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Ribavirin wurde als eines der ältesten Virostatika zuletzt v.a. zur Therapie der chronischen Hepatitis C verwendet. Sein genauer Wirkungsmechanismus ist aber unbekannt. Es scheint, dass Ribavirn über keine antivirale Wirkung im Sinne einer direkten Hemmung der HCV-Replikation verfügt, sondern über die Freisetzung verschiedener Zytokine einen Shift von TH2- zu TH1-vermittelter Immunreaktion auslöst. Amantadin wurde zur Behandlung diverser Erkrankungen einschließlich der Prophylaxe einer Influenza eingesetzt. Bei der Therapie der Hepatitis C wurde es mit Ribavirin kombiniert, um dessen Effekt zu verstärken. Sein Stellenwert in der Hepatitis-C-Therapie blieb aber umstritten. Bisher liegen nur wenige Studien vor, die den immunmodulierenden Effekt von Amantadin untersucht haben. Vereinzelt wurde eine Inhibierung der HCV-Replikation durch Amantadin bei an Hepatits C erkrankten Patienten in vivo und in vitro beschrieben, der genaue antivirale Wirkmechanismus von Amantadin in der HCV-Therapie blieb aber bis zuletzt unbekannt. Beide Medikamente werden derzeit bezüglich einer Wirksamkeit zur Therapie einer Covid-19-Erkrankung untersucht. PBMC von 20 gesunden Probanden wurden in vitro kultiviert, um dann sowohl Zellen des erworbenen Immunsystems als auch Natürliche Killerzellen genauer zu untersuchen. Hierbei sollten insbesondere TH1- und TH2-Reaktionen analysiert werden. Drei verschiedene Antigene (BCG, Tetanus-Toxoid und PPD) wurden verwendet, um die PBMC zu unterschiedlichen Immunreaktionen vom TH1- oder TH2-Typ anzuregen; ferner wurde der Einfluss von Ribavirin bzw. Amantadin in unterschiedlichen Konzentrationen innerhalb dieses in vitro-Testsystems untersucht. Ein radioaktiver Proliferationsassay diente der quantitativen Zellproliferationsbestimmung. Die Ausbildung des frühen Aktivierungsmarkers CD69 sowie verschiedener Zelloberflächenmoleküle (CD4, CD8, CD19 und CD56) wurde mittels Durchflusszytometrie nachgewiesen. Ein Zytokin-ELISA diente der Untersuchung der Zytokinproduktion (IL-1, IL-5, IL-6, IL-10, IL-13, IFN-gamma, TNF-alpha, TNF-beta und GM-CSF) unter Einfluss von Ribavirin bzw. Amantadin. Unsere Daten deuten darauf hin, dass es große interindividuelle Unterschiede in der immunologischen Reaktion auf Ribavirin und Amantadin gibt. So zeigten einige der 20 Probanden ähnliche Ansprechverhalten auf beide Wirkstoffe, welche aber in der gesamten Kohorte nicht signifikant waren. Dies erklärt auch, warum die Therapie der Hepatitis C mit diesen Substanzen nur einen marginalen Effekt hatte. In dieser Arbeit wurde eine kleine Probandenkohorte untersucht, in der sowohl TH1- als auch TH2- und TH0-Immunprofile vertreten waren. Die Untersuchung eines größeren Kollektives der jeweiligen Subtypen wäre eine Möglichkeit, um die immunmodulierenden Wirkmechanismen genauer zu verstehen und dann mögliche Therapieresponder von Non-Respondern zu unterscheiden bzw. Ansatzpunkte für künftige Therapien zu ermitteln. Individuelle Prädisposition und immunologische Reaktionsmuster könnten also wichtige Faktoren sein, welche die Wirksamkeit von Ribavirin und Amantadin beeinflussen. Möglicherweise könnte eine prätherapeutische Bestimmung des jeweiligen immunologischen Subtyps helfen, eine auf den Patienten optimal angepasste antivirale Therapie auszuwählen.

HAHA/HAMA Nachweis sowohl unter Patienten mit rheumatischen Erkrankungen (unter oder ohne Therapie) als auch unter den gesunden Probanden. Beeinflussung der Therapie auf die HAHA/HAMA Häufigkeit. Kreuzreaktivität

Die PBC ist eine chronische cholestatische Lebererkrankung, deren Ursachen und Pathomechanismen noch nicht genau geklärt sind. Sie geht mit einer autoimmun bedingten Zerstörung der kleinen intrahepatischen Gallengänge einher und kann in fortgeschrittenen Stadien zu einer Schädigung des gesamten Leberparenchyms bis hin zum Vollbild einer Leberzirrhose führen (Kaplan 1996). Derzeitige Standardtherapie der PBC ist laut aktueller Leitlinie eine Dauertherapie mit UDCS (Strassburg et al. 2017). Aufgrund anderer assoziierter Autoimmunerkrankungen oder einer stattgehabten Lebertransplantation erhält jedoch ein Teil der PBC-Patienten zusätzlich zur UDCS-Therapie eine immunsuppressive Therapie. Bei über 90% der PBC-Patienten sind Autoantikörper gegen mitochondriale Antigene (AMA) nachweisbar, die sehr spezifisch für die Erkrankung sind und daher große diagnostische Bedeutung haben (Kaplan 1996). 2010 wiesen Berg et al. bei PBC-Patienten erstmals auch Antikörper gegen ein rekombinantes Peptid des muskarinischen Acetylcholinrezeptors Typ 3 (Anti-mAchR3- Antikörper) nach. Einige Studien haben gezeigt, dass solche Anti-mAchR3-Antikörper auch die Rezeptoraktivität beeinflussen können (Frischke 2013; Preuss et al. 2014a; Preuss et al. 2014b). Ziel der vorliegenden Arbeit war es, diese funktionelle und die Proliferation beeinflussende Aktivität der Anti-mAchR3-Antikörper bei PBC- Patienten zu re-evaluieren und Änderungen in der Aktivität und Prävalenz der Antikörper im Krankheitsverlauf unter verschiedenen Therapieregimen zu analysieren. Hierfür wurden Seren von 38 PBC-Patienten zum Zeitpunkt der Erstdiagnose bzw. vor Therapiebeginn und im Verlauf der Erkrankung (ohne Therapie, n = 4; unter Therapie mit UDCS, n = 18; unter immunsuppressiver Therapie, n = 16) untersucht. Um sicher zu sein, dass mögliche Effekte auf Antikörper und nicht andere Faktoren in den Patientenseren zurückzuführen sind, wurden aus allen Seren Immunglobuline durch Ammoniumsulfatfällung isoliert. Die Untersuchung der aus den Seren isolierten Immunglobulinfraktionen erfolgte mit einer in der Literatur vorbeschriebenen, teilweise leicht modifizierten Lumineszenz-basierten Methode. Hierbei wurden neben mAchR3- überexprimierenden CHO-Zellen auch Cholangiozyten (TFK-1-Zellen) und Hepatozyten (HEP-G2-Zellen) eingesetzt. Zudem wurde im selben Patientenkollektiv mittels eines 3H-Thymidin-basierten Proliferations-Assay auch die Prävalenz und Aktivität von die Zellproliferation beeinflussenden Antikörpern untersucht. Auch hier wurden entsprechende Verlaufsmessungen durchgeführt. Es konnte besonders mit TFK-1-Zellen und HEP-G2-Zellen eine hohe Prävalenz von rezeptorinhibierenden Anti-mAchR3-Antikörpern von 84% bzw. 63% festgestellt werden. Ein kleiner Prozentsatz der Anti-mAchR3-Antikörper (5% bei den TFK-1-Zellen, 3% bei den HEP-G2-Zellen) zeigte zudem rezeptoraktivierende Aktivität. Mit den CHO-Zellen gelang der Antikörper- Nachweis überraschenderweise trotz der Überexpression des Rezeptors weniger sensitiv. Bei 