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Nosip, auch bekannt als nitric oxide synthase interacting protein, gehört aufgrund seines Aufbaus und seiner Struktur zu der Proteinfamilie der U-Box Ubiquitin E3 Ligasen. Die Expression von Nosip ist ubiquitär in vielen verschiedenen Geweben. Im Mausmodell konnte Nosip bereits eine Interaktion mit der Proteinphosphatase PP2A zugeschrieben werden, welche mit verantwortlich für die Entstehung einer Holoprosencephalie und der mit dieser einhergehenden Fehlbildungen gemacht wird. Allerdings bleibt der Pathomechanismus, in welchem Nosip agiert, bislang weitestgehend unverstanden, weshalb hier nun mit Hilfe des Modellorganismus Xenopus laevis in Bezug auf die Funktion von Nosip während der Neuralentwicklung nähere Untersuchungen durchgeführt werden sollten. Um einen besseren Einblick in die Funktion von Nosip in diesen Strukturen zu erlangen, wurden Funktionsverluststudien durch die Injektion eines auf Spezifität geprüften anti-sense Morpholino Oligonukletids durchgeführt. Hierbei zeigte sich durch den Funktionsverlust von Nosip eine Abnormalität in der Entwicklung des Auges, des Gehirns und den kranialen Knorpelstrukturen. Um die Pathophysiologie der durch Nosip Depletion verursachten Defekte besser verstehen zu können wurden in dieser Arbeit verschiedene Mechanismen des Signalwegs von Nosip in der Interaktion mit Rbp1 diskutiert. Demzufolge könnte Nosip ein Zielgen für kongenital erworbene Erkrankungen der oben beschriebenen Strukturen darstellen und ein besseres Verständnis der Funktion von Nosip für die zukünftigen Behandlungsansätze entscheidend sein.

Von neuralen Stammzellen (NSC) und deren autologer Transplantation erhofft man sich, dass sie genetisch identische, gesunde Gewebe kreieren können, die zerstörtes ZNS (Zentrales Nervensystem)-Gewebe ersetzen, indem neurotrophe Faktoren sezerniert, neuroinflammatorische Prozesse reduziert und die Neurogenese sowie nichtneuronaler Zellersatz gefördert werden. Insbesondere im Rahmen neurodegenerativer Erkrankungen wie Morbus Parkinson, Chorea Huntington oder Morbus Alzheimer, aber auch nach ischämischen/traumatischen ZNS-Erkrankungen bzw. Gehirntumoren könnten sie Therapieoptionen darstellen. Neurogenese ist modifizierbar; diverse physiologische, pathologische, chemische bzw. ex- und intrinsische Faktoren haben Einfluss auf Proliferation und Differenzierung. Die Differenzierbarkeit einer Stammzelle ist nicht auf Zelllinien ihres Keimblattes begrenzt, sie kann auch in eine Zelle, die nicht der ursprünglichen Zelllinie zugehört, differenzieren (Transdifferenzierung). Mesenchymale Knochenmarksstromazellen (MSC) können in Neurone differenzieren (mNSC). MSC haben auch direkt Einfluss auf die Neurogenese. Der direkte Effekt von mNSC wurde bis dato noch nicht untersucht. In dieser Arbeit wurde das Proliferations- und Differenzierungsverhalten embryonaler neuraler Ratten- (ratNSC) bzw. Mäusestammzellen, die einen gelb fluoreszierenden Farbstoff überexprimierten (YFP-mouseNSC) unter Zellkulturbedingungen mittels indirekter Immunfluoreszenzfärbung untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass Hypoxie (3% O2) die Proliferation von NSC hochsignifikant reduziert (von 20,6% auf 8,5%), möglicherweise durch Verringerung der Zelldichte und dadurch verringerte Zellvitalität. Gegebenenfalls bildete auch die als Maß für die Proliferation verwendete Bromodesoxyuridin (BrdU)-Inkorporation die Ergebnisse falsch ab, da BrdU auch in apoptotische Zellen inkorporiert wird und somit falsch hohe Proliferationsraten liefert. Folgeversuche sollten ergänzende FACS-Analysen des Zellzyklus beinhalten. mNSC-Überstand reduzierte in Suspensionskultur sowohl Zelltod (im Falle der