y otras muestras sólidas de índole medioambiental, mediante cromatografía líquida acoplada a espectrometría de masas con plasma de acoplamiento inductivo (LC-ICP-MS). El segundo bloque se centra en la determinación de alquilfenoles (nonilfenol y octilfenol) y del bisfenol A en distintas muestras de agua. Para asegurar la ausencia de efectos isotópicos, o distinto comportamiento entre compuestos naturales y sus análogos marcados isotópicamente, se han sintetizado sus correspondientes patrones internos con un solo carbono-13: el 13C1-nonilfenol y el 13C1-octilfenol. Para finalizar, en el último bloque se ha evaluado el efecto matriz en las cuantificaciones mediante LC-MS. Se ha utilizado como caso de estudio la determinación de micotoxinas en piensos y especias, matrices con conocido efecto matriz y se han ensayado diversas formas de calibrado que lo corrigen, entre ellas IPD. Tal y como se ha comentado anteriormente, el primer bloque incluye el desarrollo de un método para la correcta determinación de Cr(VI) en muestras sólidas medioambientales, principalmente suelos. Para ello se utilizaron dos trazadores isotópicos, el 50Cr(VI) y el 53Cr(III), con el propósito de poder estudiar y corregir las interconversiones entre ambas especies. El grueso de la investigación fue la optimización de la etapa de extracción. Se alcanzaron resultados cuantitativos para el Cr(VI) en sólo 10 minutos mediante microondas focalizadas, utilizando como extractante una solución 50 mmol/L de ácido etiliendiaminotetraacétido (EDTA) a pH 10. El tratamiento de muestra fue simplificado respecto a trabajos anteriores ya que una dilución 1:10 de la solución anterior fue empleada como fase móvil y el Cr(III) fue estabilizado. Además, la formación de Cr(III)-EDTA- permitió separar el Cr(III) cromatográficamente del Cr(VI) (presente como CrO42-) mediante cromatografía de intercambio aniónico. Para garantizar los resultados obtenidos el estudio fue realizado sobre los materiales de referencia certificados NIST 2700 y NIST 2701 (suelos contaminados por Cr(VI) a dos niveles de concentración). La metodología propuesta evita la oxidación del Cr(III) en los dos materiales de referencia estudiados, no siendo por tanto necesario el uso de dos trazadores y pudiéndose emplear sólo el de Cr(VI) en futuras aplicaciones del método optimizado. Tras aplicar la metodología de IPD en su contexto habitual, el análisis elemental, a partir del segundo bloque se inicia su aplicación al campo de análisis de compuestos orgánicos. Así, el segundo bloque se enmarca en el campo de los compuestos disruptores endocrinos a través de su cuantification en aguas mediante IDMS e IPD. Para ello, en un primer momento se llevó a cabo la síntesis, caracterización y aplicación de trazadores enriquecidos isotópicamente con un solo 13C, con el objetivo de asegurar la ausencia de efectos isotópicos. A tal efecto, el 13C1-nonilfenol fue sintetizado en un primer trabajo y el 13C1-octilfenol en el segundo trabajo, en el que fueron utilizados conjuntamente. En un tercer trabajo se utilizaron los dos compuestos anteriores junto al 13C12-bisfenol A, para cuantificar a sus análogos de composición isotópica natural. Estos tres trabajos tienen en común el uso de la cromatografía líquida de ultra alta resolución, acoplada a la espectrometría de masas en tándem (UHPLC-MS/MS (QqQ)) para llevar a cabo la cuantificación de los compuestos. Los analitos seleccionados, los alquilfenoles y el bisfenol A, fueron determinados en aguas embotelladas, residuales y superficiales. Cabe destacar las estrictas medidas necesarias para evitar la contaminación durante el tratamiento de muestra y análisis, sobre todo en el caso del nonilfenol. En el primer trabajo de este bloque, el isómero sintetizado, el 13C1-4-(3,6-dimetil-3-heptil)fenol (13C1-NP), se utilizó para cuantificar la mezcla técnica de nonilfenol en aguas, tras una extracción previa y preconcentración mediante cartuchos de extracción en fase sólida (SPE). La cuantificación basada en IPD y marcaje isotópico mínimo fue comparada con el uso de un patrón interno habitual en este tipo de análisis, la forma lineal de nonilfenol (n-nonilfenol). Las cuantificaciones realizadas con el patrón interno n-nonilfenol aportaron resultados significativamente superiores a los reales. Sin embargo, los valores para los ensayos de recuperación por IPD con 13C1-NP estuvieron entre el 83 y el 108% con coeficientes de variación entre el 1.5 y el 9%. En el segundo trabajo de este bloque se utilizaron ambos trazadores isotópicos sintetizados, el 13C1-NP y el 13C1-4-tertoctilfenol (13C1-OP). A diferencia del trabajo anterior, se apostó por una técnica de extracción más novedosa, la microextracción en fase líquida utilizando fibras huecas como soporte de la fase aceptora (HF-LPME). Tras la optimización, la extracción se realizó durante 30 minutos, utilizando octanol como fase aceptora de los analitos. En comparación con otras técnicas como la SPE, la HF-LPME reduce los costes por extracción a unos pocos céntimos por fibra y el volumen de disolventes orgánicos necesario a unos pocos microlítros. Durante su validación, se alcanzaron límites de cuantificación de 0,1 µg/L y recuperaciones entre el 97 y el 109% para ambos compuestos. En el último trabajo incluido en este bloque se desarrollaron dos métodos de extracción para la determinación conjunta de bisfenol A (BPA), octilfenol y nonilfenol en aguas de consumo y medioambientales. En este caso, el análogo marcado utilizado fue el 13C12-BPA, adquirido de forma comercial. Por una parte, se optimizó la extracción por SPE utilizando cartuchos de tipo C18. Por otra, se optimizó la extracción mediante el uso de HF-LPME. Ambas metodologías fueron comparadas en términos de precisión, coste, facilidad de uso, tiempo y uso de disolventes. Como en trabajos anteriores, los límites de cuantificación para los alquilfenoles alcanzados fueron 0,1 µg/L mientras que el caso del bisphenol tuvo que ser elevado a 0,5 µg/L por cuestiones de sensibilidad y precisión durante las medidas. El tercer y último bloque aborda el problema del efecto matriz en el análisis de micotoxinas mediante fuente de ionización electrospray en determinaciones por LC-MS/MS. Para ello, se extiende la cuantificación por IPD hasta 9 micotoxinas, ya que sus análogos marcados isotópicamente con todos los 12C sustituidos por 13C se encontraban disponibles de forma comercial. El estudio fue llevado a cabo en matrices con alta complejidad, incluyendo especias y piensos. En una primera aproximación se estudió la corrección del efecto matriz mediante la monitorización continua de un compuesto introducido de forma constante junto a la fase móvil, aunque sin obtener resultados satisfactorios. También se estudió el efecto matriz mediante la fortificación de los extractos tras la etapa de extracción. En una segunda parte del estudio se realizó de forma simultánea la cuantificación mediante 5 aproximaciones distintas: adiciones estándar con un punto y con calibrado, calibrado utilizando patrones internos marcados isotópicamente, así como dos formas de calcular con un solo punto las concentraciones: IPD y el calibrado interno isotópico (OPIC). En general, los valores de recuperaciones fueron adecuados en todas las aproximaciones excepto en los casos de IPD y OPIC para las fumonisinas y de adiciones estándar con un solo punto si la adición era demasiado próxima a la concentración de la muestra. Se observó que en el caso de que los patrones internos marcados isotópicamente no estuvieran disponibles, el uso de adiciones estándar a un solo nivel, suficientemente elevado dentro de un rango, ofrecía los mejores resultados.