63% der Patienten ließen sich mit dieser Zelllinie keine funktionell aktiven Anti-mAchR3-Antikörper nachweisen, bei 26% inhibierende und bei 11% aktivierende Antikörper. Grund hierfür ist vermutlich eine Zell- bzw. Organspezifität der nachgewiesenen Anti-mAchR3-Antikörper, die beispielsweise auf zellspezifischen Subtypen des mAchR3 oder zellspezifischen Varianten der nachgeschalteten Signalwege beruhen könnte. Zudem scheint auch der Zustand der Zellen und das intrazelluläre Milieu Einfluss auf die Antikörperwirkung zu haben. Im Verlauf der Erkrankung ergaben sich bei den Messungen mit TFK-1-Zellen und HEP-G2-Zellen unter keiner der Therapieformen signifikante Veränderungen der Antikörper-Aktivität am mAchR3 oder wesentliche Veränderungen der Antikörper-Prävalenz. Bei den weniger sensitiven Messungen mit CHO-Zellen ergab sich lediglich in der Gruppe der immunsupprimierten Patienten im Verlauf eine statistisch signifikante Zunahme der rezeptorinhibierenden Aktivität der Anti-mAchR3-Antikörper, in den übrigen beiden Gruppen ließen sich auch mit den CHO-Zellen keine signifikanten Veränderungen feststellen. Analog zu den für die Erkrankung pathognomonischen AMA scheinen damit auch die funktionellen Anti-mAchR3- Antikörper im Krankheitsverlauf wenig Dynamik bezüglich ihrer Prävalenz und Aktivität zu zeigen. Im 3H-Thymidin-Proliferations-Assay konnte hauptsächlich eine die Proliferation inhibierende Antikörperwirkung auf HEP-G2-Zellen gezeigt werden. Diese Zellen wurden durch die Antikörperfraktionen aller untersuchten Patientenseren in ihrer Proliferation gehemmt. Mit TFK-1-Zellen und CHO-Zellen war deutlich seltener eine Proliferationshemmung zu beobachten (3% bzw. 16%). Ob diese ebenfalls sehr organ- bzw. zellspezifisch die Proliferation inhibierende Wirkung durch Anti-mAchR3-Antikörper oder andere Antikörper aus den Seren der PBC- Patienten verursacht wurde, musste in dieser Arbeit offen bleiben. Im Krankheitsverlauf zeigte die proliferationsbeeinflussende Aktivität der Antikörper bei keiner Zelllinie und keiner Patientengruppe eine signifikante Veränderung. Angesichts der starken Zellspezifität der nachgewiesenen Antikörper könnten künftige Studien an aus Biopsiematerial von PBC-Patienten gewonnen Cholangiozyten und Hepatozyten helfen, die mögliche pathogenetische Bedeutung der Antikörper besser zu verstehen. Diese Studien sollten nach Möglichkeit auch erneute Verlaufsmessungen beinhalten, um zu überprüfen, ob sich die hier gewonnenen Erkenntnisse an diesen Zellen bestätigen lassen.

In verschiedenen Studien wurden Autoantikörper (AAK) gegen den muskarinischen Acetylcholin Rezeptor 3 (mAChR3) bei Patienten mit Sjögren Syndrom (SS) und primärer biliärer Cholangitis (PBC) beschrieben, und es wurde gezeigt, dass diese Antikörper den Rezeptor aktivieren oder inhibieren können, also funktionell aktiv sind. Diese Untersuchungen wurden insbesondere mit Epithelzellen der Speicheldrüsen durchgeführt. Ziel der vorliegenden Arbeit ist es, zu überprüfen, ob AAK gegen den mAChR3 auch bei Patienten mit anderen autoimmunen Lebererkrankungen, wie der primären sklerosierenden Cholangitis (PSC) und der autoimmunen Hepatitis (AIH), oder bei der Virushepatitis (VH) vorkommen, und ihre Wirkung auf die Rezeptorfunktionalität, Zellproliferation und Apoptosemechanismen von Cholangiozyten unter Verwendung der Zelllinie TFK-1, zu analysieren. Ferner sollte mittels Epitop-Mapping geklärt werden, ob es immundominante Epitope gibt, die von IgG und IgM mAChR3 AAK erkannt werden. Darüber hinaus wird der Einfluss des mAChR3 Antigens auf die humorale Immunantwort der Patientenlymphozyten untersucht. Insgesamt wurden 499 Probanden davon 142 PBC-, 50 PSC-, 44 AIH-, 50 VH-, 25 ALD-, 60 SS-Patienten und 129 gesunde Probanden mittels Lumineszenz Assay, Adsorptionstest, ELISA, Durchflusszytometrie, In-Cell Western und mittels 3H-Thymidin-Einbau getestet. In der Durchflusszytometrie haben ein Drittel der 38 PBC- und 74 % der 35 PSC-Patienten IgM-Antikörper gegen mAChR3-exprimierenden TFK-1-Zellen. IgG-Antikörper sind nicht nachweisbar. Immunglobuline (Ig) von 31 % der 142 PBC-, 14 % der 50 PSC- und 44 % der 43 AIH-Patienten stimulieren den mAChR3 auf 1*104 TFK-1-Zellen, haben aber keinen Effekt auf deren Proliferationsrate, Zytokinproduktion oder die Expression der Apoptose Proteine Bcl-2, Bax und Caspase-9. Bei Verwendung des rekombinanten mAChR3 Antigens zeigen Seren von Patienten mit SS, VH und alkohol-induzierte Lebererkrankungen (ALD) im ELISA eine verstärkte IgM-Reaktivität. IgG-Antikörper waren insbesondere bei Patienten mit AIH und SS kaum nachweisbar. IgG-AAK binden bevorzugt an den zweiten zytoplasmatischen und dritten extrazellulären Loop. mAChR3 AAK des IgM-Typus an die angrenzenden Transmembranregionen nach dem zytoplasmatischen Loop Nr.1, an die dritte extrazelluläre Schleife und das nachfolgende C-terminale Ende. Das mAChR3 Antigen aktiviert in vitro CD4+-Lymphozyten von 20 PBC-Patienten, aber inhibiert sowohl deren Th1- als auch deren Th2-Zytokinantwort. Bei 20 Patienten mit AIH führt es zu einer Aktivierung von CD4+- und CD8+-Lymphozyten, einer Stimulation ihrer Proliferation und einer Reduktion der IFN-γ- und IL-10 Produktion. Der Effekt des mAChR3 Antigens auf die PBMC von 20 PSC-Patienten ergibt bereits eine spontane Aktivierung von CD19+-Zellen sowie eine verstärkte IL-6- und verminderte IL-5-Sekretion. In dieser Arbeit wird erstmalig gezeigt, dass Antikörper gegen mACh3R-exprimierende TFK-1-Zellen in Seren von PBC-, PSC-, VH-Patienten aber auch von gesunden Probanden nachweisbar sind. Ig’s von PBC- und PSC-Patienten stimulieren aber spezifisch den mACh3R auf Cholangiozyten. Patienten- und Kontrollseren reagieren, abhängig vom IgG- und IgM-Antikörpertypus, mit unterschiedlichen mAChR3-Epitope Darüber hinaus führt die Inkubation von PBMC von PBC-, PSC- und AIH-Patienten mit dem mAChR3 Antigen in vitro zur Aktivierung unterschiedlicher Zellpopulationen mit Freisetzung verschiedener Zytokine.

Analyse von Anti-Topoisomerase I-Antikörpern und Evaluierung ihrer immundominanten Epitope bei Patienten mit diffus kutaner systemischer Sklerose vor und nach autologer hämatopoetischer Stammzelltransplantation bei 24 Patienten, die im Rahmen einer Studie im Uniklinikum Tübingen behandelt wurden. Korrelationen von Antikörperprävalenz und Höhe von Antikörpertitern. Es kam zu keiner relevanten Abnahme der Prävalenz unter der Therapie, jedoch signifikanter Reduktion der Antikörpertiter. Patienten mit schlechtem Ansprechen hatten vor der Therapie signifikant höhere Antikörpertiter.

