Search

Bu çalışmanın ilk bölümünün amacı normal-eşleştirilmiş primer meme tümörlerinde daha önceki BRCA1 tarafından indüklenen gen listesinden (OVCA1, OVCA2, ERBIN, RAD21, XRN2, RENT2, SMG1 ve MAC30) seçilen genlerin ifade profillerini bulmak ve bu seçilen aday genlerin gen ifade profillerinin BRCA1 ve çeşitli patolojik parametrelerle korelasyonunu araştırmaktır. Hedef genler arasında ERBIN, SMG1 ve RAD21 ifadelerinin BRCA1'in ifadesinin artmış veya azalmış olduğu hücrelerde BRCA1 ile yüksek derecede korelasyon gösterdiği bulundu. Bu korelasyon 32 normal-eşleştirilmiş primer meme tümörü örneğinde sekiz genin qRT-PCR ile ifade profilinin çıkartılmasıyla doğrulanmıştır. Bu genlerin aynı zamanda ER(-) ve ER(+) tümörlerle evre 1 ve evre 3 tümörleri ayırmayı sağladıkları bulunmuştur. Hedef genler ayrıca bağımsız mikrodizin veri setleri kullanılarak meme tümörü evresi, alt tipi ve hasta sağkalımı açısından öngörme güçlerini değerlendirmek üzere analiz edilmişlerdir. Bu veri setleri için ERBIN, SMG1 ve RAD21 öngörme açısından önemli bulunmuştur.Çalışmanın bu kısmının amacı meme tümörü dokularında hedef gen ifade miktarının hassas bir şekilde belirlenmesi için uygun referans genler (RG'ler) bulmaktı. Sık kullanılan 15 RG'nin ve iki bağımsız mikrodizin veri setinin analizi sonucunda seçilen üç aday genin ifade durumları 23 primer meme tümöründe ve eşleştirilmiş normal dokularında qRT-PCR kullanılarak belirlenmiştir. Ayrıca, 18S rRNA, ACTB, ve SDHA rRNA/mRNA oranını değerlendirmek üzere 13 meme tümörü çiftinden seçkisiz-prime edilmiş cDNA'lar kullanılarak test edildi. Tümörlerde normallerine göre önemli ölçüde düşük rRNA/mRNA oranına sahipti. Test edilen 18 endojen referans geni arasında normal-eşleştirilmiş tümör meme dokusu çiftlerinin analizinde qRT-PCR verilerinin normalizasyonu için en uygun referans genleri olarak ACTB ve SDHA seçildi.Çalışmanın üçüncü kısmının amacı örnek sınıfları arasında farklılaşmış ifadenin önemini değerlendirmek için tekrar örnekleme tabanlı bir meta-analiz stratejisi geliştirmekti. Meta-analiz için normal meme, invaziv duktal karsinom (IDC) ve invaziv lobuler karsinom (ILC) örnekleri içeren iki bağımsız mikrodizin veri seti kullanıldı. Tekrar örnekleme tabanlı meta-analiz hem ILC hem IDC alt tiplerini içeren meme tümörleri ve normal meme örneklerinin sınıflandırılması için yüksek düzeyde sabit bir gen seti tanımlanmasını sağlamıştır. Bu meta-gen listesinin bir alt setinin iyi belirlenmiş moleküler tümör alt tiplerini (örn., bazal ve luminal veya ER+/ER-) mevcut meme kanseri mikrodizin veri setlerinin sınıf öngörme analizine dayanılarak yüksek doğruluk derecesiyle ve hassasiyetle öngördüğü gösterilmiştir. Seçilen genlerin 10 bağımsız primer IDC örneği ve eşleştirilmiş tümör olmayan kontrollerinde gerçek zamanlı qRT-PCR ile test edilen gen ifadeleri meta-analiz sonuçlarını desteklemiştir. The aim of the first part of this study was to find out the expression profiles of the genes, which were selected from the former BRCA1-induced gene list (OVCA1, OVCA2, ERBIN, RAD21, XRN2, RENT2, SMG1 and MAC30) in normal-matched primary breast tumors and to correlate the gene expression profiles of selected candidate genes with BRCA1 and various pathology parameters. Among the target genes, the expression of ERBIN, SMG1 and RAD21 were found to be highly correlated with that of BRCA1 both in BRCA1 up- and down-regulated cells and this result was validated with qRT-PCR expression profiling of the eight genes in 32 normal-matched primary breast tumor samples. These genes were found to be discriminative between ER(-) and ER(+) tumors as well as grade 1 and grade 3 tumors. Target genes were also analyzed in independent microarray datasets to assess their predictive power for breast tumor grade, subtype and patient survival. ERBIN, SMG1 and RAD21 were found to have predictive roles in these datasets.The aim of the second part of the study was to found appropriate reference genes (RGs) for accurate quantification of target gene expressions in breast tumor tissues. The expression patterns of fifteen widely-used endogenous RGs and three candidate genes that were selected through analysis of two independent microarray datasets were determined in 23 primary breast tumors and their matched normal tissues using qRT-PCR. Additionally, 18S rRNA, ACTB, and SDHA were tested using randomly primed cDNAs from 13 breast tumor pairs to assess the rRNA/mRNA ratio. The tumors exhibited significantly lower rRNA/mRNA ratio when compared to their normals. Among the eighteen tested endogenous reference genes, ACTB and SDHA were identified as the most suitable reference genes for the normalization of qRT-PCR data in the analysis of normal-matched tumor breast tissue pairs.The aim of the third part of this study was to develop a resampling-based meta-analysis strategy. Two independent microarray datasets that contain normal breast, invasive ductal carcinoma (IDC), and invasive lobular carcinoma (ILC) samples were used for the meta-analysis. The resampling-based meta-analysis has led to the identification of a highly stable set of genes for classification of normal breast samples and breast tumors encompassing both the ILC and IDC subtypes. A subset of this meta-gene list was shown to predict well-established molecular tumor subtypes, e.g., basal vs luminal or ER+/ER-, with high accuracy and sensitivity based on class prediction analysis of existing breast cancer microarray datasets. Expression of selected genes, tested on 10 independent primary IDC samples and matched non-tumor controls by real-time qRT-PCR, supported the meta-analysis results. 282