ratNSC von 17,9% auf 6,4%, im Falle der YFP-mouseNSC von 21,6% auf 7,4%) als auch Proliferation (ratNSC: von 37,4% auf 23,9%; YFP-mouseNSC: von 64,6% auf 48,9%) von NSC signifikant. In adhärenter Kultur hingegen steigerte er die Zellproliferation signifikant (von einer Wachstumsrate von 0,04 pro Tag auf mindestens 0,34 pro Tag). Reduzierter Zelltod und gesteigerte Proliferation beruhen am ehesten auf während der Transdifferenzierung sezernierten löslichen Faktoren, während die mutmaßlich reduzierte Proliferationsrate in Suspensionskultur erneut der Proliferationsmessung mittels BrdU geschuldet gewesen sein könnte, welche die spontane Apoptose der NSC durch Anoikis als hohe Proliferationsrate zeigte, während der Zelltod reduzierende Effekt des Überstandes eine mutmaßlich geringere Proliferation ergab. In direkter Kokultur von mNSC mit NSC kam es zu hochsignifikant gesteigerten Proliferationsraten im Vergleich zu Kontrollen (Steigerung der Wachstumsrate von 0,03 auf 0,27 pro Tag bei Zugabe von 19000 Zellen). Unsere Arbeitsgruppe konnte zeigen, dass es dabei auf mRNA- und Proteinebene zu einer Hochregulierung von zytotrophischen Faktoren kommt, die zum Teil neuroprotektiv wirken. Insgesamt jedoch ist die neuronale Differenzierungskapazität von MSC limitiert. Mittlerweile können mit Verfahren, die die heterologe Expression verschiedener Transkriptionsfaktor-Kombinationen nutzen, NSC aus Fibroblasten generiert und expandiert werden – sog. induzierte pluripotente Stammzellen-, die die Haupteigenschaften primärer NSC besitzen. In zukünftigen Studien sollte der Effekt dieser Zellen in Kokultur mit primären NSC untersucht werden. Interleukin-1ß, Interleukin-11, Leukemia inhibitory Factor und Forskolin begünstigten eine neuronale Differenzierung von NSC. IL-1ß z. B., inhibiert unter anderem die Differenzierung hippokampaler neuronaler Vorläuferzellen in serotonerge Neurone, gleichzeitig fördert es im Rahmen von Schlafentzug die neuronale Zellproliferation. Bekannte Effekte dieser Faktoren konnten somit bestätigt werden. Retrospektiv wäre es jedoch sinnvoller gewesen, klar synergistisch wirkende Faktoren zu verwenden, um deren Effekt besser spezifizieren zu können. Die in dieser Arbeit verwendeten in vitro Kulturbedingungen können die Situation in vivo naturgemäß nur begrenzt widerspiegeln, weshalb es in folgenden Arbeiten sinnvoll wäre, anhand von in vivo Modellen zu überprüfen, inwieweit die untersuchten Effekte auf Differenzierung und Proliferation Bestand haben.

Ziel meiner Arbeit war es, am Beispiel des Gyrus dentatus zu untersuchen, ob und in welchem Umfang eine durch konstitutiv aktives FoxO3 induzierte Schädigung neuronaler Strukturen im Verlauf der prä- und frühen postnatalen Entwicklung durch adulte Neurogenese partiell oder in toto regeneriert werden kann. Ich habe dazu ein Mausmodell genutzt, bei dem das verwendete Transgen mit einer konstitutiv aktiven FoxO3 Mutante mittels eines Tet-off Systems inhibiert werden kann. Die Ergebnisse meiner Arbeit lassen die Schlussfolgerung zu, dass die Überexpression von FoxO3 unter dem CamKIIα Promoter zu einer massiven Hemmung der Neurogenese führt und dass die Repression dieser Überexpression bei adulten Mäusen zu Veränderungen im Verhalten führt, die nicht unmittelbar mit einer erhöhten Neurogenese korrelieren. Besonders auffallend sind Effekte auf das Angstverhalten. Da das Angstverhalten mit Neurogenese in Zellpopulationen im Hippocampus bzw. Hypothalamus korreliert, weist der Effekt einer FoxO3 Überexpression, der zwischen der Embryonalentwicklung und der Adoleszenz Neurogenese und Zelltod in diesen Populationen massiv beeinflusst, auf eine Rolle von FoxO3 bei der Steuerung betreffender Hirnfunktionen hin.