Hintergrund: Das Vorkommen verschiedener Autoantikörper bei Patienten mit neuropsychiatrischem systemischem Lupus erythematosus (SLE) hat die Aufmerksamkeit auf einen Zusammenhang zwischen dem Auftreten spezifischer Antikörper und Beteiligung des Nervensystems gerichtet. Ziel der hier vorliegenden Arbeit ist die Untersuchung der Korrelation zwischen dem Auftreten von Autoantikörpern gegen zentrales Nervensystem (ZNS) und klinisch neuropsychiatrischer Manifestationen sowie die Charakterisierung möglicher ZNS-Antigene bei Patienten mit verschiedenen Kollagenerkrankungen, insbesondere unter Berücksichtigung des SLE. Material und Methoden: Seren von Patienten mit unterschiedlichen Erkrankungen wurden mit den Methoden Western Blot und ELISA untersucht. Von den 74 im Western Blot untersuchten Patienten entwickelten 16 eine zerebrale Manifestation im Verlauf und sechs Patienten wiesen zum Zeitpunkt der Untersuchung eine ZNS-Beteiligung auf. Als Antigene wurden ein 100.000 g Überstand (SN) aus Rinderhirn sowie ein in E.coli exprimiertes alpha-Tubulin verwendet. Zur Charakterisierung der Targetantigene wurden monoklonale Antikörper gegen alpha- und beta-Tubulin sowie gegen das Mikrotubuli-assoziierte-Protein 2 (MAP2) eingesetzt. Im ELISA wiesen von insgesamt 112 untersuchten Patienten 41 eine ZNS-Beteiligung zum Zeitpunkt der Untersuchung auf, ein Patient entwickelte eine ZNS-Manifestation im Verlauf. Ergebnisse: Seren von 57% der Patienten reagierten im Western Blot unter Verwendung des 100.000 g SN aus ZNS-Gewebe mit Determinanten mit einem MG von < 50 KD. Auf Höhe des rekomb. alpha-Tubulins (50 kD), zeigten 39% der Seren eine positive Reaktion. Seren von Patienten mit ZNS Manifestation im Verlauf reagierten zu 68,8 % positiv bei einem MG von < 50 kD und zu 37,5% positiv bei 50 kD. Von den Seren der Patienten mit bekannter ZNS Manifestation reagierten 50% bei einem MG von < 50 kD und nur 16,6 % zeigten Reaktionen bei 50 kD, d.h. auf Höhe des alpha-Tubulins. Des Weiteren traten bei 49% der Patienten Banden > 50 kD auf, v. a. bei ca. 66 und 97 kD, sowie gehäuft Reaktionen an der Stelle zwischen Trenn- und Sammelgel (MAP1/2). Seren von Patienten mit ZNS Manifestation im Verlauf reagierten zu 50% positiv bei einem MG > 50 kD. Von den Seren von Patienten mit bekannter ZNS-Manifestation reagierten 33,3% positiv bei einem Molekulargewicht von > 50 kD. Im ELISA reagierten Seren von 19 der 41 Patienten mit ZNS-Beteiligung (46%) mit der Bande 1 (Bereich MAP1/2), 16 (39%) mit der Bande 2 (97 kD) und 15 (37%) mit der Bande 3 (66 kD). Seren von Patienten ohne ZNS-Manifestation reagierten mit diesen Determinanten in 37%, 37% und 34%. Schlussfolgerung: Die in der vorliegenden Arbeit präsentierten Ergebnisse ergaben keine eindeutige Korrelation zwischen einer neuropsychiatrischen Manifestation einer Kollagenerkrankung und Antikörpern gegen ein bestimmtes Antigen aus ZNS-Gewebe, insbesondere auch die bisher beschriebenen Antigene MAP1/2 und alpha-Tubulin. Ihre Beteiligung an der Entstehung eines solchen Krankheitsbildes muss daher weiter offen bleiben. Es wurde aber wieder deutlich, dass bei Kollagenerkrankungen Antikörper gegen verschiedene neuronale Strukturen gebildet werden, deren bessere Charakterisierung zur Klärung beitragen könnte, wie diese Antikörper induziert werden und welche pathogenetische Bedeutung sie haben. Background: The presence of various autoantibodies in SLE patients with neuropsychiatric manifestations has focused attention on a relationship between the occurrence of specific antibodies and involvement of the nervous system. The aim of this work is to investigate the correlation between CNS autoantibodies and clinical onset of neuropsychiatric manifestations as well as characterization of possible CNS antigens in patients with various collagen diseases with special reference to SLE. Material and Methods: Sera from patients with various diseases were examined by Western blot and ELISA methods. Of the 74 patients studied by Western blotting 16 patients developed a cerebral manifestation in the course, six patients showed CNS involvement at the time of testing. As antigens a 100,000 g supernatant (SN) from bovine brain and an in E. coli expressed alpha-tubulin were used. For the characterization of the target antigens monoclonal antibodies against alpha- and beta-tubulin as well as microtubule-associated protein 2 (MAP2) were used. In ELISA 41 of a total of 112 examined patients showed a CNS involvement at the time of examination, one patient developed a CNS manifestation in the course. Results: In Western blot against the 100 000 g SN from CNS tissue most patients (57%) showed a reaction at a MW of < 50 KD. At the height of the recombinant alpha-tubulin 39% of the patients had a positive reaction. Patients with CNS manifestation in the course had a positive reaction from 68.8% at a MW of < 50 kD and 37.5% at 50 kD. Of the patients with known CNS manifestation 50% showed a positive reaction at a MW of < 50 kD, and only 16.6% showed a positive reaction at 50 kD, which is at the level of the alpha-tubulin. Furthermore there were positive bands at > 50 kD in 49% of the patients, especially around 66 and 97 kD, and heaped reactions at the interface between separating and stacking gel (MAP1/2). 50% of the patients with CNS manifestation in the course responded positively at a MW > 50 kD. In the group of patients with known CNS manifestation 33.3% reacted positively to a molecular weight > 50 kD. A total of 112 patients were tested by ELISA, CNS involvement was described in 41 patients. ELISA showed that 19 (46%) of these 41 patients with CNS involvement had antibodies against MAP1/2 (B1), 16 (39%) against B2 (97 kD) and 15 (37%) against B3 (66 kD). Sera from patients without CNS manifestation responded to these determinants in 37%, 37% and 34%. Conclusion: The results presented in this study showed no clear link between a neuropsychiatric manifestation of collagen disease and antibodies to a particular antigen from CNS tissue, in particular the previously described antigens MAP1 / 2 and alpha-tubulin. Their involvement in the emergence of such a disease must therefore remain open. However it became clear again that antibodies against different neural structures are formed in collagen diseases. Their better characterization could help to clarify how these antibodies are induced and what pathogenetic role they have.

