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Herzkreislauferkrankungen sind sowohl in Deutschland als auch weltweit die führende Todesursache. Große epidemiologische Studien ermöglichten das Erkennen von kardiovaskulären Risikofaktoren, das Modellieren von Scores zur Risikostratifizierung und das Erarbeiten von Präventions- und Therapiestrategien. Trotz steter Anpassungen und Validierungen basieren Risikoscores auf konservativen Ergebnissen, deren limitierte Sensitivität, mit Akzentuierung für Frauen, Personen relativ jungem und fortgeschrittenem Alters, die Mehrheit unerwarteter kardiovaskulärer Erstereignisse bei bis dato asymptomatischen Individuen mitverantwortet. Modalitäten zur Erhebung eines Gefäßstatus zeigten ergänzende, respektive alternative Möglichkeiten zur Identifizierung von vermeintlichen Hochrisikopatienten mit signifikanter Verbesserung in der Risikoprädiktion. Die hier vorgelegte Arbeit war prospektiv geplant als Subanalyse „Plaque- Screening“ der populationsbasierten STAAB Kohortenstudie Würzburg. Im Zentrum der Arbeit stand das Ultraschall-basierte Plaque-Screening peripherer Arterien. Die Arbeit adressierte die Fragestellungen „Prävalenz subklinischer Atherosklerose in der Allgemeinbevölkerung in Würzburg“, „Zusatznutzen einer Femoraluntersuchung“, „Einfluss traditioneller Risikofaktoren auf die Plaqueprävalenz“ und „Übereinstimmung der Risikoklassifizierung des ESC SCORES mit dem Plaquestatus“. Die STAAB Kohortenstudie analysiert die Prävalenz und Inzidenz von Vorstufen der Herzinsuffizienz (Stadien A und B gemäß der AHA/ACC Klassifikation) in der Allgemeinbevölkerung von Würzburg. Studienbeginn war Dezember 2013. Der geplante Probandenumfang war n=5000. Die Auswahl der Studienteilnehmer erfolgte geschlechts- und altersstratifiziert über das Einwohnermeldeamt nach Zufallsprinzip. Einschlusskriterien waren Alter zwischen 30–79 Jahren und Hauptwohnsitz im Landkreis Würzburg, einziges Ausschlusskriterien war eine diagnostizierte Herzinsuffizienz Stadium C oder D. Die Subanalyse „Plaque Screening” umfasste eine Stichprobe aus der STAAB Kohorte ab Oktober 2015, n=250, nach Anwendung des zusätzlichen Einschlusskriterium Alter 40–69 Jahre und Ausschluss von Probanden mit inkonklusiven Daten oder zurückgezogenem Einverständnis. Die Resultate unserer Fragestellungen waren mit Ergebnissen in der Literatur kongruent. So detektierten wir eine relevante Plaqueprävalenz (50%) in der Allgemeinbevölkerung von Würzburg, insbesondere auch unter Personen mit niedrigem Risiko (34%). Wir wiesen einen quantifizierbaren Zusatznutzen für die Femoraluntersuchung, nebst etablierter Karotisuntersuchung, durch eine relevante Zunahme der Plaqueprävalenz (+15% absolut) und Reklassifizierungsrate (+11% absolut) nach. Wir dokumentierten eine erwartet positive Assoziation zwischen traditionellen Risikofaktoren und Plaqueprävalenz mit geschlechtsspezifischer Akzentuierung. Wir belegten eine Diskrepanz zwischen der Risikoklassifizierung des ESC SCORE und den Ergebnissen des Plaque-Screenings. In Konklusion interpretieren wir, dass das Inkorporieren eines ultraschallbasierten Gefäß-Screenings in bestehende Präventionsstrategien zur Steigerung der Sensitivität aktueller Risikomodelle beitragen könnte. Daraus wäre eine Verbesserung der Risikoprädiktion, eine frühere und gezieltere Prävention, sowie eine Reduktion von Morbidität, Mortalität und Gesundheitskosten ableiten lässt, muss in weiteren prospektiven Studien untersucht werden. Unsere Daten legen jedoch nahe, dass insbesondere für das weibliche Geschlecht und Personen in niedrigem und sehr fortgeschrittenem Alter von diesem Ansatz profitieren könnten., Cardiovascular diseases are the leading cause of death both in Germany and worldwide. Large epidemiological studies enabled the identification of cardiovascular risk factors, the modeling of scores for risk stratification and the development of prevention and therapy strategies. Despite constant adjustments and validations, risk scores are based on conservative results whose limited sensitivity, with an emphasis on women, people of relatively young and advanced age, is partly responsible for the majority of unexpected first cardiovascular events in previously asymptomatic individuals. Modalities for surveying a vascular status showed additional or alternative options for identifying putative high-risk patients with a significant improvement in risk prediction. This work was prospectively planned as a “plaque screening” sub-analysis of the population-based STAAB cohort study in Würzburg. The focus of the work was the ultrasound-based plaque screening of peripheral arteries. The work addressed the questions "prevalence of subclinical atherosclerosis in the general population in Würzburg", "additional benefit of a femoral examination", "influence of traditional risk factors on plaque prevalence" and "correlation of the risk classification of the ESC SCORES with the plaque status". The STAAB cohort study analyzes the prevalence and incidence of preliminary stages of heart failure (stages A and B according to the AHA/ACC classification) in the general population of Würzburg. The study started in December 2013. The planned sample size was n=5000. The study participants were randomly selected by gender and age stratified by the residents' registration office. Inclusion criteria were age between 30 and 79 years and main residence in the district of Würzburg; the only exclusion criteria were diagnosed stage C or D heart failure. The “Plaque Screening” sub-analysis included a sample from the STAAB cohort from October 2015, n=250, after application of the additional inclusion criterion age 40–69 years and exclusion of subjects with inconclusive data or withdrawn consent. The results of our questions were congruent with results in the literature. We detected a relevant plaque prevalence (50%) in the general population of Würzburg, especially among people with a low risk (34%). We demonstrated a quantifiable additional benefit for the femoral examination, in addition to established carotid examination, through a relevant increase in plaque prevalence (+15% absolute) and reclassification rate (+11% absolute). We documented an expected positive association between traditional risk factors and plaque prevalence with gender accentuation. We demonstrated a discrepancy between the risk classification of the ESC SCORE and the results of plaque screening. In conclusion, we interpret that incorporating ultrasound-based vascular screening into existing prevention strategies could contribute to increasing the sensitivity of current risk models with an improvement in risk prediction, earlier and more targeted prevention, and a reduction in morbidity, mortality, and health costs. Our data suggest that females, young and very old people in particular could benefit from this approach.

Hintergrundinformation und Ziel: Herz-Kreislauf-Erkrankungen, insbesondere die Koronare Herzkrankheit und die damit einhergehenden atherosklerotischen Gefäßveränderungen, stellen ein weltweit steigendes Gesundheitsrisiko dar. Aufgrund des langsamen, progressiven Verlaufs und des späten Auftretens von Symptomen bleibt sie in vielen Fällen lange undiagnostiziert oder wird erst bei akuten Beeinträchtigungen in der Blutversorgung offensichtlich. Durch den Karotis-Ultraschall, der in der Atheroskleroseabklärung als Goldstandard gilt, können Plaqueablagerungen nicht nur frühzeitig erkannt, sondern darüber hinaus in Bezug auf ihre Morphologie und Zusammensetzung beschrieben werden. Dies ist ein wichtiger Aspekt, um die Stabilität des Plaques und in weiterer Folge das kardiovaskuläre Risiko der Patient*innen abschätzen und gesundheitsgefährdende Komplikationen rechtzeitig verhindern zu können. Allerdings gibt es noch keine Datenlage über das Plaqueverhalten in den Leistenschlagadern. Ziel dieser Pilotstudie war, die Häufigkeit des Plaquevorkommens zu eruieren und die Charakteristika der Plaqueablagerungen in diesen zwei Arterien zu evaluieren. Methoden: Im Rahmen dieser Studie wurden die Arteria carotis und die Arteria femoralis communis von 81 Patient*innen mittels Ultraschalluntersuchung auf Plaqueablagerungen untersucht. Die Beurteilung der Plaques und deren Morphologie erfolgte im Längsschnitt. Zur Beurteilung der hämodynamischen (Un)Wirksamkeit der Plaques wurden die Flüsse mittels PW-Doppler gemessen. Darüber hinaus wurde der Blutfluss in der Arteria femoralis communis hinsichtlich seines Profils nach mono-, bi- oder triphasischem Fluss beurteilt. Die Beschreibung der Plaquemorphologien erfolgte durch Kategorisierung in „verkalkter Plaque“, „gemischter Plaque“ oder „weicher Plaque“. Durch diese Studie sollte geprüft werden, ob ein Zusammenhang zwischen Plaquevorkommen, Plaquemorphologie und Gefäßlokalisation besteht. Die gewonnenen Daten wurden zuerst mit statistischen Maßzahlen beschrieben, mit Kontingenztabellen dargestellt und anschließend deskriptivstatistisch mithilfe von Korrelations-, Kohärenz-, und Unterschiedsanalysen ausgewertet. Die Analyse erfolgte mittels Kontingenzkoeffizient Pearson’s C (Cp), Cohen’s Kappa und McNemar-Test, die visuelle Darstellung mittels Balkendiagrammen. Ergebnisse: In den meisten Fällen wurden Plaques in beiden Gefäßen dokumentiert. Im Gegensatz dazu trat das Ereignis „gar keine Plaques“ am seltensten auf. Die am häufigsten vorkommende Morphologie in beiden Gefäßen war der verkalkte Plaque, gefolgt von gemischten Ablagerungen in der Arteria carotis, während in der Arteria femoralis communis Verkalkungen auftraten. Wenngleich in der Arteria carotis keine Ablagerungen dokumentiert wurden, traten dennoch verkalkte und gemischte Plaques in der Arteria femoralis communis auf. Der im Zuge der Korrelationsanalyse ermittelte Kontingenzkoeffizienten von 0,226 widerlegt einen Zusammenhang bei Plaquediagnosen. Der Unterschied bei den Plaquetypen ist mit einem p-Wert nach McNemar von 0,015 signifikant. Eine Konkordanz liegt in beiden Fällen nicht vor. Schlussfolgerung: Es liegt weder ein signifikanter Zusammenhang noch ein Unterschied in der Plaquehäufigkeit vor. Allerdings konnte ein signifikanter Unterschied bei den Plaquemorphologien nachgewiesen werden. Keines der Gefäße allein kann für eine umfassende Plaque-Diagnose herangezogen werden. Background and aim: Cardiovascular diseases, in particular coronary heart disease and the related atherosclerotic vascular alterations, are a worldwide increasing health issue. Due to its slow, progressive course and the late onset of symptoms, it often remains undiagnosed for a long time or only comes to light when there is acute impairment in the blood supply. Carotid ultrasound, which is considered the gold standard in atherosclerosis assessment, can not only detect plaque deposits at an early stage, but also describe them in terms of their morphology and composition. This is an important aspect to assess the stability of the plaque and subsequently the cardiovascular risk of the patient and to prevent health-threatening complications in time. However, there are still no data available on the plaque behavior in the inguinal arteries. The aim of this pilot study is to determine the frequency of plaque occurrence and to evaluate the characteristics of plaque deposition in these two arteries. Methods: In this study, the carotid artery and the femoral artery of 81 patients were examined for plaque deposition by ultrasound. The assessment of the plaques and their morphology was performed in longitudinal section. To assess the hemodynamic effectiveness of the plaques, flow was measured by PW-Doppler. In addition, blood flow in the common femoral artery was assessed in terms of its profile according to mono-, bi-, or triphasic flow. Plaque morphologies were described by categorization into "calcified plaque", "mixed plaque", or "soft plaque". Within this study, we aimed to test whether there is a relationship between plaque occurrence, morphology, and vessel localization. The data obtained were first described with statistical measures, presented with contingency tables, and then analyzed with descriptive statistics using correlation analysis, coherence analysis, and difference analysis. The analysis was performed using Pearson's C contingency coefficient (Cp), Cohen's Kappa and McNemar test. Bar charts were used for visual representation. Results: In most cases, plaques were documented in the carotid artery as well as in the femoral artery. In contrast, the event "no plaques at all" occurred least frequently. The most common morphology in both vessels was calcified plaque, followed by mixed deposits in the carotid artery while calcifications occur in the femoral artery. Although no deposits were documented in the carotid artery, calcified and mixed plaques nevertheless occurred in the common femoral artery. The contingency coefficient of 0.226 determined in the course of the correlation analysis denies a correlation for plaque diagnoses. The difference in plaque types is significant with a McNemar p-value of 0.015. Concordance is not present for either aspect. Conclusion: Neither a significant correlation nor a difference in plaque frequency is present. However, a significant difference in plaque morphologies was demonstrated. None of the vessels can be used by itself for a comprehensive plaque diagnosis.