Der Gyrus dentatus, welcher als Teil des Hippocampus eine wichtige Position bezüglich Lern- und Gedächtnisleistungen einnimmt, ist eine von nur zwei Regionen des Säugerhirns, in denen adulte Neurogenese stattfindet. In dieser Arbeit wurde der Krüppel-like Zinkfingertranskriptionsfaktor Bcl11b (B-cell lymphoma/leukemia 11b), welcher lebenslang in postmitotischen Körnerzellen des Gyrus dentatus exprimiert wird, in der adulten Neurogenese untersucht. Die adult induzierte Mutation wurde an Bcl11bflox/flox;CaMKIIα-tTA;tetO-Cre-Mäusen unter Zuhilfenahme des tetO-Cre-LoxP-Systems durchgeführt. Die Mutanten wurden zwei Monate nach der induzierten Mutation mittels Immunofluoreszenzfärbungen an Gehirnschnitten und Verhaltensexperimenten untersucht. Bcl11b-mutante Mäuse zeigten einen signifikant verkleinerten Gyrus dentatus mit einer signifikant verringerten Anzahl an Körnerzellen im Vergleich zu den Kontrollen. Diese morphologischen Unterschiede waren unter anderem Folge einer bei den Bcl11b-mutanten Mäusen im Vergleich zu den Kontrollen signifikant erhöhten Apoptoserate, was durch die mangelnde Integration neu entstandener und eventuell nicht ausdifferenzierter Neurone und die mangelhafte Aufrechterhaltung der reifen Körnerzellen bedingt sein könnte. Darüber hinaus konnte eine reduzierte Proliferationsrate, welche sich sowohl an Tag 4 als auch an Tag 28 nach der intraperitonealen Injektion von BrdU (2-Bromo-5-Desoxyuridin) bemerkbar machte, festgestellt werden. Da Bcl11b nur in postmitotischen Körnerzellen exprimiert wird, ist eine nicht-zellautonome Rückkopplung mittels extrazellulärer Signalmoleküle am wahrscheinlichsten. Des Weiteren ergab die Analyse der neuronalen Differenzierung im Gyrus dentatus, dass Bcl11b für die zelltypspezifische Differenzierung der Neurone hin zu reifen Körnerzellen erforderlich ist. Es ist bekannt, dass Bcl11b auch für die Differenzierung von anderen Zellen, beispielsweise T-Lymphozyten, essentiell ist. Diese Erkenntnisse weisen auf eine konservierte Funktion von Bcl11b bezüglich der Differenzierung hin. Bei den durchgeführten Verhaltensexperimenten konnten keine signifikanten Unterschiede zwischen Kontrollen und Mutanten ausgemacht werden. Auch deshalb wäre es sinnvoll, die hier beschriebenen Untersuchungen noch einmal, nach einer längeren Induktionszeit der Bcl11b-Mutation, durchzuführen, da dies zu einer deutlicheren Ausprägung des Phänotyps führen könnte. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass die Expression des Bcl11b-Gens nicht nur – wie in der Vergangenheit an einem konditionellen Mausmodell bereits beschrieben – in der postnatalen Entwicklung des Gyrus dentatus, sondern darüber hinaus auch für die adulte Neurogenese im Gyrus dentatus unerlässlich ist. Bcl11b spielt im adulten Gyrus dentatus vor allem in Bezug auf die Differenzierung adult geborener Körnerzellen und die Aufrechterhaltung der Funktionsfähigkeit reifer Körnerzellen eine essentielle Rolle. In Zukunft könnten diese Erkenntnisse zu neuen Ansätzen in der Therapie neurodegenerativer Krankheiten führen.