Das Hauptaugenmerk dieser Arbeit ist auf die immundominanten Epitope der E2-Untereinheit der Pyruvatdehydrogenase (PDH-E2) gerichtet, die bei der primär biliären Zirrhose das Target der Anti-M2-Antikörper darstellt. Um die Reaktivitäten der PBC-Seren gegen verschiedene potentielle Epitope der PDH-E2 ermitteln zu können, wurde die komplette Länge der PDH-E2 Untereinheit in Form von 35 Peptiden synthetisiert. Jedes dieser linearen Proteine wies eine Länge von 25 Aminosäuren auf und überlappte mit den jeweils 8 Aminosäuren der beiden benachbarten synthetisierten Peptide. Daraufhin testeten wir diese Peptide mit Seren von 91 klinisch, serologisch und histologisch definierten PBC-Patienten, die zuvor ebenfalls auf ihre IgG- und IgM-Reaktivitäten gegen die Antigene M2 und M4 getestet wurden. Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen deutlich, dass das bedeutendste immundominante Epitop (G4-Peptid), das von den antimitochondrialen Autoimmunantikörpern (AMA) erkannt wird, sich in dem katalytisch aktiven Zentrum der PDH-E2 Untereinheit befindet. Ebenso wurde das bisher als immundominantes Epitop geltende Protein 167-184 der inneren Lipoyl-Domäne mit und ohne gebundenes Liponamid synthetisiert und mit denselben Seren der 91 AMA-positiven PBC-Patienten getestet. Jedoch blieb eine gesteigerte Reaktivität gegen die beiden Peptidvarianten aus. Des Weiteren wurden die PBC-Patienten nach komplementbindenden Antikörpern, Krankheitsverlauf, Art der medikamentösen Therapie und Lebertransplantation in verschiedene Gruppen eingeteilt. Anhand der Absorptionsmittelwerte wird ihr Verhalten im Verlauf und unter Therapie dargestellt. Die AMA-Reaktivitäten von Seren mit komplementbindenden Antikörpern und aktivem Krankheitsverlauf werden mit den Reaktivitäten gegen die 35 PDH-E2-Peptide korreliert. Auf diese Weise wurden die Auswirkungen der verschiedenen Therapien auf die AMA untersucht sowie nach Hinweisen für die Identität des M4-Antigens und für prognostisch wertvolle Marker geforscht. AIM: To search for further immunodominant peptides of the pyruvate dehydrogenase complex E2-component (PDC-E2) recognized by antimitochondrial antibodies (AMA) in primary biliary cirrhosis (PBC). METHODS: Sera from 95 patients with PBC were tested by enzyme-linked immunosorbent assay against 33 synthetic overlapping peptides (25 amino acids; aa) covering the entire length of the E2-subunit of PDC-E2. Furthermore, the inner lipoyl peptide 167-184 was used in an unlipoylated and a lipoylated form as well as coupled to ovalbumin. Sera from 11 AMA negative/ANA positive PBC patients, 63 patients with other liver disorders and 22 healthy blood donors served as controls. RESULTS: Of the 95 PBC-sera, 74% reacted with the peptide 475-499 and 58% with the peptide 407-431 located within the catalytic domain of PDC-E2. Patients with other disorders or healthy controls were positive in only up to 18%. Antibodies to the unlipoylated and lipoylated peptide 167-184 within the inner lipoyl domain were found in only 5% and 11% of the PBC sera, respectively; using ovalbumin-coupled peptides, the incidence increased up to 57% (unlipoylated form). CONCLUSION: Peptides within the catalytic site of PDC-E2 rather than the previously reported lipoyl binding peptide 167-184 may represent major immunodominant epitopes recognized by AMA in PBC.

Hintergrund: Autoantikörper spielen bei der Diagnostik und Klassifikation der autoimmunen Hepatitis (AIH) eine wichtige Rolle. Darüber hinaus wird über eine eventuelle Bedeutung von Autoantikörpern bei der Pathogenese der Erkrankung spekuliert. Bei der AIH Typ III kommen Autoantikörper gegen Leber-/Pankreas (LP)- bzw. ein lösliches Leber-Antigen (SLA) vor. Diese Autoantikörper sind krankheitsspezifisch und reagieren im Westernblot unter Verwendung eines 100 000g Überstandes aus Rattenleber mit einem 52 kDa Protein, das mittlerweile als UGA-Suppressor Transfer RNA (tRNA) assoziiertes Protein (tRNP(Ser)Sec) identifiziert wurde. Seren von Patienten mit AIH Typ III erkennen jedoch weitere Proteine, u.a. eine 48 kDa Determinante, die bisher nicht identifiziert werden konnten und auch mit Seren von Patienten beobachtet wurden, bei denen klinisch/histologisch die typische Konstellation einer AIH vorlag, die bisher bekannten relevanten Autoantikörper aber fehlten. Ziel der vorliegenden Arbeit war daher, diese Reaktionsmuster besser zu definieren und hinsichtlich ihrer Spezifität für eine AIH zu überprüfen. Methoden und Ergebnisse: Seren von 11 Patienten mit anti-LP/SLA positiver AIH III sowie von 27 Patienten mit klinisch/histologisch hochgradigem Verdacht auf AIH (n=27) und 58 Patienten mit AIH Typ I wurden im Westernblot gegen den 100 000g Überstand aus Rattenleber getestet. Als Kontrollgruppen dienten Seren von 6 Patienten mit primär-biliärer Zirrhose sowie von 35 Blutspendern. In Seren der AIH III-Patienten wurden neben Antikörpern gegen die LP/SLA-assoziierte 52kDa Determinante weitere Antikörper gegen 66, 60, 48 und 35 kDa-Proteine beobachtet. Weitere Aufreinigung über Sucrosedichtegradientenzentrifugation ergab eine Anreicherung der 66, 48 und 35 kDa Proteine in einer 1.14-Gradientenfraktion, die für weitere Untersuchungen eingesetzt wurde. 45% der Seren der AIH Typ III- Patienten und 81 % der Seren der Patienten mit v.a. AIH reagierten mit der 66 kDa Bande. Zusätzlich kamen bei diesen Patienten gehäuft Reaktionen im Bereich 48kDa (45% bzw. 37%) und 35 kDa (55% bzw. 37%) vor. Patienten mit AIH Typ I hatten Antikörper gegen das 66 kDa Protein in 9% und gegen das 35 kDa Protein in 3% der Fälle. Gesunde Kontrollen waren negativ; von den sechs PBC-Patienten hatten zwei (33%) Antikörper gegen die 66 und/oder die 48 bzw., 35 kDa-Determinante, und bei diesen Patienten bestand klinisch der Hinweis auf ein Überlappungssyndrom mit einer AIH. Um die Antigene besser zu charakterisieren, wurden die entsprechenden Proteinbanden aus den SDS-Gelen ausgeschnitten und einer massenspektrometrischen Analyse unterworfen. Ferner wurde das 66 kDa-Protein über Immunpräzipitation isoliert und ebenfalls der massenspektrometrischen Analyse zugeführt. Diese Untersuchungen führten aber bisher zu keinen aussagekräftigen Ergebnissen. Schlussfolgerung: Die in dieser Arbeit vorgelegten Ergebnisse zeigen, dass bei Patienten mit AIH Typ III weitere Antikörper vorkommen, die mit Proteinen bei 66, 48 und 35 kDa reagieren. Da dieselben Antikörper auch bei Patienten zu beobachten waren, bei denen der hochgradige Verdacht auf eine AIH bestand, jedoch alle bisher bekannten Autoantikörper negativ waren, könnte es sich um ‚neue’ Markerantikörper handeln, die die Definition einer weiteren Subgruppe von Patienten mit AIH erlauben und damit helfen, die serologische Diagnose der AIH zu verbessern. Die Identifizierung dieser Proteine auf molekularer Ebene steht jedoch noch aus. Background: Autoantibodies play in the diagnosis and classification of autoimmune hepatitis (AIH) an important role. In addition to that, there is speculation about a possible role of autoantibodies in the pathogenesis of the disease. In AIH type III autoantibodies against Liver-/pancreas (LP) - or a soluble liver antigen (SLA) occur. These autoantibodies are disease specific and react in Western blot using a 100 000g supernatant from rat liver with a 52 kDa protein, which is identified as a UGA-suppressor transfer RNA (tRNA)-associated protein (tRNP (Ser) Sec). Sera from patients with AIH type III however identify other proteins including a 48 kDa determinant in western blot. This determinant could not be identified yet and observed with sera from patients, with clinically / histologically typical constellation of AIH but without the previously known typical autoantibodies. The aim of this study was to define this new reaction patterns and to review their specificity for AIH. Methods and results: Sera from 11 patients with anti-LP/SLA positive AIH III and from 27 patients with clinically / histologically highly suspected AIH (n = 27) and 58 patients with AIH type I were tested in a Western blot against the 100 000g supernatant from rat liver. Sera from 6 patients with primary biliary cirrhosis, and 35 blood donors served as a control group. In sera of AIH-III patients were observed in addition to antibodies against the LP / SLA-associated 52kDa determinant, antibodies against 66, 60, 48 and 35 kDa proteins. Further purification on sucrose gradient centrifugation led an accumulation of the 66, 48 and 35 kDa proteins in a 1.14-gradient fraction, which was used for further investigations. 45% of the sera of AIH type III patients and 81% of the sera of patients with suspected AIH reacted with the 66 kDa band. Additionally to that we found in these patients frequently responses at 48kDa (45% or 37%) and 35 kDa (55% or 37%). Patients with AIH type I had antibodies against the 66 kDa protein in 9% and against the 35 kDa protein in 3% of cases. Healthy controls were negative. In the group of the six PBC patients two (33%) had antibodies against the 66 and / or 48 or 35 kDa determinant. In these two patients was clinically suspected an overlap syndrome with AIH. To characterize these antigens better, the corresponding protein bands from SDS gels cut out and subjected to mass spectrometric analysis. Furthermore, the 66 kDa protein was isolated by immunoprecipitation and also analysed with mass spectrometry. But this research led to so far to no meaningful results. Conclusion: This study shows that in patients with AIH type III further antibodies that react with proteins at 66, 48 and 35 kDa exist. The same antibodies were also seen in patients with a high suspicion of AIH, but with negative previously known autoantibodies. Therefore the described reactions could bee 'new' marker antibodies, which allow the definition of a new subgroup of patients with AIH. This could be helping to improve the serological diagnosis of AIH. The identification of these proteins on a molecular level is still pending.

