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Agradecimentos: The authors thank the Superintendence of the Technical Scientifc Police of the State of Sao Paulo for kind donation of data, and the Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES—Projeto INSPEQT, Edital No. 16/2020), Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP, Processo 2021/09857-8) and Conselho Nacional de Desenvolvimento Científco e Tecnológico (CNPq) for the fnancial support Abstract: MDA-19 or BZO-HEXOXIZID (N'-[(3Z)-1-(1-hexyl)-2-oxo-1,2-dihydro-3H-indol-3-ylidene]-benzohydrazide), in a more recent nomenclature, was first synthesized in 2008 as a selective type-2 cannabinoid receptor (CB2) agonist due to its potential to treat neuropathic pain. In Brazil, this substance was identified in a series of 53 apprehensions between September 2021 and February 2022. Nevertheless, what intrigues toxicologists is that BZO-HEXOXIZID does not exert significant type-1 cannabinoid receptor (CB1) agonism—which is responsible for the well-known psychoactivity of ?-9-tetrahydrocannabinol. Thus, the objective of this work is to report the first apprehension and identification of BZO-HEXOXIZID in Brazil and to discuss pharmacologically the possible reasons why a CB2 agonist has been incorporated to the illicit market. Suspected seized samples were sent to the Laboratory of the Scientific Police of the State of Sao Paulo. After the screening, samples were confirmed for the presence of BZO-HEXOXIZID using chromatography gas—mass spectrometry, Fourier-transform infrared spectroscopy and nuclear magnetic resonance techniques. Of the 53 samples analyzed, 25 contained only BZO-HEXOXIZID and 28 with mixtures, of which 11 with the CB1 agonist ADB-BUTINACA. Other substances were found in association such as cocaine and caffeine. BZO-HEXOXIZID was detected in a series of seized materials for the first time in Brazil. Nevertheless, there are still unanswered questions regarding the use of this selective CB2 agonist as a drug of abuse COORDENAÇÃO DE APERFEIÇOAMENTO DE PESSOAL DE NÍVEL SUPERIOR - CAPES FUNDAÇÃO DE AMPARO À PESQUISA DO ESTADO DE SÃO PAULO - FAPESP CONSELHO NACIONAL DE DESENVOLVIMENTO CIENTÍFICO E TECNOLÓGICO - CNPQ Aberto

Orientador: Alexandre Leite Rodrigues de Oliveira Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia Resumo: O esmagamento de nervo isquiático de ratos neonatos simula a axonotmese obstétrica, levando à significativa morte de neurônios motores e sensitivos, o que permite a avaliação de efeitos neuroprotetores de novas moléculas, como as relacionadas ao sistema endocanabinoide, espontaneamente ativado em resposta à injúria. Dessa maneira, é possível que o Canabidiol (CBD), através da ativação do sistema endocanabinoide, leve à melhora da resposta regenerativa. O presente trabalho investigou o potencial neuroprotetor do canabidiol e sua ação através de receptores canabinóides após lesão periférica em ratos neonatos. Para isso, ratos neonatos da linhagem Wistar com dois dias de vida, foram divididos nos seguintes grupos experimentais: esmagamento do nervo isquiático e tratamento com veículo (grupo veículo); esmagamento e tratamento com CBD (grupo CBD); esmagamento e tratamento com AM 251 (inibidor de CB 1) + CBD (grupo CBD + AM 251), esmagamento e tratamento com AM 630 (inibidor de CB 2) + CBD (grupo CBD + AM 630), esmagamento e tratamento com AM 251 (grupo AM 251), esmagamento e tratamento com AM 630 (grupo AM 630) e esmagamento e tratamento com AM 251 + AM 630 (grupo AM 251 + AM 630). A sobrevivência de motoneurônios, 5 dias e 8 semanas após a lesão, mostrou que o tratamento com CBD aumenta a sobrevivência neuronal em ~54%, tanto 5 dias quanto 8 semanas após a injúria. Os demais grupos experimentais mostraram maior preservação de motoneurônios que o grupo Veículo porém, quando bloqueados ambos os receptores, a sobrevivência foi igual a obtida pelo tratamento com CBD. A longo prazo, apenas o bloqueio de CB 1 reverteu o efeito positivo do CBD. O bloqueio de receptores canabinoides aumenta a morte de neurônios sensitivos, tanto por apoptose quanto devido à lesão. Embora o tratamento com CBD não tenha efeito neuroprotetor no gânglio sensitivo, ele atenua a morte neuronal causada pelo bloqueio dos receptores canabinoides. O tratamento com CBD também preservou ~35% das sinapses no corno ventral e este efeito foi parcialmente revertido pela inativação de CB 2. Os tratamentos somente com os antagonistas mostraram preservação sináptica igual ao grupo veículo. Corroborando com esses resultados, a reação microglial na fase aguda também foi reduzida em 62% pelo tratamento com CBD, sendo maior nos grupos que receberam tratamento somente com os antagonistas de receptores canabinoides. Adicionalmente, o tratamento com CBD ou com AM 251 + AM 630 reduziu a astrogliose reativa 5 dias após lesão. A expressão de transcritos gênicos para receptores CB 1 foi maior no Veículo. Adicionalmente, tanto a administração de CBD sozinho quanto combinado com os antagonistas de receptores CB 1 e CB 2, resultou no aumento da expressão de CB 2 em relação ao controle, sendo, porém, ainda menor quando comparada ao Veículo. Já no gânglio espinal, o tratamento com CBD + AM 630 aumentou os níveis de CB 1, enquanto que o tratamento com CBD + AM251 diminuiu os níveis desse receptor. Ainda, detectamos que não houve diferença estatística na expressão de neurotrofinas na medula espinal, tanto 5 quanto 15 dias após a lesão, nos grupos que receberam a administração de CBD. Porém, a administração dos antagostistas de receptores canabinoides, sozinhos ou em conjunto, reduziram a expressão de BDNF. Já no gânglio, o tratamento CBD + AM 630 aumentou e o tratamento com CBD + AM 251 reduziu a expressão dos fatores neurotróficos, sendo que, quinze dias após a lesão somente o GDNF ainda manteve os níveis elevados, principalmente no grupo CBD. Por fim, a análise da recuperação motora funcional, mostrou que 8 semanas após a lesão o grupo CBD apresentou melhor recuperação em