Polikistik over sendromu (PKOS), üreme çağındaki kadınlarda sıklıkla görülen ve yumurtlama sorunlarına bağlı infertilitenin en önemli nedeni olan endokrin ve metabolik düzensizliktir. PKOS'un nedenleri tam anlaşılmamakla birlikte, sendromda folikülün ve yumurtanın tam olarak olgunlaşamadığı, sonucunda kistik foliküllerin yumurtalık içerisinde biriktiği ve metabolik düzensizlikleri beraberinde getirdiği bilinmektedir. Yumurta hücresi kümülüs granüloza hücreleri (KGH) ile çevrelenmiş durumdadır. Bu hücreler folikül içeriğini düzenlemekten ve steroid hormonların salgılanmasından sorumlu olan mural granüloza hücreleri (MGH) ile birlikte folikülü oluşturmaktadır.Bu çalışmada aynı öncül hücreden köken alan (öncül granüloza hücreleri) bu iki somatik hücre grubu arasında PKOS'ta değişiklik gösteren mRNA ve miRNA ifadeleri incelenmektedir. Tez kapsamında literatürde bulunan bağımsız mikrodizin verileri naiv meta-analiz yöntemi ile analiz edilmiş, daha önceki çalışmada PKOS-kontrol grupları arasında MGH'lerde ifade farklılığı gösteren miRNA ifadeleri PKOS grubunda MGH-KGH sınıfları arasında araştırılmış ve mRNA-miRNA ilişkisinden yola çıkılarak PKOS'ta rol oynadığı bilinen yolakların bu iki hücre grubu arasındaki ifade düzensizlikleri araştırılmıştır.Tez çalışması sonucunda daha önce PKOS ile ilişkisi tespit edilmiş 7 miRNA'dan 5 tanesinin MGH-KGH sınıfları arasında ifade farklılığı gösterdiği tespit edilmiştir. Bu miRNA'lara ait potansiyel hedefler biyoinformatik olarak tespit edilmiş, naiv meta-analiz sonucunda PKOS-spesifik olarak ifade farklılığı gösterdiği tespit edilen 1372 gen ile kesiştirilerek ortak bir mRNA listesi elde edilmiştir. Ortak liste ile yapılan yolak analizleri sonucunda genlerin literatürde PKOS ile ilişkilendirilmiş MAPK, insülin, Wnt, TGF-β gibi yolaklarda zenginleştiği tespit edilmiştir. Elde edilen veriler miRNA ve mRNA moleküllerinin yumurta mikroçevresindeki bu somatik hücrelerde değişen ifadelerinin, yumurta-folikül olgunlaşmasını etkileyerek PKOS'un gelişiminde rol oynayabileceğini göstermektedir. Polycystic ovary syndrome (PCOS) is an endocrine and metabolic disorder which is the most common cause of infertility due to ovulation problems. Although the causes of PCOS are not fully understood, it is known that the follicle and oocyte do not fully mature in the syndrome, as a result cystic follicle accumulate in the ovary and cause metabolic disorders. The oocyte is surrounded by the cumulus granulosa cells (CCs), which are responsible for regulating follicle content and secreting steroid hormones, and the mural granulosa cells (MGCs).In this study, mRNA and miRNA expressions were identified between these two somatic cell groups originating from the same precursor cell (precursor granulosa cells) in PCOS. The independent microarray data in the literature were analyzed by naive meta-analysis method. Also, the expression profiles of miRNAs, which had been identified in our previous study between PCOS-control groups in MGCs, between MGCs and CCs in PCOS were identified. In addition, pathway dysregulations in PCOS between these somatic cells were investigated based on the mRNA-miRNA relationship.As a result of this thesis, it was identified that 5 of 7 miRNAs that were previously associated with PCOS showed expression differences between MGC-CC classes. Potential targets of these miRNAs were bioinformatically identified, and a common list of mRNAs was obtained by crossing with 1372 PCOS-specific genes which were identified from naive met-analysis. As a result of the common list pathway analysis, genes were found to be enriched in pathways such as MAPK, insulin, Wnt, TGF-β, which were related with PCOS in the literature. The data obtained show that changing expressions of miRNA and mRNA molecules in these somatic cells in the oocyte microenvironment may play a role in the development of PCOS by affecting oocyte-follicle maturation. 116

Meme kanseri, dünya çapında tanı konan ve yaşamları boyunca yaklaşık sekiz kadından birini etkileyen en yaygın ikinci kanserdir. Klinik ve biyolojik heterojenitesine rağmen, meme kanseri 50 gen imza (PAM50) veya immünhistokimyasal belirteçlerin gen ifade profillemesine dayanan altı moleküler alt tipe gruplandırılabilir: Luminal A, Luminal B, insan epidermal büyüme faktörü reseptör 2 (HER2) pozitif, claudin-düşük, bazal benzeri ve normal meme benzeri. HER2 amplifikasyonu ve / veya aşırı ekspresyonu olan tümörler, HER2-pozitif alt tipine sınıflandırılır. Üçlü-negatif meme kanseri (TNBC), ER, PR ve HER2 ekspresyonu olmayan tümörleri temsil eder ve büyük ölçüde bazal alt tip ile örtüşür. miRNA'lar 21-25 nükleotidden oluşan RNA ailesi üyesi olup çoklu hedef genlerin düzenlenmesi yoluyla çeşitli hücresel yolakları düzenlerler. Daha yakın yıllarda, kanser biyobelirteçleri olarak mikroRNA'ların (miRNA) ortaya çıkması meme kanserinin `moleküler imzasının` belirlenmesine farklı bir boyut kazandırmıştır. Tez çalışması kapsamında tamoxifen ve