La presencia de contaminantes orgánicos en entornos no deseables y/o en cantidades mayores a las recomendadas es un asunto que preocupa actualmente, resultando necesario conocer los efectos nocivos que éstos pueden causar en la salud de la población. Para ello, se requiere una investigación profunda sobre los niveles de concentración de estos contaminantes en matrices de interés, como son los alimentos y las aguas, sobre todo si se trata de aguas de consumo humano. Estos estudios aparecen con el fin de abordar una visión global sobre la seguridad alimentaria y mantener un medio ambiente libre de contaminantes orgánicos, crucial para nuestra supervivencia. Entre los retos de la química analítica moderna se encuentran la investigación y elucidación de los contaminantes presentes en aguas y alimentos, que junto con la información de sus concentraciones, ayudan a encontrar las acciones adecuadas para combatir el problema de la contaminación del medio ambiente y mantener la seguridad alimentaria. Se han abordado diferentes problemas analíticos relacionados con el análisis tanto de matrices de alimentos, tal como frutas y verduras sometidas comúnmente a la aplicación de productos fitosanitarios, como de matrices medioambientales. Para ello se ha hecho uso de distintos métodos analíticos, en función de la complejidad y requisitos de los problemas abordados. La primera parte se centra en el uso del analizador QqQ MS, escogido para el desarrollo de métodos cuantitativos para la determinación de residuos de plaguicidas, tanto en matrices de carácter alimentario como medioambiental. Se realiza una detallada revisión de los métodos desarrollados mediante GC-MS/MS QqQ en la última década en dichos campos de aplicación y se muestra el desarrollo, validación y aplicación de un método cuantitativo para la determinación de 130 plaguicidas en diversos alimentos de origen vegetal, con la modalidad de trabajo de MS en tándem que ofrece dicho analizador. En una segunda parte se muestra el potencial del analizador TOF MS, simple o acoplado a un cuadrupolo (QTOF MS) para el análisis de residuos de plaguicidas, explorando diferentes enfoques. Se desarrolla un método cuantitativo target, basado en GC-TOF MS, para una lista seleccionada de plaguicidas en muestras de naranjas, tomates, zanahorias y manzanas. Además se realizó un análisis non-target de las muestras ya analizadas con el objetivo de descubrir la presencia de otros compuestos no considerados inicialmente. En otro trabajo, haciendo uso de GC-QTOF MS, con ionización química a presión atmosférica (APCI), se analiza muestras vegetales como manzana, naranja, tomate, zanahoria, lechuga, calabacín, pimiento rojo y fresa. Mediante uso de modo MSE, se aplica un método de screening para unos 130 plaguicidas. Tras la identificación de varios positivos en las muestras, se realiza una validación cuantitativa de todos ellos, procediendo seguidamente a cuantificarlos de forma retrospectiva en las muestras ya analizadas. Finalmente, se amplía el método de screening a 250 plaguicidas más, con la detección del ion molecular/molécula protonada, usando para ello la función de baja energía. Los positivos encontrados se estudiaron con mayor detalle intentando conocer, al menos de forma tentativa, la identidad del compuesto gracias a la información sobre iones fragmento aportada en la función de alta energía. Por último se aborda un campo de trabajo diferente con la investigación de contaminantes orgánicos volátiles en aguas y vegetales. En primer lugar se desarrolla un método para analitos volátiles en aguas, haciendo uso de una optimización multivariante para determinar las condiciones óptimas de la microextracción en fase sólida (SPME). La técnica instrumental utilizada para la optimización, validación y aplicación a muestras de aguas superficiales y residuales fue GC-MS/MS QqQ. En un trabajo colaborativo se realiza una investigación sobre los compuestos volátiles que emiten los bulbos de la flor del tulipán. Se utiliza inicialmente la técnica GC-TOF MS, llevando a cabo la búsqueda de unos compuestos concretos; realizando también una búsqueda non-target para descubrir sus componentes volátiles. Tras la detección e identificación de los posibles positivos, se crea un método cuantitativo mediante GC-MS/MS QqQ para su correcta cuantificación.

Uno de los aspectos más importantes y que está suscitando mayor preocupación en el ámbito de la salud pública es el control de contaminantes orgánicos emergentes en el medio ambiente acuático, ya que puede afectar de forma notable a su calidad y a los organismos vivos que habitan en él. Los fármacos, por su elevado consumo, y las drogas de abuso, por su peligrosidad e ilegalidad, son los compuestos que están despertando mayor interés. Dichos compuestos son consumidos por los seres humanos, y los fármacos en menor medida por animales, siendo posteriormente eliminados de nuestro organismo como compuesto intacto o en forma de metabolitos. Todos estos compuestos llegan a las estaciones depuradoras pudiendo alcanzar las aguas superficiales si no son eficientemente eliminados tras los tratamientos aplicados a las aguas residuales. Por otra parte, aun siendo parcial o totalmente eliminados, pueden generar productos de transformación (TPs), los cuales también pueden llegar al medioambiente. En algunos casos, los TPs son desconocidos, por lo que la falta de información sobre sus posibles efectos sobre nuestro ecosistema es prácticamente total. La escasa información reportada sobre presencia y efectos de TPs y metabolitos de contaminantes emergentes en el medio ambiente es, en parte, debida a la falta de metodología analítica para su determinación. La presente Tesis Doctoral se ha centrado en el estudio del potencial y aplicaciones analíticas del acoplamiento instrumental Cromatografía Líquida de Ultra-alta Resolución (UHPLC) - Espectrometría de Masas (MS) con analizadores de triple cuadrupolo (QqQ) y cuadrupolo-tiempo de vuelo (QTOF) para la determinación de fármacos y drogas de abuso, principalmente en aguas residuales y superficiales, con especial énfasis en la investigación de sus metabolitos y productos de transformación. El trabajo realizado se divide en 5 partes bien diferenciadas: En la primera parte se ha estudiado el potencial del acoplamiento UHPLC-MS/MS para la determinación cuantitativa de 40 contaminantes emergentes (5 drogas de abuso y 35 fármacos frecuentemente consumidos) en aguas. El método desarrollado se basa en la inyección directa de la muestra de agua en el sistema cromatográfico y la posterior medida usando un analizador de masas de triple cuadrupolo de última generación. El método fue optimizado y validado tanto en agua superficial como en efluente urbano. La aplicabilidad del método se demostró analizando aguas de diferentes tipos y orígenes, llegando a detectar hasta 32 compuestos entre los 40 seleccionados, entre los que cabe destacar por su mayor frecuencia la carbamazepina (100%), el valsartán (90%), el levamisol, la trimetoprima, el sulfametoxazol o la venlafaxina (80%). Los compuestos detectados a mayor concentración, tanto en aguas residuales urbanas como medioambientales fueron los metabolitos de la dipirona. En la segunda parte se ha llevado a cabo un estudio sobre el fármaco omeprazol, con el objetivo de investigar las razones de su escasa detección en aguas pese a ser uno de los medicamentos más consumidos en todo el mundo. Se llevaron a cabo experimentos de degradación en el laboratorio, tratando de reproducir algunos tratamientos aplicados en las estaciones depuradoras (por ejemplo, cloración o radiación ultravioleta) y las posibles reacciones de degradación producidas en el medio ambiente (por ejemplo, foto-degradación). El análisis de las muestras sometidas a degradación mediante UHPLC-QTOF en modo MSE y el procesamiento de los datos utilizando el software MetaboLynx XSTM, permitió detectar y elucidar 17 TPs resultantes de procesos de hidrólisis, cloración y foto-degradación. Adicionalmente, se realizó un estudio sobre el metabolismo del omeprazol en humanos. Para ello, se investigaron las orinas de tres voluntarios tras la ingesta de omeprazol, tratando de detectar nuevos y abundantes metabolitos del fármaco. Las orinas se analizaron por UHPLC-QTOF (MSE) identificando hasta 24 metabolitos, comunes en los tres voluntarios. Posteriormente, con el fin de comprobar la utilidad de los trabajos de metabolismo y degradación realizados, se analizaron 52 muestras de aguas recogidas en el entorno de la Comunidad Valenciana (25 residuales y 27 superficiales) mediante LC-MS/MS QqQ y LC-QTOF MS con el objetivo de detectar los metabolitos y TPs identificados en los experimentos de laboratorio. Ello permitió detectar 4 TPs minoritarios y hasta 14 metabolitos, mientras que el omeprazol no estuvo presente en ninguna de las muestras. Finalmente, con el objetivo de comprobar la presencia de los mencionados metabolitos de omeprazol en aguas italianas, se analizaron 30 muestras de influente procedentes de diez ciudades distintas mediante HPLC-Orbitrap MS. Los resultados obtenidos en las muestras españolas e italianas fueron semejantes, detectando los metabolitos en ambos países. Cabe destacar que algunos de los compuestos detectados en la aguas y reportados en esta Tesis Doctoral eran desconocidos hasta ahora. La tercera parte se ha centrado en la investigación del principal metabolito del cannabis (THC-COOH) en muestras acuáticas. Se realizaron experimentos de degradación similares a los de la segunda parte. Tras el análisis mediante UHPLC-QTOF MS, se detectaron e identificaron tentativamente 19 TPs del THC-COOH. Con el fin de investigar la presencia de dichos TPs en aguas residuales y superficiales, se desarrolló un método analítico por LC-QqQ MS, usando la información obtenida del QTOF MS para seleccionar los iones en modo Selected Reaction Monitoring (SRM). Tras su aplicación a muestras de aguas residuales y superficiales, se detectaron varios de los TPs identificados en el laboratorio, entre los que cabe destacar pos su mayor frecuencia de detección los formados en las experiencias de de foto-degradación por simulación de la luz solar. En la cuarta parte se ha llevado a cabo un estudio de biodegradación con cinco fármacos de consumo frecuente (irbesartán, venlafaxina, ofloxacino, ibuprofeno y gemfibrozil), sometidos a experimentos con lodos activados y con aguas superficiales, tratando de investigar cómo actúan los microorganismos sobre ellos. Tras los experimentos de laboratorio, análisis mediante UHPLC-QTOF MS y procesamiento de los datos, se pudieron detectar 8 TPs de irbesartán, 6 de venlafaxina, 1 de ofloxacino, 6 de ibuprofeno y 1 de gemfibrozil. Estos TPs, junto con los cinco fármacos de partida, se buscaron retrospectivamente en muestras de agua de efluente y superficial, que ya habían sido analizadas por LC-QTOF MS. Se pudo confirmar la presencia de diversos TPs, algunos de los cuales fueron detectados en un mayor número de muestras que sus respectivos fármacos inalterados. Finalmente, en la quinta parte se ha explorado el potencial del LC-QTOF MS para la investigación de fármacos, pero en este caso sobre otro tipo de muestras diferente y en el ámbito de la seguridad alimentaria. Se desarrolló una metodología de screening rápido de tipo cualitativo de 116 fármacos de uso humano y animal en muestras de pienso para el ganado. La metodología de screening fue validada cualitativamente (detección e identificación) y aplicada a cinco matrices de pienso animal: caprino, bovino, cunícola, avícola y porcino. Tras el análisis de 22 muestras de piensos se pudieron detectar 11 fármacos; entre ellos, cabe mencionar los prohibidos α y β-nandrolona en pienso bovino, cunícola, caprino y/o porcino. También se exploró el potencial cuantitativo de la técnica LC-QTOF MS para los compuestos que se detectaron en las muestras.

