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Der Abbaumechanismus von epoxidierten Fettsäuren ist wissenschaftlich von besonderem Interesse, da sie wichtige Aufgaben erfüllen (z. B. Regulation Pathogenabwehr) aber auch aufgrund ihrer gespannten Ringstruktur toxisch, kanzerogen und mutagen wirken können. Die enzymatische Umsetzung wird vor allem durch Epoxidhydrolasen (EH) katalysiert. Dabei werden unter Inversion der Konfiguration (trans-Hydrolyse) aus cis-Epoxiden threo-Diole und aus trans-Epoxiden erythro-Diole, die weiter zu Hydroxylactonen reagieren können. Die einzig für Saccharomyces cerevisiae bekannte EH ist die Leukotrien A4 Hydrolase. Sie hydrolisiert substratspezifisch [5S,6S]-Leukotrien A4 (LTA4) zu [5S,6S]-DEHETE unter Retention der Konfiguration. Um weitere EH in Saccharomyces Stämmen charakterisieren zu können, die unter Retention der Konfiguration arbeiten, wurde (±)-cis-[3,4-2H2]-3,4-Epoxydecansäuremethylester als Substrat synthetisiert. Für die Hydrolyse gibt es zwei Möglichkeiten: Einerseits unter Inversion der Konfiguration (chemisch) – Produkte: threo-[3,4-2H2]-3,4-Dihydroxydecansäuremethylester bzw. threo-[3,4-2H2]-3-Hydroxy-γ-decalacton und anderseits unter Retention der Konfiguration (enzymatisch durch ein bisher unbekanntes Enzym EH-1) – Produkte: erythro-[3,4-2H2]-3,4-Dihydroxydecansäuremethylester bzw. erythro-[3,4-2H2]-3-Hydroxy-γ-decalacton. Um die enzymatische Umwandlung des Substrats durch EH-1 zu charakterisieren, wurde ein Enzymparametertest im Miniinkubationsansatz entwickelt. Zur Analyse der Abbauprodukte wurde ein Verfahren mittels GC-EI-MS (SIM-Modus) etabliert. Die Enantiomere wurden dabei nicht gaschromatographisch getrennt. Als Messgröße für die enzymatische Umwandlung wurde der E/t-Quotient aus der Summe der Konzentrationen der erythro-Abbauprodukte zu der Summe der Konzentrationen der threo-Abbauprodukte festgelegt. Mit Hilfe des Enzymparametertests konnte die Existenz von EH-1 in einer Leukotrien A4 Hydrolase deletierten Knockout-Mutante S. cerevisiae BY4741 ΔYNL045W (Mutante) nachgewiesen werden. Dabei wurden folgende Parameter für EH-1 optimiert: pH-Optimum in Phosphat- und Tris/EDTA-Puffer (zwei lokale Maxima pH-Bereich > 8,0), Zellkonzentration (80 mL Zellbrühe auf 10 mL Puffer), Substratkonzentration (0,27 mg/mL), Pufferkonzentration (10 mM), Temperatur (24 ± 1 °C) sowie Dauer der Inkubation (20 bis 24 h). Für S. cerevisiae BY4741 Wildtyp (Wildtyp) sowie für S. carlsbergensis RH (RH Stamm) wurden vergleichbare Ergebnisse erzielt, dabei lagen für den Stamm mit der höchsten Zelldichte auch die E/t-Quotienten am höchsten. Für S. bayanus lag die Zelldichte immer am höchsten, die E/t-Quotienten waren aber niedriger als für die anderen Stämme. Die Lokalisierung von EH-1 in der Mutante erfolgte mittels Zellaufschluss. Dabei wurden sowohl im Pellet als auch im Überstand enzymatisch gebildete erythro-Abbauprodukte gefunden. In Phosphatpuffer lagen die E/t-Quotienten im Pellet höher und in Tris/EDTA-Puffer im Überstand. Somit konnte die Lokalisierung von EH-1 nicht eindeutig geklärt werden. Auch nicht mit Hilfe der anderen drei Stämme, da diese vergleichbare Ergebnisse lieferten. Mittels Isoelektrischer Fokussierung (IEF) wurde der Isoelektrische Punkt von EH-1 über die Fraktionen mit dem höchsten E/t-Quotienten auf den pH-Bereich 5,15 bis 5,75 eingegrenzt. Die Ergebnisse für Wildtyp und RH Stamm waren vergleichbar. Für S. bayanus ergaben sich zwei lokale Maxima. Das Molekulargewicht von EH-1 konnte in der Mutante mittels SDS-PAGE auf < 78 kDa eingegrenzt werden, mit einem Hinweis auf ca. 30 kDa. Wildtyp und RH Stamm lieferten vergleichbare SDS-Gele. Für S. bayanus ergab sich ein komplett anderes Bild bei den SDS-Gelen. Dies lag möglicherweise an dem unterschiedlichen Genotyp im Vergleich zu den S. cerevisiae Stämmen. Bei S. carlsbergensis RH handelt es sich um einen Hybrid aus S. bayanus und S. cerevisiae. Der RH Stamm lieferte vergleichbare Ergebnisse zu den S. cerevisiae Stämmen. Deshalb ist davon auszugehen, dass in Bezug auf den Abbau epoxidierter Fettsäuren, die genetische Ausprägung der S. cerevisiae dominiert. Da die Ergebnisse zur Lokalisierung von