Tese de Doutoramento em Engenharia Biológica O stresse hídrico é o factor que mais limita a produção vegetal à escala mundial, reduzindo significativamente os lucros da actividade agrícola. Do ponto de vista ecofisiológico, designa-se por stresse hídrico qualquer limitação ao funcionamento óptimo das plantas imposta por uma insuficiente disponibilidade de água. As respostas das plantas à falta de água são complexas, envolvendo uma série de adaptações/aclimatações e efeitos nefastos, ou ambos. Por outro lado, à secura do solo associa-se uma forte evaporação causada pela secura do ar, elevada temperatura e elevados níveis de radiação durante o período estival, pelo que é frequente classificar este efeito conjunto de stresse estival. A oliveira (Olea europaea L.) é uma árvore de folhagem persistente, crescimento lento e grande longevidade. Conta-se entre as poucas plantas cultivadas de origem mediterrânea e a sua difusão é muito antiga. Julga-se que foi domesticada por volta de 3000−4000 anos antes de Cristo na Ásia Menor e a partir daí foi introduzida no Norte de África, Península Ibérica e resto do Sul da Europa pelas civilizações que sucessivamente ocuparam a região mediterrânica. Nos últimos 500 anos foi levada para as Américas, África do Sul, Austrália, China e Japão, mas mantém-se principalmente uma cultura da bacia mediterrânica. O seu cultivo prosperou na região, mesmo em solos pobres, porque esta espécie é capaz de produções aceitáveis, apesar de sujeita à característica falta de água prolongada durante o Verão. A crescente popularidade da oliveira como árvore de fruto relaciona-se com o aumento da procura dos seus produtos. Esta tendência favorável do mercado é parcialmente devida aos estudos científicos que demonstram as vantagens do consumo regular de azeitonas e azeite na saúde humana. De facto, o baixo teor de ácidos gordos saturados e a presença de antioxidantes pode ajudar a prevenir certas doenças. Os benefícios para a saúde induzidos pelo consumo de azeitonas e azeite virgem são devidos à acção sinérgica de diversos constituintes, como vitaminas (por exemplo α-tocopherol), fitoesteróis, pigmentos, ácidos terpénicos e compostos fenólicos. Segundo a Organização das Nações Unidas para a Agricultura e a Alimentação (FAO), a área mundial de olival é cerca de 7,5 milhões de hectares e os principais produtores são a Espanha, Itália, Grécia, Tunísia, Turquia, Síria, Marrocos e Portugal. A cultura da oliveira é conhecida em Portugal desde o domínio romano, sendo uma das mais importantes culturas do País, particularmente em Trás-os-Montes, onde detém considerável importância económica, social e ambiental. A excelente qualidade do azeite produzido na região e as suas características únicas são responsáveis pela denominação de origem protegida ῾Azeite de Trás-os-Montes DOP̕. A criação da denominação de origem é relativamente recente e estimulou a economia local, nomeadamente adicionando valor ao azeite produzido na região. Tal como outras regiões do Sul da Europa, Portugal é um local de clima Mediterrânico temperado, mas vulnerável às alterações climáticas. Todos os modelos, em todos os cenários, prevêem um aumento de temperatura média em Portugal no final do século XXI. Os cenários de precipitação são muito mais incertos. Contudo, quase todos os modelos prevêem uma redução da precipitação em Portugal Continental durante a Primavera, Verão e Outono. As alterações climáticas à escala global irão afectar significativamente as colheitas das culturas da região mediterrânica. No entanto, o impacto na produção das culturas será determinado pela capacidade dos agricultores/técnicos de se adaptarem aos novos cenários. São várias as práticas culturais que podem auxiliar a oliveira a sobreviver e a produzir em ambientes de baixa disponibilidade hídrica. Estas práticas visam alcançar um equilíbrio entre a necessidade de transpiração e a água disponível, especialmente durante o longo e seco Verão. Decisões estratégicas são a selecção de cultivares, a densidade de plantação e o tamanho da copa, juntamente com a gestão da superfície do solo. Recentemente, a rega foi introduzida para aumentar produtividade do olival. A expansão do cultivo da oliveira devido à crescente procura dos seus produtos levou a que as novas plantações fossem caracterizadas por um maior número de árvores por hectare, comparativamente aos olivais tradicionais. Nestes sistemas de cultivo intensivo, a rega é essencial para garantir a optimização da aplicação de água para o crescimento da árvore e produção de azeitona. Todavia, isso pode ser problemático