En la presente Tesis Doctoral se han estudiado las posibilidades de la cromatografía de gases (GC) acoplada a espectrometría de masas (MS) con distintos analizadores y fuentes de ionización para la determinación de contaminantes en muestras alimentarias y medioambientales. La singularidad de los cuatro instrumentos diferentes empleados reside en los analizadores de masas que los componen: cuadrupolo simple (Q), tiempo de vuelo (TOF), triple cuadrupolo (QqQ) e híbrido cuadrupolo tiempo de vuelo (QTOF). En los dos primeros sistemas, el modo de ionización aplicado ha sido el más frecuentemente utilizado en GC, la ionización electrónica (EI), mientras que en los dos últimos se ha hecho uso de la ionización a presión atmosférica (APCI), cuyo acoplamiento con la cromatografía de gases es relativamente reciente. El potencial de estas técnicas se ha investigado tanto para el análisis target como para non-target.

Treball Final del Màster Universitari en Tècniques Cromatogràfiques Aplicades (Pla de 2013). Codi: SIY009. Curs acadèmic 2013-2014

La investigación de drogas ilícitas (IDs) en aguas se ha convertido en tema de actualidad en los últimos años. Las IDs pueden entrar en las aguas residuales, inalteradas o como metabolitos, después de su consumo y excreción. Los procesos de depuración, comúnmente aplicados en las plantas de tratamiento de aguas residuales (WWTPs), son a menudo insuficientes y algunas IDs y/o sus productos de transformación (TPs) pueden ser transferidos continuamente a aguas medioambientales. La determinación de IDs y sus metabolitos en el ciclo del agua puede contribuir a entender el potente impacto de estos compuestos en el ecosistema acuático, así como proveer información sobre el consumo de drogas y sus tendencias. Por consiguiente, se requiere desarrollar metodologías analíticas sofisticadas para obtener datos de concentración exactos de estos compuestos en el medio acuático. En esta tesis doctoral, se ha investigado el potencial de técnicas analíticas modernas basadas en el acoplamiento cromatografía líquida-espectrometría de masas en tándem (LC-MS/MS), con analizadores de triple cuadrupolo (QqQ), híbrido cuadrupolo-tiempo de vuelo (QTOF) y trampa de iones lineal Orbitrap (LTQ-Orbitrap), para la determinación de IDs y sus metabolitos/TPs en diferentes tipos de muestras de agua. El trabajo se ha estructurado en cinco partes. De los datos obtenidos en esta tesis han resultado nueve artículos científicos y un capítulo de un libro, escrito por invitación. En la primera parte, se ha explorado el potencial de la UHPLC-MS/MS, con analizador de triple cuadrupolo, para la determinación cuantitativa de las IDs más frecuentemente consumidas y sus metabolitos en agua. Se han desarrollado dos métodos multiresiduales basados en una etapa de pre-tratamiento de muestra mediante extracción en fase sólida (SPE) “off-line” y posterior determinación por UHPLC-MS/MS. En ambos métodos, se pudieron cuantificar e identificar en un solo análisis compuestos pertenecientes a diferentes clases de IDs, con propiedades físico-químicas diferentes. En el primer método se seleccionaron 11 compuestos ácido/base pertenecientes a tres clases de IDs (anfetaminas, cocaína y cánnabis) en base a su elevado consumo en el área Mediterránea. Posteriormente, el método se actualizó tras la reciente adquisición de un instrumento UHPLC-MS/MS, resultando el método presentado en el segundo trabajo, en el cual se aumentó el espectro de aplicación a varios opiáceos y a la ketamina. La selección de estos compuestos se realizó de acuerdo con los datos obtenidos en estudios de control europeos donde, por ejemplo, la ketamina fue detectada, ocasionalmente, en muestras de agua residual. Se llevó a cabo un estudio detallado para la minimización del efecto matriz, evaluando su impacto en la determinación cromatográfica y en la sensibilidad. Ambos métodos fueron validados y, posteriormente, aplicados al análisis de aguas residuales urbanas de WWTPs situadas en la provincia de Castellón, España. Algunos de estos resultados forman parte del programa de control europeo, apoyado por el “Observatorio Europeo de las Drogas y las Toxicomanías” (EMCDDA), donde nuestro laboratorio es uno de los centros participantes. Las IDs más frecuentemente detectadas fueron la cocaína y el cannabis. Además, los resultados indicaron un aumento del consumo de la cocaína durante los fines de semana, así como un aumento de la mayoría de las otras drogas durante algún festival de música importante. Los datos de concentración obtenidos para las aguas residuales de entrada y salida permitieron estimar la eficiencia de las WWTPs en la eliminación de cada compuesto estudiado, la cual fue, generalmente, satisfactoria para los bajos niveles de concentración encontrados en las aguas residuales de entrada. Sin embargo, la eliminación de IDs disminuyó durante la semana del festival de rock. La segunda parte resultó en un capítulo de libro y dos artículos científicos, focalizándose en el estudio del potencial de la LC acoplada a Espectrometría de Masas de Alta Resolución (HRMS) para investigar la presencia de IDs en aguas residuales. La versatilidad de la LC, junto con el alto poder de resolución del masas y la masa exacta de la HRMS, así como la posibilidad de realizar experiencias en modo MS/MS o pseudo MS/MS, permitió la detección e identificación de IDs y sus metabolitos con la selectividad y sensibilidad requerida. Inicialmente, se exploró el potencial de la técnica UHPLC-QTOF MS para un rápido “screening” cualitativo de 76 IDs, fármacos con potencial de abuso y algunos de sus metabolitos en muestras de agua residual recogidas en España. Los análisis fueron llevados a cabo en modo MSE, el cual implica la adquisición simultánea de dos funciones con energías de colisión diferentes. Esto permite obtener datos de masa exacta para las moléculas protonadas (baja energía de colisión) e iones fragmento (alta energía de colisión) en un solo análisis. El “screening” de muestras de agua residual de entrada y salida sospechosas de estar contaminadas permitió la detección e identificación de diez compuestos, de los cuales cinco analitos (codeína, cotinina (metabolito de la nicotina), ketamina, oxazepam y temazepam) pudieron ser provisionalmente identificados sin disponer inicialmente de patrones de referencia. El análisis cualitativo y cuantitativo mediante el analizador de masas LTQ Orbitrap fue también estudiado para 24 IDs y metabolitos relevantes en aguas residuales utilizando simultáneamente datos de masa exacta de “full-scan” y medidos en MSn. Este último fue generado en el LTQ y facilitó información útil de iones producto. La validación del método demostró satisfactoriamente la capacidad cuantitativa para la determinación de IDs a niveles de sub-ppb. La metodología fue aplicada a muestras de aguas residuales de los Países Bajos. Varias IDs tales como MDMA, benzoilecgonina (BE), codeína y benzodiacepinas pudieron ser identificadas y cuantificadas. Además, los datos de MS obtenidos mediante el Orbitrap permitieron una investigación retrospectiva de los metabolitos de la ketamina en las muestras. La tercera parte consistió en la elaboración de dos artículos científicos donde el espectro de masa exacta obtenido por LC-QTOF MS en modos MS/MS y MSE permitió, por una parte, investigar la fragmentación de varios IDs y sus metabolitos, y por otra, la elucidación de TPs de la cocaína y su principal metabolito, la BE, en agua. En el primer trabajo, se estudiaron las vías de fragmentación de diferentes clases de IDs (anfetaminas, cocaína, opiáceos, cannabinoides y ketamina) y sustancias relacionadas, incluyendo metabolitos y análogos deuterados. Se propusieron estructuras químicas de iones fragmento utilizando los datos de masa exacta medida junto con los conceptos y reglas básicas de fragmentación. Nuestros datos de masa exacta permitieron confirmar estructuras y vías de fragmentación, previamente reportadas, haciendo uso de la masa nominal y al mismo tiempo, aportaron nuevos conocimientos para la anfetamina, estimulantes tipo-anfetamina, el principal metabolito del cannabis y opiáceos. En el segundo trabajo, se llevó a cabo un estudio de los TPs de la cocaína y la BE. La cocaína se seleccionó por su alto consumo y las elevadas concentraciones comúnmente encontradas en aguas residuales de entrada. La posible formación de TPs tanto durante los procesos de tratamiento de aguas residuales como por la exposición a elementos naturales del medio ambiente (p.e. la luz solar) debe tenerse en cuenta ya que estos TPs pueden ser más persistentes o presentar una toxicidad similar al compuesto inicial. Se llevaron a cabo varios ensayos de degradación en el laboratorio bajo condiciones controladas. Los datos de masa exacta medida y el conocimiento previo sobre vías de fragmentación de la cocaína y la BE fueron de gran ayuda para la elucidación de diversos TPs. Varios metabolitos/TPs conocidos pudieron ser confirmados y otros compuestos desconocidos pudieron ser provisionalmente identificados, incluso sin disponer de los patrones de referencia. Se encontraron 16 TPs de la cocaína y 10 de la BE. Cuatro TPs, no reportados anteriormente, fueron detectados en muestras de agua residual de salida y en agua superficial. La cuarta parte engloba tres artículos científicos focalizados en la formación de IDs en el medio acuático. Tanto las muestras de agua de España como las de los Países Bajos fueron analizadas mediante las metodologías analíticas cuantitativas desarrolladas en la primera y segunda parte de esta tesis. El objetivo fue el estudio de la presencia de IDs y metabolitos seleccionados, así como su posible eliminación en las WWTPs y su impacto potencial en el medio acuático. Se ha llevado a cabo con un especial énfasis el