EH-1 nicht eindeutig waren, handelt es sich bei EH-1 möglicherweise nicht um ein Enzym, sondern um verschiedene Enzyme. Weitere Hinweise darauf sind zwei lokale Maxima für das pH-Optimum in Phosphat- und Tris/EDTA-Puffer sowie ein vergleichsweise breiter pH-Bereich für den Isoelektrischen Punkt. The hydrolysis of epoxy fatty acids (EFAs) is an important concern of life sciences and related fields of research. EFAs have multiple roles in nature, their reactive epoxide function is responsible for their toxic, carcinogenic, and mutagenic properties. The hydrolysis of EFAs is primarily catalyzed by enzymes called epoxide hydrolases (EH). EH hydrolyze cis-epoxides into threo-diols and trans-epoxides into erythro-diols. Those diols can further react into hydroxy lactones. The epoxide hydrolysis occurs under retention of the configuration, also called trans-hydrolysis. In Saccharomyces cerevisiae only one EH has been characterized so far. However, this EH, namely the Leukotrien A4 hydrolase, hydrolyses [5S,6S]-Leukotrien A4 (LTA4) into [5S,6S]-DEHETE under retention of its configuration. Previous work indicate the occurrence of an additional EH enzyme in yeast, thus the aim of the present work was to prove its presence and to characterize this enzyme, (here called EH-1). For this purpose a stable isotope labeled substrate ((±)-cis-[3,4-2H2]-3,4-epoxydecanoate) was chemically synthesized and used in comparative incubation experiments including four different yeast strains. Generally, two routes of substrate conversion can occur: Firstly, hydrolysis under inversion of configuration yielding threo-[3,4-2H2]-3,4-dihydroxydecanoate and threo-[3,4-2H2]-3-hydroxy-γ-decalactone. Secondly, hydrolysis under retention of configuration yielding erythro-[3,4-2H2]-3,4-dihydroxydecanoate and erythro-[3,4-2H2]-3-hydroxy-γ-decalactone. The first reaction proceeds chemically, whereas the second reaction is catalyzed by a so far unknown enzyme EH-1. In order to monitor the activity of EH-1 an enzyme parameter assay (micro incubation) as well as a GC-SIM-MS method for quantification the 2H-labeled diastereomers of diols and hydroxy lactones was established, without separating the enantiomers. Enzyme catalysis (activity) was judged by introduction of the so called E/t-quotient, which compares the ratio of chemical threo- and enzymatic erythro-degradation products. By means of incubation experiments using S. cerevisiae BY4741 ΔYNL045W (mutant), in which genes for Leukotrien A4 Hydrolase are deleted, the presence of EH-1 was evidenced. Highest enzyme activity was detected in incubations (20-24 hours) in 10 mM phosphate or Tris/EDTA buffers with pH > 8 (two local optima), a substrate concentration of 0,27 mg/mL at 24 ± 1 °C. Incubation experiments revealed similar EH activities for the mutant strain, S. cerevisiae BY4741 Wildtyp (wild type), as well as for S. carlsbergensis RH (RH strain). Enzyme activity and cell density correlated, with exception for S. bayanus, which showed the highest cell density but the lowest E/t-quotient throughout the incubation experiments. In order to characterize EH-1, its localization within the yeast cell, its molecular weight (MW), and isoelectric point (IEP) were determined. Enzyme localization was carried out by cell disruption (ball mill). In phosphate buffer higher EH-1 activities were found in the pellets (bound enzyme), in Tris/EDTA buffer higher EH-1 activities were found in the supernatant (soluble enzyme). Thus, the enzyme localization in the mutant strain could not be clarified, whereas similar results were obtained for wild type, RH strain, and S. bayanus. Isoelectric focusing resulted in an IEP in the range of pH 5,15 - 5,75, for mutant, wild type, and RH strain, whereas S. bayanus showed two local maxima in that range. SDS-PAGE provided the following information: The MW of EH-1 is