Atherosclerotic changes in our western society are a very common pathogenesis which can cause cardiovascular diseases like myocardial infarction or [chronic] heart failure. It seems that the PACAP-System [„Pituitary Adenylate Cyclase-Activating Polypeptide“] with its receptor PAC1 plays a very important role in the development of such pathologic processes. PACAP belongs to the “vasoactive intestinal Peptide [VIP]- sekretin- somatoliberin Glucagon superfamily and is the only ligand that is able to bind at the PAC1-receptor. The PAC1-receptor is expressed mainly in the myocardium and might be able to influence the occurrence of inflammatory and anti-inflammatory cytokines that could act cardioprotective. Furthermore, the PACAP-system seems like to play an important role in influencing the outcome and development of the ischemic heart disease. In this Study we examined the outcome of the deficiency of PACAP and PAC1 in the myocardium of mice based on inflammatory, atherosclerotic and apoptosis relevant cytokines and proteins. We also examined the rate of infiltration of macrophages in the myocardium. The mice we examined had the following genotypes: 1. PACAP+/+ / PAC1+/+ / ApoE+/+ [short: WT]; 2. PACAP+/+ / PAC1+/+ / ApoE-/- [short: ApoE-/-]; 3. PACAP-/- / PAC1+/+ / ApoE-/-; 4. PACAP+/+ / PAC1-/- / ApoE-/-. All mice have been fed with a “Western Type Diet” over the period of 20 weeks, starting with the age of 10 weeks. Blood samples were taken to measure the levels of plasma-cholesterol and plasma-triglycerides. The ratio of the heart weight and length of the tibia were calculated. We examined samples of the myocardium covering COX2+-, MuRF-1+-, Moma-2+-, LOX-1+-, IL1-ß+-, TNF-α+- and Lectin+-cells. Furthermore, the composition of every myocardium in regard of the amino acids were also studied. The plasma triglyceride levels of ApoE-/- -mice in comparison to WT-mice and of PAC1-/- / ApoE-/--mice in comparison to ApoE-/--mice didn’t differ significantly. However, PACAP-/- / ApoE-/--mice by comparison to ApoE-/--mice showed an 60,6% increase of this level. Plasma cholesterol only showed an increase [tenfold] with ApoE-/--mice in comparison to WT-mice, whereas the levels in PACAP-/- / ApoE-/--, and PAC1-/- / ApoE-/--mice in comparison to ApoE-/--mice were similar. The relative heart weight was in the PAC1-/- / ApoE-/--population 18,1% lower in comparison to the ApoE-/--population. ApoE-/--, in comparison to WT-mice and PACAP-/- / ApoE-/-- mice in comparison to ApoE-/--mice didn’t show a significant change in the relative heart weights. The COX2+-cells showed a higher occurrence of 22% in the ApoE-/--, versus WT-mice and of 55,7% in the PAC1-/- / ApoE-/--mice versus the ApoE-/--mice. MuRF-1+-cells had in ApoE-/--mice compared to the WT-mice a 116,7% higher density, furthermore PAC1-/- / ApoE-/--, and PAC1-/- / ApoE-/-- mice showed an 51,2% and 66,7% increase in comparison with ApoE-/--mice. In addition, the density of macrophages was measured with the Moma-2-antibody which showed a 25,9% decline in the PACAP-/- / ApoE-/--mice, and a 44,2% decrease in the PAC1-/- / ApoE-/--mice compared to the ApoE-/--mice. The capillary supply of the myocardium [density of Lectin+-cells] showed only at the PAC1-/- / ApoE-/--mice in comparison with the WT-mice a 24,5% lower density. Furthermore, LOX-1+-cells were counted [marker for the ongoing atherosclerotic occurrence] and showed only in PAC1-/- / ApoE-/--mice a 44,47% higher activity compared to ApoE-/--mice. Also, the concentration of the amino acids the myocardium contains showed in PACAP-/- / ApoE-/--, and PAC1-/- / ApoE-/--mice a 23,6% and 20,9% lower concentration in comparison to ApoE-/--mice. Furthermore, the aminoacids Phosphatidyl-serine which is part of the apoptose-signalpathway and the gamma-amino-butter-acid which has anti-inflammatory characteristics, showed a 22% and 36,7% lower concentration in PACAP-/- / ApoE-/-- mice and a 21,8% and 18,2% lower concentration in PAC1-/- / ApoE-/--mice, all compared to ApoE-/--mice. The findings of our study show by the higher density of COX2+-positive- cells an inflammatory environment in the myocardium under the deficiency of PACAP and PAC1. Only PAC1-/- / ApoE-/--mice showed in combination with an ongoing atherosclerotic process [higher density with LOX1+-cells] a higher density of MuRF-1+-cells which indicates atrophy of the myocardium. In addition, we found a positive correlation between the density of MuRF-1+-cells and COX2+-cells, which underlines a connection between the atrophy and inflammation. Interestingly, PACAP-/- / ApoE-/--mice didn’t show a significant change in heart weight, higher density in COX2+-cells and LOX1+-cells but a higher density in MuRF-1+-cells. Furthermore, the deficiency of PACAP and PAC1 didn’t change the expression of cytokines like TNF-α, IL1-ß and the infiltration of macrophages was also unchanged. The capillary supply measured with the density of Lectin+-cells also didn’t show any significant difference. The lower concentration of the amino acids seemed only to influence the heart weight of the PAC1-/- / ApoE-/--mice, while amino acids, like Phosphatidyl-serine and GABA, only influenced the environment in PAC1-/- / ApoE-/--mice as well. In comparison to another study of our researchgroup (Dissertation Gohlke 2017), mice with the same genotype were fed “Normal diet” over the time of 30 weeks before being examined. The findings showing lighter heart weights and lower triglyceride, and cholesterol levels in the plasma [effect of cholesterol-enriched-diet]. Furthermore, comparing it to the raw data of our study the density of COX1+-cells, MuRF-1+-, LOX-1+-, Moma-2+-, and Lectin+-cells was higher. The data of the amino acids also showed a lower concentration. In summary, we conclude that PAC1 is able to influence the environment in the myocardium, has anti-inflammatory and anti-atherogenic features and influences local atrophic processes. Comparing all the collected data, with all the collected references gives PAC1 the ability to effect inflammatory processes [COX2], the expression of pro-atherogenic mediators [LOX-1] positively and subdues cardiac atrophy [MuRF-1] under a “Western Type Diet”. PACAP doesn’t seem to have these abilities under the feeding with a “Western Type Diet”, so other mechanisms must play an additional role, like the VIP-System or the persisting hypertriglyceridemia over a longer period of time. For future studies, the period of feeding [longer vs. shorter period] and the impact of the deficiency of the VIP-system would represent a good possibility in regard of a possible effect on the inflammatory and pro-atherogenic environment in the myocardium., Atherosklerotische Veränderungen sind in unserer westlichen Welt eine sehr weit verbreitete Pathologie, welche mit der Pathogenese diverser Herz-Kreislauferkrankungen, wie zum Beispiel dem akuten Myokardinfarkt oder einer [chronischen] Herzinsuffizienz in Verbindung gebracht wird. Dabei scheint PACAP [PACAP engl.: „Pituitary Adenylate Cyclase-Activating Polypeptide“] beziehungsweise dessen spezifischer Rezeptor PAC1, einen entscheidenden Faktor für die Beeinflussung bzw. Entstehung solcher Pathologika darzustellen. PACAP, welches zur Vasoaktiven Intestinalen Peptid (VIP)- Sekretin- Somatoliberin- Glukagon- Superfamilie gehört, zählt als einziger Ligand, der an den PAC1-Rezeptor binden kann. Der PAC1-Rezeptor wird unter anderem im Myokard exprimiert und könnte dort vermutlich über die Eigenschaft die Konzentration inflammatorischer, sowie antiinflammatorischer Zytokine zu beeinflussen, kardioprotektiv wirken. Weiterhin scheint das PACAP-System bei der Entstehung und dem Verlauf einer ischämischen Herzerkrankung eine beeinflussende Rolle zu spielen. In unserer Arbeit wurde der Einfluss einer PACAP bzv. PAC1-Defizienz im Myokard bei Mäusen untersucht, anhand der Expression von inflammations-, atherosklerose-, und apoptoserelevanten Proteinen und Zytokinen sowie der Infiltration von Leukozyten. Die dafür untersuchten Mäuse hatten folgende Genotypen: 1. PACAP+/+ / PAC1+/+ / ApoE+/+ [kurz: WT]; 2. PACAP+/+ / PAC1+/+ / ApoE-/- [kurz: ApoE-/-]; 3. PACAP-/- / PAC1+/+ / ApoE-/-; 4. PACAP+/+ / PAC1-/- / ApoE-/-. Dabei hatten alle Tiere ein Alter von 30 Wochen und wurden ab der 10. Woche mit einer „Western Type Diet“ gefüttert. Die Plasma-Triglycerid- und -Cholesterin-Spiegel wurden untersucht; weiterhin wurde der Quotient aus Herzgewicht und Tibialänge ermittelt. Mittels Immunhistomorphometrie wurden die Myokardschnitte auf COX2+-, MuRF-1+-, Moma-2+-, LOX-1+-, IL1-ß+-, TNF-α+- und Lectin+-Zellen untersucht. Außerdem gaben Aminosäureanalysen Aufschluss über die Zusammensetzung der Herzen. Die Plasma-Triglyceridspiegel waren bei ApoE-/-- im Vergleich zu WT-Mäusen und bei PAC1-/- / ApoE-/-- im Vergleich zu ApoE-/--Mäusen nicht signifikant verändert. PACAP-/- / ApoE-/--Mäuse zeigten im Vergleich zu ApoE-/--Mäuse 60,6% höhere Triglyceridspiegel. Zusätzlich waren die Plasma-Cholesterinspiegel nur bei ApoE-/--im Vergleich zu WT-Mäusen um den Faktor 10 erhöht. Wir fanden bei PACAP-/- / ApoE-/- - und bei PAC1-/- / ApoE-/--Mäusen im Vergleich zu ApoE-/- -Mäusen ähnliche Cholesterinspiegel. Die relativen Herzgewichte waren nur bei PAC1-/- / ApoE-/--Mäusen um 18,1% kleiner im Vergleich zu ApoE-/--Mäusen. PACAP-/- / ApoE-/--, im Vergleich zu ApoE-/--Mäusen sowie ApoE-/--, im Vergleich zu WT-Mäusen zeigten keine signifikante Veränderung der relativen Herzgewichte. Unsere Befunde weisen außerdem bei ApoE-/-- Mäusen im Vergleich zu WT-Mäusen, bzw. bei PAC1-/- / ApoE-/--, im Vergleich zu ApoE-/--Mäusen 22% bzw. 55,7% mehr COX2+-Zellen auf. Die Dichte der MuRF-1+-Zellen [Atrophiemarker] waren bei ApoE-/--, im Vergleich zu WT-Mäusen um 116,7% erhöht und bei PACAP-/- / ApoE-/--, sowie PAC1-/- / ApoE-/--, im Vergleich zu ApoE-/--Mäusen um 51,2% bzw. 66,7% mehr vertreten. Die Makrophagendichte [Dichte Moma-2+-Zellen] war bei PACAP-/- / ApoE-/-- sowie bei PAC1-/- / ApoE-/--Mäusen im Vergleich zu ApoE-/--Mäusen um 25,9% bzw. 44,2% verringert. Ferner war die Kapillarisierung [Dichte Lectin+-Zellen] nur bei ApoE-/-- vs. WT-Mäusen um 24,5% verringert. LOX-1+-Zellen [Atherogener Marker] wiesen weiterhin nur bei PAC1-/- / ApoE-/--Mäuse eine um 44,47% höhere Dichte gegenüber ApoE-/--Mäusen auf. Eine Analyse der Aminosäuren zeigte bei PACAP-/- / ApoE-/--, sowie bei PAC1-/- / ApoE-/-- Mäusen eine um 23,6% sowie 20,9 % geringere Aminosäurenkonzentration im Ventrikelmyokard als bei ApoE-/--Mäusen. Dabei waren sowohl das Apoptosesignal-Molekül Phosphatidyl-Serin, als auch die antiinflammatorische wirksame Gamma-Amino-Buttersäure [GABA] bei PACAP-/- / ApoE-/--, vs. ApoE-/--Mäusen um 22% bzw. 36,7% verringert; weiterhin bei PAC1-/- / ApoE-/--, vs. ApoE-/--Mäusen um 21,8% bzw. 18,2% vermindert. Unsere Befunde weisen durch die erhöhte Dichte COX2+-Zellen bei PAC1 bzw. PACAP-Defizienz [PACAP-/- / ApoE-/-- und PAC1-/- / ApoE-/--Mäuse] im Vergleich zu ApoE-/--Mäusen auf ein proinflammatorisches Milieu im Myokard hin. Dieses führt nur bei PAC1-/- / ApoE-/--Mäusen in Verbindung mit einem pro-atherogenen Milieu [LOX1+-Zellen] zu einer Herzatrophie, was durch eine erhöhte Dichte MuRF-1+ Kardiomyozyten verdeutlicht wird. Zusätzlich zeigt sich eine positive Korrelation zwischen der Dichte MuRF-1+-, sowie COX2+-Zellen, was einen Zusammenhang zwischen Atrophie und inflammatorischen Milieu im Myokard verdeutlicht. Interessanterweise wiesen PACAP-/- / ApoE-/--Mäuse ein unverändertes Herzgewicht, keine vermehrte Dichte COX2+-, sowie LOX-1+Zellen, jedoch eine vermehrte Dichte von MuRF-1+-Kardiomyozyten auf. Die Expression der Zytokine IL1-ß, TNF-α, die Dichte Moma-1+-Zellen [Makrophagen] sowie die Kapillarisierung des Myokards [Dichte Lectin+-Zellen] wurde durch die Defizienz von PACAP bzw. PAC1 nicht signifikant beeinflusst. Die geringere Konzentration der Aminosäuren im Ventrikelmyokard schien sich nur auf die PAC1-/- / ApoE-/--Mäuse auszuwirken [s. rel. Herzgewicht]. Weiterhin schien die geringere Konzentration der Aminosäuren GABA sowie Phosphatidyl-Serin, nur bei PAC1-Defizienten Mäusen eine Auswirkung zu haben [s. COX2, LOX-1, rel. Herzgewicht]. Im Vergleich zur Studie von Gohlke (Dissertation Gohlke 2017), bei der die Fütterung der Mäuse über 30 Wochen mittels „Normalfutter“ erfolgte, ließen sich die Auswirkungen einer cholesterin reichen „Western Type Diet“ [Cholesterinfuttereffekt] gut darstellen: Unter Normalfutter waren im Vergleich zu unserer Studie folgende Parameter verringert: Plasmaspiegel der Triglyceride sowie des Cholesterins und rel. Herzgewicht. Weiterhin war die Dichte der Zellen mit folgenden Markern erhöht: COX2, MuRF-1, LOX-1, Moma-2 sowie Lectin. Zusätzlich war die Konzentration der Aminosäuren geringer. In der Zusammenschau unserer Befunde im Vergleich mit in der Literatur existierenden Daten zeigt sich, dass PAC1 unter „Western Type Diet“ im Ventrikelmyokard folgende Faktoren beeinflusst: So wirkt PAC1 anti-inflammatorisch [COX2], senkt die Expression pro-atherogener Mediatoren [LOX-1] und vermindert eine myokardiale Atrophie [MuRF-1]. Im Hinblick auf PACAP scheinen diese Eigenschaften nicht zuzutreffen; hier müssen andere Mechanismen zusätzlich eine Rolle spielen. Eine Möglichkeit wäre dabei das VIP-System oder aber die Auswirkungen einer Hypertriglyceridämie unter Fütterung einer „Western Type Diet“ über einen längeren Zeitraum. Eine Berücksichtigung des Fütterungszeitraumes [längerer vs. kürzerer Fütterungszeitraum] sowie die Auswirkungen einer Defizienz des VIP-Systems würde sich gleichzeitig als gute Möglichkeit für zukünftige Untersuchungen im Hinblick auf den Einfluss auf ein inflammatorisches, sowie atherogenes Milieu im Myokard anbieten.

Koronare Vasomotionsstörungen stellen eine relevante Ursache für Angina pectoris bei Patienten ohne hämodynamisch relevante atherosklerotische Plaques dar. Die Genese der Vasomotionsstörungen ist multifaktoriell und nicht final geklärt. Mittels Acetylcholin-Testung lassen sich epikardiale von mikrovaskulären Spasmen differenzieren. Ziel der Arbeit war die Analyse koronarer Morphologiekriterien und deren Einfluss auf mögliche Testergebnisse. Die Kriterien einer geringgradigen Atherosklerose, Muskelbrücken, Aneurysmata und Gefäßschlängelungen wurden untersucht. Die Koronarangiographien von 610 Patienten, die im Robert-Bosch-Krankenhaus Stuttgart einen Acetylcholin-Test erhalten haben wurden auf jene Morphologiekriterien untersucht. Diese Patienten wiesen eine Angina pectoris auf, in Abwesenheit höhergradiger Stenosen. Im Anschluss wurden die Morphologiekriterien mit dem Acetylcholin-Testergebnis verglichen. Es lässt sich eine signifikante Häufung geringgradiger Atherosklerose bei Patienten mit epikardialem Koronarspasmus im Acetylcholin-Test erkennen. Zudem scheint es beim Vorhandensein von koronaren Gefäßschlängelungen weniger epikardiale Spasmusformen im Acetylcholintest zu geben.

Extracellular vesicle (EV)-mediated intercellular communication through exosomes, microvesicles (MVs) and apoptotic bodies has been shown to be implicated in various physiological as well as pathological processes such as the development and progression of atherosclerosis. While the cellular machinery controlling EV formation and composition has been studied extensively, little is known about the underlying morphological processes. This study focuses on a detailed ultrastructural analysis of the different steps of EV formation and release in Myocardial Endothelial (MyEnd) and Aortic Endothelial (AoEnd) cells cultured under serum starvation and inflammatory stimulation with TNF-α. Detailed morphological analyses were conducted applying and comparing different high- resolution light and electron microscopic methods. In this study, we could depict all steps of MV biogenesis named in literature. However, during the study of exosome biogenesis, we discovered a yet undescribed process: Instead of a direct fusion with the plasma membrane, multivesicular bodies were incorporated into a new distinct cellular compartment bound by fenestrated endothelium first. This may present a novel step in exosome biogenesis and warrants further study. Regarding the conditions of cell cultivation, we observed that the commonly used serum starvation causes MyEnd cells, but not AoEnd cells, to enter apoptosis after 48 hours. When preparing functional EV studies, we therefore recommend assessing the morphological condition of the serum-starved cells at different cultivation points first. When evaluating MV production, a statistical analysis showed that the more time AoEnd cells spent in cultivation under serum starvation, the higher the percentage of MV producing cells. However, additional TNF-α stimulation induced a significantly higher MV production than serum starvation alone. Lastly, our results show that TNF-α stimulation of AoEnd cells in vitro leads to the upregulation of CD44, an adhesion molecule critical in the early stages of atherosclerosis. CD44 was then depicted on the surface of generated MVs and exosomes. We conclude that under inflammatory conditions, EVs can mediate the transfer of CD44 from endothelial cells to target cells. This could be a novel mechanism by which MVs contribute to the development and progression of atherosclerotic disease and should be clarified by further studies., Extrazelluläre Vesikel (EV), darunter Exosomen, Mikrovesikel (MV) und apoptotische Körperchen, werden von fast allen Zellen des Körpers freigesetzt, transportieren zellspezifische Informationen und sind von großer Bedeutung in der Zell-Zell-Kommunikation. Sie spielen eine zentrale Rolle in verschiedensten physiologischen sowie pathologischen Vorgängen, wie etwa der Atherosklerose. Während die zellulären Mechanismen hinter der Entstehung und Komposition der EV bereits intensiv erforscht wurden, ist noch wenig über die zugrundeliegenden morphologischen Prozesse bekannt. Diese Arbeit präsentiert eine detaillierte ultrastrukturelle Analyse der Bildung und Freisetzung von EV in myokardialen (MyEnd) und aortalen Endothelzellen (AoEnd), die unter Serumentzug sowie inflammatorischer Stimulation mit TNF-α kultiviert wurden. Dazu wendeten wir verschiedene hochauflösende licht- und elektronenmikroskopische Techniken an. Wir konnten alle in der Literatur beschriebenen Schritte der MV-Biogenese darstellen. Bei der Untersuchung der exosomalen Biogenese entdeckten wir jedoch einen bisher unbekannten Prozess: Anstelle einer direkten Fusion der multivesikulären Körperchen mit der Plasmamembran, wurden diese zunächst in ein neues, von fenestriertem Endothel begrenztes, zelluläres Kompartiment integriert. Ferner stellten wir fest, dass der häufig durchgeführte Serumentzug während der Kultivierung bei MyEnd- – allerdings nicht AoEnd- – Zellen nach 48 Stunden zur Apoptose führte. Daher empfehlen wir, bei funktionellen Studien von EV zunächst eine morphologische Untersuchung der unter Serumentzug kultivierten Zellen zu verschiedenen Zeitpunkten durchzuführen. Eine statistische Analyse der MV-Produktion zeigte, dass die Zellen umso mehr MV produzierten, je länger sie sich unter Serumentzug befanden. Jedoch induzierte eine zusätzliche Stimulation mit TNF-α eine signifikant höhere MV-Produktion als der alleinige Serumentzug. Wir konnten zeigen, dass eine TNF-α Stimulation von AoEnd Zellen in vitro zu einer vermehrten Expression von CD44 führte – einem vor allem in der Frühphase der Atherosklerose bedeutendem Adhäsionsmolekül. CD44 konnte ebenso auf der Oberfläche von produzierten MV und Exosomen nachgewiesen werden. Wir schließen daraus, dass MV unter inflammatorischen Bedingungen den Transfer von CD44 von Endothelzellen zu Zielzellen vermitteln und so zur Entstehung und Progression von Atherosklerose beitragen können.

Hintergrundinformation und Problemstellung: Atherosklerotische Veränderungen in Blutgefäßen sind ein weltweites Gesundheitsproblem vieler Patient*innen, welches aufgrund des späten Auftretens von Symptomen meist lange undiagnostiziert bleibt. Häufig kann die Diagnose erst gestellt werden, wenn bereits eine Einengung des Gefäßlumens und Beeinträchtigung der Blutversorgung der nachfolgenden Gewebe erfolgt ist. Durch die Knöchel-Arm-Index Messung, welche der aktuelle Goldstandard auf dem Gebiet der Erstdiagnostik einer peripheren arteriellen Verschlusskrankheit ist, kann der Verdacht einer Erkrankung diagnostiziert werden. Um diese Diagnose zu bestätigen sind jedoch weitere Untersuchungen erforderlich, für welche häufig weitere Institute aufgesucht werden müssen. Mittels einer einfach durchzuführenden Screening-Methode direkt an eine auffällige Knöchel-Arm-Index Messung folgend, könnten Betroffene identifiziert und dadurch Spätkomplikationen und deren Folgen, wie etwa Herzinfarkt und Schlaganfall verhindert werden. Methoden: Im Rahmen dieser Studie wurden der Knöchel-Arm-Index sowie die maximale Flussgeschwindigkeit und Akzelerationszeit der A. poplitea mittels Ultraschalluntersuchung gemessen. Der Knöchel-Arm-Index wird durch das Verhältnis vom systolischen Blutdruck der unteren und oberen Extremitäten bestimmt und vergleicht dadurch die Widerstände der Gefäße. Die Ultraschalluntersuchung der A. poplitea erfolgt in der Kniekehle der Patient*innen. Mithilfe des Ultraschallgerätes werden die maximale Flussgeschwindigkeit und die Akzelerationszeit der A. poplitea gemessen, dabei kann auch die Flussqualität des Gefäßes beurteilt werden. Durch die Studie soll die Hypothese bestätigt beziehungsweise widerlegt werden, dass sich die Ultraschalluntersuchung der A. poplitea eignet, als Folgeuntersuchung einer auffälligen Knöchel-Arm-Index Messung eine periphere arterielle Verschlusskrankheit zu diagnostizieren. Die gewonnen Daten wurden zuerst mit statistischen Maßzahlen beschrieben und anschließend deskriptivstatistisch mithilfe von Korrelationsanalysen ausgewertet. Als Korrelationskoeffizient wurde Kendalls τ eingesetzt, zur visuellen Darstellung folgen Histogramme und Scatterplots. Ergebnisse: In der statistischen Auswertung zeigte sich bei den Histogrammen keine Symmetrie der Merkmalsausprägungen der einzelnen Merkmale, zudem konnten bereits zu Beginn deutliche Ausreißer identifiziert werden. Durch Scatterplots wurde nachgewiesen, dass zwischen verschiedenen Merkmalskombinationen kein linearer Zusammenhang vorliegt, sondern die Punkte der Merkmalsausprägungen in den Grafiken eher in Form von diffusen Wolken liegen. Durch Kendalls τ wurde der Zusammenhang zwischen den Merkmalskombinationen getestet, jedoch konnte die Alternativhypothese durch Werte von Kendalls τ annähernd 0 widerlegt werden. Schlussfolgerung: Im Rahmen der Studie konnte kein Zusammenhang zwischen den Messungen des Knöchel-Arm-Index und den Messwerten der maximalen Flussgeschwindigkeit und Akzelerationszeit der A. Poplitea nachgewiesen werden. Es ist jedoch davon auszugehen, dass in Folgestudien, welche sich ausschließlich auf Patient*innen mit Verdacht einer peripheren arteriellen Verschlusskrankheit beziehen bessere Ergebnisse erzielt werden können. Background and problem: Atherosclerotic changes in blood vessels are a worldwide health problem of many patients, that usually remains undiagnosed for a long time due to the late onset of symptoms. Often, the diagnosis cannot be made first until there has already been a narrowing of the vascular lumen and impairment of the blood supply to the subsequent tissues. The ankle-brachial-index is the current gold standard in the field of initial diagnosis of peripheral artery disease. Through this examination, the suspicion of a disease can be diagnosed. To confirm the diagnosis further examinations are required, mostly in other institutes. An easy-to-perform screening method directly following an ankle-brachial-index measurement could identify those affected and prevent late complications and their consequences, such as heart attack and stroke. Methods: In this study, the ankle-brachial-index as well as the maximum velocity and acceleration time of the A. poplitea were measured by ultrasound examination. The ankle-arm index is detected by the ratio of systolic blood pressure of the lower and upper extremities, thereby comparing the resistance of the vessels. The ultrasound examination of the A. poplitea is carried out in the back of the knee of the patients. With the help of an ultrasound device, the maximum velocity, and the acceleration time of the A. poplitea are measured, and the quality of the vessels blood flow can also be assessed. The study is intended to confirm or refute the hypothesis that the ultrasound examination of the popliteal artery is suitable for diagnosing a peripheral artery disease as a follow-up examination of a conspicuous ankle-brachial-index measurement. The data obtained were described using statistical coefficients and then statistically evaluated using correlation analyses. Kendalls τ was used as a correlation coefficient, histograms and scatterplots follow for visual representation. Results: Statistical evaluation showed no symmetry of characteristic expressions of the measured values in histograms. Also obvious outliers were identified. Scatterplots have shown that there is no linear relationship between different feature combinations. The alternative hypothesis was falsified by Kendalls τ because all results were close to 0. It cannot be assumed that there is a correlation. Conclusion: The study did not establish a correlation between the ankle-brachial-index measurements and the maximum velocity and acceleration time measurements of the A. Poplitea. However, it can be assumed that better results can be achieved in follow-up studies that relate exclusively to patients with suspected peripheral artery disease.