aseguramiento de la calidad. Los criterios de cuantificación y confirmación fueron aplicados siguiendo las guías europeas, y en cada secuencia de muestras se analizaron muestras de control de calidad (QCs). En el primer trabajo, las IDs se determinaron diariamente en muestras de agua residual, tanto de entrada como de salida, recogidas de tres WWTPs situadas en la provincia de Castellón, España. Se recogieron muestras de 24h en tres periodos semanales, incluyendo una semana en la cual se celebró un festival musical internacional en Benicassim. Bajo circunstancias normales, las concentraciones de IDs fueron bajas y las eficiencias en la eliminación fueron satisfactorias. Sin embargo, durante el festival se observó un notable aumento en las concentraciones. Esto también reflejó mayores niveles de los analitos en las salidas y mayores cargas en el ambiente acuático. En el segundo trabajo, se investigó la presencia de 24 drogas “target” por LTQ Orbitrap MS en muestras de aguas residuales de cinco WWTPs situadas en los Países Bajos, incluyendo el aeropuerto internacional de Amsterdam (Schiphol). Se estimaron las variaciones diarias de cargas de droga y la eficiencia de cada WWTP para la eliminación de las drogas estudiadas de manera individual. Los resultados contribuyeron a una mejor comprensión de la presencia de IDs en las aguas residuales de los Países Bajos, revelando en las muestras del aeropuerto un modelo de comportamiento ligeramente diferente. Las eficiencias de las WWTPs en la eliminación fueron generalmente satisfactorias a excepción de las benodiazepinas y MDMA. En el tercer trabajo, se llevó a cabo un amplio “screening” de 34 IDs y sus metabolitos más relevantes en el ciclo del agua de los Países Bajos enmarcado en un estudio de colaboración con cuatro laboratorios participantes. Se analizaron muestras de agua residual urbana (entrada y salida), agua superficial de los ríos Rhine and Meuse, y agua potable producida de estos ríos. Los resultados sugirieron que importantes fracciones de la carga total de las IDs en los ríos Rhine and Meuse llegan a los Países Bajos del extranjero. Para algunos compuestos, las cargas parecían aumentar aguas abajo, lo cual podría estar causado por la contribución de las salidas neerlandesas de las aguas residuales. En el agua potable, únicamente se detectó BE en una muestra y a un nivel de concentración por debajo del límite de cuantificación. Con los datos obtenidos en este estudio, no se desprende ninguna relevancia toxicológica para el medio ambiente y la salud humana. No obstante, debería recomendarse una investigación futura basada en los posibles efectos a largo plazo (crónicos) en los organismos vivos y los posibles efectos en combinación con la exposición a múltiples compuestos a bajos niveles de concentración. La quinta parte no es, en realidad, un trabajo que pertenezca formalmente a esta tesis doctoral. Se presenta únicamente como un breve resumen ya que merece la pena mencionar por el esfuerzo realizado para establecer una red europea que supervise la presencia de IDs en aguas residuales y estime el consumo de estos compuestos en las ciudades europeas investigadas. El autor de la presente tesis doctoral ha contribuido a esta red participando activamente en los temas analíticos. Las técnicas analíticas avanzadas, comúnmente basadas en acoplamiento cromatografía-espectrometría de masas, son la base para obtener datos de concentraciones exactas en la excreción de los productos de IDs en las aguas residuales. Es un claro ejemplo donde la química analítica moderna juega un papel clave en la obtención de más conocimientos sobre el uso y las tendencias de las drogas ilícitas en la población. En esta parte se incluyen tres artículos de colaboración y un informe, como ejemplos ilustrativos de la colaboración europea mencionada. Estos artículos ponen de relieve las diferencias en el consumo de drogas en distintas zonas de Europa y dan una visión general de los métodos analíticos comúnmente aplicados en este campo, así como las incertidumbres asociadas a estudios epidemiológicos basados en los análisis de aguas residuales.

Treball Final de Màster Universitari en Tècniques Cromatogràfiques Aplicades (Pla de 2013). Codi: SIY009. Curs: 2013/2014 La empresa biofarmacéutica española PharmaMar (Grupo Zeltia), fundada en el año 1986, es una de las pioneras en el desarrollo del proceso de estudio y descubrimiento de nuevos fármacos con acción antitumoral procedentes de organismos marinos, así como la producción y comercialización de dichos fármacos en el mercado. Esta empresa figura entre las principales compañías farmacéuticas españolas que más invierten en I+D+i anualmente (más de 500 millones de euros desde su fundación). PharmaMar se trata de una compañía líder en el sector de los fármacos con acción antitumoral de origen marino, y cuenta en su haber con cinco moléculas innovadoras en desarrollo clínico, dentro de las cuales cabe destacar tres de ellas por su avanzado estado de desarrollo: Yondelis® (actualmente en el mercado), Aplidin® (fase III) y Zalypsis® (fase II). El objetivo inicial de la empresa pasa por centrar como objeto de estudio un nicho biológico que apenas parece tener fin en lo que a biodiversidad o recursos biológicos se refiere: el mar y la gran variedad de organismos que habitan en él. Esto se debe a que los Océanos constituyen el hábitat natural más extenso de la Biosfera (prácticamente las tres cuartas partes de la superficie del planeta) y que representa el escenario de la diversificación de la vida desde sus inicios durante más de 3.500 millones de años de evolución. Es precisamente por este motivo por el cuál la evolución ha dotado a los organismos que viven en el hábitat marino de diversos mecanismos de supervivencia, defensa, ataque y comunicación, que se han traducido finalmente en el desarrollo de una gran variedad de compuestos químicos muy sofisticados por parte de los mismos. Entre esta gran variedad de compuestos químicos se encuentran moléculas dotadas de actividad citotóxica muy potente, desarrolladas por los organismos marinos como un modo de defensa natural para su supervivencia en un entorno realmente competitivo. Ciertamente, estos compuestos se tratan en su mayoría de compuestos químicos con algún tipo de actividad citotóxica, que el ser humano puede aprovechar en su propio beneficio con la finalidad de poder elaborar fármacos antitumorales a partir de ellos. La inmensa mayoría de estos compuestos con actividad antitumoral pertenecen al grupo de compuestos conocidos como metabolitos secundarios. Dichos metabolitos son compuestos orgánicos que no están involucrados directamente en el crecimiento o desarrollo del organismo del que proceden, sino más bien juegan un papel fundamental en el aspecto defensivo desde un punto de vista totalmente evolutivo del organismo. Esto implica que los citados metabolitos secundarios resultan ser una amplia gama de compuestos orgánicos, a veces desde un punto de vista estructural realmente complejos, capaces de proporcionar al organismo que los produce una serie de ventajas competitivamente selectivas con respecto al resto de los organismos de su entorno, incapaces de producirlos [1,2]. Resulta interesante recalcar la vital importancia de la producción de este tipo de compuestos por parte de diversos organismos marinos cuando hacemos alusión al entorno marino donde multitud de organismos que viven en él están sometidos a una presión competitiva no equiparable a la de cualquier otro nicho biológico del mundo [3,4]. 4 Puesto que la gran mayoría de estos metabolitos secundarios se tratan de compuestos orgánicos realmente complejos os y cuya síntesis química por parte del organismo que lo produce es extremadamente costosa en términos energéticos, tan sólo se encuentra al alcance de determinados microorganismos el hecho de poder producirlos como parte de su conjunto de metabolitos secundarios. Sin embargo, la inmensa mayoría de estos microorganismos suelen encontrarse en su nicho marino conviviendo a modo de simbionte con macroorganismos marinos como esponjas, tunicados e incluso pequeños invertebrados. Serán precisamente este tipo de metabolitos procedentes de organismos marinos simbiontes como corales, esponjas [5] o estrellas de mar, las moléculas de mayor interés para PharmaMar, toda vez hayan sido aisladas en forma de extracto [6] y sometidas luego a un proceso de screening con la finalidad de averiguar si dichos compuestos son susceptibles o no de ser utilizados como posibles agentes antitumorales en etapas preclínicas posteriores [7,8]. Finalmente, y con anterioridad a pasar a detallar el esquema general que resume el trabajo realizado en los laboratorios de I+D+i de la empresa, resultaría también relevante recordar que el proceso de desarrollo de un fármaco es realmente complejo, y requiere de un periodo de tiempo dilatado así como de una fuerte inversión y capital humano (investigación). La metodología llevada a cabo en el Departamento de Química de Productos Naturales de la empresa, que implica el procesamiento de las diversas muestras marinas recogidas así como el estudio exhaustivo de la búsqueda e identificación de nuevas moléculas con actividad antitumoral es arduo y laborioso. De la totalidad de compuestos con actividad antitumoral analizados, tan sólo es un porcentaje muy bajo el de moléculas que presenten actividad citotóxica interesante y que además puedan pasar satisfactoriamente las pruebas en fase preclínica. De hecho, se estima que tan sólo alrededor del 10% de los compuestos que consiguen entrar en fase I del desarrollo clínico serán en un futuro susceptibles de pasar a la fase siguiente, y de éstos, alrededor del 30% conseguirá pasar a la fase III, no llegando al mercado ni el 60% de dichos compuestos.