Kuhpockenviren (CPXV) verursachen die häufigsten zoonotischen Orthopockenvirus (OPV) Infektionen in Europa und Nord- sowie Zentralasien 1. Das Virus besitzt das breiteste Wirtsspektrum der OPV und wird von Nagetieren sowie weiteren Wildtieren aber auch domestizierten Tieren auf den Menschen übertragen 2. CPXV besitzen außerdem die größte genetische Diversität und den größten Satz an OPV Genen, der auch alle open reading frames des Variola Virus (VARV) beinhaltet 2. Das Ansteigen von CPXV Infektionen beim Menschen in einer Gesellschaft mit abnehmender Immunität hat Bedenken wegen des zoonotischen Potentials des Virus hervorgerufen 1. Während das Vaccinia Virus (VACV) in der Literatur als Modell für Untersuchungen der Pathogenität und des Wirtstropismus von OPV dient, sind CPXV-spezifische Studien unterrepräsentiert. Die Charakterisierung der CPXV-Partikel, sowie die Analyse CPXV-stammspezifischer Papthogenitätsunterschiede, sollen als Grundlage dienen das Gefährdungspotential dieser aufkommenden Zoonose zukünftig besser einschätzen zu können. Im Gegensatz zum Vaccinia Viren (VACV) und Affenpockenviren (MPXV) ist die Proteinzusammensetzung des CPXV Mature Virion bisher nicht beschrieben. Die Zusammensetzung des CPXV Mature Virion (MV) Proteoms ist im Rahmen dieser Arbeit erstmals qualitativ und quantitativ mit Nano-Flüssigchromatographie (nLC) und Elektrospray-Ionisation (ESI) Tandem Massenspektrometrie (MS/MS)) basierten Proteomanalysen verschiedener Kuhpockenvirusisolate ebenso untersucht worden, wie die Ubiquitinierung von viralen Proteinen, und die Assoziation von Wirtszellproteinen. Das konservierte MV Proteom von drei verschiedenen CPXV Stämmen unterschiedlicher Ursprungsspezies besteht demnach aus 101 viralen Proteinen, die zu 25 % ubiquitiniert und mit 160 Wirtsproteinen assoziiert sind. Die zehn häufigsten viralen Proteine repräsen¬tieren dabei mehr als 50 mol% des Gesamtpartikels. CPXV und VACV MV unterscheiden sich in mittel und niedrig exprimierten Proteinen, zu denen immunmodulatorische Proteine und ein host-range Faktor zählen, die CPXV Schutz vor der Immunantwort in der frühen Replikationsphase bereits vor der Synthese früher Proteine bieten können. Die Ergebnisse reflektieren dabei die Situation in vivo, die durch einen breiteren Wirtstropismus und ein höheres pathogenes Potential von CPXV gegenüber VACV gekennzeichnet ist. Für Pockenviren ist bisher kein zellulärer Rezeptor beschrieben, es wird aber vermutet, dass zelluläre Faktoren für das attachment und den entry ubiquitär verbreitet sein müssen, da OPV die meisten Säugetierzelllinien penetrieren können. Mit einem Ansatz aus nativer Gelelektrophorese gekoppelt mit nLC-MS/MS und Cluster Analysen des Co-Migrationsverhaltens der Proteine im nativen Gel sind Proteinkomplexe zwischen der Membran humaner Zellen und CPXV während des attachments identifiziert und die Resultate der Cluster Analysen in einem attachment Netzwerk visualisiert worden. Einige der zellulären Membranproteine sind, wie vermutet, ubiquitär in verschiedenen Zelltypen verbreitet und innerhalb der Säugetiere hoch konserviert. Die vorliegenden Analysen der CPXV MV sind damit die bislang umfassendste Charakterisierung von OPV-Partikeln auf Proteomebene. Natürlich auftretende Infektionen und Tierexperimente haben gezeigt, dass die CPXV-Pathogenität von der Wirtsspezies, dem Infektionsweg und dem Virusstamm abhängig ist 3,4. Die Gründe für die Pathogenitätsunterschiede verschiedener CPXV-Stämme sind bisher unbekannt. In dieser Arbeit sind Mechanismen identifiziert worden, die für Pathogenitätsunterschiede verschiedener CPXV Stämme in vivo verantwortlich sein können. Zwei im Rattenmodell verschieden pathogene Stämme sind dafür in den Genomsequenzen, dem Wachstum auf verschiedenen Zelllinien, der viralen Proteinexpression und dem Einfluss auf das Proteom humaner Keratinozyten (HaCaT) miteinander verglichen worden. Die quantitativen shotgun Proteomanalysen der Viruspartikel, des Zellkulturüberstands, der für die Immunmodulation wichtige sekretierte Protein enthält, und des Zytoplasmas, dem Ort der viralen Replikation, sind mittels nLC-MS/MS und stable isotope dimethyl labeling durchgeführt worden. Diese Untersuchungen zeigen, dass sich OPV nicht nur in der Ausstattung und der Sequenz von immunmodulatorischen Proteinen unterscheiden, sondern diese zudem unterschiedlich stark exprimieren können. Die Pathogenitätsunterschiede der Stämme in vivo können demnach die Folge verschieden stark