Hintergrund: Mit steigendem Lebensalter kommt es immer häufiger zur Etablierung somatischer Mutationen in hämatopoetischen Stammzellen. Diese Mutationen entstehen meistens in den Genen DNMT3A, TET2, ASXL1 und JAK2, welche bislang vorwiegend bei PatientInnen mit akuter myeloischer Leukämie oder myelodysplastischem Syndrom detektiert wurden. Das Vorliegen solcher Genmutationen in Abwesenheit von anderen hämatologischen Auffälligkeiten ist definiert als klonale Hämatopoese von unbestimmtem Potential (CHIP). CHIP geht mit einem erhöhten Risiko einher, eine hämatologische Neoplasie zu entwickeln. Zusätzlich besteht eine Assoziation zwischen CHIP und kardiovaskulären Erkrankungen. Bei 60% der älteren PatientInnen mit einer diagnostizierten Atherosklerose liegen keine traditionellen Risikofaktoren (Hypercholesterinämie, Diabetes, Bluthochdruck und Rauchen) vor. Aus diesem Grund wird angenommen, dass neue Risikofaktoren wie CHIP maßgeblich an der Entstehung von Atherosklerose beteiligt sind. Ziel: Das Ziel dieser Arbeit war herauszufinden, ob ein Zusammenhang zwischen CHIP und Atherosklerose in der A. carotis besteht. Dazu wurde die Häufigkeit von CHIP in einer Atherosklerose-PatientInnen-Kohorte (ICARAS Kohorte) bestimmt, mit dem Ziel die Ergebnisse anschließend mit den Daten aus anderen relevanten Kohorten zu vergleichen. Methodik: Um die Häufigkeit von CHIP innerhalb der ICARAS-Kohorte zu bestimmen, wurde ein „next-generation sequencing-based highly-multiplexed“ Assay, welcher eine Kombination aus Multiplex-PCR und Next-Generation Sequenzierung darstellt, entwickelt. Ergebnisse: CHIP wurde in ~7% der ICARAS PatientInnen detektiert und ~52% aller klonalen Varianten wurden im Gen DNMT3A festgestellt. In fast 92% der PatientInnen mit CHIP wurden somatische Mutationen als klonale Marker nur in einem einzigen Gen nachgewiesen. Conclusio: Das Vorkommen von CHIP wurde bei einem beträchtlichen Anteil an Atherosklerose-PatientInnen festgestellt. Jedoch muss der mögliche Zusammenhang zwischen CHIP und Atherosklerose, unter Berücksichtigung des Anteils von CHIP bei gesunden PatientInnen sowie der Bewertung des klinischen Hintergrundes der ICARAS PatientInnen, weiter untersucht werden. Background: Human aging is associated with an increased frequency of somatic mutations in hematopoietic stem cells. Circulating peripheral blood clones carrying mutations in the genes DNMT3A, TET2, ASXL1 and JAK2 occur most frequently in patients with AML or MDS, but also in elderly apparently healthy individuals, especially in those older than 70 years of age. The condition that people carry somatic mutations in the absence of other hematologic abnormalities is defined as clonal hematopoiesis of indeterminate potential (CHIP). CHIP is associated with an increased risk of hematologic cancer, all-cause mortality and cardiovascular disease. Surprisingly, a fraction of elderly patients with atherosclerosis do not have established conventional risk factors (hyperlipidemia, diabetes, hypertension and smoking), suggesting novel factors such as CHIP might have an impact on atherogenesis. Aim: The aim of this thesis was to find out whether there is an association between CHIP and cardiovascular disease in an atherosclerosis patient cohort (ICARAS cohort). For this reason, the frequency of CHIP was determined in ICARAS patients for the purpose of being compared to its frequency in individuals of other cohorts. Methods: To detect the presence of CHIP in the ICARAS cohort, a next-generation sequencing-based highly-multiplexed assay was established. This assay was comprised of multiplex PCR followed by next-generation sequencing. Results: CHIP was identified in ~7% of ICARAS patients and ~52% of all detected somatic variants were found in the DNMT3A gene. In ~92% of patients with CHIP, clonality was only determined by mutations in a single gene. Conclusion: CHIP was detected in some ICARAS patients, however, the connection between CHIP and carotid atherosclerosis within this cohort remains to be investigated in further analyses with respect to determination of CHIP in healthy individuals and evaluation of the clinical background in ICARAS patients.

Nachdem in den letzten Jahren die Entz��ndungshypothese in der Entstehung der Atherosklerose immer mehr an Bedeutung gewonnen und sich zuletzt die Senkung des C-reaktiven-Proteins (CRP)-Plasmaspiegels als Risikoreduktion f��r kardiovaskul��re Ereignisse herauskristallisiert hat, stellt sich die Frage nach weiteren medikament��sen/therapeutischen Verfahren zur Senkung des CRP-Spiegels. Grundlage f��r die Arbeit war die Feststellung, dass Digitalis-Pr��parate die CRP-Synthese in vitro hemmen. Die Anwendungsbeobachtung soll nun zur Kl��rung der Frage dienen, ob dieses Ph��nomen auch in vivo stattfindet. Ziel der Arbeit war es zu eruieren, ob bei Patienten, die zus��tzlich zur konventionellen Herzinsuffizienztherapie mit Digitalispr��paraten behandelt werden, eine statistisch signifikant h��here Reduktion der CRP-Spiegel erfahren als Patienten, die nur eine konventionelle Herzinsuffizienztherapie erhalten. Der gruppeninterne Abfall des CRP war in beiden Gruppen jeweils statistisch signifikant. Der Abfall des CRPs im Gruppenvergleich zeigte an Tag 21 - Tag 3 eine grenzwertige statistische Signifikanz. Durch diese Arbeit konnte gezeigt werden, dass die Digitalismedikation wahrscheinlich eine weitere medikament��se M��glichkeit darstellt, die CRP-Spiegel zu senken und somit einen weiteren Risikofaktor f��r die Entstehung von Atherosklerose zu optimieren.

Atherosklerose ist eine verbreitete Krankheit deren Pathogenese unzureichend erforscht ist. Bekannt ist jedoch, dass externe und interne Faktoren eine Rolle spielen. Die zugrunde liegenden Prozesse müssen genauer untersucht werden, um neue Therapieansätze zu entwickeln. Als Allroundtalent könnte Serotonin (5-HT) ein Kandidat sein, der eine entscheidende Rolle bei der atherosklerotischen Pathogenese spielt. Ob und wie dieses Hormon die Bildung atherosklerotischer Plaques, Makrophageninvasion, Verkalkung und Fibrose beeinflusst, war Gegenstand dieser Studie. Die vorliegende Studie ist die erste ihrer Art, die den neuartigen Ansatz von transgenen Doppel-Knockout-Mäusen verwendet, denen das Apolipoprotein E (ApoE) fehlt und, die das Schlüsselenzym für die periphere 5-HT-Synthese, Tryptophanhydroxylase 1 (Tph1), oder den primären 5-HT-Transporter (SERT) nicht bilden. Physiologie, Stoffwechselparameter und atherogene Prozesse wurden in ApoE/Tph1-/- und ApoE/Sert-/- Tieren mithilfe eines breiten Methodenspektrums untersucht und resultierten in einem umfassenden Überblick über die Wirkungsweisen von 5-HT auf Atherosklerose. Die 5-HT-Rezeptorverteilung ist unterschiedlich in Gefäßen von verschiedenen Mauslinien und in denen von Tieren mit Tph1-Defizienz, die in diesen Linien erzeugt wurden. Ferner weisen ApoE/Tph1-/- und ApoE/Sert-/- verschiedene Phänotypen auf: Tph1-Defizienz führt zu verminderter Zunahme des Körpergewichts, niedrigerem Plasmacholesterin und Leberparametern und erhöhtem Lebergewicht. Sert-Defizienz bedingt erhöhten Blutzucker, Plasmacholesterin und die Ausbildung größerer Plaques, sowie vermehrte Kollagenakkumulation. Die Langzeitgabe einer Western-Diät zeigte, dass Tph1-Defizienz schützende Wirkung auf den Lipidstoffwechsel hat, ein klarer Effekt auf die Atherogenese konnte nicht ermittelt werden. Zusammenfassend hebt diese Studie die komplexen Beziehungen vieler Faktoren während der Krankheit hervor. 5-HT spielt bei vielen dieser Faktoren eine Rolle, scheint jedoch nur eine schwache aber protektive Wirkung auf Atherogenese selbst zu haben. Atherosclerosis is a common disease and its pathogenesis is only poorly understood. It’s known that external and internal factors play a role, but the exact processes need to be investigated more intensively to develop novel therapy approaches. As an all-round talent, serotonin (5-HT) might be a promising candidate to play a crucial role in atherosclerosis. If and how 5-HT affects atherosclerotic plaque formation, macrophage invasion, calcification and fibrosis was focus of this study. This study is the first of its kind using the novel approach of transgenic double knockout mice lacking the apolipoprotein E (ApoE, atherosclerosis model) and either the key enzyme in peripheral 5-HT synthesis, tryptophan hydroxylase 1 (Tph1) or the major 5-HT transporter, SERT. Physiology, metabolic parameters and atherogenic processes in ApoE/Tph1-/- and ApoE/Sert-/- animals were examined using a broad spectrum of methods and resulted in an extensive overview of how 5-HT might influence the pathogenesis of atherosclerosis. Most striking results of this study: 5-HT receptor distribution is altered in vessels of different background strains, and also in Tph1 deficient animals generated in these strains. Further, the examination of ApoE/Tph1-/- and ApoE/Sert-/- mice elucidated that both double knockouts exhibit different phenotypes: While Tph1 deficiency resulted in decreased bodyweight, plasma cholesterol and liver parameters and increased liver weight, Sert deficiency caused increases in blood glucose, plasma cholesterol, plaque size and collagen in plaques. Long term Western Diet application confirmed that Tph1 deficiency decreases weight gain and has protective effects on lipid metabolism, but a clear effect on atherogenesis could not be reported. Concluding, this study highlights the complex relationship between many factors acting on atherosclerotic pathogenesis. 5-HT plays a role in many of those factors, but seems to have only minor but protective effects on atherogenesis itself.

Peripheral arterial occlusive disease (PAOD) is an atherosclerotic vascular disease with high morbidity and mortality. A consistent medication-based secondary prevention is part of the essential and evidence-based treatment of PAOD. The aim of this study was to ascertain the status quo of medicinal secondary prevention based on submitted prescriptions.In the time period from 2014 to 2017 patients with a confirmed PAOD coding (I70.2-/I73.9-) were identified based on secondary data of the Association of Statutory Health Insurance Physicians Westphalia-Lippe (KVWL). The prescriptions submitted with respect to platelet inhibitors, oral anticoagulants, lipid lowering therapy (LLT) and angiotensin-converting enzyme (ACE) inhibitors in the fourth quarter year after diagnosis coding were collated.In the diagnosis period 2014/2015 a total of 238,397 patients had PAOD in the catchment area of the KVWL. The proportion of submitted prescriptions in the fourth quarter year after diagnosis was 25.9% for LLT, 13.6% for acetylsalicylic acid, 4.5% for clopidogrel, 5.5% for vitamin K antagonists (VKA), 3.5% for non-vitamin K‑dependent oral anticoagulants (NOAC) and 26.8% for ACE inhibitors. Over the course of the 3 years (n = 241,375 patients with PAOD 2016/2017) the proportion of submitted prescriptions for all substances except VKA increased (p 0.001), whereby the largest relative increase was noted for NOAC (relative increase of 81.7%).The guideline-conform medicinal secondary prevention in patients with PAOD in Germany is still in need of improvement. A consistent implementation of evidence-based medicinal secondary prevention harbors a great potential for improvement of the overall prognosis in patients with PAOD.HINTERGRUND: Die periphere arterielle Verschlusskrankheit (pAVK) ist eine atherosklerotische Gefäßerkrankung mit hoher Morbidität und Mortalität. Eine konsequente medikamentöse Sekundärprävention gehört zur essenziellen und evidenzbasierten Therapie der pAVK. Das Ziel der vorliegenden Studie war es, den Status quo der medikamentösen Sekundärprävention anhand von Rezepteinlösungen zu ermitteln.Basierend auf Sekundärdaten der Kassenärztlichen Vereinigung Westfalen-Lippe (KVWL), wurden im Zeitraum von 2014 bis 2017 Patienten mit einer gesicherten pAVK-Kodierung (I70.2-/I73.9-) identifiziert und deren Rezepteinlösung bezüglich Thrombozytenaggregationshemmern (TAH), oralen Antikoagulanzien, lipidmodifizierender Medikation (LLT) sowie ACE(„angiotensin-converting enzyme“)-Hemmer im 4. Quartal nach der Diagnosekodierung erfasst.Im Diagnosezeitraum 2014/2015 hatten im Einzugsgebiet KVWL 238.397 Patienten eine pAVK. Der Anteil an eingelösten Rezepten betrug im 4. Quartal nach der Diagnosestellung 25,9 % für LLT, 13,6 % für Acetylsalicylsäure, 4,5 % für Clopidogrel, 5,5 % für Vitamin-K-Antagonisten (VKA), 3,5 % für nicht-Vitamin-K-abhängige orale Antikoagulanzien (NOAK) und 26,8 % für ACE-Hemmer. Im Verlauf von 3 Jahren (n = 241.375 Patienten mit pAVK 2016/2017) stieg der Anteil an eingelösten Rezepten bis auf VKA für alle anderen Substanzen an (p 0,001), wobei der größte relative Anstieg bei NOAK zu verzeichnen war (relativer Anstieg um 81,7 %).Die leitliniengerechte medikamentöse Sekundärprävention bei pAVK-Patienten in Deutschland ist weiterhin verbesserungswürdig. Eine konsequente Umsetzung evidenzbasierter medikamentöser Sekundärprävention beherbergt ein großes Potenzial zur Verbesserung der Gesamtprognose der pAVK-Patienten.

Neutrophile Granulozyten setzen extrazelluläre Fallen (NETs) frei, welche eine wichtige Rolle in der angeborenen Immunantwort spielen. In einem pathologischen Kontext können diese jedoch zur Entwicklung und zum Fortschreiten chronischer Entzündungen, wie Atherosklerose, führen. Ein Hauptbestandteil von NETs, welche für die Eliminierung von Pathogenen verantwortlich sind, ist das Enzym Myeloperoxidase (MPO). MPO katalysiert die Bildung von Oxidationsmitteln, wie hypochlorige Säure (HOCl). Eine Überproduktion von HOCl in atherosklerotischen Läsionen führt zu oxidativem Stress und Schäden an Wirtszellen und -gewebe, durch Verursachung von Proteinmodifikationen, -fragmenten und -aggregaten. Da Histone ebenso ein wichtiger Bestandteil von NETs sind, wurden HOCl-induzierte Modifikationen an diesen Proteinen untersucht, indem diese mit verschiedenen Konzentrationen an HOCl behandelt wurden und der Verlust bestimmter Aminosäuren und die simultane Entstehung modifizierter Aminosäuren mittels Flüssigkeitschromatographie – Massenspektrometrie (LC-MS) analysiert wurde. Um Daten zur Lokalisation modifizierter Aminosäuren zu erhalten, wurden synthetische Peptide mit bekannter Sequenz mit HOCl behandelt und anschließend über Peptid-Mapping durch Matrix-unterstützte Laser-Desorption/Ionisation – Flugzeitanalyse – Massenspektrometrie (MALDI-TOF-MS) analysiert. Darüber hinaus wurden das Thiocyanat-Ion (SCN-) und das Selenocyanat-Ion (SeCN-), zwei potentielle Modulatoren HOCl-induzierter Schäden, auf ihre Fähigkeit HOCl zu verbrauchen und Amine aus HOCl-induzierten Histonchloraminen zu regenerieren, photometrisch getestet. Mit der LC-MS Analyse konnte eine Abnahme von Tyrosin und Methionin und eine Zunahme von 3-Chlortyrosin in Proben, die mit HOCl behandelt wurden, gezeigt werden. Zudem wiesen die Massenspektren des Peptid-Mapping potentielle Modifikationen an Lysin und Tyrosin auf. Schließlich zeigten die Versuche mit SCN- und SeCN-, dass die beiden Modulatoren HOCl verbrauchen und Chloraminkonzentrationen mit ähnlicher Wirksamkeit reduzieren konnten. Neutrophils release extracellular traps (NETs), which play an important role during an innate immune response. In a pathological context, however, NETs can contribute to the development and progression of chronic inflammation, including atherosclerosis. A key component of NETs, responsible for the elimination of pathogens, is the enzyme myeloperoxidase (MPO), which catalyses the formation of hypochlorous acid (HOCl), among other oxidants. Overproduction of HOCl in atherosclerotic lesions causes oxidative stress and host cell and tissue damage, by inflicting protein modification, fragmentation and aggregation. As histones are another major component of NETs, HOCl-induced modifications to these proteins were investigated by treating them with different concentrations of HOCl and analysing the loss of specific parent amino acids and the formation of some modified amino acid species by liquid chromatography – mass spectrometry (LC-MS). To obtain positional data on modified amino acids, peptide mass mapping by matrix-assisted laser desorption/ionization – time of flight – mass spectrometry (MALDI-TOF-MS) was conducted on model peptides with known sequences, after treatment with HOCl. Two potential modulators of HOCl-induced damage, thiocyanate (SCN-) and selenocyanate (SeCN-), were tested by photometrically measuring their ability to remove HOCl and reverse histone chloramines, which are formed upon reaction of HOCl with amines. The LC-MS analysis revealed a decrease in tyrosine and methionine and an increase in 3-chlorotyrosine in samples treated with HOCl. Mass spectra of the peptide mass mapping showed potential modifications at lysine and tyrosine residues. Lastly, SCN- as well as SeCN- appeared to scavenge HOCl and reduce chloramine concentrations with similar efficacy.

