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T-Zell-basierte Immuntherapien wie bispezifische Antikörper haben die Behandlung von Tumorerkrankungen revolutioniert. Trotz ihres unbestrittenen Erfolgs bei der Behandlung hämatologischer Erkrankungen ist ihre Wirksamkeit bei soliden Tumoren stark limitiert. B7-H3 wird bei verschiedenen Tumorarten sowohl auf Tumorzellen als auch auf Tumorgefäßen überexprimiert. Im ersten Teil der vorliegenden Arbeit wird die Entwicklung eines optimierten bispezifischen B7 H3xCD3 Antikörpers (CC-3) zur Behandlung von kolorektalen Karzinomen beschrieben. Es konnte gezeigt werden, dass das Targeting eines membranständigen B7-H3-Epitops eine 100-fache Reduzierung der CD3 Affinität ermöglicht. Funktionelle Analysen zeigten die Überlegenheit unseres finalen Konstruktes CC-3 in Hinblick auf Tumorzelllyse sowie T-Zell-Aktivierung, Proliferation und Gedächtnisbildung, während die unerwünschte Freisetzung von proinflammatorischen Zytokinen durch die verringerte CD3-Affinität reduziert wurde. Im zweiten Teil der vorliegenden Arbeit wurde CC-3 bei Pankreas-, Leber- und Magenkarzinomen präklinisch charakterisiert. Funktionelle Analysen zeigten, dass CC-3 auch in diesen Entitäten eine starke T-Zell-Reaktivität auslöste, was in einer ausgeprägten Tumorzelllyse resultierte. Neben der eingeschränkten Wirksamkeit in soliden Tumoren wird die Effizienz bispezifischer Antikörper generell durch verschiedene Mechanismen der Tumor-Immunevasion beeinträchtigt. Es ist bekannt, dass Thrombozyten die Invasion, Metastasierung und Immunevasion eines Tumors fördern. Der Einfluss von Thrombozyten auf die Wirksamkeit von Immuntherapien insbesondere mit bispezifischen Antikörpern war jedoch weitgehend ungeklärt. Im letzten Teil dieser Arbeit wurde untersucht, ob und inwiefern Thrombozyten einen Einfluss auf die Wirksamkeit bispezifischer Antikörpern haben. Im Rahmen einer multizentrischen Phase-I-Studie (NCT04104607) zeigten Prostatakarzinom-Patienten, welche mit unserem bispezifischen PSMAxCD3 Antikörper CC-1 behandelt wurden, eine behandlungsbedingte Thrombozytenaktivierung und vorübergehende Thrombozytopenie. In vitro Analysen zeigten, dass die Antikörper-induzierte T-Zell-Reaktivität durch aktivierte Thrombozyten signifikant reduziert wird. Die Reduktion der durch bispezfische Antikörper vermittelten T-Zell-Reaktivität konnte durch eine pharmakologische Thrombozytenhemmung und insbesondere Blockierung der TGF-β-Achse verhindert werden. Zusammengefasst bilden die präklinischen Untersuchungen mit dem optimierten B7-H3xCD3 Antikörper CC-3 eine wesentlich Grundlage für dessen klinische Entwicklung. Die Ergebnisse des dritten Teils zeigen, dass Thrombozyten die therapeutische Wirksamkeit von bispezifischen Antikörpern beeinträchtigen können, und dass eine Modulation der Thrombozytenfunktion den Behandlungserfolg verbessern könnte.

Die Tumornekrosefaktor (TNF)/TNF-Rezeptor (TNFR)-Familienmitglieder receptor activator of nuclear factor (NF)-κB (RANK) und sein Ligand (RANKL) spielen eine Schlüsselrolle im Knochenmetabolismus. RANK ist auf Progenitoren der Osteoklasten exprimiert und kann RANKL binden, der in membrangebundener Form auf Osteoblasten exprimiert ist und von deren Oberfläche abgespalten wird. Interaktion von RANK und RANKL führt zur Differenzierung der Progenitoren in aktive Osteoklasten, welche folglich Knochensubstanz resorbieren. Neben seiner Bedeutung im Knochenstoffwechsel konnte für das RANK/RANKL-Molekülsystem mittlerweile zudem eine Involvierung bei verschiedenen anderen zellulären Funktionen einschließlich der Pathophysiologie von Tumorerkrankungen nachgewiesen werden. Basierend auf vorliegenden Daten und Erkenntnissen wurde in dieser Arbeit die Rolle von RANK und seinem Liganden bei der Metastasierung von soliden Tumoren am Beispiel des Mamma- und kolorektalen Karzinoms untersucht. Metastasierte Tumore stellen eine große therapeutische Herausforderung dar und sind häufig mit einer schlechten Prognose und einem geringen Überleben der Patienten verbunden. Metastasierende Tumorzellen weisen die Fähigkeit auf, sich aus dem Primärtumorherd kommend über den Blutkreislauf im Körper auszubreiten und so in entfernten Organen Sekundärherde zu bilden. Mittlerweile ist bekannt, dass Thrombozyten eine wichtige Rolle bei der Metastasierung spielen: Sie bilden mit im Blutkreislauf zirkulierenden Tumorzellen Aggregate, werden dabei aktiviert, setzen Wachstumsfaktoren frei, begünstigen die Transmigration und Extravasation von Tumorzellen und induzieren einen mit der Metastasierung assoziierten mesenchymalen Phänotyp. In dieser Doktorarbeit konnte gezeigt werden, dass RANKL auf Thrombozyten von Patienten mit Mamma- und kolorektalem Karzinom exprimiert ist und durch Aktivierung der Thrombozyten hochreguliert wird. Thrombozytärer RANKL wird von RANK gebunden, welcher weiter auf Natürlichen Killer (NK)-Zellen der Patienten nachgewiesen werden konnte. Die Interaktion von aus Thrombozyten stammendem RANKL mit auf NK-Zellen exprimiertem RANK führt schließlich zu einer Inhibition der NK-Zell-vermittelten Immunreaktion gegen die Tumorzellen, und durch Blockade der Interaktion mit dem RANKL-neutralisierenden Antikörper Denosumab kann die NK-Zell-Reaktivität deutlich verstärkt werden. Zu den Herausforderungen bei der Tumortherapie zählt neben metastasierten Erkrankungen auch Therapieresistenz. Letztere resultiert häufig in Rückfällen, was insbesondere bei der akuten myeloischen Leukämie (AML) häufig zu beobachten ist. Die AML ist die häufigste akute Leukämie bei Erwachsenen. Obwohl sich die Behandlungsmöglichkeiten in den letzten Jahren verbessert haben, bleibt die Prognose von AML-Patienten schlecht. Ein besseres Verständnis der molekularen Mechanismen, welche in der AML pathophysiologisch relevant sind, ist daher wichtig, um die Wirksamkeit von Behandlungen vorherzusagen und idealerweise den Therapieerfolg zu verbessern. In dieser Arbeit konnte RANK als Regulator von Resistenzmechanismen von AML-Zellen gegen konventionelle Chemotherapeutika identifiziert werden. Auf der Oberfläche der leukämischen Zellen von AML-Patienten wurde eine substantielle Expression von RANK detektiert. Eine Stimulation von RANK führte zu einer Resistenz der AML-Zellen gegenüber den in der AML-Therapie zentralen Chemotherapeutika Doxorubicin und Cytarabin. Zudem konnte ein signifikanter Zusammenhang zwischen der RANK-Expression und dem Krankheitsverlauf der in diese ex vivo Studie aufgenommenen Patienten festgestellt und somit RANK als potenzieller prognostischer Marker in der AML charakterisiert werden. Zusammenfassend wurde in dieser Dissertation gezeigt, dass das RANK/RANKL-Molekülsystem als Target dienen könnte, um eine Metastasierung bei soliden Tumoren zu verhindern sowie bei der AML eine Sensibilisierung der leukämischen Zellen gegenüber Chemotherapeutika zu erreichen und dadurch das Therapieansprechen und den Erfolg einer Behandlung positiv zu beeinflussen. Basierend auf den Ergebnissen dieser Doktorarbeit erscheinen weitere Untersuchungen gerechtfertigt, um die hier dargestellten Daten zu validieren und letztlich eine breite Basis für eine Modulation von RANK und RANKL für die Tumortherapie zu schaffen. Zukünftige Studien sollten dabei insbesondere auf die Möglichkeit fokussieren, die RANK/RANKL-Interaktion z.B. durch drug repurposing des klinisch verfügbaren neutralisierenden Antikörpers Denosumab zu durchbrechen.

In den letzten Jahren wurden große Fortschritte in der Therapie des NSCLC erreicht. Es besteht weiterhin bei geringer Gesamtüberlebenszeit und hoher Inzidenz ein dringlicher Bedarf weitere Therapien zu etablieren. Weitere Therapien werden durch Therapieansätze im Rahmen der personalisierten Medizin ermöglicht und Vakzinierungen stellen ein hohes Potenzial für gut verträgliche Therapien dar. In der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass gerade für die genaue Auswahl von Peptiden beziehungsweise ihren Quellproteinen eine auf die Ligandomanalyse aufbauende Analyse betroffener Signaltransduktionswege ein hohes Selektionspotenzial bietet. So konnten aus den vorher diskutierten tumorspezifischen Quellproteinen durch Ausschluss zugeordneter bekannter Signaltransduktionswege Quellproteine mit hohem Potenzial wie PRAME oder MAGEA3/6 isoliert werden. Zusätzlich konnten weitere Quellproteine mit noch unbekanntem Potenzial wie TMEM39A oder CRISPLD2 für weitere Untersuchungen selektioniert werden. Klare klinische Korrelationen zur Eingrenzung des diagnostischen Aufwandes ließen sich in der aktuellen Kohorte nicht nachweisen, was am ehesten auf die geringe Kohortengröße zurückzuführen ist. Jedoch konnte an verschiedenen Quellproteinen gezeigt werden, dass durch die Überexpression im untersuchten Ligandom eine Repräsentanz bekannter Assoziationen zu Überexpressionen oder diskutierten Biomarkern gegeben ist. Zusätzlich konnte belegt werden, dass die teilweise kritisch betrachtete semiquantitative Analyse hoch- oder herunterregulierter Quellproteine mittels anschließender Analyse der Signaltransduktionswege das Potenzial bietet, neue Ansatzpunkte für Therapien zu finden. In diesem Fall scheint bei deutlicher Überexpression im Falle mehrerer Probanden ein Therapieversuch mit PI3K/Akt-Inhibitoren diskussionswürdig. Da bis dato dies nur bei mutiertem PI3K durchgeführt wird, sollte im Rahmen weitergehender Untersuchungen auch eine Korrelation zu Mutationen oder eine unabhängige PI3K-Überregulierung untersucht werden.

Dissertation ist gesperrt bis zum 18.07.2023 !! Senescence induction is becoming a relevant strategy in tumour treatment. Besides induction with therapeutic compounds (TIS – therapy induced senescence) senescence can be induced in tumor cells in vitro and in vivo via cytokine (IFN-γ & TNF) or TH1 cell treatment (CIS – cytokine induced senescence). Here, vulnerabilities acquired by senescence induction in β-cancer cells were investigated. While most CIS cancer cells remain viable, cease proliferation, and show SA-beta Gal activity, the cells also accumulate features associated with early apoptotic events. The cells lose their original membrane composition indicated by an increased surface localization of negatively charged phospholipids. This is accompanied by reduced mitochondrial membrane potential (Δψm) as well as changes in opening of the mitochondrial permeability transition pore (PTP), without changes in mitochondrial mass. This in turn compromises the retention of cytochrome c, leading to a depletion of overall cytochrome c protein. While caspase 3 activity in CIS cancer cells is enhanced in comparison to non-senescent cancer cells, it was suspected that increased levels of anti-apoptotic protein Bcl-2 in CIS counteracts death induction in favor of senescence. Indeed, treatment of CIS cancer cells with ABT263 (pan-Bcl-2 inhibitor) induced apoptosis preferentially in senescent cancer cells. Furthermore, the changes in cellular status after senescence induction lifted the resistance of cancer cells to TRAIL induced cell death. This thesis shows that CIS and TIS β-cell tumour cells are susceptible to TRAIL induced cell death in comparison to non-senescent β-cell tumour cells. Further analysis showed that apoptosis induction in senescent cancer cells was a prerequisite to render β-cell cancer cells susceptible to phagocytosis by macrophages. Therefore, type I anti-cancer immune response can act as a relay between inducing a stable growth arrest in cancer cells and senescent cancer cell clearance by macrophages exploiting the acquired sensitivity to TRAIL of senescent cancer cells. Overall, introduction of senescence followed by secondary apoptosis induction may prove to be a relevant therapeutic strategy. The findings may be a first step in understanding new mechanisms in cancer immune therapy with the goal to clear senescent tumour cells.

The epigenetic code is modulated through writers, readers and erasers, which add, interpret and remove post-translational modifications on DNA and histones, respectively. However, while this process is essential to regulate gene expression and adapt to environmental influences, it is also exploited by cancer cells to enhance expression of oncogenes or silence transcription of tumor suppressors. BET proteins are epigenetic readers, which bind to acetylated lysine residues on histones and modulate transcription of target genes including the oncogene MYC. BET-inhibitors displace BET proteins from the chromatin and thereby suppress transcription of target genes. However, the complete catalogue of BET targets is still unknown and the function of BET-inhibitors especially on immune cells is under high debate showing immune suppressive and activating capabilities. In this thesis, the effect of the small molecule BET-inhibitor RG6146 was elucidated by assessing potential resistance mechanisms of Multiple Myeloma cell lines in vitro. Different hypothesis including overexpression of MYC, modulation of proteins of the intrinsic apoptosis pathway and presence of the export transporter ABCB1 were assessed in sensitive and resistant cell lines. While the effect of BET-inhibitors on cancer cells has been the main focus of research studies thus far, only little is known on the function of BET-inhibitors on immune cells. Therefore, one part of this research also focused on discovering the effect of RG6146 on CD4+ and CD8+ T cell activation using various in vitro assays. While T cell proliferation was strongly suppressed at early time points, longer treatment with RG6146 even enhanced cell division. The main part of this thesis describes the effect of BET-inhibitors in the interface between immune and cancer cells. RG6146 and structurally distinct BET-inhibitors were shown to sensitize cancer cells to TNF induced cell death by modulating pro-survival proteins of the NF-kB pathway thereby enhancing cell death in combination with a T cell bispecific antibody in vitro and in vivo. This thesis in collaboration with other research works is the basis for future potential combination strategies of BET-inhibitors with small molecules or immunotherapy.

In dieser Arbeit wurde der Einfluss der zytokininduzierten Seneszenz (CIS) auf die genetische Integrität untersucht und wie die Signalübertragung der CIS auf molekularer Ebene erfolgt. Im ersten Teil der Arbeit wurde der Frage nachgegangen, ob die Einleitung der CIS zu Veränderungen in den Chromosomenaberrationen führt, welche die Malignität der Tumorzellen verstärken könnte. Dazu wurden verschiedene murine RT2 und RT2xStat1-/- Krebszelllinien mit den Th1 Zytokinen (IFNγ und TNF) behandelt und untersucht, ob die Chromosomenaberrationen der Tumorzelllinien durch diese Behandlung verändert werden. Zu diesem Zweck wurde das genetische Material der Zellen vor Beginn des Experiments und nach 96 h Behandlung mit Medium oder Th1 Zytokinen unter Verwendung der CGH untersucht. Die Ergebnisse der Experimente zeigen, dass es sich bei den primären RT2 Krebszelllinien um eine heterogene Population handelt. Wenn zum Zeitpunkt der Untersuchung bereits ein Gleichgewicht zwischen den Subpopulationen vorliegt, führt eine Th1-Zytokinbehandlung nicht zu einer Veränderung der Chromosomenaberrationen. Dies gilt sowohl für RT2 als auch für RT2xStat1-/- Krebszelllinien. Wenn das Gleichgewicht zum Zeitpunkt des Experiments jedoch noch nicht hergestellt ist, können nach der CIS Induktion Veränderungen der Chromosomenaberrationen auftreten. Dies führte zu einer spezifischen Selektion von einer Chromosom 4 bzw. Cdkn2a deletierten Subpopulation der RT2 Krebszelllinie 3. Ein in vivo Transfer dieser Zelllinie (nachfolgend als mSc bezeichnet) mit anschließender Immuncheckpointtherapie (ICB) zeigte, dass das Wachstum dieser Zellen nicht mehr durch die ICB gestoppt werden konnte. Eine nachfolgende CGH Analyse der verschiedenen mSc ergab, dass die Zellen einen punktuellen Verlust des Cdkn2a Genes aufweisen. Eine anschließende in vitro Th1-Zytokinbehandlung bewies, dass die Zellen nicht mehr auf die CIS ansprechen konnten. Zusammenfassend konnte gezeigt werden, dass die Behandlung mit den Th1 Zytokinen die Selektion von Chromosomenaberrationen innerhalb einer heterogenen Zellpopulation beeinflussen kann. Darüber hinaus wurde gezeigt, dass das Fehlen von Cdkn2a die Induktion von CIS verhindert. Die Induktion der CIS ist als mögliche Behandlungsoption für unzugängliche oder metastasierte Krebsarten besonders interessant, weil sie zu einem p16INK4a-abhängigen Wachstumsstopp fuhrt. Da TNF aufgrund seiner zytotoxischen Wirkung nicht systemisch verabreicht werden kann, ist die Identifizierung des Signalweges entscheidend, um eine TNF-unabhängige Aktivierung des TNF-Signalweges zu induzieren. Deshalb wurde untersucht, wie die p16INK4a Expression nach IFNγ- und TNF-Stimulation eingeleitet wird. Ein möglicher Kandidat für die Signaltransduktion ist der AP-1 Transkriptionsfaktor JunB. Wie in den Experimenten gezeigt wurde, wird die JunB Expression in der CIS induziert. Diese JunB Expression ist TNF abhängig. Weitere Untersuchungen zeigten, dass die TNF-abhängige Induktion von JunB durch NF-κB vermittelt wird. Es wurden verschiedene Techniken zur Herunterregulierung bzw. zum knockout von JunB eingesetzt. Dies wurde, so die Hypothese, zu einer reduzierten p16INK4a Expression führen, welche die Induktion von CIS verhindert. Trotz einer reduzierten JunB Expression konnte in keinem der Ansätze die Einleitung der CIS verhindern werden. Es bleibt unklar, ob die verbleibende Menge an JunB ausreicht, um eine p16INK4a Expression zu induzieren, oder ob andere Transkriptionsfaktoren an der p16INK4a Induktion in der CIS beteiligt sind. In this work, the effect of cytokine-induced senescence (CIS) on genetic integrity and the way signal transduction of CIS occurs at the molecular level was studied. In the first part, the question was addressed whether the initiation of CIS leads to changes in chromosomal aberrations which might increase the malignancy of tumor cells. Therefore, different murine RIP1-Tag2 (RT2) and RIP1-Tag2 x signal transducer and activator of transcription 1-/- (RT2xStat1-/-) cancer cell lines were treated with the CD4+ T-helper cell 1 (Th1) cytokines interferon gamma (IFNγ) and tumor necrosis factor (TNF) and it was investigated whether the chromosomal aberrations of the tumor cell lines were changed by this treatment. For this purpose, the genetic material of these cells was examined before starting the experiment, and after 96 h treatment with medium or Th1 cytokines using array comparative genomic hybridization (CGH). The results of the experiments show that primary RT2 cancer cell lines are a heterogeneous population. If an equilibrium between the subpopulations has already been established at the time of the investigation, Th1 cytokine treatment does not alter chromosomal aberrations. This applies to both RT2 and RT2xStat1-/- cancer cell lines. However, if the equilibrium has not been established at the time of the experiment, changes in chromosomal aberrations may occur after CIS induction. This phenomenon appeared in RT2 cancer cell line 3, which resulted in a specific selection of chromosome 4 and, respectively, cyclin-dependent kinase inhibitor 2A (Cdkn2a) loss subpopulation. An in vivo transfer of this cell line (referred to as mouse subcutaneous cell line (mSc)) with subsequent immune checkpoint blockade (ICB) treatment showed that these cells can no longer respond to ICB. A subsequent CGH analysis of the different mSc revealed that the cells have a selective Cdkn2a loss. A subsequent in vitro Th1 cytokine treatment proved that the cells could no longer respond to CIS. In summary, it was demonstrated that the treatment with the Th1 cytokines could alter the selection of chromosomal aberrations within a heterogeneous cell population. Moreover, it was shown that the absence of Cdkn2a prevents CIS induction. The induction of CIS is particularly interesting as a potential treatment option for inaccessible or metastasized cancers, as it leads to cyclin-dependent kinase inhibitor 2A (p16INK4a)-dependent growth arrest. Since TNF cannot be administered systemically due to its cytotoxic effect, identification of the signaling pathway is crucial to induce TNF-independent activation of the TNF signaling pathway. Therefore, it was investigated how p16INK4a expression is induced after IFNγ and TNF stimulation. A possible candidate for signal transduction is the activator protein 1 (AP-1) transcription factor JunB proto-oncogene (JunB). As shown in the experiments, JunB expression is induced in CIS. This JunB expression is TNF-dependent. Further investigations showed that the TNF-dependent induction of JunB expression is mediated by nuclear factor kappalight-chain-enhancer of activated B-cells (NF-κB). Different techniques were used to downregulate or knockout JunB. According to the hypothesis, this would lead to a reduced p16INK4a expression, which prevents the induction of CIS. Despite a reduced JunB expression, none of the approaches could prevent the induction of CIS. It remains unclear whether the remaining quantity of JunB is sufficient to induce a p16INK4a expression or whether other transcription factors are involved in the p16INK4a induction.

Die Vakzinierung mit Peptiden, die von tumorassoziierten oder -spezifischen Antigenen entstammen, welche eine Art der Immuntherapie darstellt, verfolgt das Ziel, eine spezifische, gegen den Tumor gerichtete Immunantwort zu induzieren, oder eine vorhandene Immunantwort zu verstärken. Das Ziel der Arbeit war, zu untersuchen, ob solch eine Aktivierung des Immunsystems im Rahmen einer klinischen Phase I/II Peptid-Vakzinierungs-Studie bei Prostatakarzinom (PCa)- Patienten vorliegt. Die Patienten wurden wiederholt mit einem der RhoC Zielstruktur entstammenden synthetischen langen Peptid (SLP, 20 Aminosäuren), welches potentiell CD8 und CD4 Zellen aktivieren kann, zusammen mit Montanide ISA-51 vakziniert. Eine Vakzine-spezifische Immunantwort konnte in 86% der Patienten nachgewiesen werden, welche mindestens noch zehn Monate nach der letzten Vakzinierung nachweisbar war. Die Vakzin-spezifischen Zellen waren überwiegend multifunktionale CD4 Zellen, die einen Effektor-Gedächtnis-T-Zellen Phänotypen aufwiesen. Insgesamt konnten drei promiskuitiv präsentierte humane Leukozytenantigen (HLA)-Klasse II Peptide nachgewiesen werden. Die aktivierten CD4 Zellen zeigten auch nach wiederholten Vakzinierungen keinen Phänotypen der Exhaustion. Eine zusätzliche Vakzin-spezifische CD8 Zell Antwort, die durch HLA-B*27:05 restringiert war, konnte bei einem Patienten nachgewiesen werden. Die Untersuchung zeigt, dass das RhoC-entstammende Vakzin-Peptid immunogen ist und eine langanhaltende Immunantwort in einer Vielzahl von Patienten hervorruft. Der zweite Teil der Arbeit befasst sich mit den technischen Aspekten die zur Durchführung der hier präsentierten klinischen Studie wichtig sind. Zuerst werden in einem Review die gebräuchlichsten Methoden zum Nachweis von Antigen-spezifischen T Zellen in der experimentellen Immuntherapie, neben einer neu etablierten Methode zur Identifizierung von Antigen-spezifischen CD8 Zellen, erläutert. Methoden, die mitunter beschrieben werden, werden in der Folge für den Nachweis von Antigen-spezifischen CD8 und CD4 Zellen mit Hilfe von SLPs eingesetzt, dessen Protokolloptimierung danach beschrieben wird. Wir zeigen, dass der Einsatz von Poly-ICLC (Hiltonol®), ein Toll-ähnlicher Rezeptor 3 Agonist, sowie eine erhöhte SLP Konzentration führte zu einem verbesserten Nachweis von Peptid-spezifischen Zellen. Das optimierte Protokoll findet sein Einsatzgebiet nicht nur im Monitoring von klinischen Studien, sondern zum Beispiel auch in der Identifizierung von Epitopen. Vaccination with peptides derived from tumor-associated or -specific antigens is a form of immunotherapy that specifically induces or reactivates T cell immune response to fight cancer. The aim of the present work was to assess the immune responses in prostate cancer (PCa) patients upon peptide vaccination in a clinical phase I/II study. PCa patients were repeatedly vaccinated with a RhoC-derived synthetic long peptide (SLP, 20 amino acids), which potentially activates CD8 and CD4 cells, emulsified in Montanide ISA-51. An immune response was detected in 86% of the patients after vaccination, which lasts at least ten months after the last vaccination. Vaccine-specific T cells were mainly poly-functional CD4 cells of the effector memory T cell phenotype. In total, three promiscuously presented human leucocyte antigen (HLA)-class II peptides were identified. No exhausted T cell phenotype was observed after multiple vaccinations. For one patient, a vaccine-directed CD8 cell response restricted by HLA-B*27:05 was detected in addition to the CD4 cell response. In conclusion, the RhoC-derived peptide is immunogenic and induces a long-lasting immune response in the majority of patients. The second part of the thesis deals with technical aspects that are important for the presented clinical study. First, the common methods for the monitoring of clinical studies are described in a review, besides a newly established method for the identification of antigen-specific CD8 T cells. Methods that are described in this review are used for the identification of antigen-specific CD8 and CD4 cells using SLPs, which protocol optimization is described afterwards. We showed that the addition of Poly-ICLC (Hiltonol®), a toll-like receptor 3 agonist, together with an increased SLP concentration, lead to an optimized identification of peptide-specific cells. The optimized protocol could be used for the monitoring of clinical studies, as well as for the identification of epitopes, for example.

Die chronische lymphatische Leukämie (CLL) stellt die häufigste Leukämie in der westlichen Hemisphäre dar. In den vergangen Jahren gelang zwar die kontinuierliche Verbesserung der Therapie, indem die herkömmliche Chemotherapie durch neue Ansätze (wie monoklonale Antikörper und verschiedene Inhibitoren) ergänzt wurde. Allerdings ist durch hohe Rezidiv Raten noch immer meist keine vollständige Heilung möglich. Um nun Mechanismen der CLL-Pathogenese und mögliche Grundlagen für weitere Therapieoptionen zu evaluieren, fokussiert sich diese Arbeit auf die Untersuchung der Rolle der beiden Proteine NFAT2 und LCK in der CLL. Ein entscheidender Faktor hierbei ist eine bestimmte Unempfindlichkeit gegenüber B-Zell-Rezeptor-Stimulation, genannt Anergie. Die Untersuchungen wurden dabei hauptsächlich im TCL1-Mausmodell der CLL durchgeführt. Mittels des TCL1-Modells konnten wir eine Anergie-Gen-Signatur bestehend aus Cbl-b, Egr2, Grail und Lck identifizieren, welche abhängig vom B-Zell-Rezeptor- und NFAT-Signaling ist. Durch den Knockout von NFAT2 im TCL1-Modell konnten wir außerdem demonstrieren, dass die Expression einiger regulatorischer Gene (Cdkn2a und Trp53) durch den Verlust von NFAT2 reduziert ist. Ebenso ist die Expression von Chemokin-Rezeptoren, die eine wichtige Rolle in der CLL spielen, verändert. Des Weiteren gelang der Nachweis von LCK als direktem NFAT2-Zielgen in primären Patientenproben. Außerdem konnten wir zeigen, dass LCK in anergen CLL-Zellen mit dem B-Zell-Rezeptor interagiert. Um daraufhin die Bedeutung von NFAT2 und LCK in der CLL weiter zu untersuchen, wurden diese Gene im TCL1-Modell ausgeknockt. Dabei zeigte sich durch den Verlust von NFAT2 und LCK ein verringertes Überleben. Allerdings kann im Falle des Verlusts von LCK die CLL nicht als alleinige Todesursache in Betracht gezogen werden. Des Weiteren zeigten sich im Falle der Deletion von LCK zwar Hinweise, aber keine eindeutigen Belege für eine Transformation der CLL. Durch die Deletion von LCK zeigten sich zudem zwar veränderte Zellzyklus- und Apoptoseraten, welche sich aber nicht als signifikant darstellten. Abschließende Untersuchungen der Expression wichtiger Anergie-Marker (Prdm1 und IgM) sowie der Ca2+ Mobilisation belegten jedoch den Verlust der Anergie durch den Verlust von NFAT2 und LCK. Durch diese Ergebnisse wurden NFAT2 und LCK als entscheidende Faktoren in der Anergie von CLL-Zellen identifiziert. Die Modulation der NFAT2-LCK-Achse könnte daher neue Therapieoptionen eröffnen.