Los fármacos son probablemente los contaminantes emergentes que en losúltimos años han suscitado un mayor interés debido a que su presencia en el medioambiente puede afectar a la calidad del agua y a los organismos vivos. Tras su consumohumano y/o veterinario, los fármacos pueden excretarse sin sufrir ningunamodificación o bien en forma de metabolitos, llegando a alcanzar concentracionesimportantes en las aguas residuales urbanas. Los tratamientos aplicados en la mayoríade las estaciones depuradoras de aguas residuales no son suficientes para eliminarloscompletamente, con lo que finalmente llegan al medio acuático. Se requiere puesmetodología analítica que permita determinar de modo fiable los fármacos y susmetabolitos en el medio acuático para poder evaluar sus posibles efectos negativossobre el medio ambiente.En esta Tesis se ha estudiado el potencial analítico y las aplicaciones delacoplamiento instrumental cromatografía líquida-espectrometría de masas en tándem(LC-MS/MS) con analizadores de triple cuadrupolo (QqQ) y con analizador híbridocuadrupolo-tiempo de vuelo (QTOF) en la determinación de fármacos y de susmetabolitos/productos de transformación aguas de distinta naturaleza.El trabajo realizado se ha dividido en dos partes. En primer lugar, se haestudiado el potencial del acoplamiento UHPLC-MS/MS para la determinacióncuantitativa de fármacos. Se han desarrollado tres métodos multirresiduales basados enuna etapa de tratamiento de muestra mediante SPE y posteriormente determinaciónpor UHPLC-MS/MS con triple cuadrupolo. En todos ellos se han determinadosimultáneamente compuestos pertenecientes a distintas familias de fármacos, conpropiedades físico-químicas muy diversas, en una única inyección; es decir, sedeterminan simultáneamente los compuestos que se ionizan en modo positivo y enmodo negativo.En el primer método se seleccionaron los 20 fármacos más consumidos enEspaña. Se analizaron compuestos como ibuprofeno, diclofenaco, atorvastatina,omeprazol, alprazolam, entre otros. Posteriormente, esta lista de compuestos se amplió notablemente mediante la incorporación de aproximadamente 30 antibióticos, dandocomo resultado el método presentado en el segundo trabajo. La elección de estoscompuestos se basó fundamentalmente en los posibles efectos negativos que puedenocasionar en los organismos vivos y en el medio acuático. Ambos métodos fueronoptimizados y validados tanto en agua superficial como en aguas residuales urbanas.Ambas metodologías se aplicaron al análisis de muestras de influentes y de efluentescon el fin de estudiar la presencia de los fármacos seleccionados, así como su posibleeliminación en estaciones depuradoras de aguas urbanas situadas en la provincia deCastellón en las que se utilizan tratamientos convencionales. Destacó la presencia delos analgésicos/antiinflamatorios y los fármacos utilizados para el tratamiento delcolesterol y los antibióticos pertenecientes al grupo de las quinolonas. En cuanto alcomportamiento de los fármacos durante el proceso de tratamiento, se pudo diferenciarentre aquellos compuestos que se eliminaron completamente, un grupo mucho másnumeroso formado por analitos cuya eliminación fue incompleta y un último grupoconstituido por aquellos compuestos que únicamente se detectaron en las muestras deefluente.La primera parte de esta Tesis finaliza con un tercer método para el análisis defármacos seleccionados y productos de cuidado personal. El interés por este último tipode compuestos ha aumentado en los últimos años, motivo por el cual se decidióincorporarlos a la lista de contaminantes objeto de estudio. En todos los trabajosrealizados, pero especialmente en éste, se puso especial interés en la evaluación delefecto matriz en diferentes tipos de agua para la correcta cuantificación de los analitos.Se realizó un estudio en profundidad de la eficacia del proceso de extracción por SPE ydel efecto matriz en 10 muestras de agua diferentes. El método se validó así mismo envarios tipos de aguas superficiales y de efluentes con el objetivo de afrontar diferentescomposiciones de matriz y situaciones reales que pueden aparecer cuando se analizanmuestras de agua. Finalmente, en un estudio colaborativo con la Universidad deAntioquia, Medellín, se analizaron 73 muestras (aguas superficiales y efluente)recogidas en España y en Colombia. En este último caso, las muestras procedían de dosembalses utilizados para el abastecimiento de agua potable y tan sólo se detectaronproductos de cuidado personal. La presencia de estos compuestos también resultó destacable en las aguas superficiales recogidas en la Comunidad Valenciana. En ellastambién se hallaron también casi todos los fármacos seleccionados. En el caso de lasaguas de efluente, aproximadamente el 65% de los compuestos se detectaron en todaslas muestras. Cabe destacar los elevados niveles de concentración de los fármacosanalizados, a diferencia de los compuestos de cuidado personal cuyos niveles deconcentración resultaron más bien bajos.La segunda parte de la Tesis se centra en la investigación demetabolitos/productos de transformación de fármacos en aguas. Esta línea deinvestigación se inició porque algunos fármacos analizados en los primeros trabajos nose habían detectado en ninguna de las muestras. Llamó especialmente la atención en elcaso de fármacos que se habían seleccionado por su elevado consumo. Por ello, sedecidió investigar la presencia de sus metabolitos y/o productos de transformación enlas aguas. Además, la información que existe actualmente acerca de la presencia de losmetabolitos de fármacos en el medio ambiente y de sus posibles efectos es escasa, apesar de que estos compuestos deberían tenerse en consideración ya que unaexposición prolongada podría tener efectos indeseados similares a los de los fármacos.En primer lugar, se estudió el potencial del acoplamiento UHPLC-QTOF MS enla investigación de aproximadamente 160 metabolitos/TPs, reportados en labibliografía, en muestras de efluente en las que previamente se habían detectadodiversos fármacos (análisis retrospectivo). Los análisis se realizaron utilizando el modode trabajo MSE, que implica la adquisición simultánea de dos funciones a diferentesenergías de colisión (alta y baja energía) y permite adquirir simultáneamenteinformación sobre el ión molecular y sus iones fragmento en una única inyección. Laevaluación retrospectiva permitió la detección e identificación de cuatro metabolitos,en concreto, N-desmetil claritromicina y 14-hidroxi-claritomicina, ambos metabolitosde la claritromicina, ácido fenofíbrico y ácido carboxílico de clopidogrel, metabolitosdel fenofibrato y de clopidogrel respectivamente.Por otro lado, la elevada resolución y exactitud de masa del QTOF permitióresolver una situación problemática observada en análisis previos realizados por LCResumenMS/MS (QqQ), que habían dado lugar a falsos positivos de uno de los metabolitos delfármaco dipirona (4-AA). El uso de la alta resolución nos ayudó a descubrir la presenciade otros dos metabolitos de la dipirona que compartían las mismas transiciones,complicando de este modo la correcta identificación de los compuestos. Además, esteestudio sirvió para resaltar la importancia que tiene la separación cromatográfica ensituaciones problemáticas en las que los metabolitos de un compuesto puedencompartir las mismas transiciones. En el caso de la dipirona, los metabolitosdescubiertos por QTOF, que compartían las mismas transiciones que el previamenteanalizado 4-AA, fueron el 4-formilaminoantipirina (4-FAA) y 4-acetamidoantipirina (4-AAA). Aunque con una estructura química y fórmula molecular diferentes, ambossufrieron fragmentación en la fuente electrospray, dando lugar al 4-AA, que fue elcompuesto reportado en los análisis realizados mediante UHPLC-MS/MS.Finalmente, se desarrolló un método basado en UHPLC-MS/MS para ladeterminación cuantitativa de varios metabolitos identificados mediante QTOF.Además, se seleccionaron otros metabolitos reportados en las aguas según labibliografía, y se incluyeron también sus fármacos de partida. El método se validó enagua superficial y de efluente. En este último caso, gracias a la elevada sensibilidad delmétodo se pudo corregir el efecto matriz mediante una simple dilución de las muestras(x4). De los 21 compuestos analizados, tan sólo tres (ácido clofíbrico, enalaprilato yomeprazol) no se hallaron en ninguna de las muestras. Esta información demuestra laimportancia que tiene la inclusión de los metabolitos/TPs en los métodosmultirresiduales, ya que se detectan con elevada frecuencia en las aguas y, enocasiones, a concentraciones superiores a las de los propios fármacos., Pharmaceuticals are among the emerging contaminants that have caused agreater interest in the last years because of their presence in the environment can affectthe water quality and living organisms. After their human and/or veterinaryconsumption, pharmaceuticals can be excreted in unchanged form as the parentcompound and/or as metabolites, reaching high