Der postoperative Apoplex ist eine der folgenschwersten Komplikationen unter kardiochirurgischen Patienten. Das Vorliegen einer schweren Atheromatose der Aorta ascendens gilt in diesem Zusammenhang als einer der Hauptrisikofaktoren. Die Anpassung des operativen Vorgehens unter Schonung der pathologisch veränderten Hauptschlagader stellt eine Möglichkeit zur Reduktion der postoperativne Mortalität und Morbidität dar. Die vorliegende Studie beschäftigt sich mit dem perioperativen Outcome unter Patienten mit einer Porzellanaorta, bei denen ein aortenschonendes Bypassverfahren unter Umgehung einer aortalen Klemmung der verkalkten Hauptschlagader angewandt wurde. Der Fokus liegt hierbei insbesondere auf dem postoperativen neurologischen Outcome. Hierzu wurde das kurz- und langfristige Outcome von insgesamt 40 Patienten analysiert, die sich bei vorliegender Porzellanaorta zwischen dem 01.06.2008 und dem 01.06.2013 an der Klinik für Thorax-, Herz- und Thorakale Gefäßchirurgie der Universitätsklinik Würzburg einer alternativen, aortenschonenden operativen koronaren Revaskularisation unterzogen. Zum Vergleich wurde das perioperative Outcome mit einem nach Geschlecht und Alter gematchten Kollektiv in doppelter Gruppenstärke erhoben, bei dem bei fehlender Atheromatose der Aorta ascendens ein konventioneller Herzbypasseingriff durchgeführt wurde. Unter den 40 Patienten mit detektierter Porzellanaorta wurden 26 Patienten nach dem Off-Pump Beating-Heart (OPCAB) Verfahren und 14 Patienten nach dem On-Pump Beating-Heart (ON-BH) Verfahren operiert. Die Datenerhebung bestand aus einer retrospektiven Erhebung prä-, intra- und postoperativer Parameter aus der elektronischen Patientenakte. Zudem wurden bei vorliegender Porzellanaorta Langzeitdaten mittels eines Telefoninterviews akquiriert. Die Studie konnte aufzeigen, dass Patienten mit einer Porzellanaorta sowohl aufgrund der Porzellanaorta als auch aufgrund einiger Komorbiditäten ein kardiochirurgisches Hochrisikokollektiv darstellen. So zeigte sich eine signifikante Häufung für das Vorliegen einer extrakardialern Arterienerkrankung (pAVK, Carotisstenose), dem Auftreten eines Apoplex in der Vergangenheit, eines fortgesetzten Nikotinabusus und einer chronischen Lungenerkrankung. Dieses Hochrisikokollektiv zeichnete sich auch durch signifikant höhere STS-Scores und einen deutlich höheren EuroScore II aus. Bezüglich der postoperativen 30-Tage Mortalität und Apoplexinzidenz zeigten sich keine signifikanten Unterschiede. Es ließ sich jedoch eine nicht-signifikante Häufung der Apoplexraten bei Vorliegen einer Porzellanaorta (7,5% vs. 1,3%, p=0,072) erkennen. Hingegen ergab sich eine signifikante Häufung der gesamtneurologischen Komplikationen bei vorliegender Porzellanaorta (40% vs. 10%, p, Postoperative stroke is one of the most fatal complications in cardiac surgery. Severe calcification of the aorta ascendens is a main risk factor. Alternative surgical methods, that avoid the calcified aorta seem to be a possibility to reduce postoperative mortality and morbidity. Our study analyses the postoperative outcome of patients with diagnosed porcelain aorta, who were treated with a surgical technique, that precludes clamping of the calcified aorta with special focus on postoperative neurological outcome. The study population involves 40 patients who were diagnosed with a severe atherosclerosis of the aorta ascendens between 01.06.2008 and 01.06.2013 at the department of cardiothoracic surgery of the University Hospital Wuerzburg and consequently underwent a cardiac revascularisation that excluded a clamping of the calcified aorta. A group matched for age and gender in double figures that had no significant atherosclerotic disease of the aorta and underwent a conventional cardiopulmonary bypass provided the comparative collective. The 40 patients with porcelain aorta received either Off-Pump Beating-Heart revascularisation (n=26) or On-Pump Beating-Heart Technique (n=14). The data collection included pre-, intra- and postoperative data acquired from the electronic patient file. Longterm data of patients with porcelain aorta were collected via telephone interviews. Our study demonstrates that patients with a severe calcified aorta ascendens represent a high-risk group – not only because of the porcelain aorta itself but as a result of several comorbidities. Significant higher occurrence of extracardial arterial disease (peripheral arterial vascular disease, carotid occlusion), previous stroke, smoking and chronic lung disease were detected. This high-risk collective reflects in significant higher STS-Scores and higher EuroScore II. There were no significant differences concerning 30-day mortality and stroke incidence. A non-significant tendency towards a higher stroke rate in patients with a porcelain aorta was detected (7,5% vs. 1,3%, p=0,072). Significant higher rates of general neurologic complications appeared among patients with porcelain aorta (40% vs. 10%, p

Atherosklerose ist eine chronisch entzündliche Erkrankung der Gefäße, welche aufgrund der weltweit steigenden Inzidenz ihrer Folgeerkrankungen, wie Herzinfarkt und Schlaganfall, zunehmend an Bedeutung gewinnt. Die bisher verfügbaren Therapien beschränken sich überwiegend auf die symptomatische Behandlung der Atherosklerose, greifen jedoch nicht in die entzündlichen Mechanismen ein, welche die Gefäßveränderungen vorantreiben. Der neu entdeckte G-Protein-gekoppelte „orphan“ Rezeptor GPRC5B ist in den Zucker- und Lipidstoffwechsel involviert, reguliert inflammatorische Prozesse im Fettgewebe und wird auch in den Zellen des vaskulären Systems sowie in Makrophagen endogen exprimiert. In der vorliegenden Arbeit wurde ein möglicher Einfluss von GPRC5B auf die Entzündung der Gefäßwand in vitro sowie auf die atherosklerotische Plaquebildung in vivo untersucht. Die Untersuchungen zeigten, dass ein proatherogenes, inflammatorisches Milieu zu einer verstärkten Expression von GPRC5B in den Zellen des vaskulären Systems führt und dass der Rezeptor selbst über die Aktivierung von ERK 1/2 sowie des NFκB-Signalwegs die inflammatorische Antwort der Zelle im Sinne einer positiven Rückkopplung verstärkt. In vivo verstärkte GPRC5B die Infiltration inflammatorischer Makrophagen in die entzündete Gefäßwand und förderte das Voranschreiten atherosklerotischer Läsionen. Die in dieser Arbeit gewonnenen Erkenntnisse decken neue Funktionen des noch wenig untersuchten „orphan“ Rezeptors im Rahmen der Gefäßentzündung und Atherogenese auf und weisen auf ein therapeutisches Potential einer GPRC5B-Hemmung für die Behandlung dieser Erkrankung hin. Atherosclerosis is a chronic vascular inflammatory disease, which is becoming more and more important due to the increasing incidence of its secondary diseases, such as myocardial infarction and stroke. The therapies available so far are mainly limited to the symptomatic treatment of atherosclerosis, but do not interfere with the inflammatory mechanisms that drive vascular lesions. The newly discovered G-protein coupled orphan receptor GPRC5B is involved in sugar and lipid metabolism, regulates inflammatory processes in adipose tissue and is also expressed endogenously in vascular cells and macrophages. The present study investigated the regulation of GPRC5B in the cells of the vascular wall and the impact of GPRC5B on vascular inflammation in vitro and on atherosclerotic plaque formation in vivo. The investigations in the current study showed that a pro-atherogenic inflammatory signaling leads to an increased expression of GPRC5B in the cells of the vascular wall, with the receptor sequentially enhancing the inflammatory response of the cell via activation of ERK1/2 and NFκB signaling pathways pointing to a positive feedback loop. In vivo, GPRC5B enhanced the infiltration of inflammatory macrophages into the inflamed vessel wall and promoted the progression of atherosclerotic lesions. The findings obtained in this study reveal novel functions of the orphan receptor GPRC5B in vascular inflammation and atherogenesis, might leading to a specific therapeutic target in the treatment of atherosclerosis.

Im Rahmen dieser Arbeit wurden zwei separate Projekte bearbeitet: zum einen die NOD-abhängige miRNA Regulation und deren Einfluss auf die endotheliale Zytokinexpression als wesentlicher Bestandteil der vaskulären Inflammation. Zum anderen wurde die Rolle der Immunrezeptoren NOD1 und NOD2 innerhalb der Atherogenese und des Cholesterolmetabolismus charakterisiert. NOD1 und NOD2 gehören zur Proteinfamilie der Pattern Recognition Rezeptoren, welche für die Pathogenerkennung und nachgeschaltete angeborene Immunantwort relevant sind. Innerhalb des ersten Projektes wurden in murinen primären Lungenendothelzellen nach NOD Aktivierung drei differentiell regulierte miRNAs nachgewiesen: miR-147-3p, miR-200a-3p und miR-298-5p. Basierend auf der aktuellen Literatur und in dieser Arbeit durchgeführten in-silico Analysen konnten die Zytokine TNF-α und IL-6 als potentielle Zielgene der miRNAs miR-147-3p und miR-298-5p identifiziert werden. Dies wurde anhand einer verminderten Expression von TNF-α und IL-6 nach Transfektion mit entsprechenden miRNA mimics validiert. Da eine NOD Stimulation zur reduzierten Expression dieser beiden miRNAs führt, implizieren diese Ergebnisse einen miRNA-abhängigen, verstärkenden Effekt der NOD Stimulation auf endotheliale Zytokinexpression und vaskuläre Inflammation. Im zweiten Projekt konnte gezeigt werden, dass eine systemische Deletion von NOD1 und NOD2 zu verringerter Lipideinlagerung und Ansammlung von Monozyten/Makrophagen im atherosklerotischen Plaque führt. Dies geht mit reduzierten Plasma Cholesterolwerten einher und kann verschiedene Ursachen haben: zum einen zeigen Nod-defiziente Tiere eine erhöhte LRP1 Expression in der Leber, was auf eine verstärkte hepatische Cholesterolaufnahme hinweist. Makrophagen Nod-defizienter Mäuse weisen eine verstärkte Expression der Cholesteroltransporter ABCA1 und ABCG1 und eine reduzierte Schaumzellbildung auf, was einen gesteigerten reversen Cholesteroltransport in Nod-defizienten Mäusen nahelegt. Weiterhin konnte deutlich mehr Cholesterol und ein erhöhtes Vorkommen des Cholesterol metabolisierenden Darmbakteriums Eubacterium coprostanoligenes in Coecen Nod-defizienter Mäuse nachgewiesen werden. Diese Ergebnisse identifizieren NOD1 und NOD2 als essentielle Regulatoren innerhalb der Inflammation, des Cholesterolmetabolismus und der Atherogenese., Within the scope of this work two separate projects were investigated : the contribution of NOD-dependent microRNA regulation in endothelial cytokine expression and vascular inflammation and the role of NOD1 and NOD2 in atherogenesis and cholesterol metabolism. Both NOD1 and NOD2 receptors belong to the class of pattern recognition receptors responsible for pathogen sensing, which mediate a proinflammatory innate immune response upon their activation. Regarding the first project it was shown that NOD1 and NOD2 activation differentially regulates three different microRNAs in murine lung primary endothelial cells: miR-147-3p, miR-200a-3p and miR-298-5p. On the background of the current literature and in-silico analysis performed during this work, TNF-α and IL-6 were identified as potential target genes of miR-147-3p and miR-298-5p. By performing transfection experiments using mimics for both microRNAs TNF-α as well as IL-6 exhibited a diminished expression, indicating a microRNA-driven target gene regulation. Since miR-147-3p and miR-298-5p are downregulated after NOD-stimulation, these results point to an amplifying mechanism of NOD-dependent cytokine induction, an essential prerequisite of vascular inflammation. Within the second project it was demonstrated that deficiency of NOD1 and NOD2 results in reduced lipid and leukocyte accumulation in atherosclerotic plaques, which correlates with decreased plasma cholesterol. Potential causes of this Nod-deficient phenotype could be an enhanced hepatic cholesterol uptake, mediated by an increased expression of LRP1. Moreover, macrophages isolated from Nod-deficient mice showed reduced foam cell formation due to an increased ABCA1 and ABCG1 expression, thereby promoting reverse cholesterol transport. Finally, Nod-deficient mice showed increased cholesterol and coprostanol content in the cecum, which correlates with an elevated, even though not significant, relative abundance of the gut bacterium Eubacterium coprostanoligenes that metabolizes cholesterol to coprostanol. These results indicate a comprehensive interlinking role of NOD1 and NOD2, including microRNA-regulated vascular inflammation and metabolic processes affecting atherogenesis like cholesterol metabolism. These results identified NOD1 and NOD2 – at different levels – as comprehensive regulators in vascular inflammation and atherogenesis.

Atherosklerose ist nach wie vor die Haupttodesursache in den entwickelten Ländern. Es ist mittlerweile bekannt, dass es sich hierbei um eine entzündliche Erkrankung handelt, bei der verschiedene Immunzellen zur Atherogenese beitragen. Bisher wurde gezeigt, dass T-Zell-Wechselwirkungen mit Antigen-präsentierenden Zellen (APC) zu einer chronischen Entzündung bei Atherosklerose beitragen. Die genauen Mechanismen, wie APC die Atheroprogression modulieren, sind jedoch unvollständig charakterisiert. Mit Hilfe einer LacZ-Reportermaus konnten wir zeigen, dass CD11c-positive Zellen im Aortenbogen von ApoE -/- Mäusen unter cholesterolreicher Diät angereichert werden. Die systemische Langzeitdepletion von CD11c-positiven Zellen nach Transfer von Knochenmark von CD11c-GFP-Diphterie Toxin Rezeptor (CD11c-DTR) -Mäusen in ApoE -/- Mäuse durch Injektion von Diphterietoxin führte zu einer signifikant erhöhten Plaquebildung in der Aorta, wie durch Ölrot O Färbung gezeigt wurde, während die Behandlung mit Diphtherietoxin ohne Knochenmarkstransfer keinen Einfluss auf die Plaquebildung hatte. Interessanterweise haben wir bei Stimulation mit acetyliertem LDL (acLDL) erhöhte Mengen an ApoE im Überstand von aus dem Knochenmark stammenden dendritischen Zellen (DCs) gemessen. Außerdem haben wir verringerte ApoE-Serumspiegel in mit CD11c-DTR-Knochenmark rekonstituierten ApoE -/- Mäusen beobachtet nach Depletion von CD11c-positiven Zellen im Vergleich zu Kontroll-behandelten Tieren. Zusammenfassend lässt sich schließen, dass CD11c - positive Zellen die Atherosklerose in ApoE -/- Mäusen möglicherweise durch die Sekretion von ApoE mindern.

Der im Jahr 1963 erstmals beschriebene sekundäre Botenstoff cyclisches Guanosin 3´ 5´-Monophosphat (cGMP) ist ein intrazelluläres Signalmolekül mit vielen Funktionen. Zu den bekanntesten physiologischen Wirkungen von cGMP gehört die Regulation des Blutflusses durch die Relaxation der vaskulären Glattmuskelzellen (VSMCs). cGMP-modulierende Medikamente werden bereits seit mehr als einem Jahrhundert für die Behandlung vasokonstriktiver Erkrankungen verwendet. In Säugetieren erfolgt die Bildung von cGMP entweder durch (1) cytosolische Stickstoffmonoxid (NO)-sensitive Guanylyl-Cyclasen (NO-GCs) oder durch (2) transmembrane “partikuläre“ Guanylyl-Cyclasen (pGCs). Letztere werden u.a. infolge der Bindung natriuretischer Peptide wie atriales natriuretisches Peptid (ANP) oder C-Typ natriuretisches Peptid (CNP) aktiviert. In VSMCs werden viele Effekte von cGMP durch die cGMP-abhängige Proteinkinase Typ I (cGKI) vermittelt. Neben der Regulation des Gefäßtonus sind VSMCs auch am vaskulären Umbau im Rahmen kardiovaskulärer Erkrankungen wie Atherosklerose und Restenose beteiligt. Unter physiologischen Bedingungen zeigen VSMCs meist einen kontraktilen Phänotyp. Bei pathophysiologischen Veränderungen wechseln VSMCs jedoch verstärkt in einen sog. synthetischen Phänotyp. Dieser unterscheidet sich vom kontraktilen Phänotyp durch eine gesteigerte Sekretion extrazellulärer Matrix (ECM)-Proteine, den Verlust kontraktiler Markerproteine, sowie eine erhöhte Proliferation. Ob eine Aktivierung des cGMP-Signalwegs den Vorgang der phänotypischen Modulation von VSMCs fördert oder inhibiert und somit die Entstehung vaskulärer Erkrankungen beschleunigt oder verlangsamt, wird kontrovers diskutiert. Bisherige Studien mit Knockout-Mausmodellen verschiedener Komponenten des cGMP-Signalweges weisen auf eine pro-atherosklerotische Wirkung des Signalweges in VSMCs hin. Im ersten Teil dieser Arbeit wurde der Effekt von cGMP auf das Wachstum von primären VSMCs untersucht. Anders als in vorhergehenden Wachstumsuntersuchungen, deren Ergebnisse auf konventionellen Endpunktmessungen (WST, MTS) beruhten, wurde in dieser Arbeit eine neue Impedanz-basierte Messtechnik mit der Bezeichnung xCELLigence verwendet. Diese Methode ermöglichte es, das Wachstumsverhalten von VSMCs in Echtzeit zu verfolgen und somit ein besseres Verständnis der Wachstumsregulation über den cGMP-Signalweg zu erhalten. Durch den Vergleich von Wildtyp-VSMCs mit NO-GC- und cGKI-defizienten VSMCs konnte gezeigt werden, dass NO (75 µM DETA-NO) das Wachstum von VSMCs durch die Aktivierung der NO-GC-cGMP-cGKI Signalkaskade stark beschleunigt. 2 In der verwendeten Konzentration hatte NO keinen signifikanten Einfluss auf die Vitalität der Zellen. Im Gegensatz zu NO bewirkte die Stimulation mit ANP nur eine moderate Erhöhung der Wachstumsrate, hatte aber einen stark positiven Effekt auf die Vitalität der VSMCs. Diese Ergebnisse weisen darauf hin, dass es in VSMCs unterschiedliche cGMP-Kompartimente gibt, nämlich NO-induziertes globales cGMP und durch ANP ausgelöste lokale cGMP-Signale, welche unterschiedliche Effekte auf Zellwachstum und Vitalität vermitteln. Darüber hinaus konnte gezeigt werden, dass der cGMP-induzierte Wachstumseffekt am stärksten ist, wenn die Aktivierung des cGMP-Signalwegs direkt bei der Aussaat der Zellen erfolgt. Diese Beobachtung lässt darauf schließen, dass cGMP vor allem in frühen Phasen des Wachstums, insbesondere beim adhärieren der Zellen, eine wichtige Funktion hat. Im zweiten Teil dieser Arbeit wurde analysiert, welchen Einfluss das ECM-Protein Fibronektin (Fn) auf das Wachstumsverhalten und die phänotypische Modulation von VSMCs ausübt und ob es evtl. mit dem cGMP-Signalweg in Verbindung steht. cGMP-Messungen mit dem FRET-basierten cGMP-Sensor cGi500 zeigten, dass in Gegenwart von Fn gewachsene VSMCs stärker auf CNP als auf ANP reagieren. Mittels Immunfluoreszenz-Färbungen konnte gezeigt werden, dass Zellen, die verstärkt auf CNP reagieren, eine reduzierte Expression kontraktiler Markerproteine (wie z.B. SMαA) haben und demzufolge einen eher synthetischen Phänotyp aufweisen. Schließlich wurde durch die Generierung eines Glattmuskel-spezifischen Fn Knockouts (Fn-smko) untersucht, inwiefern das Fn aus VSMCs die Entstehung von Atherosklerose beeinflusst. Interessanterweise wurde in VSMC-Kulturen aus Fn-smko Mäusen ein erhöhtes Zellwachstum beobachtet. Eine Western Blot-Analyse der Phosphorylierung von VASP (ein Indikator für die Aktivität von cGKI) sowie FRET-basierte cGMP-Messungen (Konzentrations-Wirkungs-Analyse von NO) wiesen darauf hin, dass VSMCs aus Fn-smko Mäusen eine erhöhte NO-GC Aktivität besitzen, was deren erhöhtes Zellwachstum erklären könnte. In Übereinstimmung mit den in vitro Daten zeigten in vivo Untersuchungen von Fn-smko Mäusen eine Zunahme atherosklerotischer Plaques. Diese Plaques waren im Vergleich zu Plaques aus der Fn-exprimierenden Kontrollgruppe durch eine höhere Stabilität (SMαA > Mac2 positive Fläche eines Plaques) gekennzeichnet. Zusammenfassend weisen diese Ergebnisse darauf hin, dass die genetische Ablation von Fn in Glattmuskelzellen zu einer Amplifikation der wachstumsfördernden cGMP Signalkaskade in VSMCs führt, welche wiederum die Entwicklung stabiler atherosklerotischer Plaques mit einem hohen Anteil an VSMCs fördert.

Summary In 2010, eight Austrian medical societies proposed a joint position statement on the management of metabolic lipid disorders for the prevention of vascular complications. An updated and extended version of these recommendations according to the current literature is presented, referring to the primary and secondary prevention of vascular complications in adults, taking into consideration the guidelines of other societies. The “Austrian Lipid Consensus – 2016 update” provides guidance for individualized risk stratification and respective therapeutic targets, and discusses the evidence for reducing vascular endpoints with available lipid-lowering therapies. Furthermore, specific management in key patient groups is outlined, including subjects presenting with coronary, cerebrovascular, and/or peripheral atherosclerosis; diabetes mellitus and/or metabolic syndrome; nephropathy; and familial hypercholesterolemia.