Viral vector-based vaccines are promising to elicit strong cellular and humoral immune responses. Within the genus Parapoxvirus of the Poxviridae, the Orf Virus (ORFV) strain D1701-V comprises various properties particularly favorable for the development of a vector platform technology and was shown to facilitate various vaccination approaches. To enhance viral vectors’ immunogenicity, current strategies implement the use of immunomodulatory elements and the elimination of viral immunomodulatory genes still present in the viral genome. To allow the insertion of multiple transgenes into a single vector, the present work examines the suitability of novel insertion sites for transgene expression by simultaneous deletion of ORFV D1701-V encoded genes non-essential for viral replication. Novel D1701-V deletion mutants were subjected to detailed characterization of the genetic stability of inserted transgenes, their growth behavior and capability to induce transgene expression in different target cells in vitro. Additionally, the D1701-V mutants’ immunogenicity was analyzed by their ability to activate pro-inflammatory pathways, peripheral blood mononuclear and antigen presenting cells, or to induce antigen-specific immune responses in vitro and in vivo. Additionally, proof-of-concept studies were performed to evaluate the suitability of ORFV D1701-V recombinants for the expression of immune checkpoint inhibitors (ICIs).

In den letzten Jahrzehnten hat sich die Therapie und Prognose einiger Krebsformen durch die Anwendung von chimärisierten und humanisierten Antikörpern deutlich verbessert. Allerdings ist der therapeutische Erfolg solcher Substanzen, vor allem bei soliden Tumoren, bis heute begrenzt. Um die Antikörpertherapie von Tumoren zu optimieren, können verschiedene Strategien angewendet werden. Eine Möglichkeit ist die Entwicklung von bispezifischen Antikörperkonstrukten. Diese Konstrukte können simultan an zwei unterschiedliche Antigene binden, wobei das eine auf der Oberfläche von Tumorzellen und das andere auf Immunzellen exprimiert wird. Der Vorteil solcher Antikörper ist, dass über die Bindung an Oberflächenantigene auch Effektorzellen aktiviert werden, die keine Fc Rezeptoren tragen und deshalb von monospezifischen Antikörpern nicht rekrutiert werden können. An erster Stelle sind hier T-Zellen zu nennen, welche die Fähigkeit haben nach Aktivierung in vivo stark zu proliferieren und effektiv Tumorzellen bekämpfen zu können. Jedoch kann eine überschießende Reaktion des T-Zellsystems auch zu schweren Nebenwirkungen führen, was durch Auswahl optimierter Konstrukte vermieden werden kann. Die vorliegende Arbeit beschreibt die Generierung und Charakterisierung von neuen Antikörpern zur Optimierung sowohl der Effektor- als auch der Zielzellseite von bispezifischen Antikörperkonstrukten. Um die Zielzellseite zu verbessern, wurden neue Antikörper gegen die tumorassoziierten Antigene PSMA und CDCP1 generiert, wobei die α-CDCP1 Antikörper nur initial charakterisiert wurden, da die Rolle des Moleküls (CDCP1) bei der Metastasierung in neuen Arbeiten zwar bestätigt wurde, seine Spezifität für Tumorzellen aber limitiert ist. Die gleichzeitig stromale und neovaskuläre Expression von PSMA sollte zu einer gezielten Lyse des Tumorendothels führen und verbessert dadurch den Einstrom von Immunzellen, wodurch die anti-tumorale Wirkung des bispezifischen Konstrukts zusätzlich verstärkt wird. Der mittels konventioneller Hybridomatechnologie neu generierte α-PSMA Antikörper 10B3 wurde näher charakterisiert und ist dem „benchmark“ Antikörper J591 insofern überlegen als er einen verminderten Antigenshift, stärkere Färbung der tumorassoziierten Gefäße und eine erweiterte Reaktivität mit Plattenepithelkarzinomen aufweist. Mit der humanisierten Form des 10B3-Antikörpers wurden bispezifische Antikörperkonstrukte zur Rekrutierung von T-Zellen (via CD3) in unterschiedlichen Formaten (IgGsc und Fabsc) generiert. Dabei konnte festgestellt werden, dass das tetravalente IgGsc-Format dem bivalenten Fabsc-Format, hinsichtlich einer verringerten off-target Aktivierung und verlängerter Serumhalbwertszeit, überlegen war. Mit diesem Molekül wurde deshalb ein humanisiertes bispezifisches Antikörperkonstrukt generiert (IgGsc PSMAxCD3), welches für eine GMP-konforme Produktion und eine klinische Phase I Studie vorgesehen ist. Darüber hinaus wurden in dieser Arbeit Antikörper gegen den γδ-T-Zellrezeptor generiert und in vitro charakterisiert. Ziel war es durch bispezifische Antikörper γδ-T-Zellen, eine effiziente T-Zellsubpopulation, zu rekrutieren und so eine überschießende T-Zellaktivierung zu verhindern. Die generierten bispezifischen Konstrukte waren in der Lage γδ-T-Zellen effizient gegen Tumorzellen zu rekrutieren.

Die Tendenz im zunehmenden Alter an Osteoporose zu erkranken steigt jährlich in den entwickelten Ländern und führt zu enormen Kosten im Gesundheitswesen. Deshalb ist es notwendig den Auslöser einer solchen Erkrankung ausfindig zu machen und ein neues Verständnis auf zellbiologischer Ebene zu bekommen um pharmakologisch entgegen zu wirken. Im Knochenmark können mesenchymale Stromazellen (MSC) sowohl zu Adipozyten als auch zu Osteoblasten differenzieren. Beim Altern ist die Verminderung der Knochendichte mit einer Reduzierung der Osteoblasten und einer Zunahme der Adipozyten im Knochenmark assoziiert. Dabei kontrollieren Integrine die Interaktion der Zellen mit der Matrix. Dies wird durch eine Reihe weiterer Moleküle, wie die beiden RhoGTPasen Cdc42 und Rac1, moduliert. Ziel dieser Arbeit ist, die Integrin-Matrix-Interaktion bei der Differenzierung der MSCs zu Adipozyten oder Osteoblasten im Knochenmark zu charakterisieren und die Rolle der beiden RhoGTPasen Cdc42 und Rac1 hierbei zu untersuchen.

One percent of the world population suffers from the neurodevelopmental disorder schizophrenia. During the last years, above hundreds of risk genes and functional changes in glutamatergic, GABAergic and dopaminergic signalling have been identified. Furthermore, prenatal complications increase the risk to develop schizophrenia. First symptoms occur between puberty and early adolescence and are divided into positive, negative and cognitive symptoms. Until today no suitable cellular test system has been developed to study the disease background and treatment opportunities. The development of iPSC technology enables the investigation of schizophrenia related changes based on patient-derived cells. In this thesis, fibroblast derived from healthy and disease individuals were reprogrammed into iPSC and further differentiated into cortical neurons. Each developmental step starting as iPSC and resulting as neurons showed the same morphological properties independent from the donor. Despite these similarities changes in early neurodevelopmental processes were observed in iPSC-derived neurons from patients with schizophrenia. The neurite outgrowth, the PSD95 cluster density and the calcium flux were reduced in case of schizophrenia. Transcriptome analysis revealed changes in gene expression related to gene of neuronal development, synapse, calcium signalling and immune response. In increased expression of MHCII related genes was measured via transcriptome analysis and immunocytochemical staining in cells from patients witch schizophrenia. Additionally, the effect of the antipsychotics clozapine, haloperidol and olanzapine as well as the mimetic peptides narpin, neurexide and FN4-NF3 on neurite outgrowth were investigated. A significantly reduced neurite outgrowth was observed in iPSC-derived neurons from CTR 1 after treatment with haloperidol or olanzapine. Above mentioned characteristics of cortical neurons cells exhibited similarities to previously described primary cells from patients with schizophrenia. Based on these findings iPSC-derived neurons could be used as test system for basic research and for the development of new therapeutical approaches for neurodevelopmental diseases like schizophrenia.

Bispezifische T-Zell-rekrutierende Antikörper-Konstrukte, auch BiTE Antikörper-Konstrukte (BiTE AKs) genannt (von bispecific T cell engaging antibody constructs), konnten in klinischen Studien bereits erfolgreich zur Behandlung verschiedener Formen von Krebs eingesetzt wer-den. Sie besitzen zwei Bindungsstellen mit unterschiedlichen Spezifitäten und binden so zum einen spezifisch an ein bestimmtes Protein auf der Oberfläche von Zielzellen, zum anderen an CD3ε, welches auf der Oberfläche aller T-Zellen vorkommt. Durch die so zustande kom-mende enge Bindung von T-Zellen an Zielzellen kommt es zur Ausbildung immunologischer Synapsen und zur Lyse der Zielzellen. In dieser Arbeit wurden auf der Grundlage muriner Antikörper-Spezifitäten BiTE AKs generiert, deren Zielprotein-bindende Anteile die Extrazel-lulär-Domäne des Influenza A-Matrixproteins 2 (M2e) oder das Cytomegalovirus Glykopro-tein B (gB) binden. Es konnte gezeigt werden, dass diese BiTE AKs in der Lage sind, die spezi-fische Lyse von Zellen zu vermitteln, die diese Proteine auf der Oberfläche tragen. Um BiTE AKs zu erhalten, deren M2e- bzw. gB-bindende Anteile eine Aminosäuresequenz aufweisen, die eine hohe Ähnlichkeit zur humanen Keimbahnsequenz, und dadurch ein geringeres im-munogenes Potential, besitzt, wurden die sich unterscheidenden Aminosäuren in den Framework-Regionen der murinen Sequenz, wenn möglich, gegen die Aminosäuren ausge-tauscht, die in der humanen Keimbahnsequenz an diesen Positionen vorkommen. Die resul-tierenden human-ähnlichen (human-like) M2e- und gB-bindenden einzelkettigen variablen Fragmente (scFvs) mit den besten Eigenschaften wurden als komplette BiTE AKs exprimiert, aufgereinigt und charakterisiert. Die so generierten human-like M2e BiTE AKs besaßen M2e-bindende Anteile, die bis zu 87,3 % identisch mit der humanen Keimbahnsequenz wa-ren (muriner Binder: 78,2 %). Der Großteil der human-like M2e BiTE AKs wies eine höhere Affinität zu M2e, sowie eine höhere zytotoxische Aktivität im Vergleich zum murinen M2e BiTE auf, obwohl die Sequenzen der CDRs (complementarity determining regions) nicht ver-ändert wurden. Mit unterschiedlichen Influenza A-Virusstämmen infizierte Zellen wurden in einem in vitro Zytotoxizitäts-Assay durch einen human-like M2e BiTE mindestens 5-fach besser lysiert, als durch das murine Molekül. Im Maus-Modell konnte außerdem gezeigt werden, dass die Tiere durch eine Behandlung mit human-like M2e BiTE vor dem tödlichen Verlauf einer Influenza A-Infektion geschützt waren, während die Behandlung mit dem gleich dosierten murinen M2e BiTE nur zum Teil schützend wirkte. Die generierten human-like CMV-gB BiTE AKs besaßen gB-bindende scFv-Anteile, die bis zu 85,9 % identisch mit der humanen Keimbahnsequenz waren (muriner Binder: 66,8 %). Die human-like CMV-gB BiTE AKs hatten eine vergleichbar hohe Aktivität in in vitro Zytotoxizitäts-Assays, wie der murine CMV-gB BiTE. Da CMV-gB und Influenza A-M2 sowohl hoch spezifisch für infizierte Zellen, als auch hoch konserviert zwischen verschiedenen Virusstämmen sind, könnten die unter-suchten BiTE AKs ein vielversprechender Ansatz für die Behandlung dieser viralen Erkran-kungen sein. Die in der vorliegenden Arbeit gezeigten Ergebnisse zeigen zudem, dass BiTE AKs nicht nur in der Onkologie erfolgreich eingesetzt werden können, sondern ein Einsatz auch in dem breiten Feld der Infektionserkrankungen erfolgversprechend erscheint., Bispecific T cell engaging (BiTE) antibody constructs (ACs) have already been used to suc-cessfully treat different types of cancer in clinical trials. They possess two different binding sites. One binding site is specific for a certain target protein expressed on a diseased cell and the other is specific for CD3ε, which is expressed on all T cells. The resulting binding of T cells to target cells leads to the formation of immunological synapses and target cell lysis. In this thesis, different BiTE ACs were generated with target protein binding moieties based on the amino acid sequences of the variable fragments of murine antibodies specific for the extracellular domain of the Influenza A matrix-protein 2 (M2e) or the Cytomegalovirus gly-coprotein B (gB). It could be shown that these BiTE ACs are able to redirect T cells to bind and lyse cells carrying these proteins on the cell surface. To obtain BiTE ACs with M2e- or gB-binding moieties with a high similarity to the human germline amino acid sequence, resulting in a lower immunogenic potential of the antibody, the differing amino acids in the framework regions of the murine sequence were replaced by the respective human amino acids, if possible. The resulting human-like M2e- or gB-binding single-chain variable frag-ments (scFvs) with the best properties were converted into complete BiTE ACs which were expressed, purified and characterized. The generated human-like M2e BiTE ACs had M2e-binding moieties which displayed up to 87.3% identity to the human germline sequence (original murine binder: 78.2%). Most of the human-like M2e BiTE ACs showed higher affini-ties for M2e and higher cytotoxic activities, compared to the murine M2e BiTE, although the amino acid sequences of the complementarity determining regions (CDRs) had not been changed. Cells infected with different strains of Influenza A virus were lysed at least 5 times more potently by a human-like M2e BiTE, compared to the murine molecule. Moreover, a human-like M2e BiTE was able to protect mice infected with a potentially lethal dose of a mouse-adapted Influenza A strain from death, while mice treated with the same dose of the murine M2e BiTE were only partly protected. The human-like CMV-gB BiTE ACs had gB-specific moieties which exhibited up to 85.9% identity to the human germline sequence (murine gB-binding moiety: 66.8%). Compared to the murine CMV-gB BiTE, human-like CMV-gB BiTE ACs proved to be similarly effective in in vitro cytotoxicity assays. With Influ-enza A-M2 and CMV-gB being highly specific for virus-infected cells as well as highly con-served among different viral strains, the examined BiTE ACs could be a promising approach for the treatment of these two viral diseases. Moreover, the results presented in this thesis indicate a therapeutic potential of BiTE ACs beyond oncology, e.g. in the broad field of infec-tious diseases.

Treatment of oncological and autoimmune diseases still remains a considerable challenge to modern medicine. Current therapy options such as chemotherapy and radiotherapy in oncology and glucocorticoids or other conventional immunosuppressive drugs for autoimmune diseases are often of limited efficacy. They suffer from a lack of specificity, with respect to the eradication of tumour and immune cells, respectively. The use of monoclonal antibodies in oncology allowed in some instances specific targeting of tumour cells and thus, improved this situation in the last decades. Some antibodies, such as anti-CD20 antibody Rituximab, targeting normal and malignant B-cells, are meanwhile firmly established in oncological treatment regimes. Interestingly, over the last years the anti B-cell activity of Rituximab was used in addition in numerous studies for the treatment of autoimmune diseases. Many strategies have been developed to further improve therapeutic activity of monoclonal antibodies. One of them is the development of bispecific antibodies recognising target cell antigens and effector cells or effector molecules at the same time. The “bispecific concept” used in this work is the target cell restricted stimulation of the death receptor CD95 (APO-1/Fas) with bispecific antibodies as described by Jung et al. in 2000. Whereas initial experiments were performed using chemically hybridised bispecific antibodies with CD20×CD95 specificity, the goal of this thesis was the generation of recombinant antibodies within a suitable format. To this end, a recombinant CD20×CD95 molecule in the so called FabSc format, designated BS9520 was developed and characterised in various in vitro and in vivo assays. It was found that the capability of this antibody to suppress the growth of malignant B-cells in vitro and in vivo and to specifically deplete normal, activated B-cells from PBMC cultures was superior to that achieved with monospecific clinically established anti-CD20 antibodies including a newly developed third generation Fc-optimized CD20 antibody. Moreover, the bispecific antibody was the only reagent capable of significantly suppressing IgG production by activated B-cells in vitro. These findings imply that the bispecific CD95×CD20 antibody might become an attractive reagent for the treatment of B-cell malignancies as well as B-cell mediated autoimmune diseases. In the second part of this work a completely new approach for the stimulation of the CD95 death receptor on antigen specific B-cells was evaluated. For proof of principle, the CD20 part in the BS9520 antibody was replaced by antigen fragments (tetanus or diphtheria toxoid derivatives). We named these fusion proteins BS95TT and BS95DT, respectively. Such protein should bind to B-cell receptor via their toxoid part and with the CD95 antibody part to CD95 receptor on activated TTspecific B-cells. Thereby, apoptosis is induced only in an antigen-specific fashion. This approach could be used for the treatment of autoimmune diseases if the antigen inducing auto-antibody production is known (such as Myasthenia gravis, multiple sclerosis and others).

Das Orf Virus (ORFV) gehört zur Gattung Parapoxvirus der Poxviridae. ORFV zeichnet sich durch äußerst vorteilhafte immunstimulierende und protektive Eigenschaften aus, die es für den Nutzen als vielversprechende rekombinante Vektor-Vakzine interessant machen. Die vorliegende Arbeit umfasst die Neu- und Weiterentwicklung von ORFV-Rekombinanten und die Charakterisierung deren protektiven Eigenschaften sowie die Beschreibung von potentiellen neuen Evasionsmechanismen und immunrelevanten Eigenschaften von ORFV. Zur Herstellung und Selektion von ORFV-Rekombinanten wurden verschiedene Methoden der Transfektion optimiert, um in ORFV infizierten Zellen eine höchst mögliche Transfektionseffizienz zu erreichen. Die Etablierung der PCR für den Selektionsprozess neuer Rekombinanten löste das Problem der Abhängigkeit von Antikörpern, die gegen das inserierte Antigen gerichtet sind. Zudem ermöglichte der Einsatz von Fluoreszenz-Markergenen eine Reduktion der Arbeitsschritte, die zum Erhalt homogener Virus-Rekombinanten führen. Des Weiteren wurden verschiedene ORFV-Rekombinanten hergestellt, in deren Genom Fremdgene verschiedener Viren (BRV, BTV, AHSV, FMDV, RHDV und Influenzavirus) eingefügt wurden. Die korrekte Insertion und Expression dieser Gene wurden durch verschiedene molekularbiologische Methoden bestimmt und die protektiven Eigenschaften einiger Rekombinanten wurden in vivo charakterisiert. Die ORFV-Rekombinante D1701-V-VP1 konnte einen effektiven Schutz gegen RHDV im natürlichen Wirt, dem Kaninchen, induzieren. RHDV verursacht eine hochansteckende Erkrankung mit einer hohen Mortalitätsrate in Kaninchen. Da in vitro Zellkultursysteme fehlen, stammen kommerzielle Impfstoffe aus der Leber von RHDV infizierten Kaninchen. Bereits eine singuläre Immunisierung mit der Rekombinanten D1701-V-VP1 war ausreichend, um eine vollständige Immunität gegen eine letale RHDV Infektion in Kaninchen zu induzieren. Der induzierte Schutz beruhte neben der spezifischen Antikörperantwort gegen RHDV vermutlich auch auf einer Beteiligung von T-Zellen. Die generierte ORFV-Rekombinante stellt eine attraktive Alternative zu herkömmlichen Vakzinen dar. Eine weitere neu hergestellte Rekombinante (D1701-V-HAh5n) exprimiert das Hemagglutinin (H5 HA), welches das Hauptimmunogen des hochpathogenen aviären Influenzavirus (HPAIV) Stamm H5N1 darstellt und virus-neutralisierende Antikörper induziert. Die Immunogenität dieser ORFV-Rekombinante wurde nach Immunisierungen von Mäusen mit anschließenden Belastungsinfektionen verschiedener Stämme des HPAIV H5N1 charakterisiert. Die immunisierten Tiere zeigten nach Infektion weder eine klinische Symptomatik noch einen Verlust an Körpergewicht. Zudem waren vakzinierte Mäuse auch vollständig gegen das heterologe humane Influenzavirus A Stamm H1N1 geschützt. Depletionsversuche in vivo von CD4-positiven und/oder CD8-positiven T-Zellen wiesen darauf hin, dass insbesondere CD4-positve T-Zellen für die Ausbildung der protektiven Immunität notwendig waren. Die in vivo Untersuchungen der protektiven immunologischen Charakteristika von ORFV-Rekombinanten, welche die Glykoproteine des Pseudorabiesvirus (PRV) exprimieren, zeigten eine ausgeglichene spezifische TH-1 und TH-2 Immunantwort. Bis zu 24 Stunden nach ORFV Immunisierung konnte eine gesteigerte Aktivität von Natürlichen Killerzellen und die Expression pro-inflammatorischer Zytokine (IL-1β, IL- 6, TNFα und G-CSF) nachgewiesen werden. Zu späteren Zeitpunkten und nach einer zweiten ORFV Immunisierung war vermehrt die Sekretion von TH-2 spezifischen Zytokinen (IL-4, IL-5, IL-10 und IL-13) im Serum der Tiere nachweisbar. Des Weiteren konnte gezeigt werden, dass die Interferon-α/β und γ Rezeptoren essentiell für den Schutz vor einer PRV Infektion waren. Pockenviren besitzen ein breites Genspektrum, das eine Umgehung der Immunantwort des Wirts ermöglicht. So wurden die immunmodulatorischen Eigenschaften von ORFV und dessen Einfluss auf den Prozess der Antigenpräsentation über MHC I in infizierten Vero Zellen untersucht. Abhängig von der Infektionsdauer war die MHC I Expression auf der Zelloberfläche bis zu 50% reduziert. Zudem konnte bei infizierten Zellen eine verlängerte Halbwertszeit von vorhandenen MHC I Molekülen an der Zelloberfläche nachgewiesen werden. ORFV scheint die MHC I Oberflächenexpression herab zu regulieren, indem es direkt die Struktur der Golgi Kompartimente und das vesikuläre Transportsystem angreift. Dies wiederum hat Einfluss auf die Präsentation viraler Antigene und die Aktivierung von T-Zellen. Zudem zeigten Analysen eine Ko-Lokalisierung zwischen MHC I und COP-I Vesikeln sowie einen gestörten Glykosylierungszustand von post-ER MHC I Molekülen. Die beschriebenen Arbeiten demonstrieren eindrücklich die bemerkenswerten Eigenschaften des ORFV Stamm D1701-V und dessen großes Potential als Vektor- Impfstoff gegen virale pathogene Erreger.

In der vorliegenden Arbeit wurde der Immunstatus von 21 Patienten während der Radiotherapie ihres Prostatakarzinoms untersucht. Längerfristig soll der optimale Zeitpunkt für die Applikation einer Immuntherapie in Kombination mit der Bestrahlung festgelegt werden. Hierzu wurde vor, während und nach der Bestrahlungstherapie Blut abgenommen, die Lymphozyten isoliert und mittels Durchflusszytometrie analysiert. Es wurden die Verläufe der Zellanteile über die Therapie hinweg untersucht, darüber hinaus wurden Vergleiche zwischen unterschiedlichen Therapiegruppen (Hormon-ablative Therapie, Vorliegen einer erweiterten Bestrahlung des pelvinen Lymphabflusswegs, Applikation einer lokalen Steroidtherapie) und mit sechs gesunden Probanden vorgenommen. Nach Sichtung der Ergebnisse konnten einige Veränderungen im Immunstatus der untersuchten Patienten erkannt werden: Die absoluten Zahlen der Leukozyten und Lymphozyten nahmen während der Bestrahlungstherapie ab. Davon besonders betroffen waren B- und T-Zellen, während der relative Anteil der NK-Zellen zunahm. Außerdem stieg der Anteil der regulatorischen T-Zellen unter der Bestrahlung an. Bei fast allen untersuchten Zellpopulationen konnte gegen Bestrahlungsende eine deutlich erhöhte Proliferationsrate detektiert werden. Im Vergleich mit den Ergebnissen der gesunden Probanden konnten vor allem die erniedrigte Immunzellzahl und die erhöhte Proliferationsrate nachgewiesen werden. Als Simulation für Tumorantigen-spezifische CD8+-T-Zellen wurden in der Studie Virusantigen-spezifische Zellen der Patienten untersucht (für CMV, EBV und Influenza). Bei diesen Zellen konnten unter der Radiotherapie keine einschränkenden Veränderungen nachgewiesen werden, sodass es naheliegt, dass eventuell vorhandene anti-Tumor-Immunzellen ebenfalls keinen Schaden nehmen würden. Dies sollte durch speziell dafür konzipierte Studien bestätigt werden. Die Ergebnisse der durchgeführten Arbeit zeigen, dass einer Kombination von immuntherapeutischen Verfahren, zum Beispiel eine Peptidvakzinierung, mit der Radiotherapie möglich ist. Ein Beginn der Immuntherapie ist entweder mindestens drei Monate nach Ende der Bestrahlung denkbar, wenn das Immunsystem sich bereits wieder teilweise erholt hat. Alternativ scheint ein überlappendes Therapieprotokoll sinnvoll, das die erhöhte Proliferationsrate der Immunzellen unter der Radiotherapie ausnutzen würde. Diese Ansätze sollten in einer vergleichenden Studie gegeneinander getestet werden.

Natürliche Killer (NK)-Zellen sind zytotoxische Lymphozyten der angeborenen Immunität, die eine wichtige Rolle bei der Immunüberwachung von Tumoren, insbesondere von malignen hämatopoetischen Neoplasien, spielen. Aufgrund ihrer Fähigkeit nach Fc-Rezeptorstimulation antibody dependent cellular cytotoxicity (ADCC) zu vermitteln, tragen sie maßgeblich zum therapeutischen Erfolg von anti-Tumor Antikörpern, wie z.B. Rituximab, bei. Letzterer ist mittlerweile ein essentieller Bestandteil der meisten Behandlungsstrategien von B-Zell Malignomen. Während der letzten Jahre berichteten jedoch zahlreiche Studien darüber, dass in Patienten mit Chronisch Lymphatischer Leukämie (CLL) die Fähigkeit von NK-Zellen, maligne Zellen direkt zu lysieren oder Rituximab-induzierte ADCC zu vermitteln, beeinträchtigt ist. Die Mechanismen, die diesen Beobachtungen zu Grunde liegen, sind bis heute weitgehend unbekannt. In dieser Arbeit konnte nun das TNF-Familienmitglied B cell activating factor (BAFF) als Faktor identifiziert werden, welcher zur Resistenz der CLL-Zellen gegenüber einer NK-Zellattacke beiträgt. BAFF wird hauptsächlich von Zellen myeloischen Ursprungs exprimiert und spielt eine wichtige Rolle bei der Proliferation, Funktion und dem Überleben von B-Zellen. Neben seiner bedeutenden Rolle in Autoimmunerkrankungen, trägt BAFF durch seine anti-apoptotische und überlebensfördernde Wirkung auch zur Pathophysiologie von B-Zell Malignomen bei. In der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass NK-Zellen BAFF ohne detektierbare Oberflächenexpression löslich freisetzen. Die BAFF-Freisetzung wurde durch NK-Aktivierung noch gesteigert, und dies war neben aktivierenden Zytokinen auch nach Fc-Rezeptorstimulation mittels CD20-Antikörper zu beobachten. BAFF wiederum steigerte die metabolische Aktivität primärer CLL-Zellen und verringerte die direkte und Rituximab-induzierte Lyse der CLL-Zellen, ohne die NK-Reaktivität per se zu beeinflussen. Darüber hinaus vermittelte BAFF eine Resistenz von CLL-Zellen gegenüber einer Behandlung mit den Systemtherapeutika Fludarabin und Cyclophosphamid (FC). Der für die Behandlung des Systemischen Lupus Erythematodes (SLE) zugelassene neutralisierende BAFF-Antikörper Belimumab verhinderte die Effekte von BAFF auf die metabolische Aktivität der CLL-Zellen und stellte die Suszeptibilität für die direkte und Rituximab-induzierte NK-Lyse in allogenen und autologen experimentellen Ansätzen wieder her. Des Weiteren sensitivierte Belimumab die CLL-Zellen für eine systemtherapeutische Behandlung mit FC. Diese Ergebnisse identifizieren BAFF nicht nur als Faktor, der zur beobachteten Resistenz von CLL-Zellen gegenüber der direkten und Rituximab-induzierten NK-Antitumorimmunität beiträgt, sie decken darüber hinaus das Potential BAFF-neutralisierender Reagenzien zur Verstärkung der NK-Zell-Reaktivität für Immuntherapie und konventionelle Systemtherapeutika auf.

Virale Vektoren stellen eine vielversprechende Plattformtechnologie zur Herstellung rekombinanter Impfstoffe dar, die neben der klassischen Prävention von Infektionskrankheiten zunehmend auch zur Entwicklung neuer, innovativer Therapiekonzepte, wie beispielsweise als therapeutische Tumorimpfstoffe, eingesetzt werden. Die vorgelegte Dissertation basiert auf Arbeiten mit dem Orf-Virusvektor D1701-V und lässt sich in zwei Schwerpunktthemen, rekombinante Impfstoffentwicklung und Vektormodifikation, untergliedern. So konnten erfolgreich Impfstoffe gegen Tollwut und Influenza A Viruserkrankungen hergestellt und die Wirksamkeit im Tiermodell erfolgreich untersucht werden. Zusätzlich konnten Grundlagen zur Generierung polyvalenter Orf Virusvektoren konzipiert und eine neue, hocheffiziente Selektionsmethode entwickelt werden.