concentrations in urban wastewaters.Treatment processes applied in most wastewater treatment plants are not efficientenough to remove pharmaceuticals completely, which can eventually reach the aquaticenvironment. Therefore, analytical methodology is required to determinepharmaceuticals and their metabolites in the aquatic ecosystem in a reliable way toevaluate their potential negative effects on the environment.In this Thesis the analytical potential and applications of liquid chromatographyand tandem mass spectrometry (LC-MS/MS) with triple quadrupole (QqQ) and hybridquadrupole-time of flight (QTOF) analyzers in the determination of pharmaceuticalsand their metabolites/transformation products in different types of waters has beenstudied.The work done has been divided in two parts. Firstly, the potential of thecoupling UHPLC-MS/MS has been explored for the quantitative determination ofpharmaceuticals. Three multi-residue methods based on a pre-treatment step by solidphaseextraction followed by UHPLC-MS/MS determination with triple quadrupolehave been developed. In all of them, compounds belonging to different pharmaceuticalgroups, with very diverse physico-chemical characteristics have been determined in asingle injection, i.e, positive and negatively ionized compounds are simultaneouslydetermined in a single analysis.In the first method, the 20 most consumed pharmaceuticals in Spain wereselected. Compounds such as ibuprofen, diclofenac, atorvastatin, omeprazol,alprazolam, among others, were analyzed. Later, this list of compounds was notablyenlarged by the addition of around 30 antibiotics, resulting in the method presented inthe second work. These compounds were mainly selected due to their potential negativeSummaryeffects on living organisms and on the aquatic environment. Both methods wereoptimized and validated in surface waters and in urban wastewaters. Subsequently,both methodologies were applied to the analysis of influent and effluent wastewaters inorder to study the presence of selected pharmaceuticals, as well as their possibleremoval, in urban wastewater treatment plants located in the Castellon province whereconventional treatments are applied. Analgesics/anti-inflammatories and compoundsused to lower cholesterol levels and quinolone antibiotics were the most frequentlydetected pharmaceuticals. Regarding their behaviour during the treatment process, wecould distinguish among those compounds completely removed, a numerous groupformed by the analytes that were partially removed, and a last group includingcompounds that were only detected in the effluent wastewater samples.The first part of Thesis ends with a third method developed for the analysis ofselected pharmaceuticals and personal care products. The interest regarding the lastfamily of compounds has increased in the last years, therefore they were included in thelist of contaminants under study. In all the works carried out, but mainly in this one,special interest was paid on the evaluation of matrix effects in different types of waterfor the correct quantification of the analytes. A detailed study of the extraction processefficiency and matrix effect was carried out in 10 different water samples. The methodwas validated in several types of surface waters and effluents in order to evaluatedifferent matrix compositions and real situations that can appear when real-worldwater samples are analyzed. Finally, in a collaborative study with the AntioquiaUniversity, (Medellin) 73 samples (surface and effluent) collected in Spain andColombia were analyzed. In the last case, the samples were collected from tworeservoirs used for drinking water supply and only personal care products weredetected. The presence of these compounds was also remarkable in the surface watersamples collected in the Valencian Community (Spain). In these samples, almost all thetarget pharmaceuticals included in the method were found. In the case of effluentwastewater samples, approximately 65% of the compounds were detected in all thesamples. It is important to remark the high concentration levels found for somepharmaceuticals, in contrast to the personal care products which concentrations wererather low.SummaryThe second part of the Thesis is focused on the investigation of pharmaceuticalmetabolites/transformation products in waters. This research was made because someof the pharmaceuticals selected in the first works were never detected in any of thesamples analyzed. It was especially surprising in the case of pharmaceuticals highlyconsumed. So, we decided to study the presence of their metabolites and/ortransformation products in water. Moreover, the information currently availableregarding the presence of pharmaceutical metabolites in the environment and theirpossible effects is scarce, despite these compounds are also of concern as a longexposition may have undesirable effects similar to those of the parent pharmaceuticals.Firstly, the potential of UHPLC-QTOF MS has been evaluated in theinvestigation of around 160 metabolites/TPs, reported in the bibliography, in effluentwastewater samples where several pharmaceuticals had been previously detected(retrospective analysis). Analyses were made in MSE mode, which involves thesimultaneous acquisition of two functions at different collision energies (low and high).This allows acquiring simultaneously information about the molecular ion and thefragment ions in a single injection. The retrospective evaluation allowed the detectionand identification of four metabolites, such as N-desmethyl clarithromycin and 14-hydroxy-clarithromycin, both metabolites of clarithromycin, fenofibric acid andclopidogrel carboxylic acid, metabolites of fenofibrate and clopidogrel, respectively.On the other hand, the high resolution and exact mass measurements of theQTOF allowed to solve a problematic situation observed in previous analysis by LCMS/MS (QqQ), which had led to false positives of one of the metabolites (4-AA) of thepharmaceutical dipyrone. The use of high resolution helped us to discover the presenceof two other dipyrone metabolites that shared the same transitions, complicating theright identification of the compounds. Moreover, this study was useful to highlight theimportance of the chromatographic separation in problematic situations where themetabolites of a compound can share the same transitions. In the case of dipyrone, themetabolites discovered by QTOF, that showed the same transitions than the previouslyanalyzed 4-AA, were 4-formilaminoantipyrine (4-FAA) and 4-acetamidoantipyrine (4-AAA). Although they have different chemical structure and molecular formula, bothSummarysuffered in-source fragmentation in the electrospray source, producing 4-AA, thecompound that had been reported in the analysis carried out by UHPLC-MS/MS.Finally, a method based on UHPLC-MS/MS was developed for the quantitativedetermination of several metabolites identified by QTOF. Moreover, other metabolitesdetected in waters according to the consulted bibliography, as well as their parentcompounds were also included. The method was validated in surface and effluentwastewater. In this last case, the high sensitivity of the method allowed to correctmatrix effects by a simply 4-fold dilution of the samples. Only 3 out of 21 compoundsanalyzed (clofibric acid, enalaprilate and omeprazole) were not found in any of thesamples. Our data showed the importance of including pharmaceuticalmetabolites/TPs in the multi-residue methods, as they are frequently detected inwaters and, sometimes, at concentrations higher than their parent compounds.

En la presente Tesis Doctoral se ha estudiado la presencia y bioacumulación de compuestos organoclorados en la piscicultura del Mediterráneo occidental, así como en el entorno marino circundante. La investigación realizada se estructura en tres partes diferenciadas. En la primera parte se ha utilizado la técnica GC-MS para el estudio de la presencia de los contaminantes organoclorados en productos de la acuicultura marina, investigándose el comportamiento de los mismos a lo largo del ciclo biológico de la dorada (Sparus aurata), y comparando los resultados obtenidos en ejemplares salvajes y cultivados. Además, se ha realizado un estudio específico sobre la transferencia maternal de organoclorados a los ovocitos de doradas salvajes y cultivadas. En la segunda parte se han determinado las relaciones entre isótopos estables de carbono y nitrógeno con el objetivo de estudiar las diferentes características alimentarias de las doradas salvajes y cultivadas, relacionándolas con el comportamiento de los compuestos organoclorados en las cadenas tróficas estudiadas. Por último, se ha desarrollado metodología analítica para la determinación de Dioxin-Like PCBs mediante GC-MS/MS (trampa iónica), en muestras procedentes de la acuicultura marina, estudiando en detalle las etapas de purificación de los extractos y el fraccionamiento de los analitos previamente a la determinación analítica.