Dissertation, Rheinisch-Westfälische Technische Hochschule Aachen, 2019; Aachen 1 Online-Ressource (42 Seiten) : Illustrationen (2019). = Dissertation, Rheinisch-Westfälische Technische Hochschule Aachen, 2019, Patients with type 2 diabetes mellitus (T2DM) present a higher risk for acute coronary syndrome (ACS) compared to patients without T2DM. As most of these ACS are pathophysiologically caused by the rupture of a coronary plaque, in the last years researchers focused on predictors for coronary plaque instability, which may then evolve in plaque rupture. A thinner fibrous cap over the necrotic lipid core is, for instance, an established feature of plaque vulnerability and can be visualized and quantified in vivo through optical coherence tomography (OCT), an intravascular imaging technique. However, it has been recently discussed whether localization, size, shape or extent of coronary calcification play a role in plaque instability. In fact, various imaging studies supported this hypothesis by showing a higher incidence of spotty calcifications in lesions of patients with ACS compared to patients with stable coronary artery disease. However, data regarding differences in localization, size, shape or extent of calcification between patients with and without T2DM are currently lacking. Our hypothesis was that these newly suggested features of plaque vulnerability may add to the well-known vulnerable phenotype of coronary plaques in patients with T2DM.We therefore analyzed through OCT lesions of patients with and without T2DM with stable coronary artery disease. In this group we performed a pre-procedural OCT, where we analyzed the localization, size, shape or extent of coronary calcification in addition to the established parameters of plaque vulnerability. We could show that patients with T2DM present a lower minimal fibrous cap thickness (FCT) as well as a higher percent stenosis compared to patients without T2DM. On the contrary, we could not detect any significant difference in localization, size, shape or extent of intravascular calcification in the two groups. In the light of these data, the role of established features of plaque vulnerability – in particular FCT – could be confirmed as marker of the higher cardiovascular risk of patients with coronary artery disease and T2DM. On the contrary, the localization, size, shape or extent of coronary calcification does not seem to influence the higher risk of diabetic patients compared to patients without T2DM., Published by Aachen

Der Chemokinrezeptor CCR6 wird von einer Vielzahl unterschiedener Zelltypen exprimiert, wie zum Beispiel Monozyten, Th17-Zellen und regulatorische T-Zellen, die im Zusammenhang mit der Entstehung von Atherosklerose stehen. Um die Bedeutung von CCR6 in der Pathogenese der Atherosklerose bestimmen zu können, wurden CCR6-defiziente (Ccr6-/- ) Mäuse mit low-density lipoprotein receptordefizienten (Ldlr-/-) Mäusen gekreuzt, um Tiere zu erhalten, die anfällig für Atherosklerose und zudem CCR6-defizient sind. Nach acht Wochen pro-atherogener, fettreicher western-type diet war die Ausprägung der atherosklerotischen Läsionen im Aortensinus und der gesamten Aorta, sowie deren Gehalt an Plaquemakrophagen in den Ccr6-/-Ldlr-/- Tieren im Vergleich zu den Ldlr-/- Kontrolltieren signifikant vermindert. Die lokale und die systemische Verteilung von T-Zellen sowie die Häufigkeit von Th1-, Th17-Zellen und regulatorischen T-Zellen blieb hingegen unverändert. Im Gegensatz dazu reduzierte sich die Zahl der im Blut zirkulierenden Gr-1high und Gr-1low Monozyten in den Ccr6-/-Ldlr-/- Tieren deutlich. Weiter konnte gezeigt werden, dass über CCR6 in vitro die Adhäsion von Monozyten an inflammatorisch verändertem Endothel und in vivo die Adhäsion von Leukozyten an das Endothel der Karotiden vermittelt wird. Des Weiteren wurden in einem air pouch-Modell für akute Entzündungsreaktionen mittels CCR6 spezifisch Monozyten, aber keine TZellen rekrutiert. Summa summarum konnte die Bedeutung von CCR6 auf verschiedenen Ebenen der Pathogenese der Atherosklerose gezeigt werden: Während CCR6 für die Hypercholesterinämie assoziierte adaptive Immunantwort entbehrlich ist, reguliert es die Mobilisierung, Adhäsion und Rekrutierung von Monozyten und kontrolliert über diese Mechanismen die Akkumulation von Makrophagen und Genese atherosklerotischer Läsionen. CCR6 und sein Ligand CCL20 könnten somit vielversprechende Ziele neuer pharmakologischer Therapieansätze sein, um auch die Atherogenese im Menschen zu unterbinden. Die Ergebnisse der Dissertation wurden im Dezember 2013 im Journal Thrombosis and Haematostasis unter dem Titel “CCR6 selectively promotes monocyte mediated inflammation and atherogenesis in mice“ in geteilter Erstautorenschaft von Helga Manthey, Clément Cochain und Stefanie Barnsteiner veröffentlicht (PMID: 24114205)., The chemokine receptor CCR6 is expressed by various cell subsets implicated in atherogenesis, such as monocytes, Th17 and regulatory T cells. In order to further define the role of CCR6 in atherosclerosis, CCR6-deficient (Ccr6-/-) mice were crossed with low-density lipoprotein receptor-deficient (Ldlr-/-) mice to generate atherosclerosisprone mice deficient in CCR6. Compared to Ldlr-/- controls, atherosclerotic burden in the aortic sinus and aorta were reduced in Ccr6-/-Ldlr-/- mice fed a high fat diet, associated with a profound depression in lesional macrophage accumulation. Local and systemic distributions of T cells, including frequencies of Th1, Th17 and regulatory T cells were unaltered. In contrast, circulating counts of both Gr-1high and Gr-1low monocytes were reduced in Ccr6-/-Ldlr-/- mice. Moreover, CCR6 was revealed to promote monocyte adhesion to inflamed endothelium in vitro and leukocyte adhesion to carotid arteries in vivo. Finally, CCR6 selectively recruited monocytes but not T cells in an acute inflammatory air pouch model. We here show that CCR6 functions on multiple levels and regulates the mobilisation, adhesion and recruitment of monocytes/macrophages to the inflamed vessel, thereby promoting atherosclerosis, but is dispensable for hypercholesterolaemia-associated adaptive immune priming. Targeting CCR6 or its ligand CCL20 may therefore be a promising therapeutic strategy to alleviate atherosclerosis. The results of this doctoral thesis have been published in December 2013 in Thrombosis and Haematostasis in equal contribution by Helga Manthey, Clément Cochain and Stefanie Barnsteiner (PMID: 24114205).

Die Atherosklerose, welche mit ihren Folgen zu den Haupttodesursachen zählt, gilt als eine chronisch inflammatorische Erkrankung. Dendritische Zellen (DCs) sind zelluläre Bestandteile des Immunsystems und verbinden den angeborenen mit dem erworbenen Teil. Es ist vorbeschrieben, dass DCs vermehrt in für die Atherosklerose prädisponierten Stellen vorkommen. Ebenfalls sind in einer atherosklerotischen Plaque DCs nachweisbar. Die Bedeutung von Thrombozyten in der Atherosklerose ist schon länger bekannt. Es konnte gezeigt werden, dass die Interaktion zwischen Endothel und Thrombozyten für die Initiierung der Atherosklerose einen entscheidenden Faktor darstellt. Sie rekrutieren proatherosklerotische Zellen und sezernieren proinflammatorische Mediatoren. Auf der anderen Seite gibt es Hinweise, dass Thrombozyten auch Reparaturmechanismen initiieren können. Es wurde gezeigt, dass humane DCs mit Thrombozyten in vivo im Bereich einer Gefäßverletzung interagieren. DCs interagieren jedoch nicht mit der intakten Gefäßwand. In vitro vermitteln diese Interaktion unter anderem die Rezeptoren JAM-C und das Integrin Mac-1 auf DCs. Interessanterweise wird Jam-C nicht auf murinen Thrombozyten exprimiert, was auf einen alternativen Mechanismus hinweist, welcher noch nicht identifiziert wurde. Das thrombozytäre Glykoprotein GPIbα ist Teil des von-Willebrand-Rezeptor-Komplexes. Für verschiedene Leukozyten ist bekannt, dass Thrombozyt und Leukozyt eine feste Adhäsion über GPIbα und Mac-1 eingehen. So wurde in dieser Arbeit der Hypothese nachgegangen, dass DCs mit Thrombozyten über das Rezeptor-Ligandenpaar Mac-1 und GPIbα in der Atherosklerose interagieren. Hierfür wurde die mögliche Interaktion von murinen, aus Knochenmark gewonnenen DCs mit murinen Thrombozyten in statischen Adhäsionsassays in vitro, sowie mit Hilfe der Intravitalmikroskopie in vivo im Mausmodell untersucht. In vitro im statischen Adhäsionsassay zeigte sich eine Reduktion der Adhäsion von DCs an Thrombozyten nach Blockierung von Mac-1 durch einen spezifischen Antikörper, bei Blockierung anderer Oberflächenrezeptoren auf DCs war kein Unterschied nachweisbar. Ebenfalls nach Blockierung von GPIbα konnte eine signifikant verminderte Adhäsion von DCs an Thrombozyten in vitro gezeigt werden. Um diese Ergebnisse ins Lebende zu übertragen wurde die temporäre Carotisligatur mit Intravitalmikroskopie als in vivo-Modell einer Gefäßverletzung ausgewählt. Fluoreszierend markierte DCs und ein blockierender Antikörper wurden einer Maus injiziert. Die Arteria carotis wurde für 5 Minuten temporär ligiert. Hierbei kam es zu einer Quetschung des Endothels und somit zu einer Gefäßverletzung. Nach Wiedereröffnung des Gefäßes wurde die Anzahl der adhärierenden DCs an den Monolayer der Thrombozyten und somit an die Gefäßwand gemessen. Durch blockierende Antikörper, analog zu den in vitro Versuchen, konnte eine Reduktion der Adhäsion nach Blockierung von entweder Mac-1 auf DCs oder GPIbα auf Thrombozyten gezeigt werden. Ebenfalls mit GPIbα-knockout Thrombozyten zeigte sich in vitro, sowie in vivo eine Reduktion der Adhäsion von DCs an den Thrombozyten. Mittels des Anti-M2 Antikörpers konnte die Bindungsstelle in vitro, sowie in vivo mittels analogen Versuchen spezifiziert werden. Vorbekannt ist, dass die Sequenz P201-K217 der I-Domäne der αM-Einheit von Mac-1 für die Bindung von GPIbα in Neutrophilen Granulozyten zuständig ist. In dieser Arbeit konnte in vitro sowie in vivo eine signifikante Reduktion der Adhäsion von DCs auf Thrombozyten bei Blockierung der M2-Sequenz nachgewiesen werden. In Zusammenschau der Ergebnisse konnte gezeigt werden, dass die Interaktion des Integrins Mac-1 mit dem Glykoprotein GPIbα eine feste Adhäsion von DCs auf Thrombozyten vermittelt. Dies trägt dazu bei die Kinetik der DC-Gefäßwandinteraktion besser zu verstehen. Bereits bei anderen Leukozyten konnte dieses Rezeptor-Liganden-Paar gezeigt werden. Die Übertragung vom Tiermodell zum menschlichen Organismus, sowie die weitere Klärung der Folgen einer solchen Interaktion stellen die nächsten Schritte der Forschung dar. Bisher ist noch nicht aufgedeckt, ob diese Interaktion einen atheroprotektiven oder -progressiven Verlauf begünstigt. Nach Klärung dieser Effekte wäre ein therapeutisches Vorgehen mittels des spezifischen Antikörpers, welcher in dieser Arbeit verwendet wurde, ein mögliches pharmakologisches Mittel in der Bekämpfung der Atherosklerose.

Die vorliegende Arbeit soll zu einem besseren Verständnis des Einflusses des löslichen Proteins Jam-A auf die Funktion der Thrombozyten führen. Dazu wurden sowohl das natürlich vorkommende Jam-A D1/D2 als auch das künstlich geschaffene Protein mit nur einer Domäne, das Jam-A D1, untersucht. Es wurde im Vorfeld vermutet, dass sich Anhaltspunkte finden würden, die bestätigen, dass Jam-A die Entstehung und das Fortschreiten der Arteriosklerose steigern würde. Die vorliegenden Ergebnisse wurden mittels Aggregometrie, Durchflusszytometrie, Flusskammer, Lichtmikroskopie, Konfokalmikroskopie und Zellkultur gewonnen. Insgesamt ließ sich feststellen, dass das künstliche Jam-A D1 einen stärkeren Effekt als das natürlich vorkommende Jam-A D1/D2 zeigte. Die Aggregometrie ergab eine signifikante Steigerung der Thrombozytenaggregation in Kombination mit dem Agonisten ADP. Allein zeigte Jam-A keinen Effekt. Diese Ergebnisse bestätigten sich auch in der Flusskammer, wo sich in Kombination mit ADP wenige, aber sehr großflächige und voluminöse Thromben bildeten. Jam-A allein führte zu zahlreichen, winzigen, flachen Thromben. Die Thrombozytenadhäsion auf Endothelzellen nahm in Kombination mit ADP, aber auch in geringem Maße allein durch Jam-A, ebenfalls zu. Einen fördernden Einfluss zeigte Jam-A weiterhin auf die Monozyten-Makrophagen-Differenzierung. In Kombination mit TRAP steigerte Jam-A die Bildung von Thrombozyten-Monozyten-Aggregaten. Jam-A D1 verstärkte überdies die Aktivierung und Degranulation von Thrombozyten. Förderlich auf die Apoptose wirkte sich vor allem die Kombination von TRAP und Jam-A D1 aus. Jam-A löste eine vergleichbare Thrombozytenspreizung aus wie die Positivkontrolle Collagen. Zusammenfassend lässt sich feststellen, dass die Einzelergebnisse dafür sprechen, dass Jam-A die Entstehung und das Voranschreiten der Arteriosklerose unterstützt. Daher könnte es sinnvoll sein, in-vivo-Versuche anzuschließen, die die Übertragbarkeit auf den lebenden Organismus prüfen und gegebenenfalls die Wirksamkeit eines blockierenden Antikörpers gegen Jam-A zu überprüfen.

Die Atherosklerose wird heute zunehmend als inflammatorische Erkrankung betrachtet, bei der die Inflammation sowohl in der Anfangszeit bis hin zu möglichen Folgekomplikationen als eine Hauptursache gilt. Die Migration CD4- (cluster of differentiation 4-) positiver Lymphozyten in die Gefäßwand mit anschließender Aktivierung anderer Gefäßzellen stellt dabei einen wichtigen Schritt in der frühen Atherogenese dar. In verschiedenen experimentellen Untersuchungen konnte gezeigt werden, dass eine Verringerung der Rekrutierung CD4-positiver Lymphozyten die Entwicklung atherosklerotischer Läsionen und Plaques eindämmt. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde die Wirkung des Calciumantagonisten Amlodipin auf die SDF-1α (stromal cell derived factor-1) induzierte Migration humaner CD4-positiver Lymphozyten untersucht. Amlodipin ist ein Calciumkanalblocker vom Nifedipin-Typ und hemmt den Einstrom von Calcium-Ionen durch L-Typ-Calciumkanäle, die hauptsächlich in vaskulären glatten Muskelzellen vorkommen, was zu einer verringerten Kontraktilität dieser Muskelzellen und damit zu einer Vasodilatation führt. Es findet daher breite Anwendung in der Behandlung der Hypertonie. Neben der blutdrucksenkenden Funktion wurden aber auch eine entzündungshemmende Wirkung bei der Atherosklerose und eine Verringerung der Größe atherosklerotischer Läsionen durch die Gabe von Amlodipin nachgewiesen. Der Einfluss von Amlodipin auf das Migrationsverhalten CD4-positiver Lymphozyten wurde durch Migrationsversuche in einer so genannten Boyden-Kammer untersucht. Hierbei konnte nachgewiesen werden, dass Amlodipin die SDF-1α induzierte Migration der Lymphozyten hemmt. Mit steigender Zugabe von Amlodipin nahm das Migrationsverhalten der Lymphozyten ab und erreichte seinen Tiefpunkt bei einer Amlodipinkonzentration von 10 µM. Die Vitalität der Lymphozyten blieb bei den Versuchen unbeeinflusst. Mit Hilfe eines PI3- (Phosphatidylinositol-3-) Kinase-Assays konnte gezeigt werden, dass Amlodipin die PI3-Kinase in humanen CD4-positiven Lymphozyten inhibiert. Dafür wurden humane CD4-positive Lymphozyten mit steigenden Amlodipinkonzentrationen und mit dem chemotaktisch wirkenden Zytokin SDF-1α versetzt. SDF-1α steuert die Zellmigration und spielt unter anderem eine Schlüsselrolle bei der Progression von Entzündungsprozessen im Körper. Es konnte nachgewiesen werden, dass die PI3-Kinase-Aktivität mit ansteigender Amlodipinkonzentration stetig abnahm und ihr Minimum bei einer Amlodipinkonzentration von 5 bis 10 µM hatte. Mittels Western Blot Versuchen wurde die konzentrationsabhängige, inhibierende Wirkung von Amlodipin auf die SDF-1α induzierte Aktivierung von p-ERK (phospho-extracellular signal-regulated Kinase), p-AKT (phospho-aktivierte Proteinkinase B), p-MLC (phospho-Myosin light-chain) und p-SRC (sarcoma/proto-oncogenic tyrosine Kinase) in humanen CD4-positiven Lymphozyten nachgewiesen. Es wurde festgestellt, dass die Aktivierung mit steigender Amlodipinkonzentration kontinuierlich abnahm und ihren maximalen Effekt bei 10 µM Amlodipin erreicht hatte. Bei einer Konzentration von 10 µM kam es also zu einer signifikanten Inhibierung der Phosphorylierung von ERK, AKT, MLC bzw. SRC gegenüber SDF-1α stimulierten CD4-positiven Lymphozyten. Bei nicht mit SDF-1α stimulierten CD4-positiven Lymphozyten, die zusätzlich mit 10 µM Amlodipin versetzt wurden, zeigte sich kein Effekt auf die basale Aktivierung. Im Rahmen dieser Dissertation konnte der hemmende Effekt von Amlodipin auf die SDF-1α induzierte Migration humaner CD4-positiver Lymphozyten in vitro nachgewiesen werden. Dieser Effekt sollte nun auch in vivo in Tiermodellen, wie auch klinisch in weiteren Studien untersucht werden.

Die Hypoxie-induzierbaren Faktoren sind essenzielle Transkriptionsfaktoren bei der zellulären und systemischen Anpassung an Sauerstoffmangel. Unter Hypoxie induzieren sie die Expression tausender Zielgene, von denen eine Gruppe an der Anpassung des Metabolismus an eine reduzierte Verfügbarkeit von Sauerstoff beteiligt ist. Ein direktes Hif-Zielgen ist auch das Hypoxie-induzierbare Protein Hig2/Hilpda, welches als ubiquitär exprimiertes, Hypoxie-induzierbares Lipidtropfenprotein identifiziert wurde. Hilpda wurde in humanen atherosklerotischen Plaques detektiert. Inwieweit Hilpda zur hypoxischen Lipidakkumulation in atherosklerotischen Schaumzellen beiträgt, war noch nicht bekannt. In der vorliegenden Arbeit wurden daher die Regulation und die funktionelle Rolle von Hilpda in primären murinen Wildtyp und hilpda-defizienten Knochenmarksmakrophagen und in einem Mausmodell für Atherosklerose mit konditioneller hilpda-Deletion genauer untersucht. Wir konnten zeigen, dass Hilpda in murinen Makrophagen ein Hif-1- und ein Ppar-Zielgen ist. Hilpda war notwendig für die Speicherung von Triglyceriden, Cholesterinestern und oxLDL in Lipidtropfen. In hilpda-defizienten Makrophagen war eine Lipidtropfenbildung nicht möglich. Hilpda cKO Makrophagen waren weniger resistent gegenüber Stress durch Fettsäure-Überladung. Des Weiteren war Hilpda notwendig für eine kontrollierte und induzierbare Produktion von PGE2. Untersuchungen am Apolipoprotein E-defizienten Mausmodell für Atherosklerose mit tie2-Cre gesteuerter hilpda-Deletion zeigten, dass die durch Hilpda induzierte Lipidakkumulation zur Bildung von Schaumzellen und zur Entstehung der Atherosklerose beiträgt, die Serum-Lipidkonzentrationen aber nicht beeinflusst. Hilpda kolokalisierte mit Cox-2 in murinen und humanen Plaques, was auf eine Rolle bei der PGE2-Produktion hinweist. (Immun ) histochemische Analysen zeigten weniger Makrophagen und vermehrt untransformierte Gefäßmuskelzellen in Plaques Hilpda-defizienter Mäuse. In Expressionsanalysen von großen Arterien fettgefütterter Mäuse war die, fabp4, mpges-1 und vegf mRNA Expression in apoE-/- hilpda tie2-Cre Knockout Mäusen erniedrigt. Hilpda ist also essenziell für verschiedene Arten der Lipidspeicherung in Makrophagen und schützt diese vor Membranschäden durch Fettsäure-Überladung. Bei Atherosklerose ist Hilpda an der Entstehung von Schaumzellen und der Produktion von PGE2 beteiligt und trägt dadurch zur Atherogenese und wahrscheinlich zur Progression der Atherosklerose bei. Hypoxia-inducible factors are essential transcription factors in the cellular and systemic adaption to oxygen deficiency. Under hypoxia they induce the expression of thousands of target genes, among them a group of ubiquitously expressed genes responsible for the metabolic adaption to reduced oxygen availability. One of the direct Hif target genes is hypoxia-inducible protein Hig2/Hilpda which was identified as a ubiquitously expressed hypoxia-inducible lipid droplet protein. Hilpda was detected in human atherosclerotic plaques. However, it was unknown whether Hilpda plays a role in hypoxic lipid accumulation in atherosclerotic foam cells. In the present study we therefore further analyzed the regulation and functional role of Hilpda in primary murine wild type and hilpda deficient bone marrow-derived macrophages and in an atherosclerotic mouse model with conditional hilpda deletion. We could show that Hilpda is a direct Hif-1 and Ppar target gene. Hilpda was essential for the storage of triglycerides, cholesterylesters and oxLDL in lipid droplets. Hilpda-deficient macrophages were not able to form lipid droplets and were less resistant to stress by fatty acid overload. Moreover, Hilpda was essential for a controlled and inducible PGE2 production. Analysis of the atherosclerotic mouse model (apoE-/-) with tie2-Cre mediated hilpda deletion showed that Hilpda-induced lipid accumulation is involved in foam cell formation and development of atherosclerosis, but does not alter serum-lipid concentrations. Hilpda co-localized with Cox-2 in murine and human plaques, indicating a role in PGE2 production. (Immuno-)histochemical analyses showed less macrophages and increased numbers of untransformed smooth muscle cells in plaques of Hilpda-deficient mice. Expression analyses of large arteries of high-fat diet-fed mice showed decreased expression of fabp4, mpges-1 and vegf mRNA in apoE / hilpda tie2-Cre knockout mice. Thus, the hypoxia-inducible lipid droplet protein Hilpda is crucial to different forms of lipid accumulation in macrophages and protects from membrane damage through fatty acid overload. In atherosclerosis Hilpda is involved in formation of foam cells and PGE2 production and therefore promotes lesion formation and probably progression of atherosclerosis.