The isolation of spermatogonia from adult human testis is hampered by the limited selectivity of available markers. In this study, I evaluated the suitability of combinations of known markers and novel targets for the prospective isolation of spermatogonia from adult human testis. Immunohistochemical studies, multicolor staining and cell sorting of testis samples followed by multiplex PCR and dendrogram cluster analysis revealed that spermatogonia were enriched at high purity in the CD49f+CD49a-SSEA-4+SUSD2+ population as well as in the CD49f+CD49a-SSEA-4+/-CD164+ subsets. In contrast to spermatogonia, testicular stromal cells and testicular endothelial cells were found to be highly enriched in the CD49f+CD49a+CD144- and in the CD49f+CD49a+CD144+ subsets, respectively. The delineation was confirmed by the expression of specific stromal and endothelial key markers as well as by the differentiation capacity of each subset. In addition, I identified for the first time two distinct subsets of spermatogonia, distinguished by their CD49f+SSEA-4+CD164+ and CD49f+SSEA-4-CD164+ expression profiles. Multiplex PCR analysis revealed that cells of the CD49f+SSEA-4-CD164+ subset express spermatogonia/germ cell specific markers, whereas the CD49f+SSEA-4+CD164+ subset is enriched in undifferentiated spermatogonia specific markers. The knowledge about the composite phenotype of defined testicular cell subsets and the reliable isolation procedure may contribute to the precise characterization and efficient isolation of spermatogonia from small biopsies and may contribute to the treatment of infertility. Die Isolierung von Spermatogonien aus adulten menschlichen Hoden ist zur Zeit wegen der begrenzten Zahl und dem Mangel an selektiven Markern nur eingeschränkt möglich. In der vorliegenden Arbeit wurden Kombinationen bekannter Marker und neuer Targets, die für die Isolierung von Spermatogonien geeignet sind, untersucht. Mit Hilfe immunhistochemischer Analysen, Mehrfarbenfluoreszenzanalysen und Zellsortierung von Proben aus Hodengewebe sowie nachfolgenden Multiplex-PCR und Dendrogramm Clusteranalysen konnte gezeigt werden, dass Spermatogonien sowohl in der CD49f+CD49a-SSEA-4+SUSD2+ Population als auch im CD49f+CD49a-SSEA-4+/-CD164+ Subset hochrein isoliert werden können. Außer Spermatogonien konnten aus Hodengewebe auch Stromazellen in der CD49f+CD49a+CD144- Population und Endothelzellen im CD49f+CD49a+CD144+ Subset isoliert werden. Die Unterscheidung von Endothelzellen und Stromazellen wurde über den Nachweis der spezifischen Expression von Schlüsselmarkern sowie durch die unterschiedliche Differenzierungkapazität der jeweiligen Zellpopulationen erzielt. Darüber hinaus konnten zum ersten Mal zwei unterschiedliche Populationen von Spermatogonien identifiziert werden, die sich durch ihre differenziellen Expressionsprofile unterscheiden. So konnte über Multiplex PCR-Analysen gezeigt werden, dass CD49f+SSEA-4-CD164+ Zellen Keimzell-spezifische Marker exprimierten, die einem differenzierteren Stadium von Spermatogonien entsprechen, während Zellen im CD49f+SSEA-4+CD164+ Subset Marker exprimierten, die typischerweise bei Spermatogonien im undifferenzierten Stadium vorkommen. Die Kenntnis des genauen Phänotyps von Spermatogonien sowie die hochreine Isolierung dieser seltenen Zellpopulation ist möglicherweise ein wichtiger Baustein bei der Behandlung von Unfruchtbarkeit.

The degree of genomic relatedness influences many social behaviours in humans and animals. Mice, as nocturnal rodents, take advantage of their excellent sense of smell to identify kin, conspecifics and members of other species via body odours or urine scent marks. Selected groups of peptides, including those that are presented by major histocompatibility complex (MHC) proteins, are recognised by mouse chemosensory neurons with very high sensitivity (up to 10^-14 M). MHC peptide ligands have been proposed to influence social interactions in many species, including mice and humans. However, the lack of knowledge about such peptides in natural sources accessible for nasal recognition has been a major barrier for this hypothesis. Here we analyse urinary peptides from selected inbred strains of Mus musculus with respect to genotype-related differences. We discover many abundant peptides with single amino acid variations (SAVs) corresponding to genomic nucleotide variations. The polymorphism of major urinary proteins (MUPs) is reflected by variations in prominent urinary peptides, and further types of genomic variability are predicted to affect the urinary peptidome. Several peptides with MHC binding motifs are readily detectable in urine at concentrations of up to 10^-6 M, but their occurrence is independent of the MHC. On the other hand, by comparing mouse strains expressing chicken ovalbumin together with, or without, functional MHC class I molecules, we provide conclusive evidence that the prototypic H2-Kb ligand SIINFEKL (derived from ovalbumin) exists in urine at a concentration of 4 x 10^-12 M in an MHC-dependent manner. In cooperation with neurobiologists, we show that chemoreceptive neurons in the vomeronasal organ detect and discriminate SAV peptides as well as SIINFEKL. The present thesis fills a critical gap in the hypothesis that MHC peptide ligands may serve as signals of individuality in mice by providing the first evidence for such a ligand occurring in urine in an MHC-dependent manner. However, at the same time, this study profoundly questions the same hypothesis by showing, first, that the respective peptide concentrations in urine are about eight orders of magnitude lower than those previously applied in behavioural experiments and second, by demonstrating abundant MHC-independent MHC motif peptides. I therefore suppose that the copious peptides which reflect genomic individuality independent of MHC genes are far more important in determining social behaviours than the MHC-dependent ones. Collectively, urinary peptides represent a real-time sampling of the expressed genome available for chemosensory assessment by other individuals. Der genetische Verwandtschaftsgrad wirkt sich auf viele soziale Verhaltensweisen von Mensch und Tier aus. Als nachtaktive Nagetiere nutzen Mäuse ihren hervorragenden Geruchsinn, um Familienangehörige, Artgenossen und Vertreter fremder Arten zu identifizieren. Die benötigten Informationen können sie dabei auch aus Urinduftmarken gewinnen. Chemosensorische Nervenzellen der Maus erkennen bestimmte Peptidsorten, einschließlich denjenigen, die von den Proteinen des Haupthistokompatibilitätskomplexes (major histocompatibility complex, MHC) präsentiert werden, mit sehr hohen Sensitivitäten von bis zu 10^-14 M. Es wurde postuliert, dass MHC-Peptidliganden soziale Beziehungen bei vielen verschiedenen Arten, einschließlich Maus und Mensch, beeinflussen. Ein grundlegendes Problem bei dieser Hypothese ist jedoch das fehlende Wissen über solche Peptide in Duftquellen, die natürlicherweise für die Geruchserkennung zur Verfügung stehen. Hier untersuchen wir Urinpeptide von ausgewählten Inzuchtstämmen von Mus musculus in Bezug auf Unterschiede, die mit dem Genotyp zusammenhängen. Dabei entdecken wir viele häufige Peptide mit Einzelaminosäurevariationen (EAVs), welche genomischen Nukleotidvariationen entsprechen. Der Polymorphismus der Major Urinary Proteine (MUPs) spiegelt sich in Unterschieden in prominenten Urinpeptiden wider, und es kann vorhergesagt werden, dass weitere Arten genomischer Vielfalt das Urinpeptidom beeinflussen. Mehrere Peptide mit MHC-Bindemotiven sind im Harn in Konzentrationen von kleiner-gleich 10^-6 M leicht nachzuweisen, treten aber unabhängig vom MHC auf. Andererseits können wir einen schlüssigen Nachweis liefern, dass der prototypische H2-Kb-Ligand SIINFEKL, welcher aus Hühner-Ovalbumin stammt, MHC-abhängig mit einer Konzentration von 4 x 10^-12 M im Harn Ovalbumin-transgener Mäuse vorkommt. Der Nachweis der MHC-Abhängigkeit erfolgt dabei unter Nutzung eines Mausstammes, der Ovalbumin, aber keine funktionellen MHC-Klasse-I-Moleküle exprimiert. In Zusammenarbeit mit Neurobiologen zeigen wir, dass chemosensorische Nervenzellen im Vomeronasalorgan sowohl EAV-Peptide als auch SIINFEKL erkennen und unterscheiden können. Die vorliegende Doktorarbeit schließt eine entscheidende Lücke in der Hypothese, dass MHC-Peptidliganden als Signale der Individualität von Mäusen dienen können, indem sie den ersten Nachweis für einen solchen Liganden erbringt, der MHC-abhängig im Harn auftritt. Gleichzeitig stellt unsere Studie dieselbe Hypothese jedoch grundlegend in Frage, weil sie erstens zeigt, dass die entsprechenden Peptidkonzentrationen im Urin etwa acht Größenordnungen unter denjenigen liegen, welche in vorangegangenen Verhaltensexperimenten verwendet wurden und weil sie zweitens häufige MHC-unabhängige MHC-Motivpeptide nachweist. Ich vermute daher, dass die zahlreichen Peptide, welche die genomische Individualität unabhängig von MHC-Genen widerspiegeln, für das Sozialverhalten weitaus wichtiger sind als die MHC-abhängigen. In ihrer Gesamtheit bilden Urinpeptide Teile des exprimierten Genoms in Echtzeit ab und machen es somit für die chemosensorische Analyse durch andere Individuen zugänglich.

Hitzeschockproteine (HSPs) sind eine große Gruppe hoch konservierter, intrazellulärer Proteine, die ubiquitär vorkommen und ihrer Größe nach in verschiedene Familien eingeteilt werden. Hitzeschockproteine sind in erster Linie für die intrazelluläre Chaperonierung von Proteinen bei Stress verantwortlich, helfen aber auch bei der Faltung, Entfaltung oder beim Abbau von Proteinen. Sie spielen aber auch eine Rolle in der Immunabwehr. So sind zum Beispiel Hitzeschockprotein 70 (Hsp70):Peptid Komplexe in der MHC-I und MHC–II vermittelten Antigenpräsentation involviert. In der vorliegenden Arbeit sollte die Bedeutung des Hsp70 bei der Chaperonierung antigener Peptide und der daraus resultierenden verstärkten Proliferation von antigenspezifischen CD4+ Lymphozyten näher charakterisiert werden. Zunächst wurde der Frage nachgegangen, ob die Chaperonierung von antigenen Peptiden mit Hsp70 zu einer verstärkten Aufnahme in antigenpräsentierende Zellen führt. Dazu wurden Monozyten mit humanem Hsp70 und FITC-markierten Peptiden von Tetanustoxin (TT974-966) oder Peptid alleine inkubiert und die Aufnahme über mehrere Stunden hinweg durchflusszytometrisch untersucht. Es konnte jedoch keine schnellere oder erhöhte Aufnahme von Hsp70:Peptid-Komplexen festgestellt werden. Es erfolgten Untersuchungen mittels konfokaler Mikroskopie um die intrazelluläre Lokalisation der Peptide zu überprüfen. Hierbei konnte gezeigt werden, dass sich die markierten Peptide nach 3 Stunden in späten Endosomen innerhalb der Zelle befinden. Die molekularbiologischen Untersuchungen einer Interaktion von HLA-DR und Hsp70 bilden den zweiten Teil dieser Arbeit. Mit Hilfe von Sequenzvergleichen wurden die für eine Substratbindung wichtigen Aminosäuren im humanen Hsp70 identifiziert und zielgerichtet mutiert. Weiterhin wurde eine Deletion der C-terminalen Domäne durchgeführt. In quantitativen Bindungsassays (DELFIA) wurden die verschiedenen Mutationen dann hinsichtlich ihrer Bindungsaktivitäten getestet. So wurde gezeigt, dass eine Mutation in der Substratbindedomäne von Alanin 405 zu Glycin zu einem Verlust der Substratbindeaktivität führt, während sowohl eine Mutation vom Valin 437 zu Glycin als auch die Deletion der C-terminalen Domäne keinen Einfluss auf die Substratbindung hatten. Eine Bindung aller Mutanten an HLA-DR blieb allerdings unverändert im Vergleich zum Wildtyp Hsp70. Eine Bindung von Hsp70 an HLA-DR zeigte sich als substratunabhängig. Als potentielle Bindestellen an HLA-DR konnte der C-Terminus und die Substratbindedomäne von Hsp70 ausgeschlossen werden. Die Interaktion zwischen HLA-DR und Hsp70 liegt vermutlich im Bereich der ATPase Domäne von Hsp70. Das Vorhandensein einer alternativen Bindestelle von HLA-DR an Hsp70 außerhalb der Substratbindedomäne ermöglicht eine direkte Übertragung eines Hsp70-chaperonierten Peptides in die Bindegrube von HLA-DR. Die erleichterte Beladung von MHC-II Molekülen führt zu einer effektivere Präsentation an der Oberfläche antigenpräsentierender Zellen, die eine verstärkte Proliferation von antigenspezifischen CD4+-T-Lymphozyten zur Folge hat. Heat-shock proteins are, next to their houskeeping-functions, involved in the immunrespose. In this work, the immportance of Hsp70 in the uptake of antigen peptides and thus resulting proliferation is further characterized. Furthermore sequences of Hsp70 from different species have been analyzed to characterize the most homologus aminoacids. In bindingassays, the importance of several aminoacids and structural parts of Hsp70 have been tested in respect of binding capacity. It could be shown, that an alternativ binding area exists which leads to a faster interaction between Hsp70-chaperoned antigenic peptides and subsequently leading to a higher proliferatio of T-cells.

Im Kampf gegen Krebs gehört der anti-vaskuläre Therapieansatz zu den Erfolg versprechendsten. Die Inhibierung der Neoangiogenese soll dabei durch Unterversorgung des Tumors zur Wachstumsblockade führen. Im Gegensatz zur Hemmung löslicher Angiogenesefaktoren, wie etwa VEGF, wird in der vorliegenden Arbeit ein direkt gegen das Tumorendothel gerichteter, Antikörper-basierter Ansatz verfolgt. Neben der gezielten Lyse des Tumorendothels soll durch Öffnung der Tumorgefäße die Einwanderung körpereigener Immunzellen begünstigt werden und somit zusätzlich, durch Induktion einer spezifischen Immunantwort, ein direkter Effekt gegen die malignen Zellen erzielt werden. Ziel dieser Arbeit war demnach die Entwicklung eines Antikörpers mit verbesserter Spezifität für das Tumorgefäßsystem und optimierter immunologischer Effektorfunktion. In the fight against cancer therapeutic strategies directed against the tumour vasculature appear particular promising. The inhibition of neoangiogenesis results in suppression of tumor growth. In contrast to the blockade of soluble angiogenic factors, such as VEGF, the approach pursued in this work aims at the destruction of tumor endothelial cells using optimized, recombinant antibodies. In addition to the suppression of tumor angiogenesis the damaged endothelial barrier may facilitate the influx of immune cells thereby supporting immune reactions against the tumor. Thus, it was the major aim of this work to develop antibodies with increased specificity for tumor endothelial cells and optimized immunological effector functions.

Große Fortschritte in der Tumorimmunologie über die letzten ein bis zwei Dekaden ermöglichen die Erwägung der Krebsimmuntherapie als ernsthafte Ergänzung des onkologischen Behandlungsspektrums für unterschiedlichste Malignomentitäten. Trotz vieler Rückschläge und weiter bestehender Herausforderungen sind doch einige Ansätze – vor allem Antikörper – schon klinisch etabliert. Aktive Immunisierungen befinden sich noch in klinischen Studien, die bisher, auch für das Pankreaskarzinom, unterschiedlichen Vakzinationen generell Sicherheit und in einigen Patienten Induktion von Immunantworten attestieren, welche nicht selten mit verlängertem Überleben korrelieren. Motivation zu vorliegender Arbeit nährte sich aus dem Los eines chirurgisch und chemotherapeutisch erschöpfend therapierten noch sehr jungen Patienten mit histologisch atypischem, duktalem Pankreaskarzinom, für den ein Heilversuch per Tumorimpfung gewagt worden war. Die Immunhistochemie des malignen Gewebes empfahl das stark überexprimierte Zytokeratin 7 (CK7) als zusätzliches Tumorantigen. Nun sollten aus diesem Protein neue CD8+ T-Zell-Epitope identifiziert werden um sie als Peptide zur Vakzinierung zur Verfügung stellen zu können. Einer in silico-Prädiktion anhand des Vorhersagetools „SYFPEITHI“ von HLA-A*0201- bzw. HLA-B*5101-restringierten, wahrscheinlichen Epitopen folgte eine in vitro-Verifikation dieser Peptide: Aus Monozyten erzeugte, mit synthetischem Peptid beladene dendritische Zellen gesunder Spender fungierten als aktivierende, professionelle antigenpräsentierende Zellen für eine gesuchte, naive, peptidspezifische CD8+ T-Zelle im Lymphozytenpool des identischen Spenders. Nach repetitiver Stimulation und Proliferation erfolgte die Analyse der Kultur auf eine distinkte spezifische Population über intrazelluläre IFNgamma-Färbung. Zum Nachweis der endogenen Prozessierung und Präsentation der untersuchten Epitopkandidaten sowie der zytotoxischen Kapazität der erzeugten Effektorpopulation waren Tumorzelllyseexperimente geplant. Von den acht bzw. zehn HLA-A*0201- bzw. HLA-B*5101-restringierten vorhergesagten Kandidaten erwiesen sich in neunzehn verschiedenen untersuchten Leukozytenspenden jeweils zwei als immunogen und konnten distinkte peptidspezifisch IFNgamma-produzierende CD8+-T-Zellpopulationen, teilweise in mehreren, unterschiedlichen Spenden induzieren: RLAGDGVGAV, CK7 402-411 und TLNETELTEL, CK7 227-236 (HLA-A*0201-restringiert) sowie DGVDAVNI, CK7 406-413 und TAAENEFVV, CK7 188-198 (HLA-B*5101-restringiert) sind somit als hochkarätige Epitopkandidaten identifiziert. Lediglich der Nachweis ihrer natürlichen Prozession und Präsentation steht noch aus. Die Zytotoxizitätsexperimente konnten bisher aufgrund leider erfolgloser – obwohl umfangreicher – HLA-Transfektionsbemühungen einer potentiell geeigneten Zielzelle, der Pankreaskarzinomzelllinie Capan-1, noch nicht angeschlossen werden. Zukünftige Zytotoxizitäts-assays und die Evaluation der spontanen in vivo-Relevanz dieser vier Epitopkandidaten in Patienten mit Zytokeratin 7 überexprimierenden Tumoren sollten diese Lücke jedoch schließen können und den Weg zum Einsatz als Vakzine bei Pankreaskarzinomen aber auch anderen Entitäten bereiten. Bedauerlicherweise konnte unser Patient nicht mehr wie erwünscht von der Impfung profitieren. Marked progress over the past two decades in tumor immunology supplies rationale for sincere consideration of immunotherapy as complementary approach in treatment for diverse tumor entities. In spite of numerous defeats and many persisting challenges, some strategies like monoclonal antibodies are already established in clinical routine. Up to now still object of (pre-)clinical studies are active immunizations: Diverse protocols including several for treatment of pancreatic carcinoma generally attest safety and in some cases and patients also show induction of a specific immune response which not rarely correlates with improved survival. Motivation for the reported work had its source in the fate of a still quite young patient suffering from a histologically rare and atypical pancreatic adenocarcinoma. Surgery and chemotherapy had approached their limits and complementary active immunization was hopefully embraced as a last resort. Immunohistochemistry of the specimen recommended the highly overexpressed intermediate filament Cytokeratin 7 (CK7) as additional tumor antigen and vaccination target. Aim of the present study was the identification of novel CD8+ T-cell-epitopes emerging from this protein, providing immunogen peptides for vaccination: Following in silico prediction with the SYFPEITHI-tool, in vitro verification of highly likely HLA-A*0201- and HLA-B*5101-restricted epitopes was aspired. Monocyte-derived, synthetic peptide pulsed Dendritic Cells from healthy donors functioned as activating professional Antigen Presenting Cells for the wanted naive and peptide-specific CD8+ T-cell in the PBMC-lymphocyte-pool of the identic donor. After priming, repetitive stimulation and proliferation, cultures were analyzed for distinct specific populations, mainly by IFNgamma- Intracellular Cytokine Staining. Tumor cell lysis assays were planned for proof of endogenous processing and presentation of the studied epitope candidates as well as the generated effector-populations' cytotoxic capacity. Out of eight and ten HLA-A*0201- and HLA-B*5101-restricted predicted candidates respectively, in nineteen leukocyte donations two in each case proved immunogenicity and were able to induce distinct peptide-specific IFNgamma-producing CD8+-T-cell-populations: Hence RLAGDGVGAV, CK7 402-411 and TLNETELTEL, CK7 227-236 (HLA-A*0201-restricted) as well as DGVDAVNI, CK7 406-413 and TAAENEFVV, CK7 188-198 (HLA-B*5101-restricted) are now identified as epitopes. Simply proof of natural processing and presentation is pending. Because of - up to this point - unsuccessful endeavors to HLA-transfect the CK7-overexpressing pancreatic carcinoma cell line Capan-1, cytotoxicity assays could not yet be performed. Future tumor cell killing-experiments and evaluation of spontaneous in vivo responses to these four epitopes in patients with CK7-overexpressing tumors should bridge this gap and path the way to an application as vaccine in pancreatic carcinoma as well as in a variety of different entities. Regrettably our patient could not profit any more from the desired vaccination.

In dieser Arbeit wurden die T-Zellen von Patienten untersucht, welche im Rahmen einer Immuntherapie-Studie zur adjuvanten Behandlung des fortgeschrittenen Nierenzellkarzinoms Peptidvakzinierungen erhalten hatten. Bei der Studie handelt es sich um eine Kooperation der Klinik für Urologie der Universität Tübingen mit dem Interfakultären Institut für Zellbiologie, Abteilung Immunologie Tübingen. Die Patienten wurden entsprechend ihres HLA-Typs in HLA-A*02-positiv und -negativ unterteilt und dann randomisiert zwei Studienarmen zugeordnet. Die eine Gruppe erhielt GM-CSF als Adjuvans zu den intradermal injizierten Peptiden, während die andere Gruppe die Peptide subkutan in einer Emulsion mit Montanide verabreicht bekam. In beiden Studienarmen waren bis zu 18 Vakzinierungen über ein Jahr vorgesehen, die unterbrochen wurden, wenn die Erkrankung progredient war. Zum Zeitpunkt der in der vorliegenden Arbeit gezeigten Untersuchungen waren die Vakzinierungen bei zehn Patienten beendet, von denen je fünf aus dem Montanide- und fünf aus dem GM-CSF-Studienarm stammten. An Tag 0 und bei jeder weiteren Vakzinierung waren den Patienten Blutproben entnommen worden, aus denen die Lymphozyten isoliert wurden. Diese eingefrorenen Zellen wurden nach dem Auftauen mit den Impfpeptiden der HLA-Klasse I und II präsensitiviert und ihre IFNg-Sekretion 12 Tage später nach einer erneuten Peptidstimulation in Elispot-Assays analysiert. Zusätzlich wurden die CD8+ T-Zellen in Tetramer-Färbungen und die CD4+ T-Zellen in intrazellulären Zytokinfärbungen untersucht. Die Vakzinierungen induzierten einzelne HLA-Klasse-I-Antworten, von denen sich die meisten gegen ein Impfpeptid von Cyclin D1 richteten. Die Antworten traten zwischen der 6. und 10. Vakzinierung auf und waren insgesamt sehr schwach ausgeprägt. Gegen drei weitere HLA-Klasse-I-Peptide wurde bei je einem Patienten eine T-Zellinduktion gezeigt, während für die anderen sechs HLA-A*02-Peptide und die elf Peptide anderer HLA-Restriktionen keine Antworten gesehen wurden. Wesentlich stärkere Antworten wurden dagegen mit den HLA-Klasse-II-Peptiden erzielt. Die Peptide von Cyclin D1 (CCND1) und der Carboanhydrase 9 (G250) wurden bei fast allen Patienten im Elispot und in der intrazellulären Färbung ab der 2.-4. Vakzinierung positiv getestet. Für das Peptid der Matrix-Metalloproteinase 7 konnte bei keinem Patienten eine T-Zellinduktion gezeigt werden. Die CCND1-spezifischen CD4+ T-Zellen konnten bei einem Patienten mit einer sehr starken IFNg-Sekretion auch in einem ex-vivo-Elispot nachgewiesen werden, wobei ihre Frequenz deutlich niedriger als nach Präsensitivierung war. Die CD4+ T-Zellen produzierten nach Stimulation mit CCND1 und G250 nicht nur vermehrt IFNg, sondern auch IL-5 und IL-10. Um welche Zellpopulationen es sich dabei handelt und welche Bedeutung sie für den klinischen Verlauf haben, ist zum jetzigen Zeitpunkt noch unklar. Ob die Patienten auch klinisch von den Vakzinierungen profitieren, kann erst nach Auswertung aller 40 im Studienprotokoll vorgesehenen Patienten abschließend bewertet werden. In the present work T cells from patients with advanced renal cell carcinoma were analysed before and after immunotherapy which consisted of several peptide vaccinations as adjuvant treatment after surgery. The study is a cooperation between the Clinic for Urology and the Institute for Cell Biology, Department of Immunology both of the University of Tübingen. The patients were subdivided into an HLA-A*02-positive and -negative group according to their HLA-type and then randomised into two arms. In the first arm they received intradermal injections of several peptides and GM-CSF as adjuvant whereas patients in the second arm had subcutaneous injections of peptides emulsified in Montanide. A mixture of 10 peptides, derived from tumor-associated antigens, was administered in the group of HLA-A*02-positive patients. For other HLA-types an individual set of peptides was applied. If patients were clinically stable they received up to 18 vaccinations over the course of one year. At the time of this work 10 patients out of 40 had finished their vaccination scheme. Blood samples had been taken at Day 0 and after every vaccination out of which lymphocytes were isolated and frozen. For T cell monitoring these cells from different time points were thawed. Because of their low frequencies specific T cells had to be stimulated with the same peptides that had been used in vaccination and after 12 days of pre-sensitization their IFNg-secretion was tested in Elispot-assays after another stimulation with the peptides of interest. Additionally, T cells were analysed using Tetramer stainings for CD8+ T cells and intracellular cytokine stainings for CD4+ T cells. It could be shown that the vaccinations with HLA-Class I-peptides induced some responses, out of which Cyclin D1 was the most frequently found. Responses appeared around the 6th to 10th vaccination and were in general quite weak. Three more HLA-Class I-peptides were found to be positive after vaccination in just one patient. For the rest (6 HLA-A*02-peptides and 11 peptides of other restrictions) no T-cell responses could be detected. In contrast strong responses to HLA-Class II-peptides were found in all but one patient and were mainly directed against peptides from Cyclin D1 (CCND1) and Carboanhydrase 9 (G250). The increased IFNg-secretion after stimulation with these peptides was detected by Elispot as well as intracellular staining as early as from 2nd to 4th vaccination on. The peptide of Matrix-Metalloproteinase 7 showed no T cell induction at all. In a patient with a very strong response to CCND1 specific CD4+ T cells could also be found in an ex-vivo-Elispot, although their frequencies were a lot lower. Cytokine stainings revealed that after stimulation with CCND1- and G250-peptides CD4+ T cells didn’t only produce increased levels of IFNg but also of IL-5 and IL-10. Which population is responsible for this observation and if it is of any clinical relevance remains unclear until now and has to be further investigated. At this point it can be concluded that the vaccinations have induced T-cell responses, which were more pronounced in the case of HLA-Class II. The clinical outcome will be evaluated when the data of all 40 patients are available.