trastuzumab cevabı olarak belirlemiş olduğumuz miR-770-5p'nin ilaç ile birlikte (trastuzumab veya tamoxifen) ya da tek başına reseptör pozitif meme kanseri hücrelerdeki ve TNBC hücrelerindeki potansiyel etki mekenizmasının açıklanması hedeflenmiştir. Çalışmada 3 farklı ER (+) / HER2 (+) hücre hattı (MCF-7, BT-474, SK-BR-3) ve 4 farklı TNBC hücre hattı (MDA-MB-231, MDA-MB-468, MDA-MB-157 ve BT-20) kullanılmış, miR-770-5p'nin bu hücrelerde proliferasyon, motilite ve invazyon üzerine etkisi ve bu süreçlerdeki moleküler etki mekanizması araştırılmıştır. Bu amaçla WST1, Wound healing assay ve xCELLigence real-time cell analyzer yardımıyla proliferasyon, motilite-invazyon deneyleri ve potansiyel hedef genleri belirlemek için qRT-PZR ve western blot deneyleri yapılmıştır. miRNA'nın potansiyel hedef genleri ile yapılan zanginleştirme analizleri sonucunda miR-770-5p'nin HER2/EGFR sinyal iletim sistemi, fokal adezyon yolağı ve EMT sürecini düzenleyerek trastuzumab'ı potansiye ettiği, hücrenin motilite ve invazyon yeteneğini anlamlı şekilde azalttığı belirlenmiştir. Ayrıca, EMT sürecinde miR-770-5p transfekte-MDA-MB-231 hücrelerinde E-Cadherin ifadesinin geri kazandırılmasının miRNA'nın potansiyel hedefi olan DNMT3A aracılığıyla E-Cadherin metilasyon profilini değiştirerek EMT sürecini MET sürecine çevirebileceği gösterilmiştir. miR-770-5p'nin reseptör pozitif ya da TNBC meme kanseri tedavisinde potansiyel terapatik hedef olabileceği düşünülmektedir. Breast cancer (BC) is a highly heterogeneous disease and clinically categorized into four subtypes based on the presence of estrogen receptor (ER), progesterone receptor (PR), HER2 and ki67. Triple-negative breast cancer (TNBC) represents tumors without the expression of ER, PR and HER2. The concept of combining different therapeutic agents for synergistic benefits in treatment has been utilized for decades. MicroRNAs (miRNAs) comprise a class of 22–25 nucleotides long, non-coding, endogenous RNA molecules, which regulate a variety of cellular pathways. In more recent years, the emergence of miRNAs as cancer biomarkers has added an extra dimension to the 'molecular signatures' of breast cancer. The aim of the study is to identify the potential signaling mechanisms of miR-770-5p in proliferation, motility and invasion in breast cancer cells. In this study three ER / HER2 positive breast cancer cell lines (MCF-7, BT-474 and SK-BR-3) and four triple negative breast cancer cell lines (MDA-MB-231,MDA-MB-468, MDA-MB-157 and BT-20) were transfected with miR-770-5p. To check its role in proliferation, motility and invasion, WST1 assay, wound healing and invasion assays were performed respectively. Furthermore, potential target genes were analyzed in transfected cells by qRT-PCR and western blot to explain the effect of miR-770-5p in proliferation, motility and invasion. Pathway enrichment analysis results suggested that miR-770-5p might function as a mediator of EGFR signaling, focal adhesion and Epithelial-mesenchymal transition (EMT) signaling pathways. Overall, our results may suggest miR-770-5p as a pivotal regulator of EMT through DNMT3A regulation and E-Cadherin promoter methylation in TNBC. It might be concluded that the up-regulation of miR-770-5p may play a biological role in motility and invasion signaling pathways in breast cancer cells and it could be suggested as a potential therapeutic target. 204

Dünya çapında, sarı pas hastalığı buğday için yıkıcı etkidedir. Eğer gerekli önlemler alınmazsa, yeni patojen ırklarının ortaya çıkması hızla yayılarak epidemiklere yol açabilir. Hastaığı sebebi obligat biyotrofik bir mantar olan Puccinia striiformis f.sp. tritici (Pst) patojenidir. Enfeksiyon mekanizmasının nasıl gerçekletiğinin tespiti, hastalığa karşı eldeki en iyi stratejidir. Bu nedenle aday effektör proteinleri, dirençli ve dirençsiz bitkilerin patojen inoküle edilmiş dokularını kullanarak data madenciliği ile harmanlanmış de novo transkriptom dizilemesi yolu ile tespit edildi. Karşılaştımalı anlatım düzeyi analizi ile tespit edilmiş genlerin içerisinde küçük sekretom proteinleri biyoinformatik analizlerle saptandı. Literatürdeki raporlarla yapılan karşılaştırmalar yeni ya da ortak virülansta sorumlu efektör adaylarının bulunmasını sağladı. Verinin güvenilirliği test etmek için bazı aday efektörler klonlandı ve fonksiyon açısından karakterize edildi. Çalışmalar sonucunda Unigene17495 (Pstg10917) isimli aday efektörün bitki hücresinde kloroplastı hedeflediği ve INF1 proteini sebepli hücre ölümlerini ise baskıladığı gözlemlendi. Bu tez kapsamında dirençli ve dirençsiz bitkilerdeki inokülasyon sonrası değişen patojen gen anlatım düzeyleri mikro dizin analizi ile belirlendi. Aynı şekilde, tespit edilen adayların en uygun şekilde fonksiyon analizlerinin yapılabilmesi yeni nesil metodolojiler üzerinde de çalışılma yapılmıştır. Wheat yellow (stripe) rust is a devastating disease on wheat on the global scale. Emergence of new aggressive races leads swift epidemics unless countermeasures are in place. The causative agent of the disease is an obligate biotrophic fungus, Puccinia striiformis f.sp. tritici (Pst). The identification of the infection mechanisms is the best strategy to act against the disease. For that reason, candidate secreted effector proteins (CSEPs) of Pst