BACKGROUND: The German Lipoprotein Apheresis Registry (DLAR) has been initiated by members of the Nephrology Foundation (WiNe), the German association of kidney centres (DN), the German society of nephrology (DGfN) and additional medical associations taking part in the apheresis working group. Its goal is the introduction of a substantial database, suitable to provide statistical evidence for the assessment of extracorporeal procedures. Data have been added to the DLAR since October 2011. In this article, preliminary results are first reported. METHODS AND RESULTS: Data are stored on a secured Internet platform. The recorded information comprises mean values and rates of change in lipid levels (cholesterol, triglyceride, low-density lipoprotein cholesterol (LDL-C), high-density lipoprotein cholesterol, lipoprotein(a) (Lp(a)) before and after apheresis therapy, blood/plasma volume, frequency and type of adverse effects, medication, vascular events, diagnoses and comorbidity. It is collected by participating apheresis centres from all over Germany. Up until October 2014, a total of 7946 lipoprotein apheresis (LA) treatments of 991 patients (787 with documented LDL-C and 688 with documented Lp(a) levels) via 96 medical accounts were documented and analysed. The current share of Lp(a) patients is 50.6 % (Lp(a) ≥ 60 mg/dl; n = 348/688). For both LDL-C and Lp(a), lowering rates exceeding 60 % have been observed. Likely in conjunction with these reduction rates, the preliminary analysis shows a 90 % decline in major adverse coronary events (MACE) as well as a decrease in major adverse non-coronary events (MANCE) by 69 %. As before, good tolerability and low rates of adverse effects (

Although the advent of drug-eluting stents has reduced the rates of target vessel revascularization, there are observations of ongoing stent failure occurring very late after stent implantation and presenting as very late restenosis or as very late stent thrombosis. The de novo development of atherosclerosis within the neointimal region, called neoatherosclerosis, has been identified as one of the pathomechanisms of these observed late stent failures. The mechanisms of neoatherosclerosis development and its association with stent failure are currently the subject of intensive research. Optical coherence tomography (OCT) is an invasive imaging modality that allows us to visualize the micromorphology of coronary arteries with near-histological resolution, thus providing detailed assessment of the morphological characteristics of the neointima after stent implantation, including neoatherosclerosis. Several OCT studies have tried to provide in vivo insights in the mechanisms of neoatherosclerosis development and its association with late stent failure. This review summarizes the current insights into neoatherosclerosis obtained with OCT and discusses the association of neoatherosclerosis with late stent failure.

Summary Cholesterol is an essential lipid for mammalian cells and its homeostasis is tightly regulated. Disturbance of cellular cholesterol homeostasis is linked to atherosclerosis and cardiovascular diseases. A central role in the sensing and regulation of cholesterol homeostasis is attributed to the endoplasmic reticulum (ER). This organelle harbours inactive transcription factors, which sense ER cholesterol levels and initiate transcriptional responses after activation and translocation into the nucleus. Thereupon, these responses enable adaption to high or low cellular cholesterol levels. Besides the abovementioned canonical functions, ER stress—induced by metabolic burden—and the resulting unfolded protein response influence cholesterol metabolism relevant to metabolic disorders. This review summarizes basic as well as recent knowledge on the role of the ER in terms of regulation of cholesterol metabolism.

Telmisartan inhibiert die Proliferation von humanen glatten Gefäßmuskelzellen als Therapie der arteriellen Hypertonie und Atherosklerose im Rahmen der Koronaren Herzkrankheit

Die epidemiologischen und klinischen Gemeinsamkeiten zwischen den beiden Volkskrankheiten Osteoporose und Atherosklerose deuten auf einen gemeinsamen pathophysiologischen Zusammenhang. Das erhöhte kardiovaskuläre Mortalitätsrisiko bei Patienten mit osteoporotischen Knochenbrüchen, die assoziierte Dynamik der Krankheitsverläufe von Osteoporose und Atherosklerose und gemeinsame Risikofaktoren belegen diesen Zusammenhang im klinischen Alltag. Auch Gene und Genprodukte, die bei der Knochenbildung wichtige Funktionen haben, sind in atherosklerotischen Plaques mit entsprechender Hartgewebsbildung ebenso nachweisbar wie im Knochengewebe. Eine physiologische biomechanische Beanspruchung ist wesentlich für einen ausgeglichenen Knochenstoffwechsel und spielt auch in der Gefäßwandbiologie eine wichtige Rolle. Es gibt zahlreiche Hinweise, dass das OPG-RANK-RANKL-System durch die biomechanische Beanspruchung mesenchymaler Gewebe reguliert und dadurch möglicherweise die Hartgewebsbildung im Knochengewebe und in der Gefäßwand beeinflusst wird. Die vorliegenden Beobachtungen belegen eine gemeinsame pathophysiologische Endstrecke der beiden Erkrankungen Osteoporose und Atherosklerose. Die Ursachen für die parallele Entmineralisierung des Knochengewebes bei der Osteoporose und für die atherosklerotische Gefäßwandveränderung bleiben jedoch unklar.

Schwefelwasserstoff (H2S) ist ein gasförmiger Transmitter mit antiatherogener Wirkung. Die Cystathionin-γ-Lyase (CSE) ist hauptverantwortlich für die Produktion von H2S im kardiovaskulären System. In Nagetierarterien ist eine reflektorisch vermehrte Expression der CSE bei Atherosklerose vorbeschrieben. Diese Arbeit untersuchte immunhistochemisch die Expression der CSE in den Arteriae carotides und renales von Schweinen mit einem homozygoten Defekt des LDL-Rezeptors (low density lipoprotein receptor). Von diesen Tieren war bekannt, dass sie mit hoher Wahrscheinlichkeit unter einer cholesterinreichen Diät eine Atherosklerose entwickeln. Ebenso wurde untersucht welchen Einfluss eine Ischämie/Reperfusion der Nieren auf die Expression der CSE hat. Bei den Tieren mit LDL-Rezeptordefekt fanden sich nach 18-wöchiger atherogener Diät eine erhöhte Cholesterol-Plasmakonzentration, Zeichen von oxidativem Stress sowie verminderte Plasmakonzentrationen von Nitrit und Nitrat als reduzierte Formen von Stickstoffmonoxid. Die Tiere zeigten somit das Bild wie bei einer endothelialen Dysfunktion als zentralen Schritt bei der Pathogenese einer Atherosklerose. Histologisch nachweisbare Atherome hatten sich in den untersuchten Arteriae carotides und renales nicht manifestiert. Die immunhistochemische Darstellung der CSE zeigte eine Expression überwiegend in der Tunica media, dezenter auch in der Tunica intima der untersuchten Arteriae carotides und renales. Es lagen keine Unterschiede in der Expressionsstärke oder -verteilung der CSE zwischen den Tieren mit LDL-Rezeptordefekt und der Kontrollgruppe vor. Nach Ischämie/Reperfusion der Nieren kam es zu keiner veränderten Expression der CSE in den untersuchten Arterien.

In der vorliegenden Arbeit wurde die Thrombozyten-induzierte Apoptose, ausgelöst durch Koinkubation von verschiedenen Fas-positiven Zellen mit Thrombozyten, mittels Caspase-Assays, Annexin-PI- und TUNEL-Stainings untersucht. Erkenntnisse dieser Arbeit sind, dass Thrombozyten die Fähigkeit besitzen, in bestimmten Fas-positiven Zellen Apoptose auszulösen. Zudem beeinflussen ASS und NPlate Thrombozyten in Bezug auf ihre Fähigkeit, Apoptose zu induzieren, deutlich. Besonders relevant erscheint dabei, dass die Vorbehandlung der Thrombozyten mit ASS zu einer signifikant höheren Apoptoserate der Zellen führt. Thrombozyten sind multifunktional und neben ihrer wichtigsten Aufgabe, der Hämostase, an vielen anderen physiologischen und pathophysiologischen Prozessen beteiligt 9. So spielen sie unter anderem auch eine Rolle bei der Gewebereparatur11, der Immunabwehr12 und der Entstehung von Inflammation und Atherosklerose. Der genaue Mechanismus ist Gegenstand der aktuellen Forschung8, 13. Ob und wie Thrombozyten auf andere Zellen einwirken, hängt letztendlich von den Umgebungsbedingungen, dem Zelltyp und dessen Oberflächenrezeptoren ab48. Thrombotische Prozesse und Entzündungsreaktionen besitzen teilweise gleiche molekulare Schlüsselmechanismen49, die Thrombozyten-induzierte Apoptose könnte einer davon sein. Es ist daher denkbar, dass die Befunde dieser Arbeit eine entscheidende Rolle im Funktionsbereich der Thrombozyten spielen. Um diese Beobachtungen besser einordnen zu können, sind weiterführende Untersuchungen der Wechselwirkungen zwischen Thrombozyten und möglichen Zielzellen nötig. Besonders im Hinblick auf neue therapeutische Möglichkeiten ist ein besseres Verständnis dieser Mechanismen unabdingbar.

Atherosklerose ist ein wichtiger Faktor bezüglich der Pathogenese kardiovaskulärer Erkrankungen, indem sie Einfluss auf die strukturellen und funktionellen Eigenschaften der Gefäße nimmt. Wegen dieser Bedeutung ist es wichtig, diese Erkrankung und deren Zusammenhänge genau zu erforschen. Einige Studien konnten zeigen, dass die Pulswellengeschwindigkeit mit Gefäßwand-eigenschaften, insbesondere deren Steifigkeit, zusammenhängt. So konnte in Untersuchungen von Gotschy et al.27 eine Zunahme der lokalen Pulswellen-geschwindigkeit, als Marker für Gefäßwandsteifigkeit, in Aortenanteilen von ApoE(-/-)-Mäusen im Zeitverlauf mittels MRT gezeigt werden, ohne dass makroskopische Veränderungen in frühen Stufen atherosklerotischer Entwicklung sichtbar waren. Dies wird nun als Ausgangspunkt herangezogen, um zu erforschen, durch welche histologischen Veränderungen des Gefäßes innerhalb der Atherogenese eine frühe Zunahme der lokalen PWV erklärt werden kann. Hierzu wird zum einen die mit der Gefäßwandsteifigkeit in Zusammenhang gebrachte Elastinfragmentierung innerhalb der elastischen Laminae der Aorta ascendens und abdominalis mittels histologischer Untersuchung quantitativ bestimmt. Die elastischen Schichten werden durch modifizierte Elastika-van-Gieson-Färbung dargestellt. Zur vergleichenden Bestimmung wird ein Quotient aus der Anzahl bei mikroskopischer Betrachtung erkennbarer Brüche der elastischen Laminae und bestimmter Gefäßwandquerschnittsfläche erstellt. Die Ausprägung der Elastinfragmentierung unterscheidet sich signifikant in den zwei höchsten Altersklassen der Test- und Kontrollmäuse in beiden untersuchten Aortenabschnitten, wobei die ApoE(-/-)-Tiere stets den höheren Wert aufweisen. Anhand der Ähnlichkeit hinsichtlich der Entwicklung der Messwerte von beschriebener lokalen PWV und der hier gezeigten Elastinfragmentierung kann vermutet werden, dass diese zu einer Erhöhung der Gefäßwandsteifigkeit beiträgt. Die gezeigten histologischen Parameter können so als Indikator für Veränderungen der Gefäßeigenschaften während der Atherogenese und als möglicher Grund einer Veränderung der Gefäßwandsteifigkeit mit konsekutiver Erhöhung der lokalen PWV angesehen werden. Als weiterer Einflussfaktor auf die mechanischen Eigenschaften des Blutgefäßsystems wird die Entwicklung des Kollagengehaltes anteilig an der Aortenwand bestimmt. Es wurde in vielen Publikationen beschrieben, welchen großen Stellenwert Kollagenfasern für die Gefäßwandsteifigkeit haben. Auch wird das untersuchte Kollagen hinsichtlich seiner Faserdicken nochmals genauer untersucht. Die Kollagenfasern werden mittels Pikro-Sirius-Rot gefärbt und anschließend unter zirkulär polarisiertem Licht analysiert. Die erhaltenen Ergebnisse zeigen keinen eindeutigen Trend hinsichtlich ihrer Entwicklung. Sie lassen sich auch nicht mit der aufgestellten Hypothese in Übereinkunft bringen, da keine zeitliche Dynamik verglichen mit der Entwicklung der anderen Parameter nachgewiesen werden kann. Um den beschriebenen entzündlichen Charakter der Atherogenese ebenso zu berücksichtigen, wird das Einwanderungsverhalten von Makrophagen in die Gefäßwand betrachtet. Es wird die relative Fläche der durch Makrophagen besiedelten Gefäßwandanteile bestimmt und als Indikator einer Entzündungsreaktion angesehen, welche direkt oder indirekt Einfluss auf Gefäßwandeigenschaften haben könnte. Mittels eines Antikörpers gegen das makrophagenspezifische Protein CD68 und Kombination mit anti-antikörpervermittelt bindenden fluoreszierenden Substanzen, werden Makrophagen in einem Fluoreszenzmikroskop sichtbar gemacht und die besiedelte Fläche softwaregestützt bestimmt. Dabei kommt die vorliegende Untersuchung zu dem Ergebnis, dass sich die Makrophagenbesiedelung in beiden betrachteten Aortenabschnitten deutlich im Zeitverlauf bei den ApoE(-/-)-Tieren erhöht. Der relative Gefäßwandanteil der von Makrophagen besiedelten Flächen erreicht seinen höchsten Wert innerhalb der Aorta ascendens bei 18 Wochen alten ApoE(-/-)-Tieren; in der Aorta abdominalis bei 30 Wochen alten. Die absolute CD68-Fläche in beiden Aortenabschnitten steigt bis zum Versuchsende hin an, wobei der stärkste Anstieg in der Zeit von sechs zu 18 Wochen geschieht. Dagegen zeigt die Kontrollgruppe eine sehr geringe Zunahme dieser beiden Messgrößen, wobei diese stets auf einem sehr niedrigen Niveau bleiben und keineswegs mit der Entwicklung der Testtiere zu vergleichen sind. Besonders zu beachten ist, das bereits in der jüngsten Altersstufe von sechs Wochen ein höheres Maß an Makrophagenbesiedelung bei Aortenanteilen der ApoE(-/-)-Tiere zu verzeichnen ist, als bei den entsprechenden Kontrollen. Auf Grund dieser Beobachtung, lässt sich ein möglicher Zusammenhang mit der schon früh ansteigenden Gefäßsteifigkeit vor sichtbarer Plaqueentwicklung herstellen. Bei der Klärung der zentralen Fragestellung dieser Arbeit nach einem histomorphologischen Korrelat für die frühzeitige Erhöhung der lokalen PWV zeigt sich folgendes Ergebnis: Insgesamt können die gemessenen histologischen Charakteristika, vor allem die Entwicklung der Elastinfragmentierung innerhalb der Gefäßwand und der Grad der Makrophagenbesiedelung, frühe Indikatoren für Veränderungen morphologischer und funktioneller Gefäßwandspezifikationen sein. Sie kommen daher als denkbare Ursache für den Anstieg der lokalen Pulswellengeschwindigkeit in Betracht, besonders da die zuvor erwähnten histologischen Parameter zeitlich wie diese einen ähnlichen Verlauf hinsichtlich ihrer Entwicklung zeigen. Die Atherogenese und deren zahlreiche Einflussfaktoren bleiben weiterhin Forschungs-gegenstand und es gilt mehr denn je mögliche Mechanismen aufzudecken, um eine Gefäßwandschädigung frühzeitig und effektiv verhindern zu können. Hiervon würde ein Großteil der Bevölkerung profitieren, da die Atherosklerose durch ihre Folgeerkrankungen nach wie vor, nicht nur in Deutschland, die Todesursachenstatistik anführt., Atherosclerosis is the most important and prevalently appearing pathological change of arteries with influence on their structural and functional attributes. The great relevance of that disease motivates to research this relation precisely. The purpose of this study was to determine the influence of elastin fiber fragmentation, the collagen components and the inflammation in the aortic vessel wall on the aortic stiffness and the local pulse wave velocity (PWV) in the ApoE-/- mouse model. Therefore the histological fractures of elastic filaments, the inflammation (characterized by vessel wall Infiltration with macrophages) and the relative amount of collagen in the vessel wall were analyzed in a quantitative way and correlated with the characteristic of local PWV during aging and progressive therosclerosis. In the previous measurements of local PWV with MRI scan was an increase of the PWV detectable before a morphological correlate could be seen. We found a correlation between elastin fiber fragmentation, inflammation of the vessel wall and the local PWV.