Everyday, in multicellular organisms several billions of cells die by programmed cell death type 1, apoptosis, whereby tissue homoeostasis is guaranteed. Dying and dead cells are engulfed by professional phagocytes without activation of proinflammatory immune responses. A multitude of signal molecules are involved in the recognition and the elimination of apoptotic cells. They can be divided on basis of their function into 'find-me' and 'eat-me' molecules, bridging proteins and their corresponding phagocyte receptors. The coordinated interaction of these signal molecules is a requirement for the timely removal of apoptotic cells. In case of dysfunctions in the clearance of dying cells, apoptotic cells undergo secondary (post-apoptotic) necrosis, which is characterized by release of the intracellular content due to proceeding loss of cell membrane integrity. Potentially cytotoxic and antigenic intracellular contents are able to induce proinflammatory immune responses, which can lead to the development of chronic inflammation and autoimmune diseases. The causes of the transition to secondary necrosis can be of different nature. For example, disfunctions in the elimination of apoptotic cells or high apoptosis rates, overwhelming the available scavenging capacity can play an important role. In the present thesis, it could be shown, that the bridging protein annexin A1 (anx A1), which was previously described in the context of different immunological processes, plays an important role in the elimination of post-apoptotic secondary necrotic cells and the post-phagocytic immune response. In the first part of this thesis, the role of anx A1 should be investigated in the context of phagocytosis of dying cells and the post-phagocytic immunological response. Anx A1 is an intracellular protein, which is known to be involved in efficient dying cell clearance. Consistent with its function as a bridging molecule in the phagocytic synapse, we could show that recognition and engulfment of apoptotic cells by professional phagocytes can be enhanced by addition of exogenous purified anx A1. In a detailed analysis we could show that anx A1 is only slightly externalized on the apoptotic cell surface but strongly exposed by secondary necrotic cells. The phagocytosis level of secondary necrotic cells could not be enhanced by addition of exogenous anx A1. Most interestingly, we could demonstrate that anx A1 externalisation on secondary necrotic cells strongly influenced the post-phagocytic response when these cells were ingested by macrophages. It could be clearly demonstrated that engulfment of secondary necrotic anx A1 externalizing cells resulted in a strongly reduced proinflammatory cytokine production in comparison to secondary necrotic cells, not exposing anx A1 on their cell surface. These results suggest that externalization of anx A1 during secondary necrosis displays an important failsafe mechanism to counteract against proinflammatory reactions, even when timely removal of apoptotic cells is impaired. In the second part of this thesis, it could be initially observed that only certain cell types externalized anx A1 after induction of secondary necrosis, and and that anx A1 externalization was accompanied by its proteolytical cleavage. In further investigations, the ‘a disintegrin and metalloprotease’ 10 (ADAM10) was identified to be responsible for anx A1 processing within its unique N-terminal domain. Thereby a small peptid of 6 amino acids was generated and released from the secondary necrotic cell surface. Most interestingly, this anx A1 N-terminal derived peptide was able to induce THP-1 monocytes recruitment. This observation was experimentally substantiated by a strong reduction of THP-1 transmigration to secondary necrotic cell culture supernatants when anx A1 or ADAM10 expression was silenced by administration of specific small interfering RNAs. Hence, the exposure and the proteolytic cleavage of anx A1 obviously represent final events of apoptosis, which after transition to secondary necrosis lead to monocyte recruitment to the site of impaired apoptotic cell clearance. Thus, anx A1 executes several functions in the elimination of dying cells: (I) as 'find-me' signal, released from secondary necrotic cells to recruit phagocytes, (II) as 'eat-me' signal, exposed on the cell surface to enhance binding between dying cell and phagocyte, and (III) as 'anti-inflammatory' mediator, reduced proinflammatory cytokine production after engulfment of secondary necrotic cells by the phagocyte. These newly described functions of anx A1 could have an important impact on novel therapeutic strategies for the treatment of chronic inflammatory processes and autoimmune diseases. In mehrzelligen Organismen sterben täglich mehrere Milliarden Zellen durch den programmierten Zelltod Typ1, Apoptose, wodurch eine Aufrechterhaltung der Gewebshomöstase gewährleistet wird. Die sterbenden und toten Zellen werden durch professionelle Phagozyten beseitigt, ohne das Immunsystem zu aktivieren. Eine Vielzahl an Signalmolekülen ist an der Erkennung und Eliminierung sterbender Zellen beteiligt. Diese werden anhand ihrer Funktion in 'find-me', und 'eat-me' Moleküle, Brückenproteine und ihre entsprechenden Rezeptoren unterteilt werden. Das koordinierte Zusammenspiel dieser Signalmoleküle ist die Voraussetzung für die rechtzeitige Beseitigung apoptotischer Zellen. Werden apoptotische Zellen durch eine Störung nicht rechtzeitig eliminiert, dann gehen sie in das Stadium der sekundären Nekrose über. Diese ist charakterisiert durch die Freisetzung des intrazellulären Inhalts auf Grund der fortscheitenden Durchlässigkeit der Zellmembran und kann zur Induktion von chronischen Entzündungen und / oder Autoimmunerkrankungen führen. Die Ursachen für das Auftreten sekundärer Nekrose können unterschiedlicher Natur sein. Störungen bei der Eliminierung apoptotischer Zellen oder massive Apoptoseinduktion, die die verfügbare Phagozytosekapazität überschreitet, können eine entscheidende Rolle spielen. In der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass das Brückenprotein Annexin A1 (anx A1), das bereits im Zusammenhang mit verschiedenen immunologischen Prozessen beschrieben wurde, bei der Eliminierung sekundär nekrotischer Zellen und der anschließenden Immunantwort eine wichtige Rolle spielt. Im ersten Teil dieser Arbeit sollte die Rolle von anx A1 im Zusammenhang mit der Phagozytose sterbender Zellen und der post-phagozytären Immunantwort untersucht werden. Anx A1 ist ein intrazelluläres Protein, das mit der effizienten Eliminierung apoptotischer Zellen in Verbindung gebracht wird. Übereinstimmend mit seiner Funktion als Brückenmolekül in der phagozytotischen Synapse konnten wir zeigen, dass die Erkennung apoptotischer Zellen durch die exogene Zugabe von gereinigtem anx A1 die Aufnahme durch professionelle Phagozyten deutlich verstärkte. In einer detaillierten Analyse stellte sich heraus, dass anx A1 nur schwach von apoptotischen Zellen aber sehr stark von sekundär nekrotischen Zellen auf die Zelloberfläche externalisiert wurde. Die Phagozytose sekundär nekrotischer Zellen wurde durch Zugabe von gereinigtem anx A1 jedoch nicht verstärkt. Interessanterweise, konnte mit dieser Arbeit gezeigt werden, dass die Externalisierung von anx A1 auf der Zelloberfläche von sekundär nekrotischen Zellen die post-phagozytäre Immunantwort von Macrophagen beeinflusste. Es wurde eindeutig nachgewiesen, dass nach Aufnahme sekundär nekrotischer Zellen durch Macrophagen, diese in Anwesenheit von anx A1 deutlich weniger proinflammatorische Zytokine freisetzten als in Abwesenheit von anx A1 auf der sekundär nekrotischen Zelloberfläche. Die Ergebnisse im ersten Teil dieser Arbeit zeigten, dass die Externalisierung von anx A1 während der sekundären Nekrose einen wichtigen Notfallmechanismus darstellen, der Entzündungsreaktionen entgegen wirkte, gerade dann wenn die rechtzeitige Aufnahme apoptotischer Zellen nicht gewährleistet war. Im zweiten Teil der vorliegenden Arbeit, konnten wir zu Beginn beobachten, dass die Externalisierung von anx A1 nach Induktion der sekundären Nekrose nur in bestimmten Zelltypen erfolgte, und mit einer proteolytischen Prozessierung von anx A1 auf der Zelloberfläche einherging. In den folgenden Untersuchungen wurde die Metalloprotease ADAM10 als diejenige Ectoprotease identifiziert, die anx A1 in seiner einzigartigen N-terminalen Domäne prozessierte. Dies führte zur Freisetzung eines kleinen Peptides von der Oberfläche sekundär nekrotischer Zellen, das in der Lage war, THP-1 Monozyten zu rekrutieren. Diese Beobachtung konnte durch eine deutlich reduzierte Transmigration auf Zellkulturüberstände sekundär nekrotischer Zellen, in denen die anx A1 oder die ADAM10 Expression inhibiert wurde, bestätigt werden. Die Externalisierung und die proteolytische Prozessierung von anx A1 stellen damit ein finales Ereignis während der Apoptose dar, das nach dem Übergang in die sekundäre Nekrose zur Anlockung von Monozyten beiträgt. Anx A1 hat daher offensichtlich mehrere Funktionen bei der Entsorgung sterbender Zellen: (I) als 'find-me' Signal, das von sekundär nekrotischen Zellen freigesetzt wird, (II) als 'eat-me' Signal, das die Bindung zwischen sterbender Zelle und Phagozyt unterstützt und (III) eine 'anti-inflammatorische' Funktion bei der Beseitigung sekundär nekrotischer Zellen. Da Defekte in der Eliminierung apoptotischer Zellen eine entscheidende Rolle bei der Entstehung bestimmter Autoimmunerkrankungen spielen, eröffnen diese neu beschriebenen Funktionen von anx A1 potentielle Perspektiven für die Entwicklung neuer Therapien von Autoimmunerkrankungen oder chronisch entzündlichen Prozessen.

Nierenzell- und kolorektale Karzinome zählen zu den führenden Malignomentitäten der westlichen Welt und stellen bei schlechter Therapierbarkeit und hoher Mortalität für den einzelnen Menschen eine ernsthafte Bedrohung, für die Gesellschaft eine relevante Belastung durch Ausfall an Arbeitskraft und steigende Kosten dar. Für beide Tumoren wurde mit der Vakzinierungstherapie ein neuer Behandlungsansatz durch Utilisation des eigenen Immunsystems verfolgt. Die vorliegende Arbeit baut auf diesem Prinzip auf. Nach Asservierung und allgemeiner bzw. spezieller Charakterisierung von über 50 nativen Tumorgeweben dieser Entitäten wurden über eine Säureextraktion nach Immunpräzipitation MHC- I- präsentierte Liganden der Tumorzelloberfläche isoliert und – mit Hilfe der jeweiligen HLA- Motive – massenspektrometrisch ihre Sequenz bestimmt. Insgesamt konnten 70 Liganden auf verschiedenen Tumorgeweben detektiert werden. Während ein Teil als vorbeschrieben bestätigt werden konnte, ließen sich andere, bekannte Peptide erstmalig auf diesen Entitäten nachweisen. Das Gros dieser Peptide war jedoch noch nie zuvor als HLA- Ligand identifiziert worden und konnte damit erstmalig beschrieben werden. Drei dieser bislang unbekannten Peptide entstammen Proteinen, die als Tumor- assoziierte Antigene anzusehen sind und nach verifizierter T- Zell- Stimulation zur gezielten, tumorspezifischen Stimulation des Immunsystems beitragen können. Konkret handelt es sich dabei um Peptide aus dem heterogenen nukleären Ribonukleoprotein K, dem Bax Inhibitor- 1 sowie Matrin. Alle drei Peptide können folglich in Vakzinierungskonzepte integriert werden und als neue Zielstrukturen der Therapie gelten. Zudem führte eine Effizienzsteigerung der separat analysierten, optimierten und an das Gewebe adaptierten Tumoraufarbeitung zur schrittweisen Individualisierung der Behandlung. Damit kann die vorliegende Dissertation anhand der gewonnenen Erkenntnisse die bestehende Immuntherapie von Nierenzell- und kolorektalen Karzinomen optimieren und dazu beitragen, die Behandlung künftig individualisierter, effizienter und für ein größeres Patientenkollektiv verfügbar zu machen. Renal cell carcinoma and colorectal carcinoma are predominant malignancies in the western world. Due to high mortality rates and limited therapy options, these tumors are a serious thread for each individual and cause a loss of manpower and highly increasing costs. Vaccination strategy based on the human immune system rises as a new therapy concept for both entities. After asservation and characterization, over 50 solid tumor tissues were processed by immunoprecipitation to isolate MHC- I- presented ligands on the tumor cell surface. Their peptide sequences were defined by mass spectrometry using HLA- motifs. Altogether over 70 ligands could be detected on various tumor tissues. Some of these peptides were already described before while most of them could be identified for the first time. Heterogeneous nuclear ribonucleoprotein K, bax inhibitor-1 and matrin are three so far unknown peptides which derive from tumor associated antigens and may lead to a tumor specific immune stimulation. Probably these peptides can be used as new targets for vaccination strategies in the future. By identifying new peptide ligands and improving the tumor tissue processing this work optimizes the preexisting immunotherapy for renal cell carcinoma and colorectal carcinoma and leads to a more efficient, individualized treatment for a broad population.

EBV führt oft zum Tod von immunsupprimierten Transplantationspatienten oder HIV-infizierten Personen und ist mit mehreren Tumorerkrankungen assoziiert. Der Einsatz einer neuen Therapie, der adoptive Transfer von zytotoxischen T-Zellen, ist unter anderem abhängig von der individuellen Epitopmuster-modulierenden HLA-Molekül-Kombination. Das Arbeitsziel ist eine Grundlage für die Untersuchung der HLA-B18-restringierten CD8+ T-Zell-Antwort zu schaffen. Die Analysen umfassen Peptide aus 18 EBV-Antigenen. Im ELISPOT, darunter im neu etablierten Pool-single peptide-ELISPOT, wurden IFN gamma-Antworten gegen multiple Epitopkandidaten, unter anderem gegen das neue Epitop SESGQFHAF, beobachtet. Um die HLA-B18-restringierte CD8+ T-Zell-Antwort zu studieren, wurden geeignete Komponenten, die transfektante Zelllinie K562-B18 und das HLA-B18-Tetramer, generiert. Das dominante Epitop SELEIKRY und der Epitopkandidat NEIHVYNDY liegen in funktionellen Proteindomänen. Das Epitop SELEIKRY ruft ex vivo eine polyfunktionale T-Zell-Antwort hervor. Epitop-spezifische T-Zellen wurden mit dem HLA-B18-SELEIKRY-Tetramer detektiert. Der modifizierte Vital-Assay bestätigte die Zytotoxizität von SELEIKRY- und SESGQFHAF-spezifischen CD8+ T-Zellen. Die durchgeführten Untersuchungen können als Grundlage bei weiterer Erforschung der HLA-B18-restringierten CD8+ T-Zell-Antwort helfen. EBV is frequently cause of death of immunosuppressed transplant patients or HIV-infected persons and is associated with several tumor diseases. The use of a new therapy, the adoptive transfer of cytotoxic T cells, depends inter alia from the epitope-modulating HLA molecule combination. The aim of the work is to provide a basis for the investigation of the HLA-B18 restricted CD8+ T cell response. Peptides from 18 EBV antigens were investigated in the analysis. In the ELISPOT assay, thereunder in the newly established pool-single peptide-ELISPOT, IFN gamma-responses to multiple epitope candidates, among others against the new epitope SESGQFHAF, were observed. Appropriate components, the transfectant cell line K562-B18 and HLA-B18-tetramer, were generated to study HLA-B18 restricted CD8+ T cell response. The dominant epitope SELEIKRY and the epitope candidate NEIHVYNDY are located in functional protein domains. The epitope SELEIKRY elicits ex vivo a polyfunctional T cell response. Epitope specific T cells were detected with the HLA-B18-SELEKRY-tetramer. The modified Vital Assay confirmed the cytotoxicity of SELEIKRY- and SESGQFHAF-specific CD8+ T cells. The performed investigations can assist as basis in further research of the HLA-B18 restricted CD8+ T cell response.

Autoimmuninflammation kann durch einen Irrtum der angeborenen oder adaptiven Immunantwort entstehen. Daraus resultiert Zellzerstörung und der Verlust entzündetes Gewebe zu heilen. Diese Komplikationen sind im systemischen Lupus erythematodes (SLE) und in der Alzheimer-Krankheit (AK) anzutreffen. Ziel dieser Dissertation war es in beiden Krankheiten zu einem besseren Verständnis inflammatorischer Mechanismen beizutragen. Im SLE stellt das Nukleosom ein primäres Autoantigen dar. (1) Wir zeigen, dass Nukleosomen im Plasma von SLE-Patienten die Sekretion proinflammatorischer Mediatoren in Neutrophilen (PMN, polymorphonukleäre Leukozyten) induzieren. Die Nukleosomen-induzierte Aktivierung war unabhängig von Endotoxinen, endosomaler Azidifizierung, unmethylierten Cytosin-phosphatidyl-Guanosin (CpG)-Motiven und dem Toll-ähnlichen Rezeptor (TLR) 9. Der hier verwendete Signalweg scheint im Gegensatz zu nicht methylierter CpG-ODN Unterschiede aufzuweisen. Demnach spielt TLR9 bezüglich des Nukleosoms eine andere Rolle in der angeborenen Immunität oder vermittelten Autoimmunität. (2) Außerdem berichten wir die Expression des TLR9 auf der Zelloberfläche von primären PMN. Dieser TLR9 erkennt CpG-Oligonukleotide (ODN), ist funktional und führt zur Aktivierung der PMN. Somit beschreiben wir einen neuen Signalweg für CpG-ODN und die Aktivierung von PMN. Im Morbus Alzheimer wird aggregiertes A beta durch eine Mikrogliose begleitet. (3) Die Untersuchung von infiltrierenden und im Gehirn vorhandenen Immunzellen führte zur Identifizierung dendritisch-ähnlicher Mikroglia. Die Charakterisierung in transgenen (tg) Alzheimer Mausmodellen sowie in humanen Gehirnen, zeigte, dass diese Zellen über eine gesteigerte Aktivität zur Phagozytose von Abeta ex vivo verfügen. Diese Fähigkeit wird jedoch durch die Expression verschiedener inhibitorischer Signale in vivo reguliert. Es war nicht möglich das Potential zur Phagozytose in vivo durch die genetische Deletion von Programmed Death (PD)-1 in dendritisch-ähnlichen Mikroglia wiederherzustellen. Unsere Daten festigen die Annahme, dass die Aktivierung von Mikroglia komplexer ist als ein einfaches Alles-oder-Nichts Prinzip. Abhängig vom Stimulus und von der biochemischen Umgebung zeichnet sich eine Reihe von qualitativ unterschiedlichen Immunantworten in vivo ab, die die Möglichkeit zur therapeutischen Intervention signalisieren. Der nächste wichtige Schritt ist es, die Modulation der hoch regulierten Effektormechanismen von PMN und Mikroglia-Zellen besser zu verstehen, um qualitativ gewünschte Resultate im SLE und in der AK zu erzielen. Dadurch ergeben sich nicht nur neue Einblicke in Pathomechanismen sondern auch Konsequenzen für unser Wissen über die Autoimmuninflammation Autoimmune inflammation potentially arises through aberrant reactions of innate or adaptive immunity. This results in cellular destruction and the failure to heal the inflamed tissue, complications which are seen in SLE and AD. The present study has as overarching theme the understanding of inflammatory mechanisms in both diseases. One major autoAg in SLE is the nucleosome. (1) We report here that nucleosomes from SLE patients’ plasmas induce the secretion of inflammatory mediators in neutrophils (PMN, polymorphonuclear leukocytes). Nucleosome-induced activation occurred independently of endotoxins, endosomal acidification, unmethylated cytosine-phosphate-guanosine (CpG)-motifs and Toll-like receptor (TLR) 9. Thus, the signaling pathway used is different from the classical pathway of unmethylated CpG-oligonucleotides (ODN). TLR9 might play different roles in nucleosome-induced innate immunity and anti-nucleosome autoimmunity. (2) We followed initial results by Viktoria Rönnefarth and report TLR9 expression at the cell surface of primary PMN. Cell surface TLR9 recognizes CpG-ODN and is functional, leading to PMN activation. Thus, we describe a novel pathway for DNA-recognition and PMN activation. The assembly of misfolded Abeta in AD is accompanied by microgliosis. (3) Close examination of infiltrating and CNS-resident immune cells lead to the identification of dendritic-like microglia. Characterization in transgenic (tg) AD mice as well as in human brain material, demonstrated that these microglia possess a high activity of phagocytosing Abeta ex vivo. However, this mechanism is highly regulated in vivo by the expression of several inhibitory signals. We were not able to restore the phagocytosing activity of dendritic-like microglia by simply ablating the gene for Programmed Death (PD)-1, which was highly and exclusively expressed on dendritic-like microglia. Our data solidify the interpretation that microglial activation is more complex than a simple all-ornothing process. Depending on the stimulus and biochemical environment, a wide range of qualitatively different immune responses may be elicited in vivo. The next important step is to develop a thorough understanding of how all these tightly regulated effector mechanisms of PMN and microglia can be modulated to produce qualitatively desired outcomes in SLE and AD. This knowledge is likely to advance our understanding of immune dysregulation and hyperactivation, which not only provides novel insight in pathomechanisms but also has implications for our current understanding of autoimmune inflammation.

In den letzten zwei Jahrzehnten ist die Immuntherapie gegen die verschiedensten Krankheiten zu einem vielversprechenden Forschungsgebiet geworden. Zur Bewertung der Forschungsversuche auf diesem Gebiet werden momentan die spezifischen Lymphozyten in vitro untersucht. Die Effektivität der zu testenden Vakzine wird durch die Art und Stärke der gegen die verwendeten Antigene (anti-Tumor oder virale Krankheiten) ausgelösten zellulären Immunantwort gemessen. Für diese Testsysteme wird eine große Anzahl von autologen Ziel-Zellen die das zu untersuchende Antigen exprimieren benötigt. Für die Auswertung der Vakzinierung mit messenger RNA (mRNA)-Impfstoffen werden dendritische Zellen (DCs), die aus Monozyten gewonnen werden, verwendet. Zur Herstellung von dendritischen Zellen aus Monozyten werden normalerweise mindestens 100 ml Blut vom Patienten benötigt. Die daraus generierte Anzahl an dendritischen Zellen begrenzt die Anzahl an Untersuchungen die durchgeführt werden können. In der vorliegen Arbeit wurde gezeigt, dass periphere mononukleäre Blutzellen (PBMCs, Peripheral blood mononuclear cells) mit mRNA elektroporiert werden können. Diese transfizierten PBMCs können Gedächtnis–T-Zellen in vitro ebenso effizient aktivieren wie mRNA-transfizierte DCs. Es wurden verschiedene Methoden zur mRNA-Transfektion getestet und etabliert. Ebenso wurde ein Testsystem mit diesen transfizierten PBMCs als Ziel-Zellen etabliert, um natürliche oder durch Vakzine ausgelöste Immunantworten in vitro nachzuweisen. In the last two decades the research in immunotherapies against a wide range of diseases increased very rapidly. To evaluate these immunotherapies currently the lymphocyte´s activity in vitro is measured. The efficacy of the tested vaccines needs to be evaluated by quantification and characterization of the triggered cellular immune response against the used antigens. For these assays a large number of autologous target cells expressing the vaccine antigen are required. For the read-out of messenger RNA (mRNA)-based vaccination studies as target cells mRNA-transfected monocyte-derived Dendritic Cells (Mo-DCs). Their production normally needs at least 100 ml of patients blood. This limits the number of assays that can be performed. We show here that fresh Peripheral Blood Mononuklear Cells (PBMCs) can be transfected with mRNA by electroporation. These transfected PBMCs are as effective as mRNA-transfected MO-DCs in activating memory T-cells in vitro. We tested and established different transfection methods and protocols. We also established an assay system with the transfected PBMCs as target cells for the in vitro monitoring of natural or vaccine-induced immune responses.

T-Zell basierte Ansätze der Immuntherapie von Krebspatienten setzten neben der Identifikation geeigneter Tumor-assoziierter Antigene ein fundiertes Wissen über die zellulären Vorgänge des Immunsystems im Bereich des Tumors voraus. Zur Entwicklung innovativer Therapieansätze ist die phänotypische und funktionelle Charakterisierung Tumorantigen-spezifischer T-Zellen von zentraler Bedeutung. Die Untersuchung von Zytokeratin 18-spezifischen CD8+ T-Zellen in gesunden Individuen zeigte, dass diese seneszenten und hochdifferenzierten Lymphozyten keine detektierbare regulatorische Funktion auf andere Zellen des peripheren Blutes ausüben. Lymphozyten, welche spezifisch Ker1-Tetramere binden zeigten keine Aktivierung nach der Stimulation mit dem synthetisch hergestellten Ker1-Peptid. Es konnte jedoch erstmals die Induktion einer schwachen Proliferation dieser Zellen durch Stimulation mit einer leicht modifizierten Peptidsequenz in einem gesunden Spender gezeigt werden. In Patienten mit Colorektalem- (CRC) und Nierenzellkarzinom (RCC) war es möglich funktionelle CD4+ T-Zellen gegen HLA Klasse II-restringierte Peptide Tumor-assoziierter Antigene zu identifizieren. Hierbei konnten in RCC-Patienten zwei beschriebene Klasse II-Liganden von cMet und Zytokeratin 18 als T-Zellepitope identifiziert werden. Interessanterweise zeigten zytotoxische CD8+ T-Zellen in den untersuchten Krebspatienten keine Zytokinproduktion nach Stimulation mit verschiedenen Tumor-assoziierten HLA Klasse I-Peptiden. Der Vergleich periphärer und Tumor-infiltrierender T-Lymphozyten von RCC-Patienten zeigte in Letzteren einen erhöhten Anteil von Effektorzellen, welche sowohl zytotoxische, aber auch inhibitorische Oberfächenmarker aufwiesen. Die Tumor-infiltrierenden T-Zellen zeigten zudem eine reduzierte Expression früher Aktivierungsmarker im Vergleich zu denen der Peripherie, welche sich im Falle der CD8+ Lymphozyten nach Antigen-unabhängiger Stimulation in einer verminderten Produktion von TNF-Alpha, IFN-Gamma und IL-2 widerspiegelte. Weiter konnte ein erhöhter Anteil multifunktioneller T-Zellen in der Gruppe der Tumor-infiltrierenden CD4+ Lymphozyten im Vergleich zu T-Zellen aus der Peripherie beobachtet werden. Neben den Effektorzellen wurden in RCCs vermehrt tumor-infiltrierenden T-Zellen mit Markern regulatorischer Lymphozyten detektiert. Hierbei handelte es sich sowohl um regulatorische CD4+ Zellen, als auch um IL-10 produzierende CD8+ T-Lymphozyten. Sollte es in der Zukunft gelingen die Inhibition von Effektorzellen aufzuheben und regulatorische T-Zellen zu kontrollieren, könnte eine effektive Bekämpfung von Tumoren durch das eigene Immunsystem des Patienten möglich werden. T cell based approaches for the Immunotherapy of cancer patients require not only a profound knowledge of the immune system’s cellular processes in areas of tumor growth, but also identification of adequate tumor associated antigens. It is essential to characterize tumor-specific T cells both phenotypically as well as functionally for the development of new and innovative therapeutical strategies. Investigating Cytokeratin 18-specific CD8+ T cells of healthy donors revealed that these senescent and highly differentiated lymphocytes have no detectable regulatory effects on peripheral blood cells. T lymphocytes specifically bound to Ker1-tetramers do not show activation after stimulation with synthetic Ker1-peptide. However, the cells of one healthy individual exhibited moderate proliferation as result of stimulation with a modified peptide sequence. Functional CD4+ T cells specific for HLA class II-restricted tumor-associated antigens could be identified in patients with colorectal (CRC) and renal cell carcinoma (RCC). It was possible to verify two published HLA class II ligands of cMet and Cytokeratin 18 as T cell epitopes. Interestingly, no cytokine production of cytotoxic CD8+ T lymphocytes could be detected upon stimulation with tumor-associated HLA class I peptides. Comparison of peripheral blood and tumor-infiltrating lymphocytes (TILs) of RCC patients showed that the latter exhibit a higher amount of T cells expressing markers associated with cytotoxic effector functions. However, a reduction of early activation markers upon unspecific stimulations such as a decreased production of TNF-alpha, IFN-gamma and IL-2 could be observed in CD8+ TILs in comparison to peripheral T cells. By comparing peripheral and tumor-infiltrating lymphcytes, an increased number of multifunctional CD4+ T cells could be detected in the last group. The increase of effector cells in TILs was accompanied by a higher number of regulatory T cells. Thus, an increase of regulatory CD4+ T lymphocytes and IL-10 producing CD8+ cells were observed in TILs compared to peripheral cells. By undermining the inhibition of effector cells and effectively controlling regulatory T cells, it may be possible to induce immune responses against tumors in cancer patients in the future.

The immunoreceptor NKG2D promotes immunosurveillance of malignant cells and protects the host from tumour initiation by activating NK cells and costimulating CD8 T cells. MICA and other ligands of NKG2D are frequently expressed by tumour cells. Human tumour cells are thought to avert NKG2D-mediated-immunosurveillance by shedding MICA and other NKG2D ligands (NKG2DL). This thesis shows that the GPI-anchored NKG2DL ULBP2 is released from the cell surface of tumour cells by the action of metalloproteases similarly to the type I transmembrane proteins MICA and MICB. In addition, soluble ULBP2 was detected in the serum of patients with hematopoetic malignancies. Shedding of MICA and ULBP2 from tumours was induced by activation of protein kinase C (PKC) and was inhibited by the same compounds suggesting that ULBP2 and MIC molecules are released by the same or closely related proteases. Further, the molecular mechanisms of MICA shedding were defined to characterise the proteases involved. Amino acid deletions in the membrane-proximal stalk region of the MICA ectodomain greatly impaired MICA shedding, whereas amino acid substitutions had no significant effect. Further, MICA shedding was blocked by specific inhibitors of “a disintegrin and metalloprotease” (ADAM) proteases and was markedly reduced when ADAM10 and/or ADAM17 were down-regulated by RNA-interference. Altogether, these data demonstrate that ADAM10 and ADAM17 are critically involved in the proteolytic release of soluble MICA by tumours and thereby likely contribute to tumour immune evasion. Therefore, therapeutic blockade of ADAM10 and ADAM17 activities may represent a novel attractive approach to improve the efficacy of immunotherapeutic cancer treatment. NKG2D ist ein aktivierender NK-Zell Rezeptor und ein kostimulierender Rezeptor auf CD8 T Zellen. Die Expression der NKG2D Liganden (NKG2DL) wird durch Zellstress, virale Infektion und im Zuge maligner Transformation induziert und ermöglicht so dem Immunsystem die Erkennung und Elimination von veränderten und potentiell „gefährlichen“ Körperzellen (z. B. Tumoren). Die Freisetzung von löslichen NKG2D Liganden durch Metalloproteasen wird als ein wichtiger Mechanismus der Tumorzellen zur Vermeidung einer Immunantwort erachtet. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass auch der NKG2DL ULBP2, wie z. B. die MIC-Moleküle MICA und MICB, in löslicher Form von der Zelloberfläche von Tumorzellen freigesetzt wird. Lösliches ULBP2 konnte im Serum von Leukämie-Patienten nachgewiesen werden. Die Tumor-assoziierte Freisetzung sowohl von ULBP2 als auch von MICA ließ sich durch Aktivierung der Protein Kinase C verstärken und durch die gleichen Inhibitoren blockieren. Dies führte zu der Schlussfolgerung, dass sowohl die MIC Moleküle als auch ULBP2, als Vertreter der GPI-verankerten ULBPs, durch die gleichen oder nah verwandte Proteasen freigesetzt werden. Zur Identifizierung dieser Proteasen wurde beispielhaft der NKG2D Ligand MICA gewählt. Es konnte gezeigt werden, dass MICA in der Stielregion, die sich zwischen der Transmembranregion und der Ektodomäne befindet, gespalten wird. Wichtig für die Freisetzung ist nicht die Aminosäuresequenz, sondern die Länge dieser Stielregion. Des Weiteren konnte die Bildung von löslichem MICA durch Inhibitoren, die spezifisch gegen Mitglieder der ADAM (eine Disintegrin und Metalloprotease) Proteasen gerichtet sind, verringert werden. Die aufgrund dieser Experimente getätigte Annahme, dass ADAM10 und ADAM17 an der Freisetzung von löslichem MICA beteiligt sind, konnte in zwei unabhängigen Versuchsansätzen durch transiente Expressionssuppression dieser ADAMs in zwei Tumorzelllinien bestätigt werden. Zusammenfassend konnte gezeigt werden, dass die Metalloproteasen ADAM10 und ADAM17 an der Freisetzung von löslichem MICA von Tumorzellen beteiligt sind und somit einen interessanten Ansatzpunkt zur Verbesserung der Immuntherapien von Tumoren bieten.