Se estudia el potencial analítico del acoplamiento cromatografía-espectrometría de masas (LC-MS/MS o GC-MS(MS)) con empleo de diferentes analizadores, en el campo del análisis de residuos de plaguicidas. Todos los métodos de análisis desarrollados se han validado siguiendo criterios de calidad recogidos en las guías europeas con el fin de que los datos obtenidos sean altamente fiables. La investigación se estructura en dos grandes bloques. En el Bloque 1 se han desarrollado aplicaciones para el análisis de residuos de plaguicidas en muestras vegetales. Se desarrolla metodología multiresidual empleando la técnica de LC-MS/MS y UHPLC-MS/MS con analizador de triple QqQ para la determinación de compuestos con características físico-químicas muy diversas y dificultad expresa en análisis GC. También se reporta metodología GC-MS capaz de determinar, conjuntamente, dos fungicidas problemáticos: captan y folpet, dada su inestabilidad química y térmica. En el Bloque 2, se emplea la técnica GC-MS(MS) con distintos analizadores para la determinación de plaguicidas OCs y PCBs en muestras procedentes de la acuicultura marina. También se evalúan las diferencias en los niveles de concentración así como en el perfil de los contaminantes en peces cultivados y salvajes procedentes de la costa de Castellón.

En la presente Tesis se pretende avanzar en el conocimiento del potencial que representa el acoplamiento cromatografía de gases-espectrometría de masas con analizadores de triple cuadrupolo y tiempo de vuelo como herramienta de avanzada en el análisis medioambiental y biológico. El trabajo se organiza en tres grandes bloques. En primer lugar, se investiga el uso de la técnica GC-MS/MS con analizador de triple cuadrupolo para el desarrollo de metodología analítica multirresidual que permita la cuantificación y confirmación de contaminantes orgánicos en aguas y en muestras de tejido adiposo mamario. En segundo lugar, se explora el potencial del acoplamiento GC-TOF MS para el desarrollo de métodos avanzados y rápidos de screening para un amplio rango de contaminantes. El trabajo se centra principalmente en aspectos cualitativos y de elucidación estructural, campos en donde la gran cantidad de información aportada por GC-TOF MS es fundamental, al permitir la correcta identificación de las especies detectadas. Por último, se combinan las técnicas GC-MS/MS y LC-MS/MS con triple cuadrupolo y tiempo de vuelo en estudios ambientales y toxicológicos In this Thesis the potential of coupling gas chromatography-mass spectrometry with triple quadrupole and time-of-flight analyzers is investigated as an advanced analytical technique in environmental and biological analysis.

Dentro de la problemática ambiental, los plaguicidas son, posiblemente, una de lasfamilias de contaminantes que más preocupan en la actualidad, debido a su toxicidad yelevado uso en todo el planeta, así como a la posibilidad de contaminación de distintos tipos de muestras (suelos, aguas, aire, productos alimenticios). El elevado número de plaguicidas actualmente en uso, junto con la gran variabilidad que presentan en cuanto a sus propiedades físico-químicas, dificulta de forma considerable su análisis a nivel de residuos. Aunque se han realizado numerosos estudios ambientales, la mayoría de programas de control de estos contaminantes, tanto en el medio ambiente, como en alimentos o seres vivos expuestos, se centran en tan sólo unos pocos productos (normalmente el plaguicida inalterado), a pesar de que se conocen algunos productos de transformación/metabolitos relativamente estables, persistentes y tóxicos.Esta carencia de información generalizada sobre la presencia de productos de transformación (TPs) en el medio ambiente es debida, principalmente, a la falta de metodología analítica. Así pues, parece necesario generar información sobre las rutas de degradación/transformación de estos compuestos, desarrollar metodología analítica que permita determinar sus niveles en el medio ambiente, así como evaluar su impacto en elmismo, especialmente en aguas superficiales y subterráneas. Para este fin, es necesario utilizar técnicas modernas y poderosas, en especial la espectrometría de masas, que en los últimos años se ha mostrado como una técnica indispensable en muchas áreas de la Química Analítica.En esta Tesis se ha explorado el potencial analítico y las aplicaciones del acoplamiento instrumental cromatografía líquida-espectrometría de masas en tándem (LC-MS/MS) con analizadores de triple cuadrupolo (QqQ) e híbrido cuadrupolo-tiempo de vuelo (QTOF) en la determinación de plaguicidas, principalmente en el campo medioambiental, poniendo especial énfasis en los aspectos cualitativos, es decir, en la correcta confirmación de la identidad de los compuestos detectados, siguiendo los criterios de las actuales guías europeas.El trabajo ha sido estructurado en cuatro partes. En primer lugar, se ha explorado elpotencial del acoplamiento LC-QTOF MS en el análisis cualitativo. La versatilidad de la LC, junto con la elevada exactitud de masa del QTOF y la posibilidad de obtener espectros de iones producto con masa exacta, ha permitido la detección, identificación y elucidación de TPs/metabolitos de plaguicidas seleccionados. Inicialmente, se seleccionó como caso de estudio una familia de herbicidas ampliamente utilizada (triazinas). En vista del éxito de los resultados obtenidos, se decidió ampliar el trabajo a otros plaguicidas aplicados en la Comunidad Valenciana, como por ejemplo, bromacilo, diuron o diazinon. En el caso del diazinon, además, se llevaron a cabo estudios in vitro (con microsomas hepáticos humanos) e in vivo (con ratas), con el fin de elucidar sus principales metabolitos, demostrando así la gran capacidad analítica de esta técnica tanto en el campo ambiental como biológico.Adicionalmente, la metodología desarrollada fue ligeramente modificada para el estudio de compuestos desconocidos (non-target), tras la inyección directa de muestras acuosas de diferentes orígenes. La aplicación de esta metodología permitió la identificación de varios contaminantes en muestras de agua de la Comunidad Valenciana.En segundo lugar, se ha estudiado el potencial del acoplamiento LC-QqQ MS para la determinación cuantitativa de residuos de plaguicidas y de sus TPs en muestras ambientales. Se han puesto a punto dos métodos basados en SPE-LC-MS/MS: el primero de ellos para la determinación multirresiduo de plaguicidas seleccionados y de sus TPs en muestras de agua, y el segundo para la determinación de compuestos altamente polares como el glifosato, su producto de transformación (AMPA) y el glufosinato, ante la imposibilidad de incluirlos en el método multirresiduo anteriormente descrito. Los métodos fueron optimizados y validados tanto en muestras de agua subterránea como superficial siguiendo el "espíritu" de las Buenas Prácticas de Laboratorio, según los criterios de las guías SANCO de la Union Europea, estableciendo los parámetros de linealidad, especificidad, exactitud y precisión. En el caso del glifosato y AMPA, el método fue además validado en muestras de suelo. Posteriormente, la metodología se aplicó al análisis de muestras reales, con el fin de obtener información sobre el nivel de contaminación de las aguas de la Comunidad Valenciana.En tercer lugar, se ha comparado el potencial de los distintos equipos instrumentalesutilizados en cuanto a su poder de confirmación de plaguicidas y TPs en muestras reales de agua, de acuerdo con las actuales guías europeas (2002/657/EC). Se han mostrado ejemplos ilustrativos de muestras reales de agua, sobre las que se han detectado diferentes plaguicidas y TPs, y se han discutido las posibilidades de reportar falsos positivos o falsos negativos. En general, se ha demostrado que el triple cuadrupolo puede utilizarse de manera eficiente para la confirmación de muestras positivas siempre y cuando se adquieran varias transiciones MS/MS. El uso de 2 transiciones SRM (Selected Reaction Monitoring) es una alternativa válida, siempre que se realice una selección adecuada considerando su especificidad. Por lo que se refiere al QTOF, su modo de operar permite monitorizar todos los iones producto simultáneamente sin necesidad de preseleccionarlos previamente, lo que, unido a las medidas de masa exacta, le proporciona un extraordinario potencial con fines identificativos. El QTOF, sin embargo, presenta una limitación respecto al QqQ en modo SRM debido a su menor sensibilidad, lo que puede imposibilitar la confirmación de ciertos positivos a bajas concentraciones.Finalmente, se han efectuado dos revisiones científicas en las que se muestran diferentes estrategias para afrontar la determinación de plaguicidas por LC-MS/MS. La estrategia a seguir dependerá del objetivo perseguido y del instrumento disponible, ya que los requisitos del método a utilizar diferirán dependiendo de si se quiere detectar, cuantificar o confirmar la presencia de un posible residuo. A modo de resumen, el triple cuadrupolo se considera muy adecuado para la cuantificación y el cribado (screening) de compuestos predefinidos (target analytes). Esta aproximación presenta, sin embargo, una limitación debido a la necesidad de preseleccionar los compuestos objeto de estudio. En cuanto a la confirmación, el uso de transiciones no específicas, como por ejemplo pérdidas de agua, puede resultar esporádicamente en falsos positivos incluso adquiriendo dos transiciones, ya que aumenta la probabilidad de encontrar interferentes que compartan la misma transición. Por otra parte, también podrían resultar falsos negativos en el caso de que una de las transiciones fuera compartida por un interferente, ya que afectaría a la relación de abundancias iónicas experimental. Esta posibilidad aumenta cuando el analito se encuentra a niveles de concentración del orden de sub-ppb. Por este motivo, se considera que la mejor aproximación para una confirmación segura de residuos es la adquisición del mayor número posible de transiciones disponibles.El QTOF en cambio, debido a su elevada sensibilidad en modo scan y a la posibilidad de realizar experiencias en modo MS y MS/MS con medidas de masa exacta, es ideal para la búsqueda de compuestos desconocidos (sin necesidad de ser preseleccionados) y para la elucidación estructural. En cuanto a la confirmación de positivos, el QTOF puede considerarse como la herramienta ideal que permite la identificación inequívoca del analito. Sin embargo, existe la posibilidad de reportar falsos negativos si se encuentra presente en la muestra algún interferente isobárico que coeluya con el analito. En este caso, la mejor opción sería mejorar la separación cromatográfica, lo cual demuestra que ésta juega un papel fundamental en los métodos analíticos, incluso cuando va acoplada a técnicas poderosas de medida como MS/MS con analizadores de QTOF. En esta Tesis se ha establecido una metodología de trabajo moderna, altamente especializada y con herramientas analíticas poderosas, que podría aplicarse a otros campos de interés relacionados con el impacto de contaminantes orgánicos sobre el medio ambiente, alimentos, y, en definitiva, sobre los seres vivos.