races in Turkey was monitored using de novo transcriptome sequencing approach combined with data mining on the inoculated tissues of compatible and incompatible interaction. The small-secreted proteins (SSPs) of the identified differentially expressed genes (DEGs) were genenated and characterized via in silico analysis. Comparisons with published reports reveal both unique and common sets of candidate effector for virulence. In order to validate reliability of the data, some of the effector candidates were cloned and studied for their function. Unigene17495 (Pstg10917) targets chloroplasts and suppresses the cell death triggered by INF1 elicitor in planta studies. The thesis includes the microarray profiling of differentially expressed genes during compatible and incompatible interaction. Moreover, the new screening methods for determination of biological functions were studied in the thesis in order to pinpoint flexible strategies for effector studies. 191

Puccinia striiformis f. sp. tritici, buğdayda sarı pas hastalığına neden olan bir funguspatojeni olup, dünyanın bir çok yerinde buğday üretiminde büyük kayıplara nedenolmaktadır. Bu fungus patojenleri bitkinin immunitesini baskılamak için kendi efektörmoleküllerini konak hücresi içerisine göndererek, bitki üzerinde kolonileşirler.Patojenin bu önemli efektör proteinlerini karakterize etmek ve tanımlamak için birsürü çalışmalar devam etmektedir. Yine de, bu efektörlere ait biyolojik vebiyokimyasal fonkiyonlar; yeterli düzeyde tanımlanamamıştır. Bu tez çalışmasında,Puccinia striiformis f. sp. tritici fungusunun bir efektör adayı olan PstCTE1 çalışılmışve bitkide ekspres edildiğinde kloroplasta lokalize olduğu gözlemlenmiştir. Bulokalizasyona sebep olan transit peptid en çok kullanılan biyoenformatik programlarile aranmış fakat tespit edilememiştir ve kendine özgü bir transit peptidi olduğudüşünülmektedir. Daha sonra, bu transit peptidin N-terminal etiketlemedenetkilenmediği ve PstCTE1 efektörünün yine kloroplastta localize olduğugözlemlenmiştir. Ayrıca, efektörün N-terminal tarafına signal peptidi birleşik şekildeekspres edildiğinde yine kloroplasta gittiği gözlemlenmiştir ve bu bulgu da hücreiçerisine tekrar grime hipotezini desteklemektedir. Fungal pathogen, Puccinia striiformis f. sp. trtici, is the causative agent of stripedisease of wheat which causes disruption on wheat yield in many parts of the world.Fungal pathogens secrete effector molecules into host plant cells to suppress hostimmunity via virulence to colonize plants. Ongoing efforts are being made to identifyand characterize effector proteins in many fungal plant pathogens. Nevertheless, theprecise biological and biochemical functions of many effectors, such as theirtrafficking from the pathogen to the host cytoplasm, have yet to be fully understood.In this study, we show that an effector candidate (PstCTE1) of Puccinia striiformis f.sp. tritici localizes to chloroplasts when expressed in planta, although it has no transitsignal region that can be detected by widely accepted prediction tools, indicating thatit must be carrying a unique localization signal. Moreover, N-terminal tagging has noeffect on the chloroplast localization of PstCTE1. It has been also observed theentrance of the effector to the chloroplast even in the presence of an intact signalpeptide on the N-terminus of the transit peptide region, a result that supports possiblehost cell re-entry. 124

Çok sebepli, kompleks bir genetik hastalık olan meme kanseri moleküler düzeyde detaylı bir şekilde çalışılmakta ve meme kanserine sebep olan ve gelişiminde rol oynayan pek çok gen, miRNA vb. faktör tespit edilmektedir; ancak hastalığın regülasyonunda rol oynayan moleküler mekanizmalar henüz tam olarak açıklanamamıştır. Bu eksiklik, meme kanseri oluşumunu ve gelişimini öngörebilecek yeni belirteçlerin aranmasını ve düzenleyici ağların tespit edilmesini zorunlu kılmıştır. Biyolojik süreçlerin kontrolü için önemli bir mekanizma olan gen ifadesinin düzenlenmesinde miRNA'lar post-transkripsiyonel (transkripsiyon sonrası) düzeyde görev yaparken, transkripsiyonel düzeyde bu görevi transkripsiyon faktörleri (TF) üstlenmektedir. mRNA ve miRNA'ların transkripsiyonlarının TF'ler tarafından kontrol edildiği ve TF'lerin ifadelerinin de miRNA'lar tarafından düzenlendiği göz önüne alındığında birbirinden bağımsız şekilde düşünülemeyecek olan bu düzenleyici mekanizmaların karakterize edilmesi (ağlar ve devreler kurgulayarak) ve açığa çıkartılması, hücresel süreçlerin daha iyi anlaşılabilmesi için önem kazanmaktadır.Bu amaçla tez çalışmasında miRNA ve mRNA ifade verileri ve literatür tabanlı elde edilen bilgiler birlikte kullanarak TF (transkripsiyon faktörü)-miRNA-Hedef gen devrelerini (biological circuits) dinamik olarak (deneye özgü) ortaya çıkartabilecek bir algoritma tasarlanmış, zenginleştirme tabanlı (Enrichment-based) bir devre analizi sistemi oluşturulmuş ve meme kanseri oluşum ve gelişiminde rol oynayan devreler tespit edilmiştir. Breast cancer is a multifactorial and complex genetic disease and it is well studied in molecular level. Although many genes, miRNAs and other factors were identified that are taking roles in the development and progression of the disease there are still uncertainties about the exact mechanism taking roles in