Die Behandlung lymphoider Neoplasien konnte in den letzten Jahren insbesondere durch Antikörper-basierte Therapeutika deutlich verbessert werden. Dennoch stellen Rezidive weiterhin ein schwerwiegendes Problem dar, weshalb ein großer Bedarf an innovativen Therapieoptionen besteht. Das zentrale Ziel dieser Arbeit bestand daher in der Entwicklung und funktionellen Charakterisierung neuer Antikörper-basierter Immuntherapeutika. Dabei wurden folgende Moleküle untersucht, welche auf unterschiedliche Weise wirken, die aber alle gegen das CD20-Antigen auf Lymphomzellen gerichtet sind: • Monospezifische anti-CD20-Antikörper mit optimiertem Fc-Teil Wie die Erfolgsgeschichte des chimären monoklonalen anti-CD20-Antikörpers Rituximab zeigt, stellen derartige Antikörper einen effizienten Ansatz bei der Therapie von B-Zell-Lymphomen dar. Dabei spielt die Antikörper-vermittelte zelluläre Zytotoxizität (ADCC) eine wesentliche Rolle. Im Rahmen dieser Arbeit wurde basierend auf den Arbeiten von Lazar et al. [Lazar et al., 2006] und mit Hilfe von durch L. Große-Hovest (Abt. Immunologie, Universität Tübingen) entwickelten Expressionsvektoren ein Austausch der Aminosäuren S293 zu D293 und I332 zu E332 im Fc-Teil des anti-CD20-Antikörpers 2H7 durchgeführt. Dadurch konnte die Effizienz der Antikörper-vermittelten zellulären Zytotoxizität (ADCC) um mehrere Zehnerpotenzen gesteigert werden. Dies ist auf eine verbesserte Interaktion mit den aktivierenden Fc-Rezeptoren von Effektorzellen zurückzuführen. Auch durch einen einfachen Wechsel der Expressionszelllinie hin zu der gering-fucosylierenden Zelllinie YB2/0 konnte die ADCC-Effizienz wesentlich gesteigert werden. Durch eine Kombination der Aminosäure-Mutation und einer Expression in YB2/0-Zellen wurde jedoch keine weitere Verbesserung der ADCC-Effizienz erreicht. • Bispezifische Antikörper zur supra-agonistischen T-Zellstimulation über CD28 Bispezifische Antikörper können so konstruiert werden, dass nur dann eine Aktivierung von Oberflächenrezeptoren auf Immunzellen möglich ist, wenn sie mit ihrem zweiten Arm gleichzeitig an das Zielantigen, in der Regel ein tumorassoziiertes Antigen, gebunden haben. Grosse-Hovest et al. gelang es 2003 erstmalig eine Zielzell-restringierte supra-agonistische CD28-Stimulation mit einem rekombinanten bispezifischen single-chain Antikörper mit Spezifität CD28 x NG2 (r28M) zu zeigen [Grosse-Hovest et al., 2003]. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit konnte für den bispezifischen single-chain Antikörper r2820 mit Spezifität für CD28 und CD20 nachgewiesen werden, dass er die Fähigkeit zur Vermittlung einer Zielzell-restringierten supra-agonistischen T-Zellaktivierung und einer Lyse CD20-positiver Zielzellen im vollständig autologen System besitzt. Dies zeigt, dass die Zielzell-restringierte supra-agonistische CD28-Stimulation keine besondere Eigenschaft der im r28M-Molekül enthaltenen Spezifität für NG2 ist, und dass die supra-agonistische Aktivität nicht durch allogene Effekte bedingt ist. • Bispezifische Antikörper zur selektiven Apoptoseinduktion über CD95 Basierend auf der Beobachtung, dass bispezifische F(ab‘)2-Fragmente mit Spezifität CD20 x CD95 in der Lage sind, in vitro, in humanen CD95-sensitiven, Zielantigen-positiven Lymphomzellen (SKW6.4) Apoptose zu induzieren [Jung et al., 2001], wurden verschiedene bispezifische F(ab‘)2-Fragmente mit Spezifität CD20 x CD95 in vitro näher charakterisiert und auf verschiedenen, unterschiedlich sensitiven B-Lymphomzelllinien untersucht. Erstmalig konnte in Immuntherapieversuchen in einem SCID-Maus-Xenograft-Modell gezeigt werden, dass solche bispezifischen F(ab‘)2-Fragmente auch in vivo eine effektive Tumorzelllyse vermitteln können. Zusätzlich wurde eine neue Variante der Stimulation des Todesrezeptors CD95 mit bispezifischen Antikörpern evaluiert: Ein rekombinanter monoklonaler Antikörper gegen CD20 wurde am C-Terminus mit einem c-myc-Epitop versehen. Durch eine Kombination mit einem bispezifischen F(ab‘)2-Fragment mit Spezifität anti-c-myc x anti-CD95 wurde es möglich, eine CD95-vermittelte Apoptose der Tumorzellen zu induzieren. Der wesentliche Vorteil dieses Ansatzes ist die Möglichkeit, ein universell einsetzbares bispezifisches F(ab‘)2-Fragment verwenden zu können, so dass nicht für jedes Zielantigen ein neues F(ab‘)2-Fragment aus den jeweiligen Ausgangsantikörpern hybridisiert werden muss. Dadurch kann die Problematik der aufwendigen Produktion bispezifischer Antikörper, die die klinische Applikation dieser Substanzen bis heute behindert, in der Zukunft deutlich abgemildert werden. Die prä-klinischen Studien dieser Arbeit verdeutlichen das hohe Potential Antikörper-basierter Therapeutika die gegen das CD20-Antigen gerichtet sind und zeigen neue Wege auf, wie die therapeutische Aktivität von anti-CD20-Antikörpern verbessert werden kann. Treatment of lymphoid malignancies has improved considerably over the last years due to antibody-based therapeutics. Nevertheless relapse remains a major problem and the development of innovative therapeutic options is highly desirable. The central aim of this thesis was the development and functional characterization of antibody-based immunotherapeutics. In this thesis the following molecules were produced and characterized which exert their therapeutic effects in different ways, but which are all directed against the CD20-antigen on lymphoma cells: • Monospecific anti-CD20-antibodies with optimized Fc-part The success story of the chimeric monoclonal anti-CD20-antibody Rituximab demonstrates that monoclonal anti-CD20-antibodies are an efficient modality for the treatment of B-cell lymphomas. The antibody-dependent cellular cytotoxicity (ADDC) plays an essential role in mediating this activity. Based on the work of Lazar et al. [Lazar et al., 2006] and using expression vectors developed by L. Große-Hovest (Department of Immunology, University of Tübingen) the amino acids S293 and I332 in the Fc-part of the anti-CD20-antibody 2H7 were exchanged to D293 and E332. This led to an increase in the efficacy of antibody-mediated cellular cytotoxicity by several orders of magnitude. In addition by a simple change of the expression cell line to the lower fucosylating YB2/0 cells a considerable increase of ADCC efficacy could be achieved. A combination of the mutation and expression approach did not further increase the ADCC-efficiency. • Bispecific antibodies for a supra-agonistic T-cell stimulation via CD28 Certain bispecific antibodies mediate the activation of surface receptors in a target cell restricted way. In 2003 Grosse-Hovest et al. showed for the first time a target-cell restricted, supra-agonistic CD28-stimulation using a recombinant bispecific single-chain antibody with CD28 x NG2 specificity (r28M) [Grosse-Hovest et al., 2003]. In this thesis it could be demonstrated that the bispecific single-chain antibody r2820 with specificity for CD28 and CD20 has the ability to mediate a target-cell restricted, supra-agonistic T-cell stimulation and tumor cell lysis in an autologous sytem. Thus, target-cell restricted supra-agonistic CD28-stimulation is neither a property of the particular antibodies contained in the r28M molecule nor is it due to allogeneic effects. • Bispecific antibodies for selective induction of CD95-mediated apoptosis Bispecific F(ab‘)2-fragments with CD20 x CD95 specificity are capable of inducing apoptosis in human CD95-sensitive, target-antigen positive lymphoma cells (SKW6.4) in vitro [Jung et al., 2001]. Therefore CD20 x CD95 bispecific F(ab‘)2-fragments were further analysed in vitro using cell lines of different sensitivity towards CD95-mediated cell death. Furthermore, it could be shown for the first time that such bispecific F(ab‘)2-fragments mediate a tumor cell lysis in a SCID-mouse-xenograft-model. Moreover a completely new approach for a stimulation of the CD95 death receptor was evaluated: A c-myc-epitope was attached to the C-terminus of a recombinant monoclonal anti-CD20-antibody and was used in combination with a bispecific F(ab‘)2-fragment with specificity anti-c-myc x anti-CD95. This combination of reagents induced a CD95-mediated apoptosis of the tumor cells. The main advantage of this approach is the ability to use a universal bispecific F(ab‘)2-fragment targeting tagged antitumor antibodies of different specificities. This attenuates the production problem for bispecific antibodies which hampered the clinical evaluation of these reagents over the years. These preclinical studies indicate the high potential of CD20-directed, antibody-based therapeutics and show new approaches for the optimization of the therapeutic activity of anti-CD20-antibodies.

NK cell activity is governed by the complex interplay of multiple activating, inhibitory and co-stimulatory receptors. Therefore, a thorough understanding of NK cell biology requires the functional definition of these various receptors and their ligands. The NKC-encoded, homodimeric C-type lectin-like molecule NKp80 has been described as an activating orphan receptor, which is almost exclusively expressed by NK cells and stimulates NK cytolysis. This thesis identifies the adjacently encoded C-type lectin-like molecule AICL as a physiological ligand of NKp80. It also defines AICL as a myeloid-specific, activating receptor expressed on monocytes, macrophages and granulocytes. AICL is up-regulated in response to TLR stimulation and down-regulated during differentiation of monocytes to immature DCs. Cross-linking of AICL stimulated TNFalpha-release by monocytes, which was further enhanced by LPS stimulation. Additionally, it was shown that the NKp80-AICL interaction promotes lysis of AICL-expressing cells by NK cells. Malignant U937 cells were strongly lyzed by NK cells, whereas cytolysis of autologous LPS-activated monocytes was considerably lower or even absent depending on the donor. In other studies NK cell-mediated killing of infected monocytes and macrophages has been reported, and in these situations TLR-induced AICL expression may aid in the elimination of cells exposed to or infected by pathogens. Further, this work shows that secretion of pro-inflammatory cytokines, i.e. IFNgamma from NK cells and TNFalpha from monocytes, in co-cultures of NK cells and monocytes was strongly augmented by NKp80 engagement, and that the NKp80-AICL interaction accounts, at least in part, for the previously described cell contact-dependency of the activating cellular cross-talk between monocytes and NK cells. This thesis is the first report describing cell-type specific receptors mediating an activating cellular cross-talk between human NK cells and monocytes, which is thought to play a role in acute and chronic inflammatory situations. Therefore these findings provide novel insights into the communication within the innate immune system and may have important implications for the immune defence of certain pathogens and the pathogenesis of autoimmune disorders. Die NK-vermittelte Zelllyse wird durch ein komplexes Zusammenspiel von inhibierenden, aktivierenden und costimulierenden Rezeptoren gesteuert. Für ein umfassendes Verständnis der NK-Zellbiologie ist eine funktionelle Charakterisierung dieser verschiedenen Rezeptoren und deren Liganden notwendig. Der NKC-kodierte C-Typ lektin-ähnliche aktivierende NK-Rezeptor NKp80 wird als Homodimer fast ausschließlich auf NK-Zellen exprimiert und ist in der Lage NK Cytotoxizität zu vermitteln. Diese Arbeit identifiziert AICL als physiologischen Liganden von NKp80 und etabliert AICL als myeloidspezifischen, aktivierenden Rezeptor, der auf Monozyten, Makrophagen und Granulozyten exprimiert wird. AICL wird nach TLR-Stimulation hochreguliert, während AICL bei der Differenzierung von Monozyten zu unreifen DCs herunterreguliert wird. Die AICL-Aktivierung führt zur TNFalpha-Freisetzung durch Monozyten, was durch die Stimulation mit LPS noch verstärkt wird. Im Rahmen dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass AICL-exprimierende Zellen NKp80-vermittelt lysiert werden. Maligne U937-Zellen werden durch NK-Zellen in hohem Maße lysiert, autologe LPS-stimulierte Monozyten dagegen spenderabhängig kaum oder gar nicht. Es ist bekannt, dass infizierte Monozyten und Makrophagen NK-vermittelt lysiert werden. In diesem Fall könnte die TLR-induzierte AICL-Expression zur Eliminierung von infizierten Zellen führen. Es konnte weiterhin gezeigt werden, dass bei der Kokultur von Monozyten und NK-Zellen NKp80-vermittelt entzündungsfördernde Cytokine freigesetzt werden, d.h TNFalpha durch Monozyten und IFNgamma; durch NK-Zellen. Die NKp80/AICL-Interaktion ist zumindest teilweise für die beschriebene Zell-Zell-Kontaktabhängigkeit dieser reziproken Aktivierung verantwortlich. Diese Arbeit liefert die erste Beschreibung von zelltypspezifischen Rezeptoren, die an dieser reziproken Aktivierung zwischen NK Zellen und Monozyten beteiligt sind, für die eine Rolle bei akuten oder chronischen Entzündungen postuliert wird. Diese hier beschriebene NKp80-AICL-Interaktion liefert neue Einblicke in die Kommunikation innerhalb des angeborenen Immunsystems und könnte bei der Immunantwort gegen bestimmte Pathogene oder bei der Pathogenese von Autoimmunerkrankungen bedeutend sein.

Nucleosome, the basic structure of chromatin and normal product of cell apoptosis, plays a pivotal role in both the induction and pathogenesis of systemic lupus erythematosus (SLE). Nucleosomes are found to circulate at high levels in patients with SLE and are thought to be one of the major autoantigens in SLE. In the present work, it is shown for the first time that physiological concentrations of purified nucleosomes trigger the activation and recruitment of neutrophils in vitro and in vivo in a Toll-like receptor (TLR) 2- and TLR4-independent manner. Nucleosomes directly induce the activation of human polymorphonuclear neutrophils (PMN) upon internalization, as determined by up-regulation of the cell surface molecules, CD11b and CD66b, IL-8 secretion, increased phagocytic activity and delayed apoptosis. The chemokine IL-8 is one of the most potent neutrophil chemoattractants. Serum IL-8 levels strongly correlate with the disease activity in SLE patients. Since SLE is an inflammatory disease and neutrophils are the first cells recruited to infection and inflammation sites, nucleosome-induced IL-8 secretion may thus result in enhanced inflammation via an amplification loop. Nucleosomes induce PMN activation without the requirement of immune complex formation and independently of CpG motifs in free nucleosomal DNA, endotoxin or high-mobility group box-1 (HMGB-1). PMN from both normal healthy donors and patients with SLE show responsiveness to nucleosome-induced activation. Moreover, nucleosomes probably trigger the activation of human PMN without engagement of endosomal nucleic acid-sensing TLRs. However, we identified a previously unknown subpopulation of human PMN, which do express TLR9 at the cell surface. Although nucleosomes slightly induce the up-regulation of Ly-6G and CD11b on the cell surface of bone marrow-derived neutrophils from TLR9-deficient mice, the role of TLR9 in nucleosome-induced innate immune cell activation needs further detailed investigation. Indeed, nucleosomes trigger a previously unknown pathway of innate immunity, which provides an essential piece of the puzzle in understanding how self-tolerance is overcome in patients with SLE. Nucleosomen sind die Grundbausteine der Chromatinstruktur und entstehen als Abbauprodukt beim programmierten Zelltod (Apoptose). Darüber hinaus spielen Nucleosomen eine entscheidende Rolle bei der Entstehung und dem Krankheitsverlauf des systemischen Lupus erythematodes (SLE). Hohe Konzentrationen zirkulierender Nucleosomen werden bei SLE-Patienten während eines Schubs festgestellt und deshalb als wichtiges Autoantigen angesehen. In der vorliegenden Arbeit wird erstmals gezeigt, dass physiologische Konzentrationen aufgereinigter Nucleosomen die Aktivierung und Rekrutierung von Neutrophilen in vitro und in vivo induzieren; und das unabhängig von Toll-like Rezeptor (TLR)2- und TLR4. Nucleosomen induzieren die Aktivierung dieser humanen polymorphkernigen Leukocyten durch Internalisierung, wie mittels Hochregulierung von Zelloberflächenmolekülen (CD11b und CD66b), Sekretion von Interleukin (IL)-8, erhöhter Phagocytoseaktivität und verzögerter Apoptose festgestellt werden konnte. Das Chemokin IL-8 lockt vor allem Neutrophile aus dem Blut zum Infektionsherd. Der IL-8-Gehalt im Serum von SLE-Patienten korreliert stark mit dem Krankheitsverlauf. Da der SLE eine entzündliche Erkrankung ist und Neutrophile die ersten Zellen an Infektions- und Entzündungsherden sind, bewirkt die Nucleosomen-induzierte Freisetzung von IL-8 das Aufrechterhalten der Entzündung über eine Verstärkerschleife. Die Nucleosomen induzieren hier die Aktivierung von Neutrophilen ohne Bildung von Immunkomplexen mit Autoantikörpern, außerdem unabhängig von CpG-Motiven (in der nucleosomalen DNA) sowie Endotoxinen oder HMGB-1. Neutrophile von gesunden Kontrollpersonen und SLE-Patienten reagierten sensitiv auf die Nucleosomen-induzierte Aktivierung. Es spricht vieles dafür, dass die Nucleosomen die Neutrophilaktivierung ohne Mitwirkung intrazellulärer TLR triggern. Zudem haben wir eine bis dato unbekannte Subpopulation humaner Neutrophiler entdeckt, die TLR9 auf der Zelloberfläche exprimieren. Obwohl die Nucleosomen eine schwache Hochregulierung der Zelloberflächenmoleküle Ly-6G und CD11b bei (Vorläufer-) Neutrophilen aus dem Knochenmark TLR9-defizienter Mäuse induziert haben, müssen weitere Experimente durchgeführt werden, um zu einem schlüssigen Ergebnis zu gelangen. In der vorliegenden Arbeit wird aufgezeigt wie Nucleosomen einen bisher unbekannten Signalweg der angeborenen Immunantwort triggern. Diese neuen Erkenntnisse liefern somit einen wichtigen Beitrag zum Verständnis wie die Toleranz gegenüber Selbstantigenen bei SLE-Patienten verloren geht.

Die Aktivierung der T-Zellen des Immunsystems erfolgt durch Interaktionen der T-Zell-Rezeptoren (TCR) mit spezifischen Komplexen aus MHC-Molekülen und antigenen Peptiden auf Ziel-Zellen, wodurch eine Kaskade von durch Kinasen vermittelten Protein-Phosphorylierungen ausgelöst wird. Die entstehenden Phospho-Tyrosin-Motive fungieren in der Rekrutierung und Aktivierung weiterer Enzyme. Ein Beispiel hierfür ist ist die Phosphorylierung des TCR/CD3-Komplex durch die Kinase LCK, gefolgt von der Rekrutierung der ZAP-70 Kinase. Im Zusammenspiel des TCR mit Costimuli wie z.B. CD28 werden zelluläre Antworten wie Genexpression und zum Kontakt-stabilisierenden Rearrangement des Zytoskeletts ausgelöst. Wegen der Bedeutung extrazellulärer Stimuli für die Immunantwort besteht ein großes Interesse an der Entwicklung analytischer Techniken, die die quantitative Analyse zellulärer Interaktionen und unterliegender molekularer Prozesse ermöglichen und so die Integration dieser Ereignisse in Signal-Netzwerke ermöglichen. Da die an der T-Zell-Aktivierung beteiligten Komponenten weitgehend bekannt sind, ist der nächste Schritt, die zur Aktivierung der T-Zelle führenden Ereignisse unter Berücksichtigung zeitlicher Abläufe und Stimulus-Intensitäten zu analysieren. Im ersten Teil dieser Arbeit wurden die Signalwege der T-Zell-Aktivierung auf der morphologischen Ebene untersucht. Zum Einen wurde die Empfindlichkeit eines Kontakts und zwischen einer T-Zelle und einer mit anti-CD3-Antikörpern beschichteten Oberfläche gegenüber einem zu unterschiedlichen Zeitpunkten zugegebenen LCK-Inhibitor untersucht. Weiterhin wurde der Einfluss von Inhibitoren verschiedener Signalproteine auf die Zell-Anheftung und Aktivierung des Transkriptionsfaktors NFAT von mit anti-CD3 und anti-CD28 in unterschiedlichen Kombinationen stimulierten Zellen in einem zellulären Mikroarray quantifiziert. Weiterhin dienten mikrostrukturierte Oberflächen zur Analyse der Einflüsse lokaler Stimulation auf die Rekrutierung von Signalproteinen. Auf der biochemischen Ebene wurde mit Hilfe von aus Protein-Protein Interaktionsmotiven abgeleiteten Peptidmikroarrays die stimulationsabhängige Ausbildung von Multiprotein-Komplexen analysiert. The activation of T cells in the immune system occurs via interactions of the T cell-receptors (TCR) with specfic complexes formed by MHC molecules and antigenic peptides on the surface of target cells, initiating a cascade of kinase-mediated protein phosphorylations. The resulting phosphotyrosine motifs enable the recruitment and activation of further enzymes.One example for this is the phosphorylation of the TCR/CD3-complex by the LCK kinase, followed by the recruitment of the ZAP-70 kinase. In concert of the TCR with costimuli such as CD28, cellular responses such as gene expression and contact-stabilizing rearrangements of the cytoskeleton are initiated. Because of the importance of extracellular stimuli for the immune response there is a great interest in the development of analytical techniques enabling the quantitative analysis of cellular interactions and the underlying molecular processes and thus the integration of these events into signalling networks. Since the components involved in T cell activation are widely known, the next step would be the analysis of these events considering time dependence and signal intensities. In the first part of this thesis, T cell signalling pathways were analyzed on the morphological scale. Firstly, the sensitivity of a contact between a T cell and an anti-CD3 functionalized surface to an LCK inhibitor was analyzed at different time points. In the next step, the influence of inhibitors of different signalling proteins on cell adhesion and the activation of the transcription factor NFAT induced by stimulation was quantified in a microarray, in which cells were stimulated by different immobilization concentrations of anti-CD3 and anti-CD28 antibodies. Moreover, microstructured surfaces were employed to analyze the influence of local stimulation on the recruitment of signalling proteins. On the biological scale, peptide microarrays derived from protein-protein interaction motifs were used to analyze the stimulation-dependent formation of multiprotein complexes.

Die Juvenile Idiopathische Arthritis (JIA) ist die häufigste rheumatische Erkrankung im Kindesalter. Auch wenn es zahlreiche Hinweise darauf gibt, dass es sich um eine Autoimmunerkrankung handelt, sind die der Pathogenese zu Grunde liegenden Vorgänge dieses Krankheitsbildes noch weitestgehend unbekannt. Ein suffizientes Tiermodell zur Erforschung dieser Krankheit ist ebenfalls bisher nicht gefunden worden. In der K/BxN-Mauslinie entwickelt sich am Tag 25 bis 35 spontan eine Arthritis der distalen Gelenke. Die Krankheit in diesem Mausmodell wird ausgelöst durch eine Autoimmunreaktion gegen das systemische Antigen Glukose-6-phosphat-Isomerase (GPI), ein zytosolisches Enzym der Glykolyse und Glukoneogenese. Die Krankheit kann durch Transfer von anti-GPI-Antikörpern in gesunde Wildtyp-Mäuse übertragen werden. Die Symptomatik erkrankter Mäuse deckt sich in auffallender Weise mit dem Erkrankungsbild menschlicher Arthritiden. Daher sollte hier untersucht werden, inwieweit eine humorale Autoimmunreaktion gegen GPI für die Pathogenese der JIA von Bedeutung ist. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass eine humorale Immunantwort gegen GPI kein allgemeines, pathogenetisches Prinzip bei der JIA ist. Auch wenn einige Patienten eine erhöhte Konzentration von anti-GPI-IgG im Serum zeigten, konnte für keine Patientengruppe methodenunabhängig eine erhöhte Konzentration von anti-GPI-IgG in Serum oder SF nachgewiesen werden. Das native Antigen, bestimmt durch die GPI-Aktivität, war erhöht im Serum von Patienten mit systemischer Verlaufsform der JIA. Ebenso fand sich eine lokalisierte Erhöhung der GPI-Aktivität in der SF. Diese ging mit einer Konzentrationserhöhung der Laktatdehydrogenase-Aktivität einher. Daraus läßt sich folgern, dass ein massiv erhöhter Zellumsatz in der Gelenkskavität zu einer Freisetzung von GPI führt, und somit die Voraussetzung für eine Exposition des Immunsystems mit diesem Antigen gegeben sind. Die in einer initialen Studie zur Spezifität und Sensitivität einer Immunantwort gegen GPI bei RA verwendete GPI-Präparation enthielt Verunreinigungen in beträchtlichem Ausmaß. Diese wurden in dieser Arbeit identifiziert. Es zeigte sich, dass auch diese Proteine IgG-Antikörper binden, aber ebenfalls ohne Spezifität für die JIA oder eine ihrer Untergruppen. Es bleibt also festzuhalten, dass das K/BxN-Mausmodell grundlegende Untersuchungen zum Verständnis von Autoimmunreaktionen erlaubt, ohne jedoch ein Modell für die Pathogenese humaner Arthritiden zu sein. Juvenile idiopathic arthritis (JIA) is the most common rheumatic disease in childhood. It is considered an autoimmune disease, but the underlying processes are quite unknown. To compound matters, there is no adequate animal model that would assist investigations of its pathogenic principles. In the K/BxN mouse model distal joints spontaneously develop arthritis on day 25 to 35. This disease is caused by a autoimmune response against the systemic, cytosolic antigen glucose-6-phosphate isomerase (GPI), a glycolytic and gluconeogenic enzyme. Transfer of antibodies targeting GPI triggers arthritis even in wildtype mice. The similarity of the symptoms in this animal model to human disease is striking. Therefore it was the aim of this study to evaluate the significance of humoral autoreactivity against GPI in the pathogenesis of JIA. The results reveal that a humoral immune response against GPI is not a common pathogenic principle of JIA. Even if some individuals showed an elevated concentration of serum anti-GPI-IgG, this was not true for JIA or its subgroups as compared to controls. GPI activity, representing the native antigen, was increased in the serum of patients suffering from the systemic form of JIA. Additionally, synovial fluid from joints of JIA patients showed strongly elevated GPI activities, paralleled by an increase of lactate dehydrogenase. This suggests an increased cell death in the synovial cavity, resulting in the release of GPI, and thus exposing this antigen to the immune system. A previous study on the specificity and sensitivity of an immune response against GPI made use of a preparation that was considerably contaminated. Here, these contaminating proteins were identified, and it was shown that these proteins were also targeted by IgG-antibodies, but again without specificity for JIA or its subgroups. Thus, the K/BxN mouse model clearly is a valuable tool for the analysis of autoreactivity, but GPI is not a common target for autoreactivity in human arthritis.