devido aos limitados recursos hídricos disponíveis na região mediterrânica. Uma gestão prudente da água é, por isso, essencial para uma olivicultura sustentável. A redução da disponibilidade hídrica antecipada pelos cenários das alterações climáticas à escala global irá inevitavelmente agravar o problema da escassez de água em toda a região mediterrânica. Uma vez que a oliveira é a principal cultura da bacia mediterrânica, é fundamental analisar como esta espécie será afectada por uma reduzida disponibilidade hídrica. A melhoria da performance da oliveira não pode ser conseguida sem que os mecanismos de resistência à seca sejam claramente identificados. Tal não é possível sem que haja uma completa compreensão das limitações e dos danos induzidos por um fornecimento de água insuficiente. A análise da literatura científica apresentada no capítulo 1 revela que a oliveira possui importantes atributos que lhe permitem sobreviver e produzir em ambientes áridos. No entanto, muitos aspectos importantes da resistência à seca não foram ainda abordados e são poucas as diferenças estabelecidas entre cultivares de O. europaea. Apesar das cultivares com maior importância na região de Trás-os-Montes serem consideradas bem adaptadas às condições locais, não existem estudos científicos que documentem a sua adaptação ao défice hídrico. Por isso, traçaram-se três grandes objectivos: Identificar, em condições de campo, as adaptações morfo-anatómicas, fisiológicas e bioquímicas de várias cultivares de oliveira; estudar, em condições controladas, as respostas imediatas e as estratégias adaptativas das cultivares de oliveira mais representativas na região de Trás-os-Montes e avaliar os sintomas de stresse oxidativo induzidos pela baixa disponibilidade hídrica; estudar num olival comercial a influência de diferentes níveis de rega no comportamento fisiológico de oliveiras adultas e analisar os danos oxidativos e a protecção antioxidante ao nível foliar em árvores regadas e não regadas. Para alcançar tais objectivos, foram realizadas três experiências. A componente experimental desta dissertação resulta dos dados obtidos nessas experiências e está estruturada em cinco capítulos, cujos conteúdos incluem integralmente a informação publicada ou submetida a revistas indexadas na lista do Journal Citation Reports. A primeira experiência decorreu em 2001 e 2002 num olival da Direcção Regional de Agricultura de Trás-os-Montes, instalado em Mirandela (Terra Quente Transmontana). Foram analisadas oliveiras com dez anos de idade de cinco cultivares com diferentes origens geográficas (Trás-os-Montes e diferentes regiões de Espanha): Arbequina, Blanqueta, Cobrançosa, Manzanilla e Negrinha de Freixo (daqui em diante designada simplificadamente por Negrinha). No capítulo 2 o objectivo específico foi identificar os mecanismos morfo-anatómicos e as adaptações estruturais para reduzir a perda de água pelas folhas das cinco cultivares de oliveira. Foram analisados diversos parâmetros foliares: a espessura dos diferentes tecidos, a densidade estomática, a área foliar, a massa por unidade de área foliar (LMA), a densidade do tecido foliar (D), o conteúdo relativo em água (RWC), a suculência, o défice de saturação em água (WSD), o conteúdo em água em folhas saturadas (WCS) e a taxa de transpiração cuticular. Foram também efectuadas determinações do potencial hídrico do caule antes do nascer do sol (ΨPD) e ao meio-dia solar (ΨMD). Este estudo indicou que as folhas das cinco cultivares possuem diferentes mecanismos ao nível morfo-estrutural para ultrapassar o stresse estival. Apesar das folhas de todas as cultivares serem bem adaptadas à luminosidade intensa, foi demonstrado que as cultivares nativas de regiões mais secas, como a Cobrançosa, a Negrinha e a Manzanilla apresentaram folhas mais protegidas contra a perda de água do que as cultivares oriundas de regiões com um clima mais temperado, como a Arbequina e a Blanqueta. Verificou-se que as folhas das cultivares mais resistentes apresentavam maior grau de esclerofilia. A Cobrançosa revelou elevada densidade do tecido foliar (i.e. elevada razão parênquima clorofilino em paliçada/parênquima clorofilino lacunoso) e espessas camadas de cutícula e de escamas peltadas, enquanto a Manzanilla e a Negrinha aumentaram a esclerofilia ao nível foliar, aumentando a espessura dos tecidos parenquimatosos e de estruturas de protecção, como a cutícula superior (Negrinha) e as epidermes superior e inferior (Manzanilla). As folhas da Arbequina apresentaram a menor espessura total da lâmina e uma camada de escamas peltadas