Seit ihrer Entdeckung wecken Fullerene auf Grund ihrer chemischen Struktur große Hoffnungen. Zunehmend werden Fullerene besser verstanden und in der Medizin eingesetzt. Dabei können sie vielfältige Rollen einnehmen: Sei es als Transporter, als Verbindungsstück zwischen Medikament und Targeting-Protein, als Kontrastmittel oder als eigenständiges Medikament. Viele bisherige Studien schließen einen generell toxischen Effekt der Fullerene aus. Mehrere Studien beschreiben den Effekt von Fullerenen als Medikament oder als Kontrastmittel. Es gibt jedoch (außer den Zelltoxizitätsstudien) wenige Arbeiten, die sich mit der Interaktion dieser Stoffgruppe mit dem menschlichen Körper selbst beschäftigen. Für das Immunsystem gibt es nur vereinzelte Studien. Auf Grund der geringen Datenlage und der Erkenntnis, dass Fullerene Einfluss auf die angeborene Immunantwort zu haben scheinen, sowie der zunehmenden Anwendung im klinischen Sektor ist es von großer Wichtigkeit, den Einfluss der Fullerene auf den Körper und das Immunsystem besser zu verstehen. In diesem Kontext untersuchte die vorliegende Arbeit den Einfluss von zwei Vertretern der Fullerene (Polyhydroxy-C60 und N-ethyl-polyamin-C60) auf das Immunsystem. Dazu wurden die PBM Zellen aus dem Blut von 20 gesunden Probanden isoliert und kultiviert. In einem in-vitro Testsystem wurde der Einfluss der Fullerene auf diese Zellen getestet. Verschiedene Antigene (BCG, Tetanus Toxin und PPD) stimulierten die PBM Zellen zu unterschiedlichen Immunreaktionen vom TH1-oder TH2-Typ, um mögliche Effekte der Fullerene auch im aktivierten Immunsystem zu klassifizieren. Die Fullerene wurden in unterschiedlichen Konzentrationen zugeführt. Untersucht wurde damit der Einfluss der Fullerene auf die Proliferation von PBM Zellen, die Zytokinproduktion an Hand von IL-1, IL-5, IL-6, IL-10, IL-13, IFN-gamma, TNF-alpha, TNF-beta, GM-CSF mittels Sandwich-ELISA und die frühe Aktivierung der Immunzellen an Hand der CD69-Expression mittels Durchflusszytometrie. Es konnte gezeigt werden, dass die zwei Fullerene die Proliferation von PBMC stimulieren. Eine verstärkte CD69-Expression fand sich aber nur auf NK-Zellen. Auch auf die Produktion T-Zell-assoziierter Zytokine hatten sie keinen Einfluss, während sie die Sekretion von IL-6 signifikant verstärkten. Zusammenfassend können wir sagen, dass die getesteten Fullerene keinen immunsuppressiven Effekt haben und nicht zelltoxisch sind und insbesondere Zellen des spezifischen Immunsystems nicht wesentlich beeinflussen. Dagegen weisen die Befunde durchaus auf eine Aktivierung von Zellen des angeborenen Immunsystems hin (z.B. NK-Zellen). Since the discovery of fullerenes, there are great expectations because of their chemical structure. We get to know more and more about fullerenes and they are more often used in medicine. For example as transporter, as connector between drug and targeting-protein, as contrast agent or as standalone drug. Many studies show no general toxic effect of fullerenes. Some studies describe the effects of fullerenes as drug or contrast agent. There are few studies (except the cell toxicity studies) that deal with the interaction of this element group and the human body itself. Because of the few data and the fact, that fullerenes seem to have an effect on the unspecific immune response, as well as the upcoming use in medicine, it is very important to understand the influence of fullerenes on the human body and the immune system. In this work we studied two fullerenes named Polyhydroxy-C60 and N-ethyl-polyamin-C60 and their influence on the immune system. Therefore PBM-cells were isolated and cultivated from the blood of 20 healthy donors. We checked the influence of fullerenes on the PBM-cells in an in-vitro system. Different antigens (BCG, tetanus toxin and PPD) were used to provoke different immune responses (TH1- or TH2-typ), to classify possible effects of fullerenes in different situations of an immune response. The fullerenes were added in different concentrations. We investigated the influence of the fullerenes on the proliferation of PBM-cells, the cytokine production (IL-1, IL-5, IL-6, IL-10, IL-13, IFN-gamma, TNF-alpha, TNF-beta, GM-CSF via sandwich-ELISA) and the early activation of immune cells by CD69 expression with flow cytometry. We could show an increased proliferation of PBM-cells through the used fullerenes. An increased CD69 expression was only found on natural killer cells. There was no influence of the production of t-cell-associated cytokines, but the secretion of IL-6 was significantly increased. In summary, the used fullerenes do not suppress the immune system and show no cytotoxicity. They especially don’t affect specific/adaptive immune cells. But our data shows definitely an activation of innate immune cells like natural killer cells.