Das Ziel der vorliegenden Arbeit ist die patientenspezifische Analyse und Identifizierung von Tumorantigenen aus soliden Tumoren wie Nierenzellkarzinom, Kolorektalem Karzinom und Glioblastoma multiforme. Zudem sollen die identifizierten Antigene auf deren Eignung als Bestandteil einer immuntherapeutischen Vakzinierung untersucht werden. Die Arbeit beruht hauptsächlich auf zwei sich ergänzenden Methoden. Zum einen aus der Erstellung eines Expressionsprofils der Tumorzellen im Vergleich zu gesunden Geweben des Körpers. Zum anderen aus der Isolierung von auf MHC-Klasse-I präsentierten Peptiden. Dies geschieht mittels Säulenchromatographie der HLA-Moleküle, Säureelution der Peptide und deren anschließende Analyse im Massenspektrometer. Zusammengenommen können diese Methoden zur patientenspezifischen Identifizierung von Peptiden führen, deren Gene im Tumor überexprimiert erscheinen. Solche Peptide könnten das ideale Mittel einer Immuntherapie sein. Normalerweise erscheinen in Tumorproben mehrere 100 Gene als überexprimiert. Durch den Vergleich der Expressionsprofile des Tumors mit gesunden Geweben sowie der Analyse von HLA-Liganden konnten in mehreren Tumoren schon bekannte Tumorantigene nachgewiesen werden. Zum Teil wurden auch neue Antigene identifiziert, die bezüglich ihrer Tumorassoziation vielversprechend sind. In der vorliegenden Arbeit werden die Analysen von 3 Tumoren besprochen. Basierend auf diesen Ergebnissen war es möglich, für jeden Patienten einen individuellen Peptid-Cocktail zusammenzustellen, der bei einer eventuellen Vakzinierung eingesetzt werden könnte. The aim of this thesis is the patientspecific analysis and identification of tumor associated antigens from solid tumors such as renal cell carcinoma, colorectal carcinoma and glioblasoma multiforme. Further the identified antigens shall be analyzed for their suitability as part of an immunotherapeutic vaccination treatment of the patient. The thesis is based on two complementary methods: First: profiling of the tumor cell gene expression on mRNA level compared to normal tissues. Second: Isolation of peptides presented by MHC class I molecules using immunoprecipitation of HLA molecules, peptide release by acid treatment and their analysis by mass spectrometry. Taken together, these two methods can lead to the identification of MHC-bound peptides whose genes are overexpressed in the tumor. Such peptides might be ideal targets for immunotherapy. Usually in tumor samples several hundred genes appear to be overexpressed. By comparing expression profiles of the tumor and healthy tissues and by HLA ligand analysis already known tumor antigens could be found in several tumors. New antigens which appear to be promising concerning tumorassociation were also identified. In this thesis the analyses of 3 tumors will be discussed . Based on these results it was possible to compose for each patient an individual peptide cocktail which could be used for vaccination.

Das Nierenzellkarzinom (RCC) stellt durch seine weitgehende Resistenz gegenüber Strahlen- und Chemotherapie und seine oftmals späte Entdeckung einen therapeutisch schwer zu beeinflussenden Tumor dar. Schwerpunkt dieser Arbeit ist die Isolierung und Identifizierung möglicher Tumor-assoziierter Peptide aus Nierenzellkarzinomen zum Einsatz in der Patienten-individuellen Immuntherapie. Darüberhinaus wurde ein quantitatives ELISA-Verfahren zur Quantifizierung von MHC-I-Molekülen in Tumorlysaten etabliert und mit quantitativen Untersuchungen aus Western-Blot und Edman-Abbau verglichen. Im Rahmen dieser Arbeit gelang es mit Hilfe eines kombinierten Ansatzes aus massenspektrometrischer Analyse und Genexpressionsuntersuchung, aus über 350 gefundenen HLA-Liganden eine Reihe neuer, Tumor-assoziierter Peptide aus dem RCC zu identifizieren. Erstmals konnten dabei auch weit über 100 Peptide aus einer einzelnen Tumorprobe identifiziert werden. So kamen neu identifizierte Liganden aus RGS5, IGFBP3, USH1C und ADFP in der Vakzinierung von RCC-Patienten zum Einsatz. Darüberhinaus gelang der Nachweis des ersten natürlich vorkommenden Liganden aus MAGED4 im RCC. Das etablierte ELISA-Verfahren zeigte Übereinstimmung hinsichtlich quantitativer Tendenzen gegenüber Western-Blot und Edman-Abbau und stellte sich zur Messung von Lysaten als günstige Ergänzung heraus. Keines der quantitativen Verfahren vermag bislang absolut verlässliche Messwerte zu erzeugen, so dass die Methoden weiterentwickelt werden müssen. Durch diese Arbeit konnten sowohl eine Reihe interessanter Tumor-assoziierter Liganden als auch eine Vielzahl neuer, natürlich vorkommender Liganden aus dem RCC identifiziert werden. Da bislang wenige übergreifende Tumor-assoziierte Antigene im RCC bekannt sind, könnten die hier gewonnenen Erkenntnisse im Zuge der Entwicklung von Multi-Epitop-Vakzinen zur Immuntherapie des RCC von Nutzen sein. The treatment of renal cell carcinoma (RCC) is difficult due to its wide radio- and chemoresistance and its late clinical manifestation. The focus of this work is the isolation and identification of potential tumor-associated peptides in renal cell carcinoma for the use in patient-individual immunotherapy. Additionally, a quantitative ELISA for MHC-I quantification was established and compared to results from Western-Blot and Edman analysis. The combined approach of mass spectrometry and gene expression analysis led to the identification of 350 HLA ligands in RCC, among them several new, tumor-associated peptides. For the first time more then 100 peptides were identified in a single tumor sample. Newly identified ligands from RGS5, IGFBP3, USH1 and ADFP were used for vaccination of patients with RCC. Furthermore, we could identify the first ligand derived from MAGED4 in RCC. The results of the established ELISA were widely in agreement with the results of Western-Blot and Edman analysis and may proof to be an additionally useful analytic tool to analize tumor lysates. However, these analytic tools provide no absolutely precise results so far and need further improvement. In summary, this work led to both the identification of several, interesting tumor-associated ligands and many, new ligands from native RCC tissue. The results of this work may also be useful for the development of multi-epitope-vaccines for immunotherapy in RCC.

T cells are important effectors in the defense of human pathogens entering the organism. CD8+ T cells recognize peptides which are presented by MHC class I molecules and lyse cells which are infected by virus or intracellular pathogens. Moreover, they are able to destroy cancer cells. CD4+ T cells recognize peptides from exogenous proteins acquired by endocytosis or from internalized plasma membrane proteins which are presented on MHC class II. CD4+ T cells play an important role in the defense of bacteria and activation of the humoral immune response. The human cytomegalovirus (HCMV) is a cause of morbidity and mortality in immunocompromised persons. In contrast, in immunocompetent individuals HCMV is successfully controlled by specific CD8+ and CD4+ T cell responses. One aim of this thesis was the analysis of CD8+ and CD4+ T cell responses against HCMV to identify T cell epitopes which could be used for the development of a vaccine against the virus. Ex vivo analyses were performed with blood of healthy donors of different HLA-types using recombinant peptide/MHC I complexes and/or intracellular cytokine staining to characterize T cell epitopes of HCMV. New T cell epitopes of several HLA restrictions could be identified. Furthermore, some were analysed with respect to immunodominant features and hierarchies among T cell epitopes identified. Furthermore, in vitro experiments were used to identify new T cell epitopes, e.g. stimulation of PBMCs from healthy donors with peptide loaded dendritic cells (DCs). Knowledge of T cell epitopes and their immundominant features can be useful for the generation of antigen-specific T cells for adoptive immunotherapy or for the development of a peptide-based vaccine against HCMV. A further aim of this thesis was the induction and analysis of CD8+ and CD4+ T cell responses against tumor-associated antigens. MHC class II ligands identified by mass spectrometric methods were used to perform in vitro stimulations. For CD8+ T cell stimulation, artificial antigen presenting cells (aAPCs) were used, for generation of antigen specific CD4+ T cells, DCs were loaded with peptides and used as APCs. Several new helper T cell epitopes from different tumor-associated antigens were identified. Zur Abwehr humanpathogener Organismen sind T-Zellen unerlässlich. CD8+ T-Zellen erkennen Peptide, die auf MHC Klasse I präsentiert werden und stellen Abwehrreaktionen gegen Viren und intrazelluläre Erreger, aber auch gegen Krebs, bereit. CD4+ T-Zellen erkennen MHC Klasse II-präsentierte Peptide, die aus dem Inneren von Vesikeln stammen und spielen somit eine Rolle bei der Abwehr von Bakterien, aber auch bei der Anregung des humoralen Immunsystems über Aktivierung von B-Zellen. Das humane Cytomegalievirus (HCMV) verursacht bei Patienten mit geschädigtem oder nicht voll ausgebildetem Immunsystem häufig schwere bis tödlich verlaufende Infektionen. Bei immunkompetenten Individuen hingegen wird das Virus erfolgreich durch spezifische CD8+ und CD4+ T-Zellen kontrolliert. Ein Ziel dieser Arbeit war es, CD8+ und CD4+ T-Zellantworten gegen das humane Cytomegalievirus (HCMV) zu untersuchen, um T-Zellepitope für mögliche Impfstoffe zu identifizieren. Zur Charakterisierung von T-Zellepitopen aus HCMV wurden zum einen ex vivo-Analysen in gesunden Spendern verschiedener HLA-Typisierung unter Verwendung rekombinanter Peptid/MHC I-Komplexe oder intrazellulärer Zytokinfärbung durchgeführt. Neue T-Zellepitope zahlreicher HLA-Restriktionen konnten identifiziert werden. Einige wurden zusätzlich hinsichtlich ihrer Immundominanz oder Hierarchie untereinander beleuchtet. Auch in vitro-Experimente, beipielsweise die Stimulation von gesunden Spender-PBMCs mit Peptid-beladenen dendritischen Zellen (DCs), trugen zur Identifizierung neuer T-Zellepitope bei. Dieses Wissen um T-Zellepitope und ihre immundominanten Eigenschaften kann nützlich sein für die Generierung antigen-spezifischer T-Zellen für adoptive Immuntherapien oder für die Entwicklung einer Peptid-basierenden HCMV-Vakzine. Neben viralen T-Zellantworten war ebenso die Induktion und Analyse von CD8+ und CD4+ T-Zellantworten gegen tumorassoziierte Antigene Bestandteil dieser Arbeit. Mittels massenspektrometrischer Verfahren identifizierte MHC Klasse II-Liganden wurden für in vitro Stimulationen eingesetzt. Artifizielle Antigen-präsentierende Zellen wurden als Werkzeuge für die Stimulation von Antigen-spezifischen CD8+ T-Zellen genutzt, während CD4+ T-Zellen mittels Peptid-beladener dendritischer Zellen stimuliert wurden. Dies führte zur Identifizierung neuer T-Zellepitope aus verschiedenen Tumor-assoziierten Antigenen.

In den letzten Jahren wurden immer mehr Kenntnisse über den MHC-Klasse I-Antigenprozessierungsweg gesammelt und viele Einzelheiten im Detail untersucht. Damit ist es nun nicht nur möglich die einzelnen Schritte nachzuverfolgen, sondern auch einige von ihnen vorherzusagen. Die großen Unbekannten bei der Klasse I-Prozessierung sind jedoch immer noch die Aminopeptidasen, die im Cytosol wie auch im ER das Epitop schließlich auf die endgültige Größe trimmen können. Dabei wird auch der N-Terminus des Epitops generiert und ließe sich somit zu einem gewissen Prozentsatz über die Spezifität der Peptidasen beschreiben. Im Laufe dieser Arbeit sollten die Aminopeptidasen und damit auch die Generierung des Epitop-N-Terminus untersucht und damit die letzte große Lücke bei der MHC-Klasse I-Antigenprozessierung geschlossen werden. Im ersten Teil des Projekts wurde dabei die Breitspektrenanalyse, eine Kombination von biostatistischer und biochemischer Analyse verwendet, um die allgemeinen Vorgänge bei der Prozessierung des N-Terminus zu untersuchen und der Einfluss von cytosolischen und endoplasmatischen Aminopeptidasen auf dessen Generierung nachzuweisen. Da keinerlei Daten zur cytosolischen und endoplasmatischen Aminopeptidaseaktivität existierten, wurden diese zuerst durch Aufreinigung der jeweiligen Kompartimente und anschließendem Umsatz eines Satzes bestehend aus allen 20 fluorogenen Ein-Aminosäure-AMC-Substraten gewonnen. Die bestehenden Daten über das Proteasom und TAP und die neu generierten über cytosolische und endoplasmatische Aminopeptidasen konnten nun mit den Aminosäuren N-terminal von um die 900 Epitopen aus der SYFPEITHI-Datenbank verglichen werden. Schon bei der Untersuchung möglicher Epitopvorläufer hat sich gezeigt, dass in einer ungefähr 7 Aminosäure-langen Sequenz upstream des N-Terminus von Epitopen die Aminosäuren nicht zufällig vorkommen, sondern es gewisse Bevorzugungen gibt. Diese Sequenz soll nun als N-terminales Prozessierungsmotiv bezeichnet werden. Bei dem Vergleich mit der Proteasom- und TAP-Spezifität stellte sich heraus, dass innerhalb dieses Motivs nicht nur präferenziell geschnitten, sondern auch diese Vorläufer bevorzugt transportiert werden. Bei einem genauen Vergleich zeigt sich jedoch, dass es auch Aminosäurebevorzugungen an bestimmten Positionen gibt, die sich nicht durch das Proteasom oder TAP begründen lassen. Diese jedoch lassen sich erklären, wenn man die Spezifitäten der Aminopeptidasen in Betracht zieht. Bei diesem Vergleich stellt sich heraus, dass die letzten beiden Aminosäuren direkt vor dem N-Terminus eines Epitops eine deutliche Bevorzugung für ein Trimming durch endoplasmatische Aminopeptidasen zeigen. Daraus lässt sich schlussfolgern, dass die letzten beiden Positionen vieler MHC-Klasse I-Liganden-Vorläufer im ER durch Aminopeptidasen geschnitten werden. Während im ersten Teil dieser Arbeit nun die allgemeinen Prozessierungsvorgänge, insbesondere im Hinblick auf Aminopeptidasen, untersucht wurden, sollte im zweiten Teil die Gesamtaminopeptidaseaktivität in ihre Einzelteile zerlegt und diese im Detail analysiert werden. Dazu wurde Cytosol zuerst aufgereinigt und dann mittels verschiedenster chromatographischer Techniken aufgetrennt. Die Fraktion mit der jeweils relevanten Aktivität wurde danach einer SDS-PAGE unterzogen und dann über MALDI/Tandem MS identifiziert. Die entsprechenden Aminopeptidaseaktivitäten wurden zum einen über Tests mit allen 20 Ein-Aminosäure-Substraten und zum anderen durch verschiedene Inhibitoren bestimmt. Dabei hat sich herausgestellt, dass es im Cytosol drei Hauptaktivitäten und zwei Nebenaktivitäten gibt. Zu den drei wichtigsten Aminopeptidasen zählen die Puromycin-sensitive Aminopeptidase (PSA) und die Bleomycin-Hydrolase (BH), die zusammen schon einen Großteil abdecken. Die dritte Aminopeptidase ist die Aminopeptidase B (AP B), die fast exklusiv für Lysin, Arginin und Prolin zuständig ist. Die zwei kleineren cytosolischen Aktivitäten sind die Leukotrien A-4 Hydrolase (LTA4H) und eine Aspartat-abbauende Aminopeptidase, bei der es sich um die Aspartyl Aminopeptidase handeln könnte. Um nun den Einfluss in vivo untersuchen zu können, wurden die als spezifisch im Sinne ihrer Verwendung getesteten Inhibitoren Puromycin für PSA, E64 für BH, Arphamenin A für AP B und Captopril für LTA4H auf ihre Membrangängigkeit hin analysiert. Da hierbei nur E64 positiv war, muss für weitere Versuche auf das siRNA-System ausgewichen werden. Damit sollte es möglich sein, den Einfluss dieser fünf Proteasen auf die Prozessierung von verschiedenen Epitopen in der Zelle selbst zu bestimmen. Mit diesem Wissen ließe sich das Bild der MHC-Klasse I-Antigenprozessierung komplettieren. Damit wäre es auch möglich, die Entstehung des N-Terminus von Epitopen individuell vorhersagen zu können, ein Aspekt der für die Immunisierung und Krankheitsbehandlung gleichermaßen von Interesse wäre. In the last years an increase of knowledge was collected about the MHC class I antigen processing pathway and many details were analysed. This made it possible to not only follow every single processing step, but also to predict some of them. The big enigma in class I processing are still the aminopeptidases in the cytosol and ER that have the ability to trim the epitope to its final size, thereby generating the epitope N-terminus. Consequently, this process could be described to a certain percentage by the specificity of these peptidases. In the course of this work the aminopepidases and the subsequent generation of the epitope N-terminus should be analysed so that the last big gap in the MHC class I antigen processing pathway can be closed. In the first part of this project broad spectrum analysis was used, consisting of a combination of biostatistical and biochemical analysis, to examine the general processes during the creation of the N-terminus and to prove the influence of cytosolic and endoplasmic aminopeptidases on its generation. Due to the fact that there was no data about the cytosolic and endoplasmic aminopeptidase activities, it had to be generated first. This was done by purifying each compartment followed by measuring the turnover of a complete set of all 20 fluorogenic one-amino acid-AMC-substrates. The existing data of the proteasome and TAP and the newly generated one of cytosolic and endoplasmic aminopeptidases could now be compared with the amino acids N-terminal of about 900 epitopes from the SYFPEITHI database. The analysis of possible epitope precursors already showed that there is a sequence of approximately 7 amino acids upstream the N-terminus of epitopes in which the amino acid distribution is not random but shows a certain preference. This sequence shall now be called the N-terminal processing motif. The comparison with the proteasome- and TAP-specificity revealed that there is not only preferential cleavage within this motif but also that the resulting precursors are favoured for transport into the ER. A closer look showed however that there is also amino acid preferences at certain positions which can not be explained by the specificity of the proteasome or TAP. These differences however, can be resolved if the specificities of aminopeptidases are taken into account. Comparing these with the processing motif shows that the last two amino acids right before the N-terminus of an epitope are clearly preferred by endoplasmic aminopeptidases. This observation leads to the conclusion that the last two positions of many MHC class I ligand precursors are cleaved off by endoplasmic aminopeptidases. In the first part of this project, the general processing events especially concerning the steps involving aminopeptidases were analysed. In the second part the overall aminopeptidase activity should now be divided into single activities followed by further analysis. For that purpose, cytosol was first purified and then fractionated by different chromatographic methods. The final fractions with the relevant activities were further seperated by SDS-PAGE and after visualisation and tryptic in-gel digestion identified by MALDI/Tandem MS. The resulting aminopeptidases were further characterised with the help of a complete set of 20 single residue substrates and specific inhibitors. This approach led to the conclusion that there are three major and two minor activities in the cytosol. Puromycin-sensitive aminopeptidase (PSA) and bleomycin hydrolase (BH) belong to the more important activities and together they already cover a major part of the overall cytosolic activity. The third major aminopeptidase could be identified as aminopeptidase b (AP B), which is almost exclusively responsible for the cleavage of lysine, arginine and proline. The two minor activities are leukotriene A-4 hydrolase (LTA4H) and an aspartate-cleaving aminopeptidase, which could be aspartyl aminopeptidase. To be able to examine the influence in vivo, the specific (in this experimental setup) inhibitors puromycin for PSA, E64 for BH, arphamenine a for AP B and captopril for LTA4H were tested on their ability to permeate the cell membrane. Due to the fact that only E64 showed a positive result, further experiments in this direction have to be based on the usage of siRNAs. With their help it should be possible to evaluate the influence of all five proteases on the processing of different epitopes in the cell itself. With this knowledge it is possible to complete the picture of the MHC class I antigen processing. Moreover, this would make it possible to predict the generation of the N-terminus of individual epitopes, which would be of great interest for future vaccinations and the treatment of diseases.

Autoimmunerkrankungen wie die Rheumatoide Arthritis (RA) gelten als T-Zellvermittelte Erkrankungen, deren Pathogenese eng mit der Expression definierter HLA (human leucocyte antigen) Klasse II-Moleküle assoziiert ist. Bei der RA wird dabei zwischen prädisponierenden und protektiven HLA-DR-Molekülen unterschieden. Neben dieser HLA-Assoziation spielen noch weitere Faktoren eine Rolle in der Pathogenese von Autoimmunerkrankungen, beispielsweise wird eine Beteiligung von Hitzeschockproteinen (HSPs) diskutiert. HSPs können unter anderem Zellen des Immunsystems aktivieren, HSP-gebundene Peptide können von HLA-Klasse I-Molekülen re-präsentiert werden und eine T-Zell-Reaktivität auf HSP-Epitope scheint Einfluss auf den Verlauf von Autoimmunerkrankungen zu haben. In der Literatur wurde eine Interaktion von DnaK, dem HSP70-Molekül aus E.coli mit Peptidfragmenten aus RA-prädisponierenden HLA-DR-Molekülen beschrieben. Ziel dieser Arbeit war es, die Interaktion von HSP70-Molekülen mit HLA-DR-Peptidfragmenten sowie ganzen HLA-DR-Molekülen näher zu charakterisieren, sowie die Auswirkungen einer direkten HSP:HLA-DR-Interaktion auf die MHC II-vermittelte Antigenpräsentation und CD4+ T-Zellaktivierung zu untersuchen. Mit einer sehr sensitiven Methode wurde das Bindungsverhalten von HLA-DR-Peptidfragmenten an verschiedene HSP70-Moleküle (dem stress-induzierbaren humanen Hsp70, dem konstitutiv exprimierten Hsc70 und DnaK aus E.coli) untersucht. Dabei wurde ein von der Literatur abweichendes Bindungsmuster gefunden, bei dem alle HLA-DR-Peptidfragmente eine Affinität zu HSP70 zeigten. Lediglich eine Peptidsequenz, die ausschließlich in RA-protektiven HLA-DR-Molekülen gefunden wird, besaß keine Affinität zu HSP70. Ein quantitatives Verfahren wurde etabliert, um diese Ergebnisse zu bestätigen und zu untersuchen, ob auch die zu den Peptidfragmenten korrespondierenden ganzen HLA-DR-Moleküle mit HSP70 interagieren. Aus Zelllinien isolierte und rekombinant hergestellte HLA-DR-Moleküle zeigten dabei eine spezifische, hochaffine Interaktion mit humanem, stress-induzierbarem Hsp70. Die HLA-DR-Bindung an andere HSP70-Moleküle war nur sehr schwach ausgeprägt. Ein signifikant differentielles Hsp70-Bindungsmuster zwischen RA-prädisponierenden und RA-protektiven HLA-DR-Molekülen konnte für die ganzen Moleküle nicht gezeigt werden. Durch diese hier gefundene direkte Interaktion mit HLA-DR-Molekülen könnte Hsp70 hypothetisch als Peptid-„Carrier“ in der MHC II-vermittelten Antigenpräsentation dienen und damit eine Rolle in der CD4+ T-Zellaktivierung spielen. In einem humanen, antigenspezifischen System wurde der Einfluss von Hsp70 auf die CD4+ T-Zell-aktivierung untersucht. T-Zellen von Donoren mit verschiedenen HLA-DR-Haplotypen wurden mit Peptiden oder Hsp70:Peptid-Komplexen stimuliert und die Anzahl proliferierter CD4+ T-Zellen bestimmt. Antigenspezifität proliferierter T-Zellen wurde mittels HLA-DR-Tetramer-Färbung gezeigt. Die Stimulation mit Hsp70:Peptid-Komplexen führte zu einer deutlich verstärkten Proliferation antigenspezifischer CD4+ T-Zellen, insbesondere unter Bedingungen mit äußerst geringen Peptidmengen oder einer reduzierten Zahl antigenpräsentierender Zellen. Die vorausgehende Komplexierung von Hsp70 mit dem Peptid war essentiell für diese Hsp70-abhängige Proliferationsverstärkung, Kontrollproteine zeigten keinen Effekt. Insgesamt konnte in dieser Arbeit gezeigt werden, dass HSP70-Moleküle an HLA-DR-Peptidfragmente mit unterschiedlicher Affinität binden können. Intakte HLA-DR-Moleküle können spezifisch mit humanem Hsp70 interagieren. Eine verstärkte Immunogenität von Hsp70-gebundenen Peptiden bei der Stimulation humaner, antigenspezifischer CD4+ T-Zellen wurde gefunden. Inheritance of specific HLA (human leucocyte antigen) class II alleles can greatly influence the risk for autoimmune diseases like rheumatoid arthritis (RA). In the pathogenesis of RA some HLA-DR alleles are considered to predispose to this autoimmune disorder, whereas others seem to mediate protection. In addition to HLA-association, other mechanisms are influencing the pathogenesis of RA. In this context the involvement of heat shock proteins (HSPs) is discussed. HSPs are involved in activating cells of the immune system, HSP-chaperoned peptides can be re-presented via MHC I molecules and T cell reactivity to epitopes from HSPs may influence the pathogenesis of autoimmune diseases. An interaction between DnaK, the HSP70 from E.coli and peptide fragments from RA-predisposing HLA-DR molecules was described in the literature. The aim of this study was to investigate the interaction of HSP70 molecules with HLA-DR derived peptide fragments and the corresponding complete HLA-DR molecules and to evaluate the effects of a possible direct HSP-MHC-interaction on MHC II-restricted antigen presentation and CD4+ T cell activation. Using a highly sensitive method, binding studies with different HSP70 molecules (stress inducible human cytosolic Hsp70, constitutively expressed Hsc70 and E.coli DnaK) revealed a binding pattern differing from those described in literature: It was found that HLA-DR derived peptide fragments from most HLA-DR molecules interact with HSP70. Only a single peptide sequence found in HLA-DR molecules associated with strong protection from RA showed no HSP70-affinity. A quantitative binding assay was established to quantify peptide binding studies and to analyze whether the corresponding complete HLA-DR molecules also interact with HSP70. A specific interaction between the human stress-inducible Hsp70 and HLA-DR molecules isolated from cell lines and recombinant HLA-DR molecules could be demonstrated in these experiments. Other tested HSP molecules showed only a weak affinity to complete HLA-DR molecules. A differential Hsp70-bindiung pattern between the different allelic variants of HLA-DR could not be confirmed. With the direct interaction between Hsp70 and HLA-DR molecules demonstrated in this work a scenario might be conceivable in which Hsp70 might function as peptide-carrier in the MHC II-restricted presentation of antigenic peptides and thus might play an important role in the activation of CD4+ T cells. Therefore the effect of Hsp70 on CD4+ T cell activation was tested in a human antigen-specific setting. T cells from donors with different HLA-DR haplotypes were stimulated either with antigenic peptides alone or with Hsp70:peptide complexes. Hsp70:peptide complexes were found to amplify the proliferation of antigen-specific CD4+ T cells as confirmed by HLA-DR tetramer staining. Complex formation of the antigenic peptide with Hsp70 was absolutely required to elicit an antigen-specific amplification, control proteins showed no enhanced proliferation. This effect was most pronounced at low doses of antigen and decreasing APC:CD4+ T cell ratios. Taken together it was shown in this work that HSP70 molecules can interact differentially with HLA-DR peptide fragments. A specific interaction between Hsp70 and complete HLA-DR molecules could be demonstrated. The potential of Hsp70 to enhance antigen-specific CD4+ T cell proliferation and to increase the immunogenicity of presented peptides in human CD4+ T cells was shown.