mais fina, o que implica que são menos protegidas contra a perda de água. Para além disso, esta cultivar apresentou os valores mais elevados de transpiração cuticular, em resultado de possuir uma camada cuticular mais fina e/ou devido a diferenças na estrutura e composição da cutícula. Como consequência, e apesar do desenvolvimento de folhas mais pequenas, esta cultivar apresentou menor RWC e ΨMD e maior WSD. Por seu lado, a Blanqueta apresenta folhas de maiores dimensões, responsáveis por uma maior perda de água. No capítulo 3 foram estudadas as variações diurnas das trocas gasosas das cinco cultivares e avaliadas as limitações na fotossíntese impostas pelas condições de sequeiro. Foram também analisados mecanismos de tolerância à seca associados à acumulação de açúcares solúveis, proteínas solúveis e prolina nas folhas. A variação diurna da taxa de fotossíntese das cultivares de oliveira seguiu uma tendência típica da vegetação lenhosa mediterrânica, com um máximo de manhã e mínimo ao meio-dia ou durante a tarde. Contudo, o grau de depressão da fotossíntese ao meio-dia foi dependente do genótipo, com um máximo na Arbequina e um mínimo na Negrinha. O controlo estomático da perda de água foi identificado como uma resposta inicial das oliveiras ao défice hídrico, levando a uma limitação da assimilação do carbono pelas folhas. No entanto, verificou-se que as reduções na taxa de assimilação de CO2 também foram atribuídas a factores não estomáticos, particularmente na cultivar Blanqueta. A acumulação de prolina nas folhas de todas as cultivares, essencialmente na Manzanilla, indica um possível papel deste aminoácido na tolerância à seca da espécie O. Europaea. A segunda experiência foi efectuada numa estufa situada no campus da UTAD durante o ano de 2002. Este estudo foi desenvolvido em oliveiras envasadas, com um ano de idade, das três cultivares mais representativas na região de Trás-os-Montes (Cobrançosa, Madural e Verdeal Transmontana), submetidas a diferentes regimes hídricos durante a época estival (bem regadas − regadas três vezes por semana com a água necessária para manter o solo à capacidade de campo; baixa disponibilidade hídrica − 1/3 da água aplicada às bem regadas). No capítulo 4 foram objecto de estudo os efeitos da cultivar e do regime hídrico no crescimento e repartição de biomassa, nas trocas gasosas, nas propriedades hidráulicas do xilema e na eficiência do uso da água. Verificou-se que a baixa disponibilidade de água afectou negativamente o crescimento e a acumulação de biomassa em todas as cultivares, embora em menor grau na Cobrançosa. Verificou-se também que as plantas reagiram à baixa disponibilidade hídrica desenvolvendo mecanismos para evitar a seca baseados no controlo estomático, alterações das propriedades hidráulicas do xilema e redução da área foliar. O decréscimo na taxa de crescimento relativo (RGR) das plantas sob baixa disponibilidade hídrica foi associado a decréscimos da taxa média de assimilação aparente (NAR) e da razão da área foliar (LAR). A menor LAR foi devida a uma menor translocação de biomassa para as folhas (LWR) e, sobretudo, a uma menor área foliar específica (SLA), em consequência de uma maior densidade do tecido foliar. As plantas da cultivar Verdeal Transmontana foram uma excepção a este comportamento, revelando uma tendência para uma maior LAR sob baixa disponibilidade hídrica, em resultado de uma maior expansão das folhas jovens. Sob stresse hídrico, a área foliar por planta foi drasticamente reduzida em todas as cultivares devido a uma combinação da redução da expansão foliar e da abscisão precoce das folhas mais velhas. Outra constatação importante foi que a baixa disponibilidade hídrica induziu um aumento na frequência de vasos xilémicos em todas as cultivares, proporcionado um maior potencial vascular e uma maior segurança da condução da seiva. As plantas da cultivar Cobrançosa que cresceram em condições de baixa disponibilidade hídrica foram as únicas que revelaram maior condutividade hidráulica relativa que as plantas controlo, mas igual índice de vulnerabilidade à cavitação. No capítulo 5 foram estudados o efeito da cultivar e do regime hídrico na anatomia e estrutura foliar, composição química e relações pressão-volume das folhas e os sintomas de stresse oxidativo induzidos pela baixa disponibilidade hídrica. Anatomicamente, a Cobrançosa e a Madural mostraram-se capazes de lidar melhor com a baixa disponibilidade hídrica que a Verdeal Transmontana. As folhas da Cobrançosa e da Madural revelaram uma epiderme superior e um parênquima clorofilino em