Das Medikament Umckaloabo (Eps®7630) stellt einen ethanolischen Auszug aus den Wurzeln von Pelargonium sidoides und P. reniforme dar, einer südafrikanischen Geranienart, die in der dortigen traditionellen Medizin zur Behandlung von Infektionskrankheiten eingesetzt wird. Es ist in Deutschland zur Behandlung von Bronchitiden zugelassen. Chemische Analysen des Pflanzenauszuges ergaben ein großes Spektrum an Polyphenolen. In bisherigen experimentellen Studien wurde bei Zugabe von Umckaloabo u.a eine erhöhte IFN-gamma-Synthese in virusinfizierten Zellen nachgewiesen sowie eine Aktivierung von Zellen des angeborenen Immunsystems einhergehend mit einer Freisetzung von TNF-alpha, IL-1, IL-12, Il-18 und IFN-alpha/gamma und Stickoxiden. Ziel der vorliegenden Arbeit war daher, die Wirkung von Umckaloabo auf Zellen des erworbenen Immunsystems in vitro zu analysieren mittels PBMC (peripheral blood mononuclear cells) von insgesamt 20 gesunden Probanden. Durch kostimulierende Antigene (BCG, purified protein derivative [PPD] und Tetanus-Toxoid [TT]) wurden TH1- bzw. TH2-Immunreaktionen provoziert und der Einfluss von Umckaloabo in unterschiedlichen Konzentrationen innerhalb dieses in-vitro-Testsystems untersucht. Zum Einsatz kamen Proliferationsassays, Methoden zur quantitativen Zytokinbestimmung mittels Sandwich-ELISA, sowie durchflusszytometri¬sche Detektionsmethoden zum Nachweis verschiedener Zelloberflächenmoleküle (CD3, CD4, CD8, CD19, CD45, CD56) sowie des frühen Aktivierungsmarkers CD69 und der Expression des für regulatorische T-Zellen (Treg) charakteristischen intrazellulären Proteins Foxp3. Umckaloabo führte in Konzentrationen von 1 bis 1000 µg/ml zu einer signifikanten Steigerung der Proliferation von Lymphozyten: Ohne Kostimulation und bei Kostimulation mit PPD um den Faktor 10, bei Kostimulation mit TT um den Faktor 2. Durchflusszytometrisch konnte gezeigt werden, dass insbesondere die CD4-positiven T-Helferzellen zunahmen, etwas weniger auch die CD8-positiven zytotoxischen T- bzw. CD56-positiven natürlichen Killer (NK)-Zellen. CD19-positive B-Zellen wurden dagegen kaum beeinflusst. In einer Konzentration von 10 µg/ml führte Umckaloabo zu einem signifikanten Anstieg der Expression von CD69, d.h. einer Aktivierung dieser Zellsubpopulationen. Die Analyse der Zytokinproduktion ergab, dass die für Makrophagen typischen Zytokine wie IL-1, IL-6 und TNF-alpha bei 10 µg/ml signifikant anstiegen, ebenso bei Kostimulation durch PPD oder TT. Die Ausschüttung von TNF-alpha bei Kostimulation mit TT wurde bei 10 µg/ml signifikant gehemmt, die von IFN-gamma signifikant gesteigert. Die durch TT induzierte Produktion der TH2-typischen Zytokine IL-5 und IL-13 wurde durch Umckaloabo bei 1 µg/ml signifikant gehemmt. Die Ausschüttung von IL-10 durch Umckaloabo wurde bei 1 µg/ml signifikant gesteigert, ebenso bei Kostimulation mit PPD, während die IL-10-Spiegel bei den starken Kostimuli TT bzw, BCG durch Zugabe von Umckaloabo nicht verändert wurden. Die durchflusszytometrische Analyse der regulatorischen T-Zellen ergab eine deutliche Zunahme des Anteils an Treg innerhalb der Population der CD4-positiven Zellen bei Zugabe von Umckaloabo, die in schwächerer Ausprägung auch bei Kostimulation mit TT bzw. PPD zu sehen war. Zusammenfassend konnten die angeführten experimentellen Untersuchungen zeigen, dass Umckaloabo in einem in-vitro-System komplexe Wirkungen auf PBMC hat. Es führt in erster Linie zu einer Aktivierung von Makrophagen, TH1-Zellen und NK-Zellen, während TH2-Reaktionen inhibiert werden. Darauf könnte durchaus der in vivo beschriebene positive Effekt bei Infektionskrankheiten zurückzuführen sein. Ferner scheint die Substanz Treg zu aktivieren, was möglicherweise erklärt, dass das Medikament nur in seltenen Fällen zu Überreaktionen führt. Die vorliegende Arbeit ist somit ein Beitrag, den bisher nur empirisch belegten immunstimulierenden Einsatz von Umckaloabo wissenschaftlich zu untermauern, macht aber auch weiteren Forschungsbedarf deutlich. Anzustreben sind insbesondere eine Zuordnung der immunologischen Effekte zu bestimmten Komponenten des Extraktes sowie prospektive Studien unter Einnahme von Umckaloabo. Ectracts of the Geraniacea Pelargonium sidoides have been traditionally used for the treatment of respiratory tract infections in southern Africa. Nowadays, the modern equivalent termed Eps®7630 (trademark: Umckaloabo), an ethanolic extract of the roots of the plant is succesfully used in phytotherapy. Numerous clinical studies have provided evidence of the beneficial effects of Eps®7630 therapy in patients afflicted with bronchitis, sinusitis and rhinopharyngitis but the molecular mechanisms that provide these effects are not yet known. Therefore it is promising that Eps®7630 alone as well as several of its major constituents could be recently shown to have effects on innate immunity in vitro, e.g. they enhanced the release of TNF-alpha and iNO in Leishmania-infected macrophages. Therefore, aim of this project was to study the influence of Eps®7630 in adaptive immune responses in vitro by means of FACS, proliferation and cytokine assays. PBMC of 20 healthy donors were isolated and cultivated with different concentrations of Umckaloabo. Addition of different antigen stimuli (BCG, PPD and tetanus toxoid) provocated different immunologic reactions (TH1 respectively TH2). In these in-vitro studies we could show that addition of Umckaloabo in concentrations from 1µg/ml up to 1000 µg/ml significantly enhanced proliferation of different kinds of lymphocytes, especially of CD-4 positive cells and Treg -cells. Analysis of cytokines showed a significantly enhanced secretion of IL-1, IL-6, TNF-alpha and IL-10. We could prove that Umckaloabo does not only influence the innate immune system but also influences lymphocytes by different mechanisms. Enhancing of TH1 reactions could be a possible mechanism of antiviral effects of Umckaloabo.

Hintergrund: Antimitochondriale Antikörper (AMA), insbesondere Anti-M2, gelten als pathognomonisch für die primär-biliäre Zirrhose (PBC). In der vorliegenden Arbeit werden neue mitochondriale Antigen-Antikörpersysteme vorgestellt, die bei Patienten mit klinisch/ histologisch hochgradigem Verdacht auf PBC und positiven AMA aber negativen Befunden für Anti-M2 zu beobachten waren. Methoden und Ergebnisse: Es wurden 73 Anti-M2 negative Seren von Patienten mit PBC, 22 Anti-M2 positive Seren, insgesamt 88 Seren von Patienten mit anderen Autoimmun- oder Lebererkrankungen sowie 30 Seren von gesunden Blutspendern untersucht. Vierzehn von 43 (33%) Anti-M2 negativen Seren von Patienten mit PBC, die im Westernblot gegen einen 100 000g Überstand von submitochondrialen Partikeln aus Rinderherz getestet wurden, reagierten mit einer Determinante bei 60 kD, die sich in der Saccharose-Dichtegradientenzentrifugation bei 1,18-1,20 anreichern ließ. Nach Isolierung durch Elektoelution aus dem Gel konnten in dieser Bande mittels massenspektrometrischer Analysen F1-ATPase und Komplex III der mitochondrialen Atmungskette identifiziert werden. Von den Seren der Vergleichsgruppen reagierten auch 70% der Anti-M2 positiven Seren mit der 60 kD Bande. Seren von gesunden Probanden und Patienten mit anderen Erkrankungen waren dagegen vollständig negativ. Schlussfolgerung: Die hier vorgelegten Untersuchungen lassen darauf schließen, dass es bei der PBC neben den Anti-M2 Antikörpern weitere spezifische antimito-chondriale Antikörper gibt, die bisher allerdings ausschließlich im IFT und Westernblot nachgewiesen werden können. Diese Befunde tragen einerseits zur Verbesserung der serologischen Diagnostik bei, könnten aber auch neue Aspekte zur Aufklärung der Ätiopathogenese dieser chronischen Erkrankung eröffnen. Background: Antimitochondrial antibodies (AMA), especially anti-M2, are considered to be pathognomonic for primary biliary cirrhosis (PBC). In this work new mitochondrial antigen-antibody-systems are described which could be found in the sera of patients with clinically/ histologically defined PBC and presence of AMA in IFT but no reaction with the PBC-specific M2-antigen in ELISA and Western blotting. Methods and results: 73 anti-M2 negative sera from patients with PBC, 22 anti-M2 positive sera from patients with PBC and all together 88 sera from patients with other autoimmune diseases or diseases of the liver, as well as 30 sera of healthy donors have been investigated. Fourteen of 43 (33%) anti-M2 negative sera from patients with PBC which had been tested against a 100 000 g supernatant of submitochondrial particels from beef heart (BH SMP SN) recognized an antigen of 60 kd. This antigen could be enriched by Sucrose Density Gradient Centrifugation at 1,18-1,20. After isolation by electroelution out of stainded polyacrylamid gels, in this 60 kd band F1-ATPase and complex III of the mitochondrial electron transport chain could be identified by mass spectrometry (MALDI-TOF). In the control groups, 70 % of anti-M2 positive sera reacted as well with the 60 kd antigen, however none of the sera from healthy donors and patients with other diseases than PBC recognized the antigen. Conclusion: These results suggest additional specific antimitochondrial antibodies other than anti-M2 antibodies in patients with PBC. These antibodies have been shown so far exclusively in IFT and Western blotting. Recognition of these antibodies may improve serologic diagnosis of PBC in the future as well as clarify the ethiopathogenetic understanding of this chronic disease.