The immune system is essential in guarding the body against pathogens and tumor cells. Immunity has many facets, the dichotomy separating innate and adaptive immunity in the last decades, nowadays emerges as evolutionary consecutive with interdepending pathways and continuative receptor evolution. The complexicity of the somatic rearrangement of TCR genes guarantees virtually infinite variability in the specificity of TCRs expressed on naïve T cells, i.e. costimulated via CD27/CD70 interaction, but relies on the body's rapid innate defense mechanisms where receptors with consistent PRR recognise PAMP transmitting valuable signals to the adaptive immune system, i.e. via TLR, activated by ssRNA. Thus it is not astonishing that TLR are accounted as the interface between innate and adaptive immunity (242). It actually becomes clear that the innate arm of immunity links with its adaptive counterpart in tumor immune surveillance also via NK cells, i.e. with NKG2D as a receptor of an activatory pathway. Proteomic analysis of unactivated and activated human NK cell membrane-enriched fractions demonstrated that activated NK cells can efficiently stimulate T cells, since NK cells upregulate MHC class II molecules and multiple ligands for TCR costimulatory molecules (243). Combining these findings with our improved understanding of cancer biology has helped to understand how to configure immunological strategies against the "hallmarks of cancer" (244). Encounter the escape of immune surveillance and the immunosuppressive properties of glioma cells (chapter 1), i.e. by TGF- , are the major challenges in our laboratory and were the main topics in my Ph.D. work. In my Ph.D. research I have thus explored several novel approaches aiming at engaging immune surveillance via direct activation of adaptive immunity or by more indirect ways via innate pathways and at an improved understanding of the immune-paralysing capacities of glioma cells. While the connections between these various aspects of glioma biology may not be apparent at first sight, there are good reasons for taking a combined look at the complex interactions of innate and adaptive immunity and tumor immunology. Tumor immune surveillance is mediated by immune effector cells that selectively kill cancer cells. Activated T and NK attack their targets by the expression of death ligands (245, 246) and by secretion of cytotoxic granules (87, 247) and thus seek to activate both the death receptor and the intracellular apoptotic pathway. An apoptosis-resistant target cell is therefore less susceptible to immune-mediated lysis. Sensitization of tumor cells for apoptotic stimuli could therefore enhance the efficacy of ongoing anti-tumor immune responses. Further, activation of the costimulatory pathways, e.g. using CD70 transgenes or ssRNAs may be beneficial when the tumor may strike back and induce apoptosis in tumor-infiltrating lymphocytes by various mechanisms, including the expression of CD95/FasL, HLA-G or TGF- (140, 248-250). Finally, therapeutic induction of apoptosis via these mechanisms is thought to provide a source of antigens that can be taken up and presented by professional APC, resulting in an anti-tumor immune response. The mounting of a productive anti-tumor immune response may be prevented by immune-inhibitory signals sent out by the tumor itself. Therefore, a costimulation-based reduction of large tumor masses may require the simultaneous relief of tumor-dependent immunosuppression in order to be followed by a productive immune response that can finally clear residual glioma cells dispersed in the brain. Das Immunsystem schützt unseren Körper vor Pathogenen und Tumorzellen, als Spezialfall. Die Immunität hat viele verschiedene Facetten, wobei die in den letzten Jahrzehnten propagierte Zweiteilung der angeborenen und adaptiven Immunität heute vielmehr als evolutionär aufeinander aufbauend, mit voneinander abhängigen Signaltransduktionspfaden und ontogenetisch verwandten Rezeptoren, angesehen wird. Die Komplexität der somatischen Rekombination der TCR-Gene ermöglicht eine nahezu unendliche Variabilität der Spezifität von TCR. Diese werden auf naiven T-Zellen exprimiert. Diese Zellen können u.a. durch kostimulatorische Interaktionen via CD27/CD70 stimuliert werden, sind aber von einer schnellen Antwort der angeborenen Immunität abhängig. Rezeptoren mit konsistenten PRRs erkennen PAMP und leiten Signale an das adaptive Immunsystem weiter. Die Familie der TLR spielt hier eine wichtige Rolle. In dieser Arbeit waren vor allem die Interaktionen der TLR7-9 mit ihren jeweiligen Liganden bei der Abwehr von Tumorzellen von Bedeutung. Es ist deshalb nicht erstaunlich, dass die TLR als Schnittstelle zwischen angeborener und adaptiver Immunantwort angesehen werden (242). Bei der Immunüberwachung des Körpers sind nicht nur wie bisher bekannt T- und B-Zellen, sondern auch NK-Zellen beteiligt, die z.B. über den aktivatorischen Rezeptor NKG2D aktiviert werden. Proteomanalysen von angereicherten nicht aktivierten und aktivierten NK-Zellmembranen zeigten, dass aktivierte NK-Zellen T-Zellen sehr effizient stimulieren können, da sie MHC-Klasse II-Moleküle und multiple TCR-kostimulatorische Liganden hochregulieren (243). Die Kombination dieser Befunde mit unserem verbesserten Verständnis der Tumorbiologie hilft uns zu verstehen, wie wir immunologische Strategien konfigurieren müssen, um den Mechansimen, die einen Tumor kennzeichnen, etwas entgegenzusetzen können (244). Gliomzellen entziehen sich der Immunüberwachung durch immunsuppressive Mechanismen. Dabei werden das angeborene und adaptive Immunsystem, u.a. TGF- -vermittelt supprimiert. Die Überwindung solcher immunsuppressiver Mechanismen waren die Hauptpunkte meiner Doktorarbeit. Während meiner Doktorarbeit habe ich an verschiedensten neuen Ansätzen zur Therapie maligner Gliome mitgewirkt. Diese basierten nicht nur auf der Wiederherstellung einer Tumor-Immunüberwachung durch direkte Aktivierung der adaptiven Immunantwort, sondern auch auf Mechanismen der angeborenen Immunität, die schliesslich auch zu einer Aktivierung der adaptiven Immunität führten. Während die Verbindungen zwischen diesen verschiedenen Aspekten der Gliombiologie nicht sofort ersichtlich sind, ist es dennoch unumgänglich, sich mit den komplexen Zusammenhängen zwischen angeborener und adaptiver Immunantwort und der Tumorimmunologie zu befassen. Die Tumor-Immunüberwachung wird von Immuneffektorzellen vermittelt, die selektiv apoptotischen und nicht-apoptotischen Zelltod in Krebszellen induzieren können. Werden diese Zellen jedoch in ihren Mechanismen supprimiert, etwa durch TGF- so können Mechanismen die zu einer Erhaltung eines T-Zellpools, z.B. nach einer Aktivierung durch CD70, dienen, dennoch eine Immunantwort erzeugen, die es erlaubt bereits etablierte Tumoren zu vernichten. Weiterhin können Aktivierungsprozesse induziert werden, die der angeborenen Immunität angehören, wie es die Toll-ähnlichen Rezeptoren 7 und TLR8 durch einen Kontakt mit ihrem Liganden, der Einzelstrang-RNA, oder MICA als Ligand von NKG2D, vermögen. Jedoch können Tumoren auch diesen Mechanismen dadurch entgegenwirken, dass sie in Lymphozyten Apoptose induzieren, etwa durch CD95/FasL-Expression oder diese immunsupprimieren durch HLA-G oder TGF- (140, 248-251). Schliesslich führt die Abstossung von Tumorgewebe zu einer Quelle von Antigenen, die von professionellen Antigen-präsentierenden Zellen, wie es DC sind, aufgenommen und präsentiert werden können (252-256).

Dendritische Zellen (DC) sind professionelle antigenpräsentierende Zellen (APC), die bei der Induktion einer antigenspezifischen Immunantwort eine entscheidende Rolle spielen. Kürzlich konnte gezeigt werden, daß mit aus Tumoren isolierter RNA transfizierte DC effektive T-Zell-Immunantworten in vitro und in vivo induzieren können. Der entscheidende Vorteil dieser Vakzinierungsmethode besteht darin, daß zu ihrer Anwendung weder ein charakterisiertes Tumorantigen noch ein bestimmter HLA-Typ des Patienten notwendig ist. Mögliche Nachteile dieser Strategie könnten in der Induktion von Immunantworten gegen körpereigene Gewebsstrukturen (Autoimmunrekationen) bestehen. Im ersten Teil der vorliegenden Arbeit evaluierten wir drei verschiedene Methoden zur RNA-Transfektion von DC (Elektroporation, Lipofektion mit dem kationischen Lipid Unifectin M, Transferrinrezeptor-(CD71)-vermittelte Endozytose) hinsichtlich ihrer Effizienz. Bei Experimenten mit in vitro transkribierter EGFP mRNA zeigte sich eine deutliche Überlegenheit der Elektroporation mit einer erzielten Transfektionseffizienz von annähernd 30%, während die beiden anderen Methoden deutlich niedrigere Transfektionseffizienzen lieferten. Die Lipofektion mit Unifectin M ergab eine Transfektionseffizienz von ca. 17.5%, wenn deutlich höhere mRNA-Mengen eingesetzt wurden, während die CD71-vermittelte Endozytose lediglich eine EGFP-Expression in etwa 1% der DC zeigte. Wurden diese verschiedenen Methoden jedoch zur Antigenbeladung von DC vor CTL-Induktion in vitro eingesetzt, erwiesen sich alle drei Techniken als potent bezüglich der Induktion einer antigenspezifischen T-Zellantwort, was als Hinweis darauf verstanden werden kann, daß bereits sehr geringe Transfektionseffizienzen für eine ausreichende Antigenpräsentation durch die DC ausreichend sind. Wir konnten weiter zeigen, daß in vitro transkribierte mRNA zumindest teilweise biologische Aktivität besitzt und für Vakzinierungszwecke eingesetzt werden kann. Ebenso konnten wir mittels eines EGFP-Modelllsystems die Expressionskinetik von nativer und in vitro amplifizierte EGFP mRNA in DC aufklären. Hierbei zeigte sich eine signifikante Expresssion des Proteins bereits wenige Stunden nach erfolgter Elektroporation. Die Expression erreichte nach etwa 40 h ihr Maximum und war bereits nach 48 h wieder auf sehr niedrige Werte zurückgegangen. In den durchgeführten Experimenten konnten wir außerdem zeigen, daß die untersuchte Methode auch zur Induktion von Coloncarcinom-spezifischen T-Zellen eingesetzt werden kann. Im zweiten Teil wurde die erprobte Methode zur Induktion von antigenspezifischen CTL durch RNA-transfizierte Methode auf eine autologes humanes System übertragen, wobei hier die chronisch-lymphatische Leukämie (CLL) als Modellerkrankung ausgewählt wurde. Hierbei konnte gezeigt werden, daß bei Patienten mit B-CLL funktionelle DC aus PBMNC generiert werden können. Diese waren nach Transfektion mit aus Leukämiezellen isolierter RNA in der Lage zytotoxische und proliferative leukämiespezifische T-Zellantworten zu induzieren. In den durchgeführten 51Cr-Freisetzungstests zeigte sich eine spezifisch gegen die CD5+ CLL-Zellen und gegen mit CLL-RNA transfizierte autologe DC gerichtete HLA Klasse I-restringierte Zytotoxizität der CTL, während CD19+CD5- B-Zellen nicht lysiert wurden. In weiteren Experimenten konnten wir eine mögliche Beteiligung eines aus dem tumorassoziierten Antigen Survivin stammenden Peptidepitops an der beobachteten Zytotoxizität nachweisen. Ferner konnten wir auch zeigen, daß auch im autologen System mit RNA-transfizierten DC HLA Klasse II-restringierte T-Helferzellantworten induziert werden können. Dendritic cells (DC) are professional antigen-presenting cells playing a central role in the induction of antigen-specific cytotoxic T-lymphocytes (CTL). We analyzed the efficiency of tumor RNA transfection into DC using different sources of RNA as well as delivery strategies including electroporation, lipofection and CD71-receptor-based delivery. To evaluate the sensitivity of these approaches, we utilized in vitro transcribed enhanced green fluorescence protein (EGFP)-RNA and whole tumor RNA from EGFP-transfected renal cell carcinoma cell line N43. We demonstrate that electroporation was the most effective way yielding about 30% EGFP positive cells while less than 1% of DC expressed EGFP using the transferrin receptor transfection system. Delivery of RNA with liposomes resulted in 17.5% of EGFP positive cells depending on the RNA amount. However, when these approaches were applied to transduce DC with RNA derived from the A498 cell line for T-cell priming, tumor-specific CTL could be induced using all delivery strategies suggesting that this technology has the potential to induce cytotoxic T-cell response even when low level of antigen is delivered. Furthermore, we demonstrate that amplification of whole tumor messenger RNA (mRNA) as well as the use of total instead of purified mRNA can be utilized for stimulating tumor-specific CTL responses. Additionally, we applied this approach to induce HLA class I- and class II-restricted T-cell responses directed against malignant cells from patients with chronic lymphocytic leukemia (B-CLL). Here, we show that DCs generated from monocytes of patients with B-CLL induce leukemia-specific cytotoxic and proliferative T-cell responses on transfection with total RNA isolated from autologous leukemic B lymphocytes. Standard 51Cr-release assays showed specific major histocompatibility complex (MHC) class I-restricted cytotoxic activity against the autologous leukemic B cells and DCs transfected with CLL-RNA, whereas nonmalignant B cells were spared. The specificity of the cytotoxic T-lymphocyte (CTL) response was confirmed using cold target inhibition assays and by blocking HLA class I molecules. The use of DCs transfected with in vitro amplified B-CLL mRNA elicited specific T-cell responses similar to the results obtained with native mRNA. These data suggest that vaccinations using DCs transfected with RNA might be a potent new strategy in the treatment of CLL.

Teil 1: Hitzeschockproteine als Indikatoren der Wundheilung Im ersten Teil der Arbeit wurden Zusammenhänge zwischen Anwesenheit und Konzentrationen der Hitzeschockproteine (Hsps) Gp96 und Hsp70 in humanen Wundflüssigkeiten (WF) und Wundheilungsverläufen untersucht. Während Hsp70 durch Verwendung eines ELISA-Kits in WF und Seren nachgewiesen werden konnte, musste für Gp96 ein geeignetes immunologisches Detektionssystem entwickelt werden. Hierfür wurde eine Gp96-Immunpräzipitation mit anschließendem Western Blot zur Detektion und Semiquantifizierung des Hsps etabliert. Um mögliche Korrelationen zwischen Konzentrationen der Hsps in WF und der Wundheilung aufzudecken, wurden WF und Seren von Patienten verschiedener Kategorien über einen Zeitraum von mehreren Tagen beginnend nach der OP gesammelt und analysiert. Verglichen wurden die Hsp-Verläufe von elektiven Eingriffen (Endo), sowie von traumatischen und chronisch/septischen Wunden. Während in allen Patientenseren nur geringe Mengen Gp96 und Hsp70 ohne erkennbaren Verlauf detektiert wurden, fanden sich interessante Konzentrationsverläufe beider Hsps in den WF. In den WF von Traumapatienten nahm sowohl die Konzentration von Hsp70 wie auch Gp96 im Laufe der Wundheilung ab, gleiches galt für Gp96 in WF nach elektiven Eingriffen. Hier gab es deutliche Unterschiede zum Verhalten von Hsp70, dass eine starke Zunahme erfuhr. Im Gegensatz dazu konnten keine Änderungen der Hsp-Konzentrationen in chronisch/septischen Wunden beobachtet werden. Hier blieben sowohl Gp96 als auch Hsp70 bis zur Abheilung nahezu konstant. Diese Beobachtungen wiesen darauf hin, dass Anwesenheit und Konzentrationsverläufe von Hsps Rückschlüsse auf die Wundheilung zu lassen. Das z. T. unterschiedliche Verhalten der beiden verschiedenen Hsps könnte auf ihre unterschiedliche Herkunft zurückzuführen sein. Während es sich bei Gp96 um ein ER lokalisiertes Glykoprotein handelt, dass hauptsächlich durch Nekrose in den extrazellulären Raum gelangt, gehört Hsp70 zu den Stress-induzierten Hsps. Teil 2: Koordination von Reifung und Antigenpräsentation bei Dendritischen Zellen der Maus Der zweite Teil der Arbeit beschäftigte sich mit den Vorgängen während der Reifung von BMDCs in Zusammenhang mit der Antigenpräsentation. Im Gegensatz zu nicht-professionellen antigenpräsentierenden Zellen (APCs), bei denen eine frühe Herstellung und Präsentation von CTL-Epitopen wichtig für eine schnelle Viruselimination ist, benötigen DCs Zeit, einen reifen Phänotyp zu entwickeln, um ihre Aufgabe als T-Zell-Aktivatoren erfüllen zu können. Tatsächlich wiesen die Ergebnisse dieser Arbeit auf eine verzögerte Antigenpräsentation von BMDCs nach Influenz-Infektion im Vergleich zu nicht-professionellen APCs hin. Diese koinzidierte mit dem Auftreten von so genannten DALIS (dendritic cell aggresome-like induced structures). Hierbei handelt es sich um transiente Anhäufungen ubiquitinylierter Proteine (DRiPs) im Zytoplasma, die während der Reifung von DCs und Makrophagen auftreten. Durch ihre Zwischenspeicherung in DALIS wird der Abbau der DRiPs verzögert, daher wurde in dieser Arbeit postuliert, dass es sich bei DALIS um Antigenspeicher handeln könnte, die es den DCs ermöglichen, die Vorgänge der Reifung und Antigenpräsentation zu koordinieren. Hierfür sprach auch die Entdeckung des Influenza Nukleoproteins in DALIS infizierter BMDCs und das zeitliche Zusammenfallen von DALIS-Entwicklung und Expression von kostimulatorischen Molekülen auf der Oberfläche der DCs sowie anderen Reifungsmarkern. Ferner konnte durch Inhibition der DALIS-Entstehung die Antigenerkennung auf BMDCs beschleunigt werden. Im Vergleich zu Influenza-infizierten BMDCs wiesen mCMV-infizierte Zellen keine DALIS Bildung auf. Der Vergleich von Influenza und mCMV Infektion war von besonderem Interesse, da Zytomegaloviren (mCMV) die Reifung von DCs und somit ihre Fähigkeit, T Zellen zu aktivieren, beeinträchtigten. Hier zeigten BMDCs dieselbe Präsentationskinetik wie infizierte Fibroblasten, die ebenfalls nicht zur DALIS-Bildung fähig waren. Neben der Aufgabe der DALIS sind auch die Mechanismen, die zu ihrer Entstehung führen, bislang ungeklärt. In dieser Arbeit konnte durch den Einsatz von Inhibitoren gezeigt werden, dass die Aktivierung der MAPK-Wege ERK1/2 und p38 ebenso eine wichtige Rolle spielen wie der PI3K/Akt-Weg. Desweiteren scheint die Aktivierung des Translationsfaktors eIF4E für die DALIS-Bildung und IL-6 Produktion von BMDCs von Bedeutung zu sein. Part 1: Heat shock proteins as indicators for wound healing The first part of this thesis is about the coherence of concentrations of the heat shock proteins (hsps) gp96 and hsp70 in human wound fluids (WFs) and the process of wound healing. Whereas detection of hsp70 in WFs and serum was performed with the help of an special ELISA-kit, an adequate and specific immunological detection method for gp96 had to be developed. This method includes gp96 immunoprecipitation and western blotting for detection and semiquantification of the hsp. To detect possible correlations of hsp concentrations in WFs and wound healing, WFs and sera of different patients were collected over a few days beginning one day after surgery and analysed. Hsp concentrations in WFs of trauma, chronic/septic and elective surgery wounds were compared. In contrast to WFs, patients sera contained only small amounts of hsps. In the WFs of trauma patients were high levels of both hsps at the beginning which decreased during wound healing. The same could be observed for gp96 in WFs after elective surgery in contrast to hsp70, which increased over the time. WFs of chronic and septic wounds showed constant hsp levels. These results suggested the possibility to draw conclusions about the process of wound healing by monitoring the hsp-levels of WFs. The partly different behaviour of gp96 and hsp70 can be explained by their different backgrounds. Gp96 is an ER-localised glycoprotein, which can be found in the extracellular space mainly after necrosis, whereas hsp70 belongs to the famliy of stress-induced proteins. Part 2: Coordination of maturation and antigen presentation of murine dendritic cells The second part of the dissertation dealt with the procedures during BMDC maturation in context with antigen presentation. In contrast to nonprofessional antigen presenting cells (nonprofessional APCs), in which early generation and presentation of CTL epitopes is required to allow fast elimination of infected cells by activated cytotoxic T lymphocytes (CTLs), the situation for dendritic cells (DCs) is different. Although viral infection and expression of virus-derived proteins are very fast, DCs need time to acquire an activated phenotype that allows optimal activation of naïve T cells. Actually, the results of this thesis revealed that the presentation of the immunodominant influenza nucleoprotein (NP)-derived CTL epitope is delayed in BMDCs compared to nonprofessional APCs. This delay coincided with the so called DALIS formation (dendritic cell aggresome-like induced structures). DALIS are transient aggregations of ubiquitinated proteins (DRiPs = defective ribosomal proteins) which appear in the cytosol of maturing DCs and macrophages. Normally, DRiPs are degraded rapidly by proteasomes. However, their storage in DALIS delay their degradation and stabilize them. So, it is hypothesized that DALIS can function as antigen depots, allowing DCs to coordinate regulation of DC maturation and antigen presentation. This assumption is supported by the finding of influenza NP in DALIS of infected cells. Besides, DALIS appearance and upregulation of MHC class I molecules as well as costimulatory molecules coincided during DC maturation. Furthermore, inhibition of DALIS formation led to an earlier recognition of influenza infected BMDCs by CTLs. In comparison to influenza-infected cells, cytomegalovirus (mCMV)-infected BMDCs showed no DALIS formation. In contrast to influenza, mCMV affects maturation and antigen presentation of BMDCs and therefore their ability to elicit a T cell response. In this case, mCMV-infected BMDCs showed the same antigen presentation kinetics as infected fibroblasts, which were also unable of DALIS formation. Apart from the exact functions of DALIS the mechansim leading to DALIS formation are also still unknown. Using different inhibitors of the toll like receptor (TLR) signaling pathways, this study show an important role of the MAPK pathways ERK1/2 and p38 as well as the PI3K/Akt pathway in DALIS formation. Furthermore, the activation of the translation initiation factor eIF4E seemed significant for IL-6 production and DALIS formation in BMDCs.

Die Interaktion von T-Zell-Rezeptoren mit MHC II-Selbstpeptid-Komplexen auf dendritischen Zellen scheint nicht nur für verschiedene Phasen der T-Zell-Entwicklung, sondern auch für die Regulation der T-Zell-Reaktivität gegenüber Fremantigenen von fundamentaler Bedeutung zu sein. In der vorliegenden Arbeit wurden die HLA-DR-restringierten Selbstpeptide unreifer und reifer humaner dendritischer Zellen untersucht und mittels Nanoelektrospray LC-MS/MS über 200 Peptidsequenzen identifiziert. Es zeigte sich, dass die von unreifen und reifen DCs präsentierten Selbstpeptide weitgehend identisch waren und dass die Peptide aus Proteinen nicht nur endosomal/lysosomaler Kompartimente, sondern auch aus cytosolischen und nukleären Proteinen stammten. Wesentlicher Unterschied in den Peptidrepertoires war die starke, selektive Anreicherung von MHC II-CLIP-Komplexen in reifen DC. Der Grund für die Akkumulation von CLIP auf der Zelloberfläche reifer DCs liegt vermutlich in der während der DC-Maturierung erfolgenden deutlichen Reduzierung der Menge und katalytischen Aktivität von HLA-DM, welches für die CLIP-Freisetzung verantwortlich ist. CLIP wird zusammen mit exogenen Antigenpeptiden in Tetraspan-Mikrodomänen angereichert, für die eine Funktion in der T-Zell-Aktivierung beschrieben wurde, und ist Bestandteil immunologischer Synapsen. MHC II-CLIP-Komplexe auf der Zelloberfläche von DCs beeinflussen die Polarisierung naiver T-Zellen: Eine Erhöhung des Anteils CLIP-beladener MHC II-Moleküle auf der Zelloberfläche wirkt der TH1-Polarisierung entgegen und fördert die Enstehung des TH2 und TH0 Phänotyps. Offenbar handelt es sich bei CLIP um einen endogenen Peptidliganden, der die Art der T-Zell-Antwort gegenüber exogenen Antigenen modulieren kann. Die Induktion und Aufrechterhaltung von Antitumor-Immunität erfordert die Aktivierung von CD4+-Helferzellen. Dazu werden in der Regel MHC II-restringierte, tumorspezifische Antigenepitope benötigt. In der vorliegenden Arbeit wurde eine Methode entwickelt, welche die direkte, d.h. T-Zell-unabhängige, massenspektrometrische Identifizierung von Antigenen erlaubt, die von Tumorzellen auf MHC II-Moleküle von DCs übertragen wurden. Es zeigte sich, dass Antigene besonders gut auf MHC II-Moleküle von DCs übertragen wurden und zu deutlichen Veränderungen im HLA-DR-Peptidrepertoire führten, wenn nekrotische Tumorzellen zusammen mit einem zusätzlichen inflammatorischen Stimulus in einer frühen Phase der DC-Maturierung als Antigenquelle eingesetzt wurden. Der effiziente Transfer von Antigenen aus nekrotischen Tumorzellen auf DCs, könnte durch freigesetzte Hitzeschock-Proteine vermittelt werden, die bestimmte MHC II-Epitope binden. Mit Hilfe dieser Methode gelang die Identifizierung eines neuen, tumorspezifischen T-Helferzell-Epitops. Durch differentielle Nanoelektrospray LC-MS/MS-Analyse ungepulster versus mit nekrotischen Tumorzellen gepulster DCs konnte das erste MHC-II-Epitop des melanomspezifischen Proteins Melanotransferrin, Melanotransferrin(668-684), identifiziert werden. Das Epitop erwies sich als guter Ligand für unterschiedliche HLA-DR-Moleküle und konnte eine spezifische CD4+-T-Zell-Antwort induzieren. Zudem konnte es als endogener MHC II-Ligand auf einer MHC II-positiven, Melanotransferrin-exprimierenden Melanomzellinie nachgewiesen werden. Neben seiner melanomspezifischen Expression konnte für Melanotransferrin auch eine spezifische Überexpression in Lungen- und Colon-Karzinomen gezeigt werden, so dass das identifizierte Epitop als aussichtsreicher Kandidat für den Einsatz in Vakzinierungen angesehen werden kann. Self-peptide-MHC II recognition on dendritic cells by T-cell receptors plays a role at all stages of T-cell development and seems to be of fundamental importance for the regulation of T-cell reactivity against foreign antigen as well. In this study HLA-DR restricted self-peptides of immature and mature human dendritic cells were analyzed via Nano-LC-MS/MS and more than 200 peptide sequences were identified. Self-peptides presented by immature and mature dendritic cells were largely identical and derived from proteins of endosomal/lysosomal compartments but also from cytosolic and nuclear proteins. The major distinction in the self-peptide repertoires was the selective upregulation of MHC II molecules occupied by the self-peptide CLIP on mature DCs - a phenomenon that is apparently due to the significant down-regulation of HLA-DM activity upon maturation. CLIP is enriched together with exogenous antigenic peptides in tetraspan microdomains, which have been described to play a role in T-cell activation, and localizes to DC-T-cell synapses. The rise in CLIP-MHC class II complexes favours polarization of autologous naïve T cells towards the unpolarized and TH2 phenotype, thereby antagonizing TH1 polarization. Thus, self-peptide CLIP appears to be a key regulator on DCs involved in balancing cytokine responses of T helper cells. Induction and maintenance of anti-tumor immunity depends on the activation of specific CD4+-helper cells. Therefore MHC class II restricted tumor specific antigens are required. In the present dissertation a method is introduced which allows the direct, T-cell independent identification of antigenic epitopes, which were transferred from tumor cells onto MHC class II molecules of dendritic cells, via mass spectrometry. Changes in the peptide repertoire were most prominent if antigen was provided by necrotic tumor cells in an early stage of maturation together with an inflammatory stimulus. The efficient transfer of antigens via necrotic tumor cells might be mediated by heat shock proteins, which were shown to bind certain MHC class II peptides. The identification of a novel, tumor specific T-helper epitope via this method is described. Differential nanospray LC-MS/MS analysis of unpulsed DCs versus DCs pulsed with necrotic tumor cells led to the identification of the first MHC class II epitope of the melanoma specific protein melanotransferrin, melanotransferrin (668-684). The identified epitope showed promiscuous binding to several HLA-DR types, proved to be immunogenic and was as well presented by a MHC class II positive, melanotransferrin expressing tumor cell line. Melanotransferrin is not only expressed on melanoma but also specifically over- expressed in certain lung as well as colon carcinoma. The identified epitope can therefore be seen as a promising candidate to be included in tumor vaccination trials applying tumor specific MHC peptides.