regulation of it. So it becomes inevitable to search for new biomarkers and regulatory networks that can predict the formation or prognosis of breast cancer. Transcription factors (TFs) and microRNAs (miRNAs) are key regulators for gene expression regulation. miRNAs are post-transcriptional regulatory elements while TFs are regulators at transcriptional level. Since the transcription of mRNAs and miRNAs are known to be regulated by TFs and TFs are the targets of miRNAs, these two mechanisms cannot be separated from each other. Therefore it is so important to characterize (by building networks and circuits) these regulatory mechanisms to reveal the biological processes in detail. In this thesis an enrichment-based algorithm, which transforms the miRNA and mRNA expression data obtained from databases and literature was designed to identify TF-miRNA-target gene circuits dynamically. The algorithm was specifically applied to breast cancer data and TF-miRNA-target gene circuits that could be important in the development and the progression of breast cancer were investigated. 132

Meme kanseri kompleks moleküler mekanizmaya sahip, gelişmiş ülkelerde kadınlarda en fazla oranda görülen kanser türüdür. ERBB (EGFR) reseptör ailesine ait HER2 reseptörünün aşırı şekilde ifade edildiği alt tipin görüldüğü hasta oranı %30 civarında seyretmektedir. Bununla birlikte tedavide kullanılan odaklı terapilere (trastuzumab, lapatinib vb.) karşı direnç gelişimi büyük bir sorundur.mikroRNA'ların (miRNA) keşfi ile birlikte meme kanserine katkı yapan ya da tam tersi hücre çoğalmasını sonlandıran pek çok miRNA'nın varlığı tespit edilmiştir. Yapılan son çalışmalarla miRNA'ların tedavi üzerine varlığına odaklanılmakta, tedavi sürecinde rol alabilecek alternatif hedef moleküller olarak kullanımları araştırılmaktadır. Bununla birlikte tedaviye duyarlı miRNA'ların hedef gen profili üzerinde detaylı analizine gidilmemiş, ilaç tedavilerinde etkiledikleri mekanizmalar tam olarak aydınlatılmamıştır.Bu tez çalışmasında HER2 pozitif meme kanseri hücreleri BT-474 ve SK-BR-3'te trastuzumaba ve lapatinibe duyarlı miRNA'lar tespit edilmiş ve AGO2-IP analizi kullanılarak miRNA hedeflerinin detaylı analizi gerçekleştirilmiştir. Ek olarak trastuzumaba duyarlı miRNA'lar kullanılarak yapılan network (ağ) analizi sonucu ilaca duyarlı miRNA'lar tarafından kontrol edilen mekanizmaların varlığı sistemik seviyede araştırılmıştır. Breast cancer is the most common cancer seen in women. It is a complex disease with different molecular subtypes and some certain receptors have an important role on its molecular classification as well as progression and treatment. HER-2/neu is one of these receptors, which is found to be overexpressed in 20-30% of the patients. It contributes to the progression and pathogenesis of the breast cancer. MicroRNAs (miRNAs) are endogenous non-coding RNAs in 21-25 nucleotides long. They regulate gene expression at the post-transcriptional level and miRNA deregulation is important in many pathological conditions including breast cancer. It is known that some miRNAs show oncogenic and tumor suppressor properties and they might also have effective roles in drug treatment by mediating gene regulation in cancer.In this study, we aimed to identify miRNA-mediated mechanisms driven by the drug responsive miRNAs and their target genes in lapatinib and trastuzumab treatment. For this purpose, we first found out the drug responsive miRNAs and then we focused on their functional characterization by looking for their potential effects in breast cancer cell lines. We also performed an AGO2-IP experiment to pull down the targets of drug responsive miRNAs. In addition, we constructed miRNA-miRNA networks to figure out the miRNA-mediated mechanisms at systemic level in trastuzumab treatment. 278

Miyelodisplastik Sendrom (MDS) ve Akut Miyeloid Lösemi (AML) kemik iliğindeki kök hücreleri etkileyen klonal hastalıkların heterojen gruplarını temsil etmektedir. Mikroçevre direkt olarak hematopoetik hücrelerle etkileşime girerek ve/veya düzenleyici moleküller salgılayarak hematopoezi düzenler. Hematopoetik mikroçevrenin ana bileşeni mezenkimal kök hücreler (MKH)'dir. MKH'lerin hastalık patogenezine katkısı yeterince araştırılmamıştır.Bu çalışmada 22 MDS/AML hastası ve 8 sağlıklı kontrol kemik iliğinden MKH'ler izole edilmiş ve hücre kültürlerinde çoğaltılmıştır. MKH karakterizasyonu için yüzey antijen özellikleri akım sitometrisiyle analiz edilmiştir. MKH'lerin osteojenik ve adipogenik farklılaşma potansiyelleri test edilmiştir. MKH'lerden RNA izole edilmiş, daha sonra miRNA mikrodizin teknolojisiyle miRNA ifade profilleri analiz edilmiş ve farklılık gösteren miRNA'lar eş zamanlı PZR ile doğrulanmıştır. Biyoinformatik analizler ile miRNA'lar tarafından düzenlenen edilen genler belirlenip mRNA seviyeleri hastalar ve normal kontrollerde karşılaştırılmıştır. DICER1 gen ifade profili hasta ve normal örnekler arasında incelenmiştir. Myelodysplastic syndrome (MDS) and Acute Myeloid Leukemia (AML) represent the heterogenous groups of clonal diseases that affect the stem cells in bone marrow. The microenvironment can regulate hematopoiesis by interacting directly with hematopoietic cells and/or by secreting regulatory molecules. The key component of the hematopoietic