In der vorliegenden Arbeit wurden alle Methoden etabliert, um Peroxisomen in Makrophagen zu untersuchen. Die Aktivierung der Makrophagen wurde durch Inkubation mit LPS bzw. mit oxLDL ausgelöst. Darüber hinaus wurden LPS-induzierte Effekte in Makrophagen mit defekten Peroxisomen untersucht. Die Etablierung eines optimalem Protokolls zur subzellularen Fraktionierung und Isolierung einer angereicherten Peroxisomenfraktion mit Hilfe von differentieller Zentrifugation erbrachte, dass Einfrieren der Zellproben bessere Ergebnisse bei der Homogenisierung lieferte und notwendig war, um eine ideale Anreicherung der Peroxisomen zu erzielen. Nur durch die Verwendung der angereicherten Peroxisomenfraktion konnten auch peroxisomale Enzyme analysiert werden, die nur in geringer Menge exprimiert werden, wie z.B. die peroxisomale Thiolase. Während der Etablierung eines optimalen Protokolls zur Langzeitinkubation der Makrophagen mit LPS zeigte sich, dass die Zugabe von Serum ins Inkubationsmedium essentiell notwendig war, um das Überleben der Zellen zu sichern. Des weiteren beeinträchtigte die Verwendung von serumfreiem Medium, wie sie in der Literatur angegeben wird, die Peroxisomenaktivität. RT-PCR und Western Blot-Analysen sowie Immunofluoreszenz-Studien erbrachten tiefgreifende Veränderungen des peroxisomalen Kompartments nach LPS Behandlung. Nach 24 h wurde die Genexpression von beta-Oxidationsenzymen, der H2O2 abbauende Katalase und des peroxisomalen Biogeneseproteins PEX11alpha drastisch reduziert. Dagegen war die Expression des PEX13 Gens kaum und die des PEX14 nicht beeinflusst. Da die LPS Behandlung PEX14 nicht beeinträchtigte, wurde ein Antikörper gegen Pex14p als idealer Marker zum Nachweis der Peroxisomen nach LPS-Behandlung verwendet. Versuche - basierend auf Immunofluoreszenzfärbungen von peroxisomalen Proteinen zum Nachweis des Organells - ergaben, dass sich die Peroxisomenanzahl nach Langzeitbehandlung mit LPS (>=48 h) signifikant vermehrte. Zudem ging der Peroxisomenproliferation ein Anstieg der Pex11alpha-Genexpression voraus und die Proteinspiegel von peroxisomalen beta-Oxidationsenzymen und Katalase wurden weitgehend wiederhergestellt. Diese Ergebnisse weisen auf eine Rolle des peroxisomalen Metabolismus in der Auflösung inflammatorischer Prozesse in Makrophagen hin. Weiterführend wurden die zugrunde liegenden Signalwege untersucht. Verwendet wurden spezifische Inhibitoren gegen TLR-4, NFkappaB sowie TNF-R. Die Ergebnisse zeigten, dass die peroxisomale Reaktion auf die LPS-Behandlung durch den TLR-4/NFkappaB Signalweg sowie durch TNF-R, insbesondere in frühen Zeitpunkten, vermittelt wurden. Die Behandlung von Makrohagen mit oxidiertem LDL (oxLDL) zeigte entgegengesetzte Effekte wie die LPS-Behandlung. Eine Western Blot-Analyse erbrachte erhöhte Proteinmengen an Katalase sowie Thiolase. Dies könnte ein Hinweis darauf sein, dass das peroxisomale Kompartment in Makrophagen während der Beseitigung von intimalem oxLDL aktiviert wird. Damit könnte der Schutz von Makrophagen vor Lipotoxizität und oxidativen Stress verbunden sein, um die Schaumzellbildung zu verhindern. Zuletzt konzentrierten sich die Versuche auf den Einfluss einer peroxisomalen Dysfunktion auf die LPS indizierte Makrophagenaktivierung. Dazu wurden Makrophagen aus PEX11alpha KO Mäusen isoliert, da sich gezeigt hatte, dass die PEX11alpha -Expression stark von der LPS-Behandlung beinflusst wird. Tatsächlich wurden in PEX11alpha KO Makrophagen ein erhöhter Zelltod und die Aktivierung von Caspase-3 beobachtet, verbunden mit einer erhöhten Bad mRNA-Expression in KO-Makrophagen, was darauf hindeutet, dass der intrisiche mitochondriale Apoptoseweg vermehrt induziert ist. Des Weiteren traten geschlechtsspezifische Unterschiede in der Reaktion auf LPS-Behandlung auf, was sich durch eine stärkeren Expression pro-inflammatorischer Marker in Makrophagen von weiblichen PEX11alpha KO Mäusen äußerte. Zusammenfassend lässt sich feststellen, dass Peroxisomen in Makrophagen wichtige Funktionen während der Aktivierung von Makrophagen durch verschiedene Stimuli wahrnehmen. Wie durch Versuche an PEX11alpha -KO-Mäusen gezeigt wurde, verändert die peroxisomale Dysfunktion die Expression pro-inflammatorischer Marker und könnte zur Verlängerung oder zur Chronifizierung inflammatorischer Prozesse führen. Daher erfüllt der peroxisomale Metabolismus wichtige Funktionen im Schutz von Makrophagen vor frühzeitigem Zelltod während ihrer Aktivierung und der Pathogenabwehr. Der hier beobachtete Effekt könnte Teil eines generellen Schutzmechanismus in Makrophagen sein. Daher ist es wahrscheinlich, dass Peroxisomen ebenfalls bei chronischen Entzündungskrankheiten wie Leberzirrhose, neurodegenerativer Erkrankungen, z.B. Alzheier, oder Atherosklerose, eine Rolle spielen. Macrophages are, as part of the innate immune system, at the first line of defense against invading pathogens and intrinsic inflammatory factors. Although it is known that macrophages contain peroxisomes which fulfill important functions in cell metabolism, e.g. ROS degradation or lipid metabolism, before the beginning of this thesis, nothing was known about the role of peroxisomes in macrophages. In this thesis, all methods available were established to study peroxisomes in macrophages. Pro-inflammatory reactions were induced by LPS or oxidized LDL. Moreover, LPS-mediated effects on macrophages were characterized under conditions of peroxisomal dysfunction. Establishment of an optimal protocol for subcellular fractionation by differential centrifugation for the isolation of enriched peroxisomal fractions revealed that freezing of the macrophage cell samples was beneficial for the homogenization procedure and necessary for the best peroxisome recovery. Only these enriched peroxisome fractions enable the study of less abundant peroxisomal metabolic proteins, such as the peroxisomal thiolase. Moreover, during the establishment of an optimal protocol for long term LPS treatment, it was noted, that serum addition to the incubation medium was essential for macrophage long-term survival. Serum-free incubation, as generally used in the literature, exerted negative effects on cell survival and the peroxisomal compartment. After LPS treatment, RT-PCR and Western blot analyses as well as immunoflourescence studies with antibodies against POL proteins revealed tremendous changes in the peroxisomal compartment and related genes. Up to 24 h beta-oxidation enzymes, the H2O2 degrading catalase as well as the peroxisomal biogenesis protein PEX11alpha were strongly reduced. In contrast, the PEX13 gene was hardly influenced and PEX14 not altered at all. Since Pex14p was not changed, an antibody against this protein was used as an ideal marker to identify peroxisomes after LPS treatment. Immunofluorescence-based studies on peroxisome morphology revealed a significant increase in numerical abundance of peroxisomes after long-term LPS incubation (> 48 h). Moreover, increased PEX11alpha induction preceded the peroxisomal proliferation and the protein levels of catalase as well as beta-oxidation enzymes were almost reconstituted at late incubation times. This suggests an important role of peroxisomal metabolism in the resolution of inflammatory processes in macrophages. Furthermore, the underlying signaling pathway was investigated with specific inhibitors against TLR-4, NFkappaB and TNF-R1/2. The results revealed that the peroxisomal response was mediated by the TLR-4/NFkappaB pathway, as well as the TNF-R pathway in the early phase of LPS-treatment. Incubation of macrophages with oxidized LDL (oxLDL) induced opposite effects on the peroxisomal compartment of macrophages, increasing protein levels of catalase and thiolase. This suggests that the peroxisomal compartment in macrophages is activated during clearing of oxidized lipids and would lead to cell protection against oxLDL-mediated lipotoxicity and oxidative stress, possibly preventing or retarding foam cell formation during the development of atherosclerosis. Finally, experiments focused on LPS-induced effects under peroxisomal dysfunction conditions in primary macrophages of Pex11alpha knockout mice, since this gene was severely affected in distinct phases of LPS-treatment. Indeed increased macrophage cell death and activation of caspase-3 was observed, accompanied by increase of Bad mRNA expression, suggesting an activation of the intrinsic mitochondrial apoptosis pathway. Moreover, sex-specific differences in expression of pro-inflammatory marker genes were noted under steady-state conditions as well as under LPS-stimulation, revealing a stronger reaction of macrophages isolated from female mice. Taken together, the results of this thesis indicate that peroxisomes are abundant in macrophages and fulfill important metabolic tasks during macrophage activation by distinct pro-inflammatory stimuli. As shown in Pex11alpha gene KO experiments, peroxisomal dysfunction severely alters pro-inflammatory mediators and might lead to prolongation or chronification of inflammatory processes. In this respect, peroxisomal metabolic pathways play an important role for the protection of macrophages against cell death during activation and anti-pathogenic response and the resolution of inflammatory processes. Since the observed effects seemed to be part of a general defense mechanism in macrophages, it is likely, that peroxisomes play also a role in a variety of chronic inflammatory diseases, such as liver cirrhosis, neuro-degenerative diseases like Alzheimer’s disease or atherosclerosis.

Untersuchung zur Bedeutung einer PPARβ/δ Aktivierung auf die experimentelle Restenose anhand eines Kaninchen-Tiermodells und Untersuchung der PPARβ/δ Expression in humanem Atherektomie-Gewebe

Atherosclerosis is a chronic inflammatory process where pro-inflammatory cytokines and chemokines mediate the continuous recruitment of inflammatory cells and thereby increase lesion inflammation. The chronic inflammation in atherosclerosis damages the structural components of lesions, such as SMCs and collagen, by increasing degradation and apoptosis, which promotes lesion vulnerability to hemodynamic stress. Hence, treatment strategies to stabilize advanced rupture prone lesions should aim at decreasing the lesion inflammation and increasing the structural components, which would increase the biomechanical strength of the lesions. Treatment with ex vivo expanded SPCs induces stable lesions in mice model of atherosclerosis. Moreover, elevation in plasma CXCL12 level for short duration mobilizes SPCs from BM. Furthermore, LPA-mediated HIF-1alpha expression in injured carotid artery up-regulates CXCL12, which leads to recruitment of BM-derived SPCs to the lesion site via CXCR4. Recruited SPCs differentiate to SMCs and contributes to the neointimal growth. Therefore, the effect of CXCL12 treatment on stabilization of vulnerable lesions was studied. Application of CXCL12 transiently increased SPCs in the circulation by eliminating the physiological CXCL12 gradient between the BM and circulation. Repeated treatment with CXCL12 reduced the lesional macrophage content without affecting the lesion size. Moreover, FC thickness, and the lesional SMC and collagen-I content were also increased by CXCL12. The induction of a stable lesion phenotype by CXCL12 was due to increased recruitment of SPCs from the circulation, which differentiated specifically to lesional SMCs. Recruitment of SPCs was in part due to increased expression of CXCL12 in lesions after CXCL12 treatment presumably mediated by HIF-1alpha. Furthermore, CXCL12 treatment had no effect on inflammatory cell mobilization or recruitment. Of note, the stable lesion phenotype with increased SMCs, collagen and decreased macrophages was sustained even in the absence of further CXCL12 treatment, which subjected application of CXCL12 as a potential therapeutic approach for treating unstable lesions. To study the role of endothelial HIF-1a in atherosclerosis, Apoe-/- mice with an EC specific deletion of Hif1a were studied. Endothelial deletion of HIF-1alpha reduced the lesion size and lesional macrophage content in aortas in diet-atherosclerosis and in disturbed flow induced atherosclerosis in the carotid artery. Interestingly no effect on lesional SMCs and collagen-I was observed, which suggests that endothelial HIF-1alpha is involved primarily in monocyte recruitment to the lesion site. Moreover, HIF-1alpha was up-regulated in ECs by the pro-atherogenic factors moxLDL, unsaturated LPA, and AT-2. Furthermore, stimulation of ECs with moxLDL and LPA20:4 increased transcription and translation of CXCL1 in an HIF- 1alpha- and LPA receptor-dependent manner. Silencing of HIF-1alpha reduced monocyte adhesion to moxLDL- and LPA20:4-stimulated ECs. Thus, these findings suggest that endothelial HIF-1alpha participates in the early recruitment of monocytes by augmenting monocyte adhesion to the endothelium via increased synthesis of CXCL1 and thus drives the inflammatory response in atherosclerosis.

Erkrankungen des Herz-Kreislauf-Systems stellen heutzutage die häufigste Todesursache in Industrieländern dar. Hierbei wird der Atherosklerose mit ihren Folgeerkrankungen wie Hirninfarkt oder Myokardinfarkt eine wichtige Rolle zugeschrieben. Neben den klassischen Risikofaktoren hierfür wird in den vergangenen Jahren immer häufiger auch der oxidative Stress hiermit in Verbindung gebracht. Studien und Experimente haben gezeigt, dass Patienten mit bekannten atherosklerotischen Gefäßwandveränderungen eine erniedrigte Aktivität der antioxidativen Enzyme GPx-1, GR und SOD aufweisen. Bislang ist allerdings nicht gänzlich geklärt, inwieweit sich oxidativer Stress auf die arteriellen Gefäße auswirken kann. Das Ziel dieser Arbeit ist es daher, die Evidenz der antioxidativen Enzymaktivitäten der GPx-1, GR und SOD als potentielle prädiktive Risikomarker bei einem jungen, gesunden Probandenkollektiv zu prüfen. Weiterhin gilt das Interesse dieser Arbeit, weitere Parameter wie der PTP-1B und des Selens, für die ein Zusammenhang mit der Aktivität des antioxidativen Defenssystem des menschlichen Organismus beschrieben ist, auf diese Wirkung zu überprüfen. Zur Quantifizierung der frühen atherosklerotischen Gefäßwandveränderungen wurde die IMT der A. carotis communis gewählt, für die in früheren Studien ein signifikanter Zusammenhang mit dem Risiko für Atherosklerose gezeigt werden konnte. Für die Aktivitäten der GPx-1, GR und SOD und für Selen fanden sich keine signifikanten Korrelationen mit der IMT. Es konnte allerdings ein signifikanter inverser Zusammenhang für die PTP-1B-Aktivität mit der IMT festgestellt werden. Bisher wurde der PTP-1B eine wichtige Rolle in der Entstehung des Diabetes mellitus zugesprochen, was widersprüchlich zu unseren Ergebnissen erscheint. Es sind daher weitere Untersuchungen der PTP-1B notwendig. Die Aktivitäten der GPx-1, GR und SOD sind zur prädiktiven Risikoeinschätzung für kardiovaskuläre Erkrankung bei jungen gesunden Menschen ohne kardiovaskuläre Risikofaktoren unseren Ergebnissen zufolge nicht geeignet. Diseases of the cardiovascular system nowadays represent the commonest cause of death in industrialized countries. Atheroscerosis causing stroke and myocardial infarction plays an important role at this. Besides the classic risk factors of atherosclerosis oxidative stress has been discussed as a further risk factor in the past few years. Research has shown a decreased activity of the antioxidative enzymes GPx-1, GR and SOD in patients suffering from atherosclerosis. However, until today the influence of oxidative stress on the arterial wall has not been completely understood. For this reason, the aim of this study is to examine whether the activities of GPx, GR and SOD are potential risk markers for atherosclerosis in a group of young, healthy men and women without traditional risk factors for atherosclerosis. Furthermore, selenium and the activity of PTP-1B, which are associated with the GPx, are investigated. To quantitate early atherosclerotic changes we chose intima-media-thickness (CCA-IMT) of the carotid artery. Univariate analysis showed no significant correlation between CCA-IMT and activities of GPx-1, GR, SOD and selenium. An inverse significant correlation between PTP-1B-activity and CCA-IMT (p=0,002) could be detected. Yet, increasing evidence support an important role of PTP-1B in insulin action and diabetes, which seems to be contradictory to our results and demands more investigations. The activities of GPx-1, GR and SOD are not suitable for predictive risk estimation of cardiovascular diseases in young, healthy men and women.

Erhitzte Fette entstehen während der thermischen Behandlung fetthaltiger Lebensmittel. Sie enthalten biologisch hochaktive Bestandteile, die natürliche Aktivatoren des Transkriptionsfaktors PPARalpha sind. PPARalpha ist maßgeblich an der Regulation der Fettsäureverwertung beteiligt und seine Aktivierung geht im Tiermodell mit einer verminderten Triglyzeridkonzentration im Serum sowie der Leber einher. Neben der hypolipidämischen Wirkung ist bekannt, dass eine PPARalpha-Aktivierung in vaskulären Zellen zu einer Entzündungshemmung führt, den reversen Cholesteroltransport in Makrophagen aktiviert und dadurch die Atherosklerose hemmt. Ziel der vorliegenden Arbeit war daher die Hypothese zu bestätigen, dass erhitzte Fette durch eine PPARalpha-Aktivierung anti-atherosklerotisch wirken. Dafür wurde zunächst über einen Zeitraum von 14 Wochen ein Fütterungsversuch mit einem etablierten Tiermodell der Atheroskleroseforschung, der LDL Rezeptor -Knockout-Maus, durchgeführt. Im Ergebnis führte die Verabreichung erhitzter Fette, welche unter praxisrelevanten Bedingungen hergestellt wurden, zu verminderten Konzentrationen an Triglyzeriden und Cholesterol in Plasma und Lipoproteinen. Weiterhin wurde anhand erhöhter relativer mRNA-Konzentrationen bekannter Zielgene des PPARalpha dessen Aktivierung in der Leber nachgewiesen. Die Ergebnisse der immunhistologischen Auswertung zeigen erstmals, dass die Aufnahme erhitzter Fette die Ausbildung atherosklerotischer Läsionen im Aortenursprung der Tiere reduziert und mit einer erhöhten PPARalpha-Proteinexpression in den krankhaft veränderten Gefäßwandabschnitten einhergeht. Dabei ist anzunehmen, dass die erhöhte PPARalpha-Expression indirekt für die verminderte Expression der inflammatorischen Markerproteine VCAM-1 und smooth muscle actin sowie für die verminderten Lipid- und Kollageneinlagerungen in den Läsionen der Versuchstiere, die erhitztes Fett erhielten, verantwortlich ist. Insgesamt zeigen diese Ergebnisse, dass erhitzte Fette anti-atherosklerotisch wirken. Dieser Effekt beruht dabei voraussichtlich auf einer günstigen Beeinflussung des Blutlipidprofils auf Grund einer ligandenabhängigen Aktivierung des PPARalpha in der Leber sowie auf der erhöhten Expression des Transkriptionsfaktors in der Gefäßwand, die mit einer Hemmung pro-atherogener Mechanismen wie der Rekrutierung von Monozyten und der Proliferation von glatten Gefäßmuskelzellen einhergeht. Zusätzlich sollte in einer zweiten Studie geprüft werden, ob oxidierte Fettsäuren als Bestandteile erhitzter Fette und starke PPARalpha-Aktivatoren für die anti-atherogene Wirkung erhitzter Fette mitverantwortlich sind. Im Fokus standen Untersuchungen zur Wirkung von 13-Hydroxy-9,11-octadecadiensäure (13-HODE) auf die Cholesterolhomöostase in murinen RAW264.7-Makrophagen. Dabei zeigte sich, dass die Behandlung der Zellen mit 13-HODE zu einer gesteigerten PPAR-Transaktivierung führt und die Konzentration von Proteinen erhöht, die an der Regulation des zellulären Cholesteroltransports beteiligt sind. Darüber hinaus führte die Behandlung mit 13-HODE und dem Cholesterolakzeptor Apolipoprotein A-1 (Apo A-1) zu verminderten zellulären Cholesterolkonzentrationen in Makrophagen sowie zu erhöhten Cholesterolkonzentrationen im Kulturmedium. Beim Einsatz selektiver PPARalpha- und PPARgamma-Antagonisten blieben die Effekte von 13-HODE auf den Cholesterolefflux und die ermittelten Proteinexpressionen aus, was darauf hindeutet, dass beide PPAR-Isoformen für die beobachteten Effekte eine Rolle spielen. Die Befunde aus dieser Studie zeigen insgesamt, dass 13-HODE den Apo A-1-abhängigen Cholesterolefflux aus Makrophagen durch Aktivierung des PPAR-LXRalpha-Signalwegs stimuliert. Da eine Cholesterolüberladung in Makrophagen die Entwicklung atherosklerotischer Läsionen fördert, deuten die Ergebnisse dieser Studie darauf hin, dass die beobachteten anti-atherosklerotischen Effekte erhitzter Fette in LDL Rezeptor- Knockout-Mäusen zumindest teilweise durch eine Hemmung der Cholesterolakkumulierung und durch eine Stimulierung des reversen Cholesteroltransports in Makrophagen durch oxidierte Fettsäuren, wie 13-HODE, begründet sind. Dietary heated fats are generated during thermal treatment of fatty foods. They contain biologically active compounds which are natural activators of the transcription factor PPARalpha which is the main regulator of fatty acid metabolism. Thereby numerous observations from feeding experiments demonstrating triglyceride-lowering properties of heated fats in liver and plasma. Besides the hypolipidemic effects, PPARalpha regulates anti-atherogenic inflammatory processes in vascular cells and also activates the reverse cholesterol transport in macrophages. The aim of the present work was to investigate anti-atherogenic properties of heated fats. Therefore, we performed first of all a feeding experiment with low-density lipoprotein receptor (LDLR) knockout mice as a well-established experimental model of atherosclerosis. As a result of feeding dietary heated fat, there was a reduction of triglycerides and cholesterol in plasma and lipoproteins. Furthermore, we determined increased relative mRNA concentrations of PPARalpha target genes in the liver in animals with dietary heated fats as an indicative effect of its hepatic activation. It became apparent for the first time that feeding diets containing heated fats caused a significant reduction in cross-sectional lesion area and increased PPARalpha protein expression in the aortic root. It can be suggested that the reduction of the proinflammatory marker vascular cell adhesion molecule-1 (VCAM-1) and smooth muscle actin as well as the decrease in lesion lipid and collagen content in the aortic root of mice fed heated fat is a consequence of an enhanced PPARalpha expression in vascular cells. In conclusion, the results of the first experiment demonstrate anti-atherogenic effects of heated fats. Therefore, we assume that these effects are due to ligand–dependent activation of PPARalpha in the liver, which contributes to plasma lipid lowering but also due to increased PPARalpha expression in vascular cells which inhibits pro-atherogenic events like monocyte recruitment and proliferation of vascular smooth muscle cells. The aim of a second study was to verify whether oxidized fatty acids as inherent part of heated fats and strong PPARalpha activators are also responsible for the anti-atherogenic effects of heated fats. The focal point was to investigate the effects of 13-hydroxy-9,11-octadecadienoic acid (13-HODE) on cholesterol homeostasis in murine RAW264.7 macrophages. Treatment of cells with 13-HODE increased PPAR-transactivation activity and concentrations of proteins involved in cellular cholesterol transport. In addition, 13-HODE decreased cellular cholesterol concentration in macrophages during incubation with the extracellular lipid acceptor apolipoprotein A-1 as well as 13-HODE increased cholesterol concentration in the culture medium. Pre-treatment of macrophages with a selective PPARalpha or PPARgamma antagonist completely abolished the effects of 13-HODE on cholesterol efflux and protein levels of genes investigated, suggesting an involvement of both PPAR isotypes. The results indicate a stimulatory effect of 13-HODE on apolipoprotein A-1-dependent cholesterol efflux from macrophages due to PPAR-LXRalpha-pathway. Because extensive cholesterol accumulation by macrophages in the arterial wall promotes atherosclerotic lesion development, these findings suggest that the observed anti-atherogenic effects of heated fats in LDLR knockout mice might be, at least in part, due to inhibition of macrophage cholesterol accumulation and stimulation of reverse cholesterol transport caused by oxidized fatty acids such as 13-HODE.