paliçada mais espessos e maior densidade estomática que a Verdeal Transmontana. A disponibilidade hídrica apresentou um papel determinante na modificação da estrutura foliar. Assim, as folhas das plantas que cresceram com baixa disponibilidade de água tiveram uma menor SLA que as plantas controlo, em resultado de um aumento da D, uma vez que não foram observadas diferenças de espessura. Entre cultivares, a Cobrançosa apresentou menor SLA e maior D. A maior D pode ser útil para esta cultivar, uma vez que as folhas com maior D têm mais capacidade de resistir à seca severa, apresentando maior resistência aos danos físicos por dessecação. A Cobrançosa e a Madural também mostraram maior capacidade de ajustamento osmótico e um aumento da rigidez dos tecidos em condições de baixa disponibilidade hídrica. Contrariamente, a Verdeal Transmontana não exibiu ajustamento osmótico, mas foi capaz de aumentar a elasticidade dos tecidos e a concentração de proteínas solúveis. As folhas que cresceram com baixa disponibilidade hídrica mostraram sinais de stresse oxidativo, com decréscimos nas concentrações de pigmentos fotossintéticos e tióis totais e níveis elevados de peroxidação lipídica. No entanto, essas plantas desenvolveram alguns mecanismos de defesa contra o stresse oxidativo, como o aumento das concentrações de compostos fenólicos totais e de proteínas solúveis totais. O aumento da concentração de substâncias reactivas com o ácido tiobarbitúrico (TBARS) e o decréscimo da concentração de tióis totais em condições de baixa disponibilidade hídrica sugere que os mecanismos de defesa contra o stresse oxidativo foram menos eficazes na Madural. Do comportamento da Cobrançosa, com menor translocação de biomassa para as folhas, uma menor redução de NAR, um transporte de água pelo xilema mais eficiente, uma maior eficiência do uso da água para a produção de biomassa em condições de baixa disponibilidade de água e maior protecção contra o stresse oxidativo, é possível concluir que se trata da cultivar mais adequada para cultivo em condições de baixa disponibilidade hídrica. A terceira experiência decorreu durante três anos consecutivos, de 2002 a 2004, num olival comercial (cv. Cobrançosa) em Vilarelhos (Vale da Vilariça, Terra Quente Transmontana). As oliveiras com oito anos de idade foram submetidas às situações de sequeiro (T0) e três tratamentos de rega durante o período estival (T1, T2, T3), equivalente a 30, 60 e 100% da evapotranspiração potencial, respectivamente. No capítulo 6 foi estudada a influência dos diferentes regimes hídricos nas trocas gasosas e fluorescência da clorofila a. Foram também analisados os danos por stresse oxidativo e a protecção antioxidante ao nível foliar em árvores regadas e não regadas. O estudo revelou que todos os níveis de rega melhoraram a taxa de fotossíntese aparente das oliveiras e reduziram a depressão da fotossíntese e da condutância estomática observada durante os períodos do meio-dia e tarde. Verificou-se também a ocorrência de fotoinibição dinâmica ao meio-dia solar nas árvores regadas principalmente nas árvores sujeitas aos tratamentos T2 e T3, o que parece ter sido eficaz para proteger o aparelho fotossintético. As folhas das oliveiras que cresceram em condições de sequeiro revelaram sintomas de stresse oxidativo, como um menor teor clorofilino e níveis elevados de peroxidação lipídica. Observou-se também a redução da actividade da enzima superóxido dismutase nas árvores não regadas. Contrariamente, as baixas concentrações de TBARS nas folhas das plantas regadas, indicam que a rega reduz os danos oxidativos por peroxidação lipídica. Concluiu-se também que a rega aumenta a protecção antioxidante ao nível foliar, visto que as folhas das árvores regadas apresentavam maiores concentrações de tióis totais e maior actividade antioxidante total in vitro. Contudo, a maior actividade da enzima guaiacol peroxidase nas folhas das plantas de sequeiro, associada à manifestação de danos oxidativos, sugere que esta enzima não tem um papel antioxidante muito importante na oliveira. Adicionalmente, os resultados demonstraram que as árvores regadas com o equivalente a 30% da evapotranspiração potencial tiveram maior eficiência intrínseca do uso da água ao meio-dia e à tarde, permitindo economizar grandes volumes de água, o que justifica o RWC similar às árvores dos tratamentos T2 e T3. Para além disso, este nível de rega pareceu ser suficiente para reduzir os danos oxidativos ao nível foliar. Este resultado é importante, uma vez que uma estratégia de rega deficitária é essencial para uma olivicultura