microenvironment is mesenchymal stem cells (MSCs). The contribution of MSCs to disease pathogenesis has remained poorly explored.In this study MSCs were isolated from the bone marrow of the 22 MDS/AML patients and 8 controls and expanded in the cell culture. The surface antigen features of MSCs were analyzed by flow cytometry for MSC characterization. The osteogenic and adipogenic differantiation potentials of MSCs were also tested. RNA isolation was performed from MSCs and then miRNA expression profiles of MSCs were analysed by microarray technology. Differentially expressed miRNAs were validated by qRT-PCR. The genes regulated by miRNAs were identified by bioinformatic analyses and their mRNA levels were compared in patients and controls. DICER1 expression profiles were also be investigated in normal and patients. 189

Meme kanseri, klinik davranış ve genetik çeşitliliğe bağlı terapatik müdaheleye verdiği cevap açısından heterojen bir hastalıktır. Östrojen ve östrojen reseptörü meme kanserinin dörtte üçünde ifade gösterir ve meme kanserinin büyüme ve ilerlemesinde rol alır. HER2 (ErbB2) gen amplifikasyonu ve aşırı ifadesi ile ilişkili olarak artan protein seviyesi meme kanseri içerisinde %30 civarında görülür ve genellikle kötü prognoz ile koreledir Monoklonal antikor ve endokrin terapi, meme kanseri tedavisinde moleküler değişiklikleri temel alan terapatik uygulamalardan ikisidir. MikroRNA'lar (miRNA) 20-25 nt uzunluğunda protein kodlamayan RNA molekülleridir. miRNA'lar pekçok organizmada evrimsel olarak korunan diziler olup post-transkripsiyonel olarak gen ifadesini baskılarlar. Yapılan pekçok çalışma mikroRNA'ların meme kanserinde bilinen mekanizmaları etkileyebildiğini göstermekte ve bu düzenleyici RNA moleküllerinin tedavi sürecinde rol alabilecek alternatif hedef molekül olabileceğini göstermektedir.Bu çalışma, iki farklı meme kanseri alt-tipine uygulanan iki farklı ilacın ortak moleküler etki mekanizmalarını miRNA boyutunda açıklamayı hedefleyen ilk çalışmadır. Tez kapsamında üç farklı meme kanseri hücre hattında iki farklı ilaç muamelesi yapılmış ve ilaca duyarlı miRNA profilleri belirlenmiştir. miRNA'lara ait hedef genler ve rol aldıkları yolaklar veritabanları aracılığıyla belirlenmiştir. İlaç ve iki farklı meme kanseri alt-tipinden bağımsız olarak ortak olan ve anlamlı farklılık gösteren üç miRNA varlığı tespit edilmiştir. Bu üç miRNA meme kanseri tedavisinde hücre tipi ve terapiden bağımsız ortak miRNA imzası için aday hedef miRNA'lar olarak belirlenmiştir. Bu miRNA'ların olası hedeflerinin kullanılan ilaçların etki mekanizmalarındaki sinyal iletim yolaklarında yer alması ve kanserde varlığı bilinen ER-HER karşılıklı etkileşiminde aktif rol alan reseptörleri hedefleyerek kanserli hücrelerinin kaçış yollarını dururabileceği dikkat çekmektedir. Breast cancer is a heterogeneous disease in which clinical behavior and responses to therapeutic interventions depend on multiple genetic alterations. Oestrogens and oestrogen receptor (ER) play fundamental roles in the development and progression of more than three-quaters of breast cancers (BC). The HER2 (ErbB2) gene encodes an epidermal growth factor reseptor related tyrosine kinase that is overexpressed in 30 % of invasive breast cancers. For the treatment of breast cancer, therapeutic approaches have been developed based on particular molecular alterations. These include monoclonal antibodies and endocrine therapy. MicroRNAs (miRNA) are non-protein coding RNA sequences that have length of about 20-25 nucleotides (nt). miRNAs are evolutionary conserved in many organisms and have important regulatory functions. Studies support the crucial roles played by dysregulation of specific microRNAs in breast cancer progression. The potential of candidate microRNAs for clinical diagnosis and prognosis was revealed, and treatments involving microRNA achieved some amazing curative effects in cancer disease models.This is the first study that identifies the global expression profiles of miRNAs in tamoxifen and trastuzumab sensitive breast cancer cell lines. In this thesis study, the putative roles of miRNAs in relation to trastuzumab and tamoxifen response was investigated. miRNA qRT arrays were used to search for differentially expressed genes between three different breast cancer cell lines. At the end of analysis 3 common miRNAs were found to be significantly differentially expressed. The identification of predicted target genes of these miRNAs and the pathway enrichment analysis was performed by databases.The data obtained in this study emphasizes the potential targets of three miRNAs in the molecular regulation of drug mechanism, which explains the blocking of crosstalk between ER and ErbB family. 120