Atendiendo al creciente interés de Ecuador en el establecimiento de políticas para el control de residuos de plaguicidas debido al elevado uso de productos fitosanitarios en el tratamiento de enfermedades de diversos cultivos, particularmente, en el caso de fungicidas utilizados en el control de la Sigatoka Negra, enfermedad que afecta al banano. Considerando, además, la repercusión que han tenido estos fungicidas en el medio ambiente, tal y como se manifestó con la aparición del denominado Síndrome de Taura, causante de la mortandad masiva de camarón en piscinas de cultivo próximas a las plantaciones bananeras, lo que causó una fuerte polémica entre estos dos importante sectores de la economía ecuatoriana. Teniendo en cuenta, también, que el nivel de exportación de cítricos en España, así como de bananas en Ecuador, demanda la aplicación de fungicidas post-cosecha, requiriéndose el control de residuos a efectos de comercialización de las frutas. Y considerando que uno de los temas que más preocupa a la opinión pública, en general, es la presencia de residuos de estas sustancias en alimentos tratados, sobretodo frutas y hortalizas, puesto que incide directamente en la seguridad alimentaria.La presente Tesis Doctoral se centra, por tanto, en el desarrollo de una metodología analítica moderna acorde con el estado tecnológico actual y con las exigencias que demanda la legislación en materia de residuos de plaguicidas y, también, de metodología más convencional factible de aplicación en medios de investigación menos desarrollados. De esta manera se han desarrollado varios métodos analíticos mediante técnicas cromatográficas avanzadas (LC-FD, GC-MS, LC-LC-FD, LC-MS/MS) para la determinación de residuos de funguicidas seleccionados en muestras de banana y naranjas.Se ha demostrado la aplicabilidad de los métodos desarrollados en muestras de naranjas y bananas, confirmándose la idoneidad de los métodos multiresiduos para fines de control (monitoring). Para la determinación selectiva de o-fenilfenol se recomienda la aplicación del método LC-LC/FD, más rápido, sensible y selectivo que los multiresiduos. Finalmente, la poderosa técnica LC-MS/MS ha permitido determinar tridemorf y otros fungicidas y, así como confirmar los resultados obtenidos con los métodos más convencionales descartándo la existencia de falsos positivos.Adicionalmente, se ha desarrollado metodología analítica basada en LC-MS para la determinación de residuos de paclobutrazol, regulador de crecimiento ampliamente utilizado en frutas de hueso, por la necesidad de disponer de datos de residuos de este compuesto, cuyo LMR ha sido recientemente rebajado hasta 0.05 mg·Kg-1, lo cual ha originado graves problemas en la exportación de peras españolas. Este compuesto también presenta propiedades fungicidas, pudiendo incluirse en el grupo de los azoles según su estructura química.

El amplio uso de plaguicidas en el área Mediterránea, hace que la exposición a los mismos suponga un evidente riesgo para la salud pública, debido a su demostrada toxicidad. La actividad donde el uso de plaguicidas es mayor es la agricultura, ya que las cosechas se ven afectadas por una gran diversidad de plagas, así como por la competencia de las malas hierbas. Pero no solamente el sector agrícola se encuentra expuesto a plaguicidas, la población en general también están expuestos a ellos, aunque en distinto grado. Uno de los riesgos para la población general es la exposición a largo plazo provocada por la presencia de residuos de plaguicidas en los alimentos como consecuencia de los tratamientos fitosanitarios, así como por los contaminantes ambientales. Atendiendo a la necesidad de controlar y evaluar esta exposición humana, el objetivo principal de la presente Tesis Doctoral ha consistido en el estudio y puesta a punto de procedimientos analíticos eficaces basados en cromatografía de gases (GC) capilar para la determinación de plaguicidas organofosforados (OPs) y organoclorados (OCs) en muestras biológicas de origen humano.En una primera etapa del presente trabajo, se han desarrollado dos procedimientos multiresiduales sencillos para el análisis de plaguicidas en muestras humanas de suero y orina. Se han basado en técnicas tradicionales como son la microextracción líquido-líquido (LLME) y la extracción en fase sólida (SPE). El procedimiento basado en SPE ha resultado más rápido, ha evitado la formación de emulsiones, frecuentes en la técnica de extracción con disolventes orgánicos, y ha permitido la obtención de extractos más limpios. Sin embargo, los límites de detección obtenidos han sido, en muchos casos, insuficientes para el control biológico de la población en general, aunque sí resulten adecuados para la determinación de altos niveles de contaminantes en población expuesta.En una segunda etapa de la investigación, se ha incorporado el uso de una técnica más novedosa, como es la microextracción en fase sólida (SPME) para la determinación de residuos de plaguicidas OPs y OCs en muestras de fluidos biológicos. Esta técnica permite simplificar notablemente el tratamiento de muestra en comparación con las técnicas tradicionales, lo cual supone una reducción del tiempo de análisis, así como una menor manipulación de la muestra. Además y debido a la complejidad de las muestras estudiadas, el uso del modo de trabajo de espacio de cabeza ha permitido la obtención de precisiones satisfactoria y bajos niveles de detección, muy adecuados para el control, tanto de población expuesta como no expuestaFinalmente, y coincidiendo con la tercera etapa del proceso de investigación, también se han analizado muestras de tejido adiposo humano, las cuales presentan una elevada complejidad por su alto contenido lipídico (aproximadamente un 84%). La cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) en fase normal con columnas de Silicagel ha sido la técnica seleccionada para la etapa de purificación en la determinación de compuestos OCs, tanto plaguicidas OCs como PCBs, en este tipo de matrices. Los procedimientos de purificación desarrollados han permitido obtener los plaguicidas y sus metabolitos en fracciones libres de grasa, o con un contenido menor a la máxima cantidad de carga de grasa recomendada para columnas de gases capilares. Esto ha hecho posible la inyección directa de las fracciones HPLC en GC.La sensibilidad y selectividad de los procedimientos de extracción y purificación desarrollados se ha conseguido aumentar con el empleo de técnicas cromatográficas de análisis mediante espectrometría de masas (GC-MS), permitiendo la confirmación inequívoca de los compuestos detectados. También se ha utilizado para la detección una técnica más novedosa como la espectrometría en tándem masas (MS/MS), la cual se revela como una herramienta poderosa para el análisis de matrices complejas, ya que aporta un factor adicional por la realización del espectro de los iones secundarios formados a partir de un precursor seleccionado. La adecuada selección de los iones precursores y de los iones secundarios permite disponer de una de las técnicas más sensible y selectivas para trabajar con muestras complejas.Y por último, todos los métodos analíticos desarrollados se han aplicado al análisis de muestras de fluidos y tejidos humanos, tanto de agricultores como de población supuestamente no expuesta a plaguicidas, detectándose con frecuencia algunos de los analitos objetos del presente estudio.