Aprotinin wird sowohl in systemischer Applikationsform als auch lokal als Bestandteil von Fibrinklebern zur perioperativen Blutungsverringerung angewendet. Als Fremdantigen kann es das Immunsystem sensibilisieren und bei Reexposition anaphylaktische Nebenwirkungen verursachen. Die vorliegende Arbeit sollte die zelluläre Immunreaktion bei Patienten untersuchen, die Aprotinin erst- und einmalig in systemischer, lokaler oder kombinierter Applikationsform erhielten. Es wurde die Proliferation der aus peripherem Patientenblut gewonnenen Lymphozyten mit dem Antigen Aprotinin im Lymphozytenproliferationstest (LTT) bestimmt, und zwar vor Exposition sowie eine, vier und zwölf Wochen nach Exposition. Desweiteren wurden die Zytokine IL-1, IL-6, TNF-a, IL-4, IL-5, IL10, IL-12, g-IFN und GM-CSF in den Überständen der Lymphozytenkulturen und in den Patientenseren mittels ELISA sowie die Expression der Zytokin mRNA in den Lymphozyten mittels PCR bestimmt. Die Lymphozytenproliferation zeigte unabhängig vom Applikationsmodus in allen drei Gruppen beginnend 4 Wochen nach Exposition eine Sensibilisierung des Immunsystems. Die Zytokinspiegel in Überständen in Aprotininstimulierten Lymphozyten nach ein- und erstmaliger Gabe veränderten sich in den drei Gruppen im Verlauf nicht signifikant, IL-6 und IL-10 wurden allerdings auffällig häufig produziert. Eine eindeutige Zuordnung der Immunantwort zu Typ1- bzw. Typ2-Reaktion ließ sich nicht nachweisen. In Einzelfällen scheint Aprotinin aber Typ2-Reaktionen (IL-5) zu stimulieren. Die Zytokine in den Patientenseren zeigten keine wesentlichen Veränderungen. Diese Daten zeigen, daß Aprotinin immunkompetente Zellen und insbesondere TH1/Typ1- bzw. TH2/Typ2-Reaktionen in der Gesamtheit nicht signifikant beeinflußt, aber in Einzelfällen eine TH2-Antwort induzieren kann. Dazu würde passen, daß zwar gelegentlich Nebenwirkungsreaktionen in Form von anaphylaktischen Reaktionen auftreten, diese jedoch im Hinblick auf die häufige Applikation von Aprotinin doch sehr selten sind. Dennoch sollte, wie bereits von anderen Autoren gefordert, eine eventuelle frühere Aprotiningabe sorgfältig evaluiert werden. Eine mögliche Reexposition sollte nur unter strenger Indikationsstellung und unter Anaphylaxieprophylaxe erfolgen. Aprotinin, a well-known protease-inhibitor, is applied systemically and locally as fibrin sealant to decrease peri-operative bleeding. As foreign antigen it can sensitize the immune system and cause anaphylactic reactions. Therefore, the present study was designed to examine the cellular immune reaction in patients having received Aprotinin for the first time and uniquely either systemically, locally or both. The lymphocyte proliferation in response to the antigen Aprotinin was determined in the lymphocyte transformation test (LTT) before as well as one, four and twelve weeks after exposition. Furthermore, the production of the cytokines IL-1, IL-6, TNF-a, IL-4, IL-5, IL-10, IL-12, g-IFN and GM-CSF in lymphocyte culture and in patients' sera was determined on protein level by ELISA as well as on mRNA level by RT-PCR. Lymphocyte proliferation showed independently of the application mode in all three groups (Aprotinin application locally, systemically or both) a sensitization of the immune system beginning four weeks after exposition. The cytokine levels in culture supernatants of aprotinin-stimulated lymphocytes after the first and unique application did not show significant alterations. However, IL-6 and IL-10 were remarkably frequently produced. A clear subclassification of the immune response into Th1/type1- and /or Th2/type2-reaction on the basis of the cytokine patterns could not be done. However, in individual cases Aprotinin preferentially seemed to induce type2-reactions which could be seen at the increased IL-5 production. The cytokines in the patients' sera did not show any substantial changes. These data indicate that Aprotinin does not significantly affect immune-competent cells and in particular Th1/type1 and/or Th2/type2- reactions. However, in individual cases a Th2/type2-reaction can be induced, an observation which goes in line with the fact that some but very few patients show occasional side effects in form of anaphylactic reactions. Nevertheless, in view of the broad and frequent applications of Aprotinin these side effects are very rare. Yet, the earlier exposition to Aprotinin, as already demanded by other authers, should be evaluated carefully. A possible reexposition should take place under strict observation and accompanied by prophylactic means against anaphylactic reactions.

Der Verlauf von Eosinophilen Leukozyten im Blut und Anti-ML-1-IgG-Subklassen über 24 Monate wurde im Sinne einer retrospektiven Anwendungsbeobachtung bei Mammakarzinom-Patientinnen einer onkologischen Schwerpunktpraxis untersucht, die sich erstmals einer Behandlung mit dem Mistelpräparat ABNOBAviscum Mali (R) unterzogen. Zielsetzung der Untersuchung ist die Bereitstellung eines größeren Datenmaterials dieser Verlaufsparameter und eine Auswertung unter explorativen Gesichtspunkten. Im Verlauf der 24-monatigen Behandlung bildeten alle Patientinnen IgG-Antikörper gegen ML-1. Der individuelle Verlauf der IgG-Subklassenmuster erwies sich als ausgesprochen vielgestaltig und korrelierte nicht mit anderen Patienten- oder Verlaufscharakteristika. Die Bildung von Antikörpern der Subklassen 1 und 3 ging zeitlich der Subklasse 4 voran, die Subklasse 2 wurde nur bei 18 % der Patientinnen gebildet und nahm im Verlauf der Behandlung wieder ab. In einer logarithmischen Modellrechnung nahm sowohl der Titer für IgG1 wie für die IgG4 vom 3. zum 24. Monat signifikant zu. Auch die (nicht logarithmischen) Titer-Mittelwerte der Subklassen 1 und 4 sowie der Subklassen 2 und 4 sowie 2 und 3 waren signikant positiv korreliert (p< 0,01). Keine signifikante Korrelation bestand zu den Eosinophilen. Die Eosinophilenzahlen waren sowohl 1 Monat wie auch 24 Monate nach Behandlungsbeginn signifikant erhöht. Trotz der hohen Immunogenität des verwendeten Mistelextraktes zeigt sich eine gute Verträglichkeit ohne schwerwiegende Nebenwirkungen. Die Untersuchung bestätigt die vorbeschriebene hohe Penetranz einer frühen Eosinophilie und einer Anti-ML1-IgG-Bildung unter Behandlung mit VAE. Das zur Zeit der höchsten Eosinophilie noch seltene Auftreten lektinspezischen IgG und das im Verlauf der Antikörperbildung eher späte Auftreten von solchen der Subklasse 2 und 4 unterstützt die Annahme, dass die Eosinophilie durch das Vielstoffgemisch des VAE über das unspezifische Immunsystem getriggert wird. Verwendet man die Subklassenverteilung als Surrogatmarker für die Typ1/Typ2-Polarisierung des Immunsystems so entwickelt sich während einer 24monatigen Behandlung mit VAE eine parallele Stimulation beider Wege. Weitere Untersuchungen sind erforderlich, um den Stellenwert von Eosinophilie und Anti-ML1-IgG-Bildung in der Behandlung mit VAE zu erhellen. Eosinophilic leukocytes and mistletoe-lectin specific anti-ML-1-IgG subclasses were monitored in breast cancer patients during 24 months of treatment with a mistletoe extract (ABNOBAviscum Mali (R)) in an ambulatory oncologic setting and evaluated retrospectively. The aim is to provide a pool of data on these parameters and perform an explorative analysis. During 24 months of treatment, all patients developed IgG antibodies against mistletoe lectin I (ML-1). The individual patterns of IgG-subclass distribution were highly variable and did not correlate with other parameters. The production of IgG1 and IgG3 began earlier than that of IgG4. IgG2 reached a maximum prevalence of only 18% and declined later. In a logarithmic model, the titer of IgG1and IgG4 increased significantly between the month 3 and month 24. A significant positive correlation was found for the non-logarithmic mean of IgG1 with IgG4, IgG2 with IgG4 and IgG2 with IgG3 (p< 0,01). No significant correlation of IgG-subclass levels existed with eosinophils. The eosinophils themselves where significantly elevated in month 1 and month 24. Despite of a high immunogenic potential of the used mistletoe extract, no severe adverse reactions were observed. This study underlines the earlier described high potency of mistletoe extracts to induce anti-ML1-IgG and elevations in eosinophilic counts. Given the fact that the eosinophily occurs much earlier in the treatment course than the subsequent conversion for IgG2 and IgG4 antibodies, it is assumed that eosinophily is triggered by mechanisms of the unspecific immune system in response to mistletoe components. When using the IgG-subclass distribution to estimate the polarisation of the immune response to mistletoe, a co-stimulation of both Typ-1- and Typ-2- paths is observed within 24 months of treatment with mistletoe extracts. Further studies are needed to examine the significance of eosinophily and anti-ML1-IgG production during treatment with mistletoe extracts.