Anovulatuar infertilitenin en sık rastlanan sebeplerinden biri olan polikistik over sendromu (PKOS) infertiliteye sebep olan bir endokrin hastalığıdır ve hirsutizm, obezite, insulin direnci ve hiperinsülinemi ile alaka gösterdiği bilinmektedir. MikroRNA'lar (miRNA) gen regülasyonunda rol oynayan ve protein kodlamayan, 21-25 baz uzunluğunda endojen küçük RNA molekülleridir ve insan genlerinin %60'ının miRNA'lar tarafından düzenlendiği tahmin edilmektedir. miRNA'ların yumurtalıklarda ve oosit hücrelerindeki ifade profil çalışmaları henüz başlangıç aşamasındadır ve yumurtalıkta, oositlerde ya da yumurtalık somatik hücrelerinde (teka, granüloza, kumulus), ifade olan miRNA'ların PKOS gibi infertiliteye sebep olan hastalıklardaki rolü henüz ortaya konmamıştır.Bu çalışma PKOS'ta oosit mikroçevresini oluşturan somatik hücrelerden biri olan granüloza hücrelerinde miRNA profilinin belirlenmesine yönelik yapılan ilk çalışmadır. Tez kapsamında infertilite sebebi ile IVF tedavisine başvuran 14 PKOS hastası ve 9 normal bireyden elde edilen granüloza hücreleri ile miRNA mikrodizin çalışması gerçekleştirilmiştir. Mikrodizin verilerinin analizi sonucunda PKOS'ta normal bireylere göre anlamlı olarak farklılık gösteren 7 adet miRNA bulunmuştur. miRNA'lara ait tahmini hedef genler ve rol aldıkları yolaklar veritabanları aracılığıyla belirlenmiştir. Belirlenen tahmini hedefler; granüloza hücreleri ile PKOS ve normal bireyler kıyaslanarak gerçekleştirilen bağımsız mikrodizin çalışması kullanılarak biyoinformatik olarak doğrulanmıştır.Tez çalışması sonucunda daha önce PKOS ile ilişkilendirilmemiş 7 adet miRNA tespit edilmiştir. Bu miRNA'ların olası hedeflerinin daha önce PKOS ile ilişkilendirilmiş olması ve PKOS'ta etkin olduğu tespit edilen yolaklarda (MAPK, TGF-ß, steroidogenez, insülin sinyal yolakları) görev almaları ve bağımsız çalışmada biyoinformatik olarak doğrulanmaları miRNA'ların PKOS ile olan ilişkisinin güvenilirliğini artırmaktadır. Bu tez kapsamında elde edilen veriler miRNA'ların yumurta mikroçevresindeki moleküler düzenlemede aktif rol alabileceklerine dikkat çekmektedir. Polycystic ovary syndrome (PCOS) is an endocrine disorder and it is the most common cause of anovulatory infertility, which is related with hirsutism, obesity, insulin resistance and hyperinsulemia. MicroRNAs (miRNAs) are small non-coding RNA molecules that regulate gene expression and up to 60% of human protein coding genes are expected to be regulated by miRNAs. miRNA expression studies in the oocytes and ovaries are still at the very beginning and the roles of miRNAs expressed in oocytes or ovarian somatic cells (theca, granulosa, cumulus), have still not been revealed in reproductive infertility disorders such as PCOS.This is the first study that identifies the expression profiles of miRNAs in granulosa cells, which is one of the somatic cells of oocyte microenvironment, in PCOS. In this thesis study, miRNA microarray analysis was conducted with granulosa cells obtained from 14 PCOS patients and 9 healthy controls that are subjected to in vitro fertilization (IVF) procedure. At the end of microarray data analysis 7 miRNAs were found to be differentially expressed significantly in PCOS patients compared to normal controls. The identification of predicted target genes of these 7 miRNAs and the pathway enrichment analysis was performed by databases. Afterwards the target genes were validated bioinformatically by an independent microarray study.As a result of this thesis study 7 miRNAs that have not been previously associated with PCOS were identified. The potential targets of aforementioned miRNAs and the pathways they are enriched (MAPK, TGF-ß, ovarian steroidogenesis, insulin signaling pathway) were previously associated with PCOS. These relations together with the validation with an independent microarray study increases the reliability of the relationship of these miRNAs with PCOS. The data obtained in this study emphasizes the potential roles of miRNAs in the molecular regulation of oocyte microenvironment. 104

mikroRNA'lar (miRNA) gen ifadesini transkripsiyon sırasında ya da transkripsiyon sonrası düzenleyen küçük RNA molekülleridir. mikroRNA'lar, gelişim, hücre bölünmesi, hücre başkalaşması ve programlı hücre ölümü gibi biyolojik işlerde önemli roller üstlenmektedir. Bu doğrultuda değişen miRNA ifadesinin kanser gibi hastalıkların oluşumuna katkısı olması muhtemeldir ve yapılan çalışmalar miRNA'ların sadece kanser oluşumunda değil kanser gelişiminde de etkili olduklarını göstermektedir. Yoğunlaşmakta olan miRNA çalışmaları, miRNA klonlaması, kantitatif PZR ve mikrodizin gibi teknikleri kullanarak miRNA ifade profillerinin araştırılmasına olanak sağlamış ve bu araştırmaların sonucunda meme kanserinin de dahil olduğu pek çok kanser türünde anormal miRNA ifade profillerinin varlığı gösterilmiş ve onaylanmıştır. Bu çalışma meme kanserinde miRNA mikrodizin verilerini bir araya getiren ilk meta-analiz çalışmasıdır. Meme kanseri ile ilgili şimdiye kadar yapılmış, verilerine ve klinik bilgilerine ulaşılabilen miRNA mikrodizin çalışmaları, geliştirilen ANOVA temelli ve sıralama tabanlı meta-analiz yöntemi uygulanarak bir araya getirilmiş ve meme kanserinin alt tipleri için belirteç adayı miRNA'lar ortaya çıkartılmıştır (meta-miRNA). Elde edilen miRNA'ların hedef genlerinin belirlenmesi ve yolak analizlerinin yapılması, miRNA'ların meme kanseri oluşumu ve gelişimindeki rollerine açıklık getirmektedir. Ayrıca geliştirilen meta-analiz yöntemi meme kanserinde yapılmış olan ifade mikrodizin verilerine de uygulanmış ve yine meme kanseri alt tiplerinde ifade farklılıkları gösteren transkriptler (genler) ortaya çıkartılmıştır (meta-gen). Meta-miRNA'ların hedef genlerini meta-gen'ler ile kıyaslama imkanı da sağlayan bu çalışma ile meme kanserinde miRNA imzalarının bulunmasının yanı sıra miRNA-mRNA ilişkisi