sustentável devido aos limitados recursos hídricos na região mediterrânica Olive (Olea europaea L.) is an evergreen tree traditionally cultivated in the Mediterranean basin for oil and table fruit consumption. During the summer months, olive, like other Mediterranean xerophytes, is usually subjected to high solar irradiances, high air temperatures, high vapour pressure deficits and limited water availability in the soil. The reduction of moisture availability anticipated in the climate change scenarios would inevitably add to the problem of water scarcity throughout the Mediterranean region. So, how olive trees are affected by restricted water availability, is of great concern. A survey of the scientific literature revealed that olive has important attributes that enable survival and production in drought-prone environments (chapter 1), but important areas are still untouched and few differences have been established between O. europaea cultivars. Therefore, the aim of this thesis was to identify the drought resistance mechanisms of olive tree cultivars and the limitations and damages imposed by water shortage. It was also our goal to investigate how irrigation assists the olive tree to withstand Mediterranean field conditions. The experimental work was divided in five chapters, which include the information published or submitted to journals belonging to the Journal Citation Reports. Three experiments have been conducted. In the first experiment, we investigated the morpho-anatomical, physiological and biochemical adaptations of five field-grown olive cultivars with different geographical origins (Arbequina, Blanqueta, Cobrançosa, Manzanilla and Negrinha) to drought conditions (chapters 2 and 3). Chapter 2 presents data on the leaf-level morphological and structural adaptations to reduce water loss. Leaf measurements included leaf tissue thickness, stomatal density, leaf area, leaf mass per unit area, density of leaf tissue, relative water content, succulence, water saturation deficit, water content at saturation and cuticular transpiration rate. The results revealed that olive cultivars native to dry regions, such as Cobrançosa, Negrinha, and Manzanilla, have more capability to acclimate to drought conditions than cultivars originated in regions with a more temperate climate, like Arbequina and Blanqueta. Adaptation was effected by an increase in sclerophylly. Cobrançosa avoids water loss with high density of foliar tissue and the presence of the thick cuticle and trichome layers. Manzanilla and Negrinha enhanced their sclerophylly by building parenchymatous tissues and increasing protective structures like the upper cuticle (Negrinha) and both the upper and lower epidermis (Manzanilla). In chapter 3, gas exchange rates, chlorophyll a fluorescence, photosynthetic pigments, plant water relations, total soluble sugars, starch, soluble proteins and proline concentrations were investigated in the five olive cultivars. Stomatal control of water loss was identified as an early response of all olive cultivars to water deficit, leading to limitation of carbon uptake by the leaves. However, the degree of midday depression of photosynthesis was genotype dependent, with a maximum in Arbequina and a minimum in Negrinha. Non-stomatal factors also play an important role in limiting photosynthesis when olive cultivars (mainly Blanqueta) are submitted to prolonged drought under field conditions. In all cultivars, but mostly in Manzanilla, free proline was accumulated in the foliage. However, olive trees have other mechanisms of drought resistance in addition to the solely proline accumulation, such as stomatal closure and soluble protein accumulation. In a subsequent study, a glasshouse experiment was conducted. One-year-old plants of three Portuguese O. europaea cultivars (Cobrançosa, Madural and Verdeal Transmontana, the more representative cultivars in Trás-os-Montes) were submitted to contrasting water availability regimes during the dry season (chapters 4 and 5). Chapter 4 presents the effect of cultivar and watering regime in the vegetative growth, gas exchange, xylem hydraulic properties and water use efficiency of biomass production. Low water availability (LW) affected growth and biomass accumulation of the three cultivars. However, Cobrançosa plants were the less affected. Under LW conditions, total leaf area was sharply reduced due to a combination of leaf growth reduction and shedding of older leaves, minimising water losses by transpiration. Water stress also caused a marked decline on photosynthetic capacity