In der vorliegenden Arbeit wurden verschiedene Verfahren zum Nachweis von Anti-Neutrophil-Cytoplasmic Antibodies (ANCA) verglichen und die Prävalenz dieser Antikörper bei verschiedenen Erkrankungen (autoimmune Lebererkrankungen, Vaskulitiden) sowie ihre Assoziation mit anderen serologischen Markern untersucht. Für den Immunfluoreszenztest (IFL) wurden Objektträger mit Granulozyten von 10 verschiedenen Spendern angefertigt und ausgetestet; ferner wurden unterschiedliche Fixationsmethoden (Äthanol vs. Methanol und Formalin) untersucht. Die Patientenseren wurden zusätzlich im ELISA und Westernblot gegen Granulozyten getestet. Nur von zwei der getesteten zehn Spender konnten Granulozyten isoliert werden, die sich zum Nachweis von ANCA im Immunfluoreszenztest (IFL) eigneten. Fixation mit Methanol führte zu reproduzierbareren Ergebnissen als die mit Äthanol oder Formaldehyd. ANCA mit einem perinukleären Fluoreszenzmuster (pANCA) waren vor allem bei Patienten mit primär sklerosierender Cholangitis (PSC), autoimmuner Hepatitis (AIH), chronisch entzündlichen Darmerkrankungen und Vaskulitiden nachweisbar, ein zytoplasmatisches Fluoreszenzmuster (cANCA) war in erster Linie bei Patienten mit primär-biliärer Zirrhose und M. Wegener zu beobachten. Unter standardisierten Testbedingungen, lag bei der PSC die Prävalenz der ANCA bei 79%, bei der AIH bei 73%, bei Patienten mit chronisch entzündlichen Darmerkrankungen bei 56%(M. Crohn) bzw. 86% (Kolitis ulcerosa). 87% der PBC Patienten waren AMA positiv, 40% von ihnen zeigten ein cANCA Muster. Bei diesen Patienten waren IgM- und Gesamtbilirubinspiegel signifikant häufiger erhöht als bei ANCA negativen. Der ELISA mit Granulozyten eignete sich nicht zur Detektion von ANCA. Bei der Untersuchung von Patientenseren mit dem Westernblot konnten zwei Determinanten bei 35 und 95kD identifiziert werden, mit denen spezifische Seren von Patienten mit PSC und Kolitis ulcerosa reagierten. Diese Befunde machen einerseits die Problematik in der Standardisierung des Nachweises von ANCA deutlich, belegen aber andererseits, dass mit Hilfe eines gut etablierten Testsystems der Nachweis von p- oder cANCA einen sinnvollen Parameter in der Diagnostik nicht nur der Vaskulitiden sondern auch der autoimmunen Lebererkrankungen darstellt. Der Nachweis identischer Determinanten mit Westernblot bei Patienten mit PSC und Kolitis ulcerosa weist auf einen gemeinsamen Antigenkomplex und damit möglicherweise einen gemeinsamen pathogenetischen Mechanismus bei beiden Krankheitsbildern hin. Der Nachweis von ANCA mit einem atypischen zytoplasmatischen Muster bei Patienten mit PBC die nicht mit den bekannten AMA-Spezifitäten zu korrelieren scheinen, könnte auf einen weiteren zytoplasmatischen Antigen/Antikörperkomplex bei dieser Erkrankung hinweisen, der möglicherweise mit der Krankheitsaktivität korreliert. Eine weitere Identifizierung der Targetantigene von ANCA wäre daher ein wichtiger Schritt in der Einordnung ihrer diagnostischen und ätiopathogenetischen Relevanz. In the following study, several different methods for the detection of anti-neutrophil-cytoplasmic antibodies (ANCA) were compared with each other and the prevalence of these antibodies in various diseases (autoimmune liver diseases, vasculitis) as well as their association with other serological markers was examined. Microslides with granulocytes from 10 different persons were made and tested with the immunofluorescence test (IFL); furthermore, different methods of fixation (ethanol vs. methanol and formalin) were examined. The patient’s serums were further tested in ELISA and Western blot for granulocytes. Granulocytes could only be isolated in two of the ten donors, which were then suitable for the detection of ANCA in the immunofluoresence test (IFL). Fixation with methonal produced more reiterable results than fixation with ethanol or formaldehyde. ANCA with a perinuclear fluorescent pattern (pANCA) were observed mostly in patients with primary sclerosing cholangitis (PSC), autoimmune hepatitis, inflammatory bowel diseases, and vasculitis; a cytoplasmic fluorescent pattern (cANCA) was observed primarily in patients with primary-biliariy cirrhosis and Wegener’s granulomatosis. Under standardised test conditions, the prevalence of ANCA in PSC stood at 79%, in AIH at 73%, and in patients with inflammatory bowel diseases at 56% and 86% for Crohn’s disease and ulcerative colitis respectively. 87% of the PBC patients were AMA-positive; 40% showed a cANCA pattern. These patients had a significant, more frequently heightened IgM and total bilirubin level than those patients who were ANCA-negative. The ELISA with granulocytes was not suitable for the detection of ANCA. In the examination of patient serums with Western blot, two determinants were identified at 35 and 95kD that reacted with specific serums from patients with PSC and ulcerative colitis. These results demonstrated on the one hand the problems associated with the standardisation of the detection of ANCA, however, on the other hand, these results verify that, with the help of a well established test system, the detection of pANCA or cANCA offers a useful parameter in the diagnosis not only of vasculitis but also of autoimmune liver diseases. The detection of identical determinants with Western blot in patients with PSC and ulcerative colitis indicates an antigen complex common to both, and therefore potentially indicates a pathogenetic mechanism common to both illnesses. The detection of ANCA with an atypical cytoplasmic pattern in patients with PBC that do not appear to correlate with known AMA-specificities could indicate an additional cytoplasmic antigen/antibody complex in connection with this illness that possibly correlates with illness activity. A further identification of the target antigen of ANCA would therefore be an important step towards the classification of its diagnostic and aetiopathogenetic relevance.