The generation of immunological memory is the result of a successful immune response and a pivotal goal of vaccination. Protective immunity is mediated by memory cells and can provide protection against reinfection and disease. Comprehending the mechanisms, which drive memory generation and subsequent memory maintenance, is very difficult owing to the extreme heterogeneity of the immunological memory. The pool of memory cells represents a complex compartment comprised of a wide variety of subpopulations, which differ significantly in function and phenotype. Upon antigen encounter during an infection or vaccination, naïve T cells become activated and differentiate into effector T cells. The mounted immune response resolves the infection and eliminates the pathogen. Subsequently, after the antigen has been cleared, most of these effector cells die, but those that survive give rise to memory T cells. A fraction of these memory cells are memory CD8 T cells, which can be further divided into two subsets, central memory (TCM) and effector memory (TEM) CD8 T cells, but their lineage relationships, ability to persist and confer protective immunity are not well understood. We demonstrate that in the continued absence of antigen TEM differentiate into TCM. Moreover, it is upon this differentiation into TCM that memory T cells acquire rapid responsiveness to antigen, the ability to produce and respond to certain cytokines, and the ability to undergo homeostatic turnover for long-term maintenance. Thus, our results show that TCM have a greater capacity than TEM to persist in vivo and are more efficient in mediating protective immunity because of their increased proliferative potential. Furthermore, we propose that TCM and TEM do not necessarily represent distinct subsets, but are part of a developmental continuum in the naïve -> effector -> TEM -> TCM linear differentiation pathway. We also demonstrate that the rate of conversion from TEM to TCM within the memory pool is programmed during the first week after immunization and may dependent on the amount of antigen available during initial antigen encounter. In the present work, we further examine the rate of reversion from TEM to TCM for several different epitope-specific T cell populations, which are induced during the same infection. Additionally, we compare the reversion rates of these different virus-specific CD8 T cell populations in multiple lymphoid and non-lymphoid tissues. Our findings demonstrate that memory conversion from TEM to TCM is a distinct function of time and that the rate at which this differentiation occurs after the resolution of an infection, is characteristic for each single epitope-specific T cell population. We further show that memory conversion is not confined to specialized sites but occurs in all tissues, and that conversion rates are different for each location. Additionally, our study demonstrates that memory conversion occurs at similar rates and pattern after different types of infection. Several recent studies have examined the molecular mechanisms that are involved in memory T cell development by examining the gene expression profile of those cells. The pattern of gene expression changes as T cells progress from the naïve stage through the effector stage toward memory cell development, including TEM -> TCM differentiation. We have demonstrated in preceding work that TEM and TCM are phenotypically and functionally distinct, but whether this is due to transcriptional and/or post-transcriptional mechanisms is not clear. In this study, in order to better understand the emerged differences between TEM and TCM, we now examine genes that are differentially expressed in these subsets and attempt to correlate their molecular profiles with their distinct functions and memory properties. The two major differences between TEM and TCM are migration pattern and proliferative capacity. Here, both are also confirmed on a molecular basis and are strikingly mirrored in the expression profile of correlating genes. Altogether, this work is ought to shed some new light on the phenomenon of memory generation and to contribute new information to the process of memory CD8 T cell formation in vivo. The delineation of mechanisms that determine and regulate memory differentiation and maintenance has great impact on vaccination immunology. Particularly the notion that effector memory T cells need to further differentiate to acquire full proliferative capacity has considerable implications for vaccine regimens involving boosting strategies. Our results suggest that vaccine boosters should be separated by a significant length of time to allow generated effector cells to differentiate into central memory cells. Only this way T cells are able to reset their state of responsiveness to antigen and to acquire their full proliferative capacities to optimally confer and mediate protective immunity. Naive T Zellen werden aktiviert und differenzieren sich in Effektor T Zellen, nachdem sie im Rahmen einer Infektion oder Impfung mit ihrem Antigen in Kontakt gekommen sind. Die so initiierte Immunantwort bekämpft die Infektion und eliminiert das ursächliche Pathogen. Die meisten Effektorzellen sterben danach ab und nur wenige überleben und gehen in Gedächtniszellen über. Ein Teil dieser Gedächtniszellen sind CD8 T Zellen, welche in zwei Untergruppen aufgeteilt werden können: Zentrale (TCM) und Effektor (TEM) CD8 T Gedächtniszellen. Die Linienverwandtschaft dieser beiden Untergruppen ist nicht eindeutig geklärt, ebenso deren Fähigkeiten im Organismus zu überdauern und protektive Immunität zu vermitteln. Wir zeigen in dieser Arbeit, dass sich TEM in andauernder Abwesenheit spezifischen Antigens zu TCM differenzieren. Mit dieser Differenzierung ist es außerdem erst möglich, als Gedächtniszelle eine vereinfachte Aktivierbarkeit gegenüber dem Antigen zu erwerben, sowie bestimmte Zytokine zu produzieren und auf andere zu reagieren. Außerdem werden Gedächtniszellen hierbei mit der Fähigkeit ausgestattet, sich durch homöostatische Teilung auf lange Zeit zu unterhalten. Unsere Ergebnisse zeigen, dass TCM bessere Voraussetzungen für ein Überdauern im Organismus haben als TEM. Außerdem sind TCM effizienter in der Vermittlung protektiver Immunität; ein Phänomen, welches auf deren erhöhten Teilungsfähigkeit beruht. Des weiteren demonstrieren wir, dass TCM und TEM keine von einander getrennten Untergruppen darstellen, sondern dass beide vielmehr Teil eines gemeinsamen Entwicklungsprozesses sind. Wir schlagen deshalb folgenden linearen Entwicklungsweg vor: Naive Zelle -> Effektorzelle -> Effektor Gedächtniszelle -> Zentrale Gedächtniszelle. Es wird ferner von uns gezeigt, dass die Umwandlungsrate von TEM zu TCM innerhalb einer Gedächtniszellpopulation während der ersten Woche nach einer Immunisierung festgelegt wird. Hierbei scheint die anfangs zugängliche Menge an Antigen eine wichtige Rolle zu spielen. In dieser Arbeit untersuchen wir daher auch die Umwandlungsrate von TEM zu TCM für verschiedene epitop-spezifische T Zellpopulationen, welche durch dieselbe Infektion induziert wurden. Zusätzlich vergleichen wir die Umwandlungsraten dieser verschiedenen epitop-spezifischen CD8 T Zellpopulationen in mehreren lymphatischen und nicht-lymphatischen Geweben. Unsere Daten demonstrieren hierbei, dass die Umwandlung von TEM zu TCM einer strengen zeitlichen Funktion folgt und für jede einzelne epitop-spezifische T Zellpopulation verschieden und charakteristisch ist. Die Umwandlung ist außerdem nicht spezialisierten lymphatischen Geweben vorbehalten, sondern erfolgt in allen Geweben, wobei sich die Umwandlungsraten wiederum in den einzelnen Geweben charakteristisch voneinander unterscheiden. Die Umwandlung von Gedächtniszellen erfolgt außerdem nach ähnlichen Prinzipien und Gesetzmäßigkeiten auch bei Infektionen mit unterschiedlichen Pathogenen. Einige aktuelle Untersuchungen beschäftigen sich mit den molekularen Mechanismen, welche für die Entwicklung von T Gedächtniszellen eine wichtige Rolle spielen. Hierbei nutzen sie vor allem die Analyse der Genexpressionsprofile dieser Zellen. Die Gen-expressionsmuster ändern sich, wenn naive T Zellen sich entlang ihrer Zwischenstadien zu Gedächtniszellen entwickeln. Hierzu gehört auch die Umwandlung von TEM zu TCM. Wir haben bereits gezeigt, dass TEM und TCM sich phänotypisch und funktional unterscheiden, doch ob dies transkriptionellen und/oder post-transkriptionellen Mechanismen zugrunde liegt ist unklar. Wir untersuchen daher in dieser Arbeit diejenigen Gene, die differenziell in den beiden Untergruppen TEM und TCM exprimiert werden, um die offensichtlichen Unterschiede zwischen ihnen besser zu verstehen. Wir versuchen hierbei ihre molekularen Profile mit den unterschiedlichen Funktionen und Eigenschaften als Gedächtniszellen zu korrelieren. Die zwei Hauptunterscheidungsmerkmale zwischen TEM und TCM sind deren Migrationseigenschaften und Teilungsfähigkeiten. Beide Merkmale konnten von uns auch auf molekularer Ebene bestätigt werden und spiegeln sich sehr deutlich in den Expressionsprofilen der entsprechenden Gene wider. Von großer Bedeutung für die Impf- und Immunisierungsimmunologie ist besonders die Vorstellung, dass TEM sich in Abwesenheit spezifischen Antigens weiter differenzieren müssen, um volle Gedächtniszelleigenschaften und Gedächtniszellfähigkeiten zu erlangen. Unsere Ergebnisse legen nahe, dass sequenzielle Mehrfachimpfungen und Auffrischimpfungen durch einen signifikanten Zeitraum getrennt sein sollten, um den neu entstandenen Effektorzellen eine vollständige Differenzierung in Zentrale Gedächtniszellen zu ermöglichen. Nur auf diesem Wege ist es T Zellen möglich den Status ihrer Aktivierbarkeit gegenüber dem Antigen erfolgreich zu ändern und die volle Teilungsfähigkeit einer Zentralen Gedächtniszelle zu erwerbeben, um optimal protektive Immunität zu vermitteln.

Professionell antigenpräsentierende Zellen, z.B. dendritische Zellen, sind für die Induktion einer spezifischen zellulären Immunantwort verantwortlich. Obwohl antigenpräsentierende Zellen sehr effizient Antigene aufnehmen können, gestaltet sich insbesondere die gezielte Einschleusung von Antigenen für die Präsentation über den MHC-Klasse I-Weg schwierig, welche zur Induktion einer CD8+ T-Zellantwort, z.B. gegen Tumorzellen, erwünscht ist. Zellpermeable Moleküle stellen für einen Antigentransfer attraktive Kandidaten dar; sie können die an sie fusionierten bzw. assoziierten Antigene direkt in das Zytoplasma von antigenpräsentierenden Zellen eintransportieren und somit dem MHC-I-abhängigen Präsentationsweg zugänglich machen. Eine in der PreS2-Domäne der viralen Oberflächenproteine des humanen Hepatitis B-Virus charakterisierte 12 AS lange Sequenz (TLM) weist die Eigenschaft der Zellpermeabilität auf. Das TLM gelangt in einem energie-, rezeptor- und temperaturunabhängigen Diffusionsprozess in das Zytoplasma von Zellen, ohne die Zellintegrität zu beeinflussen. Im Rahmen dieser Arbeit wurde das Potential des TLM als Vehikel für einen Antigentransfer untersucht. Verschiedene mit dem TLM modifizierte Antigenspezies (spezifisches CD8+ T-Zellepitop, virale HBV Corepartikel als Epitopträger und gesamte Proteine) wurden auf ihre Fähigkeit hin charakterisiert, in das Zytoplasma von antigenpräsentierenden Zellen zu transduzieren und nach der Internalisierung eine spezifische CD8+ T-Zellantwort zu induzieren. Das Modellprotein Ovalbumin wurde als Schwerpunkt im Rahmen der Arbeit eingesetzt. In der Sequenz von Ovalbumin wurde ein 8 AS langes, H-2Kb restringiertes, immundominantes MHC-Klasse I-Epitop (SIINFEKL) charakterisiert, welches für Untersuchungen des MHC-I-abhängigen Präsentationsweges vorteilhaft ist. Die OT-1 Maus stellt ein transgenes Mausmodell für den passenden spezifischen T-Zell-Rezeptor dar, welcher den SIINFEKL-H-2Kb-Komplex erkennt, und ist damit für funktionelle Studien einsetzbar. Rekombinante Ovalbumin-Proteine, das Wildtyp-Protein (OVA-HA) sowie das am N-Terminus um das TLM verlängerte Protein (TLM-OVA-HA), wurden aus einem bakteriellen Expressionssystem gewonnen. Für TLM-OVA-HA konnte im Gegensatz zu OVA-HA Zellpermeabilität mittels Immunfluoreszenzfärbung beobachtet werden. Die Inkubation von OT-1 Milzzellen mit TLM-OVA-HA führte in vitro zu einer besseren Stimulation von transgenen spezifischen CD8+ T-Zellen als die Inkubation mit OVA-HA. Die Zellen zeigten eine stärkere Expression des Aktivierungsmarkers CD69, eine stärkere Produktion von IFNgamma und eine bessere Proliferation. In einem adoptiven Transfermodell wiesen die transferierten CD8+ T-Zellen in vivo nach Immunisierung mit einer geringen Dosis an TLM-OVA-HA im Vergleich zu OVA-HA eine stärkere Proliferation auf. Weiter konnte eine stärkere zytotoxische Aktivität der spezifischen CD8+ T-Zellen nach Gabe von TLM-OVA-HA im Vergleich zu OVA-HA beobachtet werden. In einem Tumormodell führte die Immunisierung von C57BL/6 Mäusen mit den rekombinanten Ovalbumin-Proteinen nur zu einer schwachen Antitumor-Antwort. Die Insertion des TLM bewirkte ein leicht vermindertes Auswachsen von Tumoren. In OT-1 Mäusen entwickelten alle Tiere nach Immunisierung mit OVA-HA einen Tumor; im Gegensatz dazu blieben nach Immunisierung mit TLM-OVA-HA fast die Hälfte der Tiere tumorfrei. Die Ergebnisse der Arbeit zeigen das Potential von TLM-Fusionsproteinen auf, einen Antigentransfer in antigenpräsentierende Zellen zu vermitteln und sowohl in vitro als auch in vivo eine CD8+ T-Zellantwort auszulösen. Antigen presenting cells (APCs), e.g. dendritic cells, are responsible for the induction of specific cellular immune responses. Although APCs can take up antigens very efficiently, the insertion of antigens in the MHC class I presentation pathway is often difficult leading to stimulation of CD8+ T-cell mediated immune responses, e.g. against tumour cells. Cell permeable molecules are very attractive tools for mediating antigen transfer. They can translocate antigens (proteins, peptides) fused to them directly into the cytosol of APCs and deliver them into the MHC-class I presentation pathway. Recently a 12 aa long cell permeable peptide in the PreS2-domain of Hepatitis B-virus surface antigens was characterised. This motif (called translocation motif, TLM) can act as a shuttle into the cytosol of cells for peptides and proteins fused to the TLM. The cell permeability is mediated in an energy, receptor and cell type independent way without affecting the cell integrity. In this project the efficient transfer of antigens (specific CD8+ T-cell epitopes, HBV derived core particles as epitope carriers, full length proteins) into the cytosol of APCs via the TLM was investigated. The induction of CD8+ T-cell mediated immune responses against these internalised antigens was characterised. As main part of the project Ovalbumin was used as model antigen. An immunodominant MHC class I binding peptide (SIINFEKL) that elicits H-2Kb restricted cytotoxic T- cells (CTLs) has been identified. The OT-1 mouse is a transgenic mouse model carrying the appropriate T-cell receptor for the H-2Kb-MHC I-SIINFEKL-complex and it is suitable for functional studies. Recombinant Ovalbumin proteins, the wild type protein (OVA-HA) and Ovalbumin which carries the TLM at the N-terminus (TLM-OVA-HA), were produced and purified in a bacterial expression system. The cell permeability of TLM-OVA-HA in contrast to OVA-HA was detected via immunofluorescence staining. Splenocytes of OT-mice were incubated in vitro with recombinant Ovalbumin proteins. In comparison to cultures pulsed with OVA-HA the stimulation kinetics of cells pulsed with TLM-OVA-HA were earlier and higher. Also a stronger secretion of IFNgamma and a better proliferation by the specific CD8+ T-cells were observed. In an adoptive transfer model better proliferation of transferred transgenic CD8+ T-cells was observed in mice immunised with TLM-OVA-HA compared to mice immunised with OVA-HA using small amount of protein. After immunisation with TLM-OVA-HA compared with OVA-HA better cytolytic activity of specific CD8+ T-cells was detected in an in vivo cytotoxic assay. Using a tumour model in C57BL/6 mice only a weak antitumour response was observed after immunisation with recombinant Ovalbumin proteins. Immunisation with TLM-OVA-HA mediated a little better effect compared to immunisation with OVA-HA. Treating OT-1 mice all animals showed tumour growth after immunisation with OVA-HA. In contrast after immunisation with TLM-OVA-HA nearly half of the animals did not develop a tumour. Results of the project show that proteins fused to the TLM can translocate into the cytosol of antigen presenting cells and can induce CD8+ T-cell mediated immune response in vitro and in vivo.

Genomics (Oligonukleotid Mikroarray-basierte Expressionsanalyse) und Analyse des MHC Klasse I-Ligandoms (Massenspektrometrie) wurden zur Charakterisierung von primären Nierenzellkarzinomen kombiniert, um Impfstoffe für die Immuntherapie bei Tumorerkrankungen entwickeln zu können. Es konnte gezeigt werden, dass das Verfahren schnell genug ist, um nach chirurgischer Entfernung des Tumors in angemessener Zeit eine Impfung des Patienten zu ermöglichen. An sieben Beispielen wurde dargestellt, dass es möglich ist, aus dem entnommenen Tumor die Informationen zu erhalten, welche für das Design eines Peptid-basierten Multi-Epitop-Impfstoffes benötigt werden. Der Impfstoff ist auf den einzelnen Patienten zugeschnitten und berücksichtigt dessen individuelle Target-Moleküle sowie alle seine exprimierten HLA-Allele. In-vitro T-Zell-Analysen, welche exemplarisch für zwei der neu entdeckten Liganden durchgeführt wurden, bestätigten die Anwendbarkeit des neuen Verfahrens. Es konnte gezeigt werden, dass es sich bei den Liganden erstens um T-Zell-Epitope handelt und zweitens, dass T-Zellen, welche diese Epitope erkennen, Tumorzellen auslöschen können und gleichzeitig gesunde Kontrollzellen verschonen. Als wesentlicher Bestandteil des gesamten Verfahrens wurde eine auf Oligonukleotid Mikroarrays basierende Expressionsdatenbank erstellt, welche es erlaubt, die Expression eines beliebigen sich auf dem Array befindlichen Genes (insgesamt 22.000 Gene) in zwanzig verschiedenen gesunden Geweben und Organen abzurufen. Eine klinische Studie zur Erprobung des Verfahrens wurde begonnen und die ersten vier Patienten bereits rekrutiert und analysiert. Der zweite Teil der Dissertation beschreibt Ergebnisse auf dem Gebiet der Antigenprozessierung. Zum einen wurde eine neue Aminopeptidase, die sich im Lumen des Endoplasmatischen Retikulums befindet und in das Trimming von Epitopen involviert ist, untersucht. Diese wurde inzwischen als ERAP1 identifiziert. Weiter konnte gezeigt werden, dass Tripeptidylpeptidase eine wesentliche Rolle bei der Generierung eines MHC Klasse I-Epitopes spielt. Genomics (oligonucleotide microarray based expression profiling) and MHC class I-ligandome analysis (mass spectrometry) were combined to analyse tumors of renal cell carcinoma patients. This can be performed in an appropriate timeframe after surgical intervention to allow rapid subsequent vaccination. Thus, it was demonstrated in seven cases that it is possible to extract information from a single excised tumor specimen that leads to an optimized design of a multi-epitope, peptide-based vaccine directed against the tumor of an individual patient and considering all expressed HLA-alleles. New tumor associated antigens together with MHC class I-ligands encoded by them can be identified using this approach. In vitro T cell analyses carried out for two of the newly discovered ligands have proven that, first, they were T cell epitopes, and, second, T cells specific for these epitopes mediated lysis of tumor cells but not control cells. As part of the complete approach, a database based on oligonucleotide microarrays was built covering 22.000 gene expression values of twenty one human healthy tissues and organs. Finally, a clinical study using this approach was started and four RCC patients were already analyzed and three patients vaccinated. The results of this thesis presented in part two provided new insights into the antigen processing mechanisms. First, there was evidence for a novel luminal endoplasmic reticulum aminopeptidase involved in epitope trimming events, which in the meantime has been identified as being ERAP1. Second, it could be shown that tripeptidyl peptidase plays an essential role in the generation of an MHC class I epitope.

In der vorliegenden Arbeit wurde die bestehende Datenbasis von proteasomalen Schnittdaten durch die Analyse des in vitro Verdaus von PrP und durch eine große Zahl von Peptidverdaus beträchtlich erweitert. Alle durchgeführten Verdauexperimente wurden quantitativ durch eine Kombination von Edman-Sequenzierung und Massenspektroskopie analysiert. Durch die quantitative Analyse des Verdau von PrP konnten die Unterschiede in den Schnittpräferenzen von konstitutiven und immuno-20S-Proteasomen, die bereits durch Verdau von Hefe Enolase-I erstmals charakterisiert wurden, weiter differenziert und verfeinert werden. Des Weiteren konnte gezeigt werden, dass die Unterschiede in der Pathogenität zweier unterschiedlicher PrP-Allele in Schafen mit der proteasomalen Abbaugeschwindigkeit der exprimierten PrP-Varianten korreliert, was den Schluss nahe liegt, dass der proteasomale Abbau von PrP eine wichtige Rolle in der Pathogenese von PrP spielt. In mehreren Peptidverdaus konnte für unterschiedliche CTL-Epitope nachgewiesen werden, ob diese präferentiell durch konstitutive oder immuno-20S-Proteasomen prozessiert werden. Diese Peptidverdaus stellen neben der direkt daraus extrahierbaren Information über die Prozessierung eines speziellen Epitops auch eine wertvolle Datenquelle für die Evaluierung von proteasomalen Schnittvorhersagen dar. Es konnte eine Methode etabliert werden, die den Verdau von weiteren Substraten durch 20S Proteasomen in vitro ermöglicht, damit ist der Grundstein für eine weitere Erweiterung der verfügbaren Daten über die proteasomale Schnittspezifität gelegt, die letztendlich zur Verfeinerung und Qualitätsverbesserung der Vorhersagealgorithmen für proteasomale Schnitte führen wird. Aufgrund der nun vorliegenden Datenbasis von proteasomalen Schnittdaten war eine Entwicklung von Vorhersagealgorithmen möglich, die eine differenzierte Schnittvorhersage von konstitutiven und immuno-20S-Proteasomen erlauben, dies ist insbesondere für die Vorhersage von viralen Epitopen von nicht zu vernachlässigender Bedeutung. Die Vorhersagequalität der in dieser Arbeit entwickelten Methode zu proteasomalen Schnittvorhersage übersteigt die anderer publizierter Algorithmen. Weiterhin konnte durch eine Kombination dieser Algorithmen mit der Vorhersage von TAP-Transport und MHC-Bindung eine kombinierte Vorhersagemethode etabliert werden, die es ermöglicht, den Einfluss der drei höchst-selektiven Prozesse auf die Antigenprozessierung zu modellieren. Die dabei erreichte Vorhersagequalität erreicht Werte von AUC >0.95, was der Vorhersagequalität von SYFPEITHI in den untersuchten Testdatensätzen vergleichbar, in manchen Fällen auch leicht überlegen ist. Diese kombinierte Vorhersage steht für eine Vielzahl unterschiedlicher MHC-Klasse-I Allele zur Verfügung. Mit dem Projekt “Reverse Analysis of Processing“ konnte schließlich die Grundlage für eine Evaluierung des Einflusses flankierender Sequenzen auf die Antigenprozessierung innerhalb einer lebenden Zelle gelegt werden. Das etablierte System ermöglicht eine einfache Analyse des Einflusses sowohl einzelner Aminosäuren als auch der Gesamteinflusses der betrachteten flankierenden Positionen auf die Prozessierungseffizienz durch konstitutive und immuno-Proteasomen. Erste Ergebnisse aus diesem Projekt zeigen bereits eine sehr gute Korrelation des Einflusses der untersuchten flankierenden Sequenzen mit der in MHC Klasse-I-Liganden vorliegenden Aminosäureverteilung. Letztendlich können die aus diesem Projekt gewonnenen Ergebnisse über die Antigenprozessierung in vivo mit in die Entwicklung eines Vorhersagealgorithmus zur Prozessierung von MHC-Klasse-I Liganden miteinfließen und so zu einer weiteren Verbesserung der Vorhersagequalität führen. In this work, the database of proteasomal cleavage data was substantially extended by the analysis of the digestion of prion protein (PrP) and a large number of peptide digests. All digestion experiments were quantitatively analyzed by a combination of Edman-sequencing and MALDI-mass spectrometry. The quantitative analysis of the proteasomal digestion of PrP allowed further differentiation and refinement of the different cleavage specificities of constitutive and immuno-20S porteasomes, that were first characterized by the analysis of the digesition of yeast enolase-1. Furthermore, it was shown that the differences in the pathogenicity of two different alleles of PrP correlate with the rate of proteasomal digestion of the expressed PrP-variants. This allows the conclusion, that proteasomal degradation plays a role in the pathogenesis of PrP. Using peptide digests, differential processing of multiple CTL-Epitopes by constitutive and immuno-20S-proteasomes could be shown. These peptide digests not only provide information about the processing of a defined CTL-epitope, but are also a valuable source of cleavage data for the development of prediction algorithms for proteasomal cleavages. Additionally, a method was established that allows the digestion of further substrates by 20S proteasomes in vitro, laying the foundation for the growth of the database of proteasomal cleavages, which will finally lead to the improvement of prediction algorithms for proteasomal cleavages. Using the available proteasomal cleavage data, it was possible to develop prediction algorithms that differentiate between cleavages made by constitutive and immuno-proteasomes, which is of special interest for the forecast of viral epitopes. The quality of the established prediction method surpasses all other previously published prediction algorithms. Combining this algorithm with the prediction of TAP-transport and MHC-binding, a prediction method was established that allows to model the influence of the three most selective steps in antigen presentation. The prediction quality reaches AUC-values of >0.95, which is comparable and in some cases better than SYFPEITHI. The combined prediction is available for more than 30 human HLA-alleles on www.mhc-pathwy.net. The project “Reverse Analysis of Processing” provides the basis for the evaluation of the influence of epitope-flanking residues on antigen processing inside living cells. The established system provides a simple way to analyze the influence of single amino acids on the processing efficiency by constitutive and immuno-proteasomes. First results from this project show a very good correlation of the influence of the analyzed flanking residues and their propensities in MHC class-I ligands. The insights into antigen presentation in vivo gained from this project will help to further refine the prediction algorithms for MHC class-I ligands.

The small GTPase Arf1 is a crucial regulator of vesicle formation at many steps of the secretory pathway in the yeast Saccharomyces cerevisiae as well as in higher eukaryotes. Currently best understood is the role of Arf1 in the formation of COPI-coated vesicles at different levels of the Golgi apparatus. In addition, there is growing evidence of Arf1 being involved in actin cytoskeleton rearrangements as well as in lipid metabolism. The variety of already known regulators and effectors of Arf1 is, however, still insufficient to explain the multiple functions of the same molecule at different cellular locations. Furthermore, it is likely that new Arf1-dependent pathways await discovery in both yeast and mammals. In this study, a differential affinity chromatography approach was used to identify new interactors of Arf1p from Saccharomyces cerevisiae cytosol. One of the new interactors of activated Arf1p that was identified was the polyA-binding protein Pab1p, which binds to the polyA-tail of mRNA. Pab1p was found to associate with purified COPI-coated vesicles generated from Golgi membranes in vitro. The stability of the Arf1p-Pab1p complex depends on the presence of mRNA. Both symmetrically distributed mRNAs as well as the asymmetrically distributed ASH1 mRNA are found in association with Arf1p. Remarkably, Arf1p and Pab1p are both required to restrict ASH1 mRNA to the bud tip. Arf1p and coatomer play an unexpected role in localizing mRNA independent and downstream of the SHE machinery. Hereby acts the SHE machinery in long-range mRNA transport while COPI vesicles could act as short-range localization vehicles. The ER-Golgi shuttle might be involved in concentrating mRNA at the ER. Other interactors of activated Arf1p identified were Chs5p and Bch1p, a member of the Bud7-Chs6 family. In this study, I showed that all members of this new and previously uncharacterized fungi-specific protein family physically interact with Arf1p and Chs5p. Moreover, the Bud7-Chs6 family proteins interact with one another and form higher molecular weight complexes. In addition, they are all at least partially localized to the trans-Golgi network. Most importantly, at least Bud7p and Bch2p are found on vesicles generated from Golgi membranes in vitro. The Bud7-Chs6 family is required for trafficking of specific cargo molecules like the chitin synthase Chs3p from the trans-Golgi-network to the mother-bud neck and plays a role in bud-site selection. These functions of the Bud7-Chs6 family proteins converge in Chs5p. Finally, I propose that the Bud7-Chs6 family proteins act as cargo receptors and are involved in Arf1p-dependent post-Golgi transport steps of fungi-specific cargo molecules directed to the mother-bud neck. Die kleine GTPase Arf1 ist ein entscheidender Regulator bei der Vesikelbildung an vielen Stellen des sekretorischen Wegs in der Hefe S. cerevisiae und ebenso in höheren Eukaryoten. Momentan ist die Funktion von Arf1 bei der Bildung von COPI-Vesikeln am besten charakterisiert. Es gibt aber auch immer mehr Hinweise darauf, dass Arf1 an der Umbildung des Actin-Cytoskeletts beteiligt ist und ebenso den Lipid-Metabolismus beeinflusst. Die große Vielfalt an schon bekannten Interaktoren von Arf1 ist jedoch immer noch nicht ausreichend, um die multiplen Funktionen ein und desselben Moleküls an verschiedenen zellulären Orten zu erklären. Es ist außerdem wahrscheinlich, dass weitere Arf1-abhängige Wege in Hefen und höheren Eukaryoten noch gar nicht entdeckt wurden. In dieser Arbeit wurde eine differenzielle Affinitätschromatographie durchgeführt, um neue cytosolische Interaktoren von Arf1p aus S. cerevsiae zu identifizieren. Einer der neu gefundenen Interaktoren von aktiviertem Arf1p war das PolyA-bindende Protein Pab1p. Es wurde gefunden, dass Pab1p mit aufgereinigten COPI-Vesikeln assoziiert ist, die aus Golgi Membranen in vitro hergestellt wurden. Die Stabilität des Arf1p-Pab1p Komplexes war ab hängig von mRNA. Sowohl symmetrische mRNAs als auch die asymmetrisch verteilte ASH1 mRNA waren mit Arf1p assoziiert. Bemerkenswerterweise waren sowohl Arf1p als auch Pab1p nötig, um ASH1 mRNA auf die Knospungspitze zu beschränken. Arf1p und Coatomer spielen eine unerwartete Rolle in der Lokalisierung von mRNA. Diese ist unabhängig von der SHE Maschinerie und ihr nachgeschaltet. Die SHE Maschinerie agiert hier als Langstrecken-Transportsystem, während COPI-Vesikel kurze Strecken überbrücken könnten. Der ER-Golgi Pendelverkehr könnte daran beteiligt sein, mRNA am ER zu konzentrieren. Weitere neue Interaktoren waren Chs5p und Bch1p, ein Mitglied der Bud7-Chs6 Familie. In dieser Arbeit wurde gezeigt, dass alle Mitglieder dieser pilzspezifischen Proteinfamilie physikalisch mit Arf1p und Chs5p wechselwirken. Darüber hinaus interagieren die Proteine der Bud7-Chs6 Familie miteinander und bilden höhermolekulare Komplexe. Alle sind zumindest teilweise am trans-Golgi Netzwerk lokalisiert und außerdem sind Bud7p und Bch2p auf Vesikeln zu finden. Die Bud7-Chs6 Familie ist nötig für den Transport von spezieller Proteinfracht wie etwa der Chitin Synthase Chs3p vom trans-Golgi-Netzwerk zum Knospungshals und spielt eine Rolle bei der Auswahl der Knospungsstellen. Diese Funktionen der Bud7-Chs6 Familie konvergieren in Chs5p. Es wird vorgeschlagen, dass die Mitglieder der Bud7-Chs6 Familie als neuartige Fracht-Rezeptoren fungieren und beteiligt sind an Arf1p-abhängigen post-Golgi Transportschritten hin zum Knospungshals.