The main aim of the project was to study the formation of the main brain scaffold and the mechanisms underlying this process. The brain forms during embryogenesis from an initial thin layer of cells (neuroectoderm) that unfolds into a three dimensional complex structure. This process involves both an intense mitotic activity of progenitor cells (neuroblasts) and a series of morphogenetic movements that lead to a mature and functioning structure of the brain. Analyses were based on immunohistochemical techniques, use of proliferation markers (e.g. 5-bromo-2-deoxyuridine and 5-ethynyl-2’-deoxyuridine) and confocal laser-scan microscopy. Moreover, the use of a specific monoclonal antibody against the protein expressed by engrailed (a segment polarity gene) identified single neuronal cells that were compared with data available for Insecta. In this way, both information on the neurobiology of the Marbled crayfish and on its phylogeny were acquired. One important feature of the crayfish brain is the high plasticity that it shows not only during embryogenesis but throughout its life span. The brain in fact does not stop to develop and after embryogenesis the central olfactory pathway receives newly born olfactory local interneurons and projection neurons that replace old neurons or simply are added to the previous neuronal population. These neurons are provided by a specific post-embryonic structure, the neurogenic niche. By monitoring the activity of NBs, it was possible to discover when and how the niche starts forming and functioning. The topic of adult neurogenesis is a fascinating field of research which involves stem cells biology and regulatory mechanisms that are just now started to be explored. This challenging field of research holds many future perspectives, because some of the main characteristics of the adult neurogenesis in crustaceans are shared with vertebrates, in particular with mammals.

Here the phenotype and differentiation capacity of human adult hippocampal NPCs (hNPCs), derived from patients who underwent epilepsy surgery, is characterized. Isolated hNPCs were cultured in clonal density by transferring the cells to serum-free media supplemented with FGF-2 and EGF in 3 % atmospheric oxygen. The hNPCs showed neurosphere formation, expressed high levels of early neuroectodermal markers like NeuroD1 and Olig2, the NSC markers Nestin and Musashi1 and the proliferation marker Ki67. hNPCs spontaneously differentiated into a neuronal, astroglial and oligodendroglial phenotype. Differentiated hNPCs showed functional properties of neurons, such as sodium channels, action potentials and production of the neurotransmitters glutamate and GABA. Additionally a global gene expression profiling was performed using RNA from adult human hippocampus-derived neuroprogenitor cells (NPCs) and multipotent frontal cortical fetal NPCs in comparison to adult human mesenchymal stem cells (hMSCs) as a multipotent adult stem cell control, and adult human hippocampal tissue, to define a gene expression pattern which is specific for human NPCs. The results were compared with data from various databases. Hierarchical cluster analysis of all neuroectodermal cell/tissue types revealed a strong relationship of adult hippocampal NPCs with various white matter tissues, while fetal NPCs strongly correlate with fetal brain tissue. However, adult and fetal NPCs share the expression of a variety of genes known to be related to signal transduction, cell metabolism and neuroectodermal tissue. In contrast, adult NPCs and hMSCs overlap in the expression of genes mainly involved in extracellular matrix biology. This provides a framework for standardized comparative gene expression analysis of human brain-derived NPCs with other stem cell populations or differentiated tissues.

This document contains a dissertation written to obtain the degree "Dr. rer. med." of the Medical Faculty of the University of Ulm. The scope of my thesis has been to identify possible alternative cell sources for neural stem cells which fulfill important requirements for the use of these cells in regenerative treatment strategies: (i) Generation of high yields of cells out of a small starting population without loosing their differentiation potential, (ii) on-demand availability of cells without major logistical and ethical problems and (iii) the possibility to standardize the cell source in a future clinical setting. Isolation and characterization of human NPCs from adult human hippocampus derived from epileptic surgery procedures (selective hippocampectomy or medio-temporal lobectomy) served as positive control. A second approach has been the identification and in vitro characterization of neural stem cells in the adult midbrain as a cell source for possible endogenous regeneration in the brain region where the neurodegenerative process in Parkinson’s disease is located. Since the reported data on in vivo dopaminergic neurogenesis in the adult brain are conflicting, the aim of the second part of this study was to investigate dopaminergic neurogenesis from adult neural stem cells in vitro to provide data on adult dopaminergic differentiation of neural stem cells as one major prerequisite for endogenous regenerative approaches in Parkinson’s disease by recruiting endogenous stem cells in the adult brain.