de açıklanmaya çalışılmıştır. Meta-miRNA'lar ve meta-mRNA'lar için doğrulama çalışmaları meme dokularında eş-zamanlı PZR yöntemi ile gerçekleştirilmiştir. Meta-analiz sonucu ortaya çıkan ve hepsi let-7 ailesine ait miRNA'ların, bağımsız tümörler ile yapılan eş-zamanlı PZR çalışması ile meme kanseri tümör dereceleri için belirteç adayı olduğu onaylanmıştır. Ayrıca meta-miRNA'ların hedeflerinin meta-analiz sonucu elde edilen meta-mRNA listeleri ile büyük ölçüde ortaklık gösterdiği bulunmuştur. Yolak analizleri sonucunda ortak hedeflerin istatistiksel olarak anlamlı şekilde hücre döngüsü, MAPK, Jak-STAT ve TGF-beta sinyal yolakları gibi kanserde önemi bilinen yolaklarda rol aldığı gösterilmiştir. Hedef genler ile gerçekleştirilen eş-zamanlı PZR sonuçları ve biyoinformatik analizler de meta-analiz sonuçlarını doğrular niteliktedir. MicroRNAs (miRNAs) are small RNA molecules that regulate gene expression post-transcriptionally. MicroRNAs play a key role in diverse biological processes, including development, cell proliferation, differentiation, and apoptosis. Accordingly, altered miRNA expression is likely to contribute to human disease, cancer formation and also progression. Intensifying research in miRNA studies, using a range of techniques including miRNA cloning, quantitative PCR and microarrays has resulted in the identification and confirmation of abnormal miRNA expression in a number of human malignancies including breast cancer This is the first meta-analysis study that combines miRNA microarray studies conducted in breast cancer. In this study, the breast cancer miRNA microarray studies were collected according to the availability of their raw data and combined by an ANOVA dependent ranking-based meta-analysis to find out candidate miRNA biomarkers (meta-miRNAs) that classify breast cancer into subtypes. The targets of meta-miRNAs were found and pathway analysis was performed with these target genes, which explained the roles of miRNAs in the development and progression of breast cancer. Furthermore the same meta-analysis approach was applied to the mRNA microarray studies in breast cancer and meta-genes that could classify breast cancer tumors into subtypes were demonstrated. With this study in addition to the identification of miRNA signatures the relation between miRNAs and mRNAs was also explained. The validation studies both for meta-miRNAs and meta-mRNAs were performed by qRT-PCR analysis. The qRT-PCR studies performed with independent breast tumors confirmed the potential biomarker role of let-7 family members in grade classification in breast cancer. Additionally the targets of meta-miRNAs were found to be highly correlated with the meta-mRNAs. The pathway analysis results showed that most of the common genes between miRNA targets and mRNAs were taking part in cancer related pathways like cell cycle, MAPK, Jak-STAT and TGF-beta. The qRT-PCR studies together with bioinformatic analyses confirmed the results of meta-analysis study 142

BACKGROUND: Breast cancer is a remarkably heterogeneous disease. Luminal, basal-like, "normal-like", and ERBB2+ subgroups were identified and were shown to have different prognoses. The mechanisms underlying this heterogeneity are poorly understood. In our study, we explored the role of cellular differentiation and senescence as a potential cause of heterogeneity. METHODOLOGY/PRINCIPAL FINDINGS: A panel of breast cancer cell lines, isogenic clones, and breast tumors were used. Based on their ability to generate senescent progeny under low-density clonogenic conditions, we classified breast cancer cell lines as senescent cell progenitor (SCP) and immortal cell progenitor (ICP) subtypes. All SCP cell lines expressed estrogen receptor (ER). Loss of ER expression combined with the accumulation of p21(Cip1) correlated with senescence in these cell lines. p21(Cip1) knockdown, estrogen-mediated ER activation or ectopic ER overexpression protected cells against senescence. In contrast, tamoxifen triggered a robust senescence response. As ER expression has been linked to luminal differentiation, we compared the differentiation status of SCP and ICP cell lines using stem/progenitor, luminal, and myoepithelial markers. The SCP cells produced CD24+ or ER+ luminal-like and ASMA+ myoepithelial-like progeny, in addition to CD44+ stem/progenitor-like cells. In contrast, ICP cell lines acted as differentiation-defective stem/progenitor cells. Some ICP cell lines generated only CD44+/CD24-/ER-/ASMA- progenitor/stem-like cells, and others also produced CD24+/ER- luminal-like, but not ASMA+ myoepithelial-like cells. Furthermore, gene expression profiles clustered SCP cell lines with luminal A and "normal-like" tumors, and ICP cell lines with luminal B and basal-like tumors. The ICP cells displayed higher tumorigenicity in immunodeficient mice. CONCLUSIONS/SIGNIFICANCE: Luminal A and "normal-like" breast cancer cell lines were able to generate luminal-like and myoepithelial-like progeny undergoing senescence arrest. In contrast, luminal B/basal-like cell lines acted as stem/progenitor cells with defective differentiation capacities. Our findings suggest that the malignancy of breast tumors is directly correlated with stem/progenitor phenotypes and poor differentiation potential.