exprimierter viraler Zytokinrezeptoren und damit einer unterschiedlich effektiv inhibierten Immunantwort sein. Cowpox Virus (CPXV) is the cause of most zoonotic orthopoxvirus (OPV) infections in Europe and North- as well as Central Asia 1. The virus has the broadest host range of OPV and is transmitted to humans from rodents and other wild and domestic animals 2. Furthermore, CPXV possess the largest set of OPV genes, which contain all Variola Virus (VARV) open reading frames 2. The rise of human CPXV infections in a society with declining immunity has raised concerns about the virus’ zoonotic potential 1. While Vaccinia Virus (VACV) is usually used as a model for the analysis of pathogenicity and host tropism of OPV, CPXV-specific studies are underrepresented in the literature. The characterization of CPXV-particles, as well as the analysis of strain-specific differences in pathogenicity, can serve as a foundation for the evaluation of the hazard potential of this emerging zoonoses in the future. In contrast to Vaccinia Virus (VACV) and Monkeypox Virus (MPXV), the protein composition of the CPXV Mature Virion (MV) is unknown. In this study, the proteome of CPXV viral particles has been analysed qualitatively and quantitatively using mass spectrometry based proteomic methods (nano-liquid-chromatography (nLC) and electrospray ionisation (ESI) tandem mass spectrometry (MS/MS)) for the first time, as well as the ubiquitination of virus proteins and associated host proteins. The conserved CPXV MV proteome of three various strains from different host species has been determined to consist of 101 viral proteins, 25 % of them are ubiquitinated and 160 host proteins are associated. The ten most abundant viral proteins represent more than 50 mol% of the virus particle. CPXV and VACV MV differ in medium and low abundant proteins, among them are immunomodulators and host range factors, which might protect CPXV from immune response in the early replication phase prior to protein synthesis. The results reflect the in vivo situation, which is characterized by a broader host range and higher pathogenic potential of CPXV compared to VACV. No cellular receptor for OPV has been identified so far, although it is assumed that cellular factors for attachment and entry need to be spread ubiquitously, since OPV can enter most mammalian cell lines. Cellular binding partners of viral membrane proteins during the attachment of CPXV to a human cell membrane have been identified by combining native gel electrophoresis and nLC-MS/MS with cluster analysis of the co-migration behavior of proteins in the gel. The results have been visualized in an attachment network. Some cellular members of the attachment complex are distributed ubiquitously in different cell types and are highly conserved among mammals. To date, the present analysis is the most comprehensive characterization of OPV particles on a proteome level. Naturally occuring infections and animal experiments have shown that pathogenicity of CPXV depends on the host species, the route of infection and the viral strain 3,4. Mechanisms that might be related to strain-specific pathogenicity in vivo have been identified in this thesis. Therefore, the genome sequence, the growth kinetics on different cell lines, the viral protein expression as well as the influence of an infection on the proteome of human keratinocytes (HaCaT) have been compared for two CPXV strains with different pathogenicity in a rat model. The quantitative shotgun proteome analysis of viral particles, the secretome, which contains proteins related with imunmodulation, and the cytoplasm, the place of the virus replication, have been carried using nLC-MS/MS and stable isotope dimethyl labelling. These investigations show for the first time that OPV differ not only in their equipment and sequence of virus-host interactors but also in their degree of expression. The different pathogenicity of the strains in vivo may therefore be the result of an altered expression of viral cytokine receptors, which might modulate the antiviral immune response with different effectivity.

http://tartu.ester.ee/record=b2286645~S1*est