and stomatal control was the major factor affecting photosynthesis. Under LW, water use efficiency of biomass production was improved in Cobrançosa, whereas it decreased in Madural and Verdeal Transmontana. In all cultivars, water stress induced an increase in xylem vessel frequency, providing a greater vascular potential and a greater security of xylem sap conduction under drought conditions. From the behaviour of Cobrançosa plants, with a lower allocation of assimilates to leaves, smaller leaves, a smaller reduction in net assimilation rate and photosynthetic rate, a more efficient water transport through the xylem, and an enhanced water use efficiency of biomass production under LW, we consider this cultivar the more appropriate for cultivation under restricted water availability. Chapter 5 presents the effect of cultivar and watering regime in leaf anatomy, sclerophylly, pressure–volume relationships, chemical composition and oxidative stress symptoms. Anatomically, Cobrançosa and Madural were more capable than Verdeal Transmontana to cope with LW availability, with a thicker upper epidermis, a thicker palisade parenchyma and higher stomatal density. Cobrançosa leaves also revealed the lowest specific leaf area and the highest density of the foliar tissue. Under LW conditions, Cobrançosa and Madural showed greater capability for osmotic adjustment and increased tissue rigidity. By contrast, Verdeal Transmontana did not exhibit osmotic adjustment, but was able to increase tissue elasticity and total soluble protein concentration. Leaves grown under LW conditions revealed signs of oxidative stress, with decreases in chlorophyll, carotenoid and total thiol concentrations and increased levels of lipid peroxidation. Nevertheless, LW plants developed some defence mechanisms against oxidative stress, like the increase in total phenol and total soluble protein concentrations. Comparatively, Cobrançosa revealed more protection against oxidative stress. In opposition, the increased levels of lipid peroxidation and the decreased total thiol concentration under LW conditions suggest that the mechanisms against oxidative stress were less effective in Madural. In chapter 6, the influence of different irrigation regimes were investigated on an 8- year-old olive (Olea europaea L., cv. Cobrançosa) commercial orchard located in northeast Portugal. Trees were subjected to a rainfed control (T0) and 3 treatments (T1, T2, T3) that received a seasonal water amount equivalent to 30, 60 and 100% of the estimated local evaporative demand by a drip irrigation system. All irrigation levels improved carbon assimilation of olive trees and reduced the midday and afternoon depression of photosynthesis and stomatal conductance. The experiment also revealed the occurrence of a dynamic photoinhibition in irrigated trees, mainly in trees irrigated with 60 and 100% of the estimated local evaporative demand, which seemed to be effective in protecting the photosynthetic apparatus from photodamage. Leaves grown under rainfed conditions revealed symptoms of oxidative stress, like the reduction in chlorophyll concentration and the increased levels of lipid peroxidation. We also found that the scavenging function of superoxide dismutase was impaired in rainfed plants. In contrast, the low thiobarbituric acid reactive substances concentration in irrigated trees indicates that irrigation decreases the oxidative damage by lipid peroxidation. Furthermore, we concluded that irrigation enhanced antioxidant protection at leaf level since leaves of irrigated trees had high levels of –SH compounds and the highest antioxidant potential. Meanwhile, the finding that guaiacol peroxidase activity increased in rainfed plants, associated with the appearance of oxidative damage, suggests that this enzyme has no major antioxidative function in olive. Additionally, this experiment demonstrated that olive trees irrigated with 30% of the estimated local evaporative demand had high intrinsic water use efficiency at midday and afternoon, saving consistent amounts of water and revealing a relative water content similar to trees irrigated with high amounts of water. Moreover, this level of irrigation seemed to be sufficient to reduce oxidative damage at leaf level. This is an important finding since a sagacious irrigation approach is essential for viable olive industry due to the limited water resources available in the Mediterranean region. Chapter 7 present the general conclusions from the research work that was undertakenand indicates some directions for future research.