Aufgrund ihrer hohen Ortsauflösung ermöglicht die Nano-Computertomographie die Darstellung und Diagnose einer Intraplaquehämorrhagie mittels Detektion von in den atherosklerotischen Läsionen befindlichen Eisenablagerungen. Zudem erlaubt die Technologie der NCT eine detailgetreue Darstellung und non-destruktive Analyse des atherosklerotisch veränderten, aortalen Stromgebietes sowie der pathologischen VV-Neovaskularisation in der Gefäßwand. Anhand der dreidimensionalen Datensätze gelang es, das zeitliche und räumliche Verteilungsmuster der VV in Abhängigkeit verschiedener atherosklerotischer Läsionstypen entlang der murinen Hauptschlagader zu untersuchen und zu quantifizieren. Es zeigten sich signifikante Unterschiede in der adventitiellen Vaskularisierung unterschiedlicher Plaquetypen. Die höchste VV-Dichte ließ sich in fibrotischen und hämorrhagischen Läsionen nachweisen. Kalzifizierte Plaques präsentierten hingegen ein nur gering ausgeprägtes VV-Netzwerk. Der Korrelation zwischen Verteilungsmuster der VV und Lokalisation im aortalen Stromgebiet lag die charakteristische Verteilung der unterschiedlichen Läsionstypen im aortalen Stromgebiet zugrunde. So wiesen die Aorta ascendens und der Aortenbogen Plaques mit Kalkspangen und einer sehr geringen Anzahl an VV auf. In der Aorta descendens zeigten sich hingegen fibrotische und hämorrhagische Läsionen mit ausgeprägter VV-Neovaskularisation. Die Analyse des räumlichen Verteilungsmusters der VV im aortalen Stromgebiet zeigte somit, dass die Dichte des VV-Netzwerkes in keinem direkten Zusammenhang mit der Plaquefläche steht, sondern dass ausschließlich eine positive Korrelation zwischen der Anzahl und Gesamtfläche der VV und dem atherosklerotischen Läsionstyp nachweisbar ist. The present study was designed to test the potential of nano-computed tomography in imaging advanced lesions in aortas of apoE-/-/LDL-/--double-knockout mice. Due to the high resolution of the resulting NCT images, we were able to detect iron deposits within an atherosclerotic plaque. Iron deposits serve as a marker of intraplaque hemorrhage and indicate the vulnerability of the corresponding atherosclerotic lesion. Besides the detection and analysis of advanced, vulnerable lesions, quantitative nano-CT imaging allowed us to investigate the spatio-temporal distribution patterns of VV in murine aortas. The number and total luminal cross-sectional area of VV showed a significant decrease in the ascending aorta and the aortic arch when comparing the results of 25 and 80 weeks old mice. The descending aorta, on the other hand, lead to a significant increase of VV-density from the 25 to the 80 weeks old animals. When looking at the local variations of the VV-distribution patterns in different aortic regions, the area of VV in 80 weeks old mice progressively increased along the aorta from least in the ascending aorta to a maximum in the descending aorta. At the age of 25 weeks, the animals showed an inverse pattern within these parameters. In general, the number and cross-sectional area of VV showed significant differences depending on the adjacent atherosclerotic lesion type. The VV-density was highest in lesions with intraplaque hemorrhage and lowest in calcified plaques. However, there was no correlation found between the number and cross-sectional area of VV and the plaque surface.

Fragestellung: Anhaltende Ischämie in kritisch durchbluteten myocutanen (m.c.) Lappen kann eine partielle oder gar totale Nekrose hervorrufen. Gleichzeitig stellt heute die Atherosklerose eine Volkskrankheit dar, an der bundesweit ca. 8 Millionen Menschen leiden. Neben einem ungünstigen Einfluss[for full text, please go to the a.m. URL], Deutscher Kongress für Orthopädie und Unfallchirurgie (DKOU 2012)

Hintergrund und Ziele: Die Atherosklerose in den Koronargefäßen ist eine multifaktorielle Erkrankung, welche für einen Großteil der Todesfälle in der westlichen Welt verantwortlich ist. Grundlegend für die Entwicklung der Gefäßveränderungen ist die Entzündungsreaktion in der Gefäßwand, welche auch über C-reaktives Protein (CRP) und seine Rezeptoren beeinflusst wird. Die stärkste biologische Wirksamkeit hierbei besitzt der Fc[gamma]RIIa Rezeptor, der durch eine Punktmutation unterschiedlich starke Bindungseigenschaften aufweist. Eine durch Plaquedestabilisierung ausgelöste Komplikation der koronaren Herzkrankheit ist das akute Koronarsyndrom (ACS), eine Erkrankung, welche – vor allem bei Manifestation als akuter Myokardinfarkt – mit hoher Letalität einhergeht. Grundlegend für diese Destabilisierung ist ebenfalls eine Entzündungsreaktion. Ziel der vorliegenden Doktorarbeit ist es, zu untersuchen, ob der Fc[gamma]RIIa Rezeptor mit der Progression der stabilen koronaren Herzkrankheit (KHK) zum akuten Koronarsyndrom assoziiert ist. Methoden: Es wurden 467 Patienten mit stabiler Angina pectoris (SAP), 294 Patienten mit instabiler Angina pectoris (UAP), 407 Patienten mit akutem Myokardinfarkt (AMI) sowie eine herzgesunde Kontrollgruppe bestehend aus 684 Patienten rekrutiert; bei allen Patienten erfolgte die Genotypisierung des o.g. Rezeptors. Desweitern wurde bei den Patienten eine Anamnese bzgl. kardiovaskulärer Risikofaktoren erhoben und diesbezügliche Laboruntersuchungen durchgeführt. Ergebnisse und Beobachtungen: In dieser Studie konnte gezeigt werden, dass der R/R131 Polymorphismus im Vergleich zu Patienten mit stabiler Angina pectoris signifikant häufiger mit dem akuten Koronarsyndrom (OR 2,84; CI 2,04-3,96; p

In a large series of studies was reported that culturing of smooth muscle cells with serum from atherosclerosis patients caused intracellular lipid accumulation, while serum from healthy controls had no such effect. Cultures were used for evaluation of antiatherogenic drugs. Numerous substances were reported to lower serum atherogenicity: statins, trapidil, calcium antagonists, garlic derivatives etc. On the contrary, beta-blockers, phenothiazines and oral hypoglycemics were reported to be pro-atherogenic. Known antiatherogenic agents can influence lipid metabolism and cholesterol synthesis, intestinal absorption or endothelium-related mechanisms. All these targets are absent in cell monocultures. Inflammatory factors, addressed by some antiatherogenic drugs, are also not reproduced. In vivo, relationship between cholesterol uptake by cells and atherogenesis must be inverse rather than direct: in familial hypercholesterolemia, inefficient clearance of LDL-cholesterol by cells predisposes to atherosclerosis. Accordingly, if a pharmacological agent reduces cholesterol uptake by cells in vitro, it should be expected to elevate cholesterol in vivo. Validity of clinical recommendations, based on serum atherogenicity testing in cell monocultures, is therefore questionable. These considerations pertain also to the drugs developed on the basis of the cell culture experiments., GMS German Medical Science; 10:Doc02; ISSN 1612-3174

This study focuses on understanding the role of complement C5a receptors (C5aR and C5L2), release of neutrophil extracellular traps (NETs) and the role of neutrophil granule protein (CRAMP in mouse) in atherosclerosis. Atherosclerosis is agreed to be a chronic inflammatory disease of the arterial vessel wall involving both innate and adaptive immunity. Despite considerable progress in the field of medicine, cardiovascular diseases are a major cause of death world-wide. The complement system is involved in every stage of atherosclerosis, from the onset till the development of acute thrombotic events. C5a anaphylatoxin interacts with its two functional receptors C5aR and C5L2. Receptor C5L2 has recently been identified and its role in atherosclerosis is unknown. C5aR was detected at every stage of atherosclerotic plaque with its receptor expression increasing with increasing complexity of the plaque. The pattern observed was similar with mRNA and it correlates with the receptor expression. The C5L2 receptor expression increased substantially in the late stages of atherosclerosis and then there is a gradual increase in its protein levels. The present study reveals that C5aR is expressed initially on the luminal side of the atherosclerotic vessel and C5L2 is expressed in the areas of inflammatory cell infiltrates. Also, the cells that co-express both the receptors (C5aR and C5L2) and positive for oxLDL are phagocytic in origin. Neutrophils are the first phagocytic cells that reach the injured tissue. Neutrophils on engulfing oxLDL have increased expression of C5L2. Following this, internally present C5L2 on neutrophils and is expressed on their surface. Neutrophils have been identified recently to be very important in early atherosclerosis. The mechanistic insight into neutrophil-dependent pro-atherogenic mechanism like release of NETs in atherosclerosis is unveiled in the second part of this thesis. Cytokine stimulation in murine models showed release of NETs from the neutrophils. NETs were luminally present in murine and human atherosclerosis. Atherosclerosis related compound such as oxLDL stimulates neutrophils to release NETs along with granule proteins, such as LL37 (CRAMP in mouse), bound to the released NETs. In the final part of the project the role of cathelicidin (LL37) in atherosclerosis was explored. Lack of cathelicidin reduced the accumulation of lipids in the aorta and reduced the lesion sizes with decrease in cellularity. Compared to the control (Apoe-/-), the knockout (Cramp-/-Apoe-/-) mice showed no difference in cholesterol triglyceride levels, circulating leukocyte count and apoptotic cell count. Data from single cell suspensions of aorta for CRAMP in Cramp-/-Apoe-/- and Apoe-/- mice reveal that cellular expression of CRAMP is confined to neutrophils and the activated neutrophils release CRAMP and immobilize on the endothelium. In vivo adhesion of leukocytes of the carotid artery reveals that LL37 induced adhesion of classical monocytes and neutrophils and blocking the formyl-peptide receptors with an antagonist significantly reduced the adhesion of classical monocytes and neutrophils. Thus summarizing the studies of this thesis-OxLDL stimulates neutrophils leading to the endogenous production of C5a. C5a then binds to C5aR expressed on the membrane of neutrophils. This C5a-C5aR complex exteriorizes the internally present C5L2. Moreover, increase of oxLDL stimulates the neutrophils to releases NETs via NETosis with LL37 adhering to them. The presence of NETs and granule proteins increase the inflammatory cell environment and recruit other immune cells, aiding in the progression of atherosclerosis and resulting in advanced stage plaques.

In der vorliegenden Arbeit wurde mittels Synchrotron- basierter Mikro-CT und Nano-CT der Einfluß von Thalidomid auf die Atherogenese im Tiermodell von 35 Wochen alten ApoE-/-/LDL-/-- Doppel- Knockout Mäusen untersucht. Die Technologie der Nano-CT ermöglicht eine nicht- destruktive Darstellung von Strukturen im Submikrometerbereich. Nach intravasaler Kontrastmittelperfusion können Gefäßnetzwerke dreidimensional erfasst und volumetrische Analysen vorgenommen werden. Die hohe Ortsauflösung ermöglicht die Quantifizierung stenosierender Gefäßläsionen und ihrer adventitiellen VV anhand eines dreidimensionalen Datensatzes. Die Tiere der Verumgruppe, welche über 29 Wochen Thalidomid verabreicht bekamen, wiesen im Vergleich zur Kontrollgruppe, signifikant kleinere atherosklerotische Läsionen (mm2), weniger adventitielle VV und insgesamt eine reduzierte Gesamtfläche an VV (mm2) entlang der deszendierenden Aorta auf. Die Mäuse der Kontrollgruppe, welche über 29 Wochen eine atherogene Basisdiät ohne Thalidomidzugabe erhielten, entwickelten hingegen eine ausgeprägte adventitielle VV- Neovaskularisation und eine erhöhte Plaquefläche. Bei allen in der Aorta descendens beobachteten atherosklerotischen Läsionen handelte es sich um den fortgeschrittenen fibrotischen Plaquetyp. Die histologische Aufarbeitung (Elastika-, HE-, Masson Trichrome- Färbung) der Segmente verifizierte die Ergebnisse aus dem Mikro - und Nano-CT. Die antiangiogenetische Wirkung von Thalidomid wurde begleitend mit Hilfe eines Proliferations- und eines Migrationsassays in- vitro an humanen Endothelzellen untersucht. Die Auswertung der Assays ergab eine dosisabhängige, signifikante Inhibition der Proliferation und Migration der Endothelzellen durch Thalidomid. In der vorliegenden Arbeit konnte erstmalig unter dem Einsatz der Mikro - und Nano-CT gezeigt werden, dass Thalidomid das Wachstum atherosklerotischer Plaques über die Hemmung der VV- Neovaskularisation im Tiermodell der ApoE-/- /LDL-/-- Doppel- Knockout Maus inhibieren kann. Ob die anti-atherosklerotischen Eigenschaften von Thalidomid auf seine antiinflammatorische, auf seine antiangiogenetische Wirkung oder auf beide zurückzuführen ist, kann man zum jetzigen Zeitpunkt jedoch noch nicht sagen. Using synchrotron- based micro- and nano- CT we analysed the effect of thalidomide on the atherogenesis in apoE-/-/LDL-/-double knockout mice at the age of 35 weeks. The high resolution of the nano- CT images enables a non- destructive and three- dimensional visualization of structures in a submicrometer- size. Images based on nano- CT allow analysis of VV neovascularization and plaque characteristics. At the age of 35 weeks, thalidomide treated apoE-/-/LDL-/-double knockout mice demonstrated a significant decrease of atherosclerotic plaque area and VV neovascularization confirmed by histology. Compared to controls, the adventitial VV lumen cross sectional area of the thalidomide- challenged mice was significantly lower. We identified the observed atherosclerotic lesions in the descending aortas of the apoE-/-/LDL-/-double knockout at the age of 35 weeks as advanced fibrotic plaques. Moreover, we analysed the effect of the anti- angiogenic drug on human artery endothelial cells in vitro by using a BrdU and a migration assay. The results indicate that thalidomide significantly prevented EC proliferation and migration in a dose- dependent manner. In this study we demonstrate that thalidomide, a potent anti-angiogenic drug, inhibits growth of atherosclerotic plaque in the descending aorta of apoE-/-/LDL-/-double knockout mice by using synchrotron- based micro- and nano-CT. VV neovascularization and inflammation are strongly associated with plaque growth. Because of its anti-inflammatory and anti-angiogenic effect Thalidomide leads to a suppression of both, but the anti- atherosclerotic properties of that drug remains to be determined.

The COP9 signalosome (CSN), a multi-functional protein complex involved in the regulation of E3 ubiquitin ligases, has been described as a regulator of NF-kappaB signaling, a function assigned to the metalloisopeptidase activity of its subunit CSN5. However, its effect on NF-kappaB activation and pro-atherogenic responses in endothelial cells and macrophages and in atherogenesis in vivo remains unknown. This study sought to identify a role of the CSN complex and in particular CSN5 in IKK/NF-kappaB signaling in atherogenic endothelial cells in vitro and in murine atherosclerosis in vivo. Endothelial cells (ECs) are not just barrier bystanders, but actually determine whether immune cells will work within the limits of homeostasis or go overboard into autoimmunity and inflammation. As the vascular endothelium plays a pivotal role in the inflammatory reactions driving atherosclerosis, the first part of this study focused on the role of CSN5 in modulating inflammatory and atherogenic processes in ECs through the regulation of NF-kappaB. By using ECs, this study for the first time demonstrates endothelial CSN5 to reduce inflammatory responses and mononuclear cell arrest by impairing NF-kappaB activation, proposing that CSN5 confers atheroprotective effects in the endothelium. This was mechanistically shown by co-immunoprecipitation in human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) that revealed the presence of a supercomplex between IKK and the CSN, which dissociates upon TNFalpha administration. The CSN was found to attenuate the phosphorylation of IKK when cells were treated with siRNAs targeting CSN subunits 2 and 5. Furthermore, transient overexpression of CSN5 protected IkappaB-alpha from degradation and reduced NF-kappaB activation upon TNFalpha stimulation, whereas silencing RNA-mediated CSN5 depletion enhanced TNFalpha-induced IkappaB-alpha degradation and the concomitant NF-kappaB activity in NF-kappaB binding and luciferase reporter assays. Sequentially, NF-kappaB-dependent expression of chemokines and adhesion molecules was upregulated, as measured by real-time PCR and flow cytometry, which translated into an increased arrest of perfused monocytes on TNFalpha-stimulated, CSN5-depleted HUVECs. Importantly, double-immunostaining for CSN and CD31 confirmed the expression of CSN subunits in the endothelial layer of human atherosclerotic lesions, and revealed an increased expression of CSN5 upon atheroprogression. The second part of this work intended to elucidate the functional role of CSN5 in murine atherosclerosis in vivo. Macrophages are key cells not only in acute inflammation but also in chronic inflammation as they release a number of cytokines and other factors upon activation. Chronic inflammatory processes underlie atherosclerosis and macrophages have been shown to be key cells in atherosclerotic processes. Employing a macrophage-specific deletion of Csn5 in a murine atherosclerosis model, this study identifies Csn5 as a novel player in atherosclerosis. Ablation of Csn5 was found to exacerbate murine atherosclerosis, an observation that confirms the atheroprotective role of CSN5 demonstrated for the first time in this study. The evidence presented in this thesis sets the pace to pursue the functional role of CSN5 and the entire CSN complex in atherosclerosis in a broader manner including EC- and SMC-specific knockout of Csn5 in vivo by conditional deletion. This could also be extended to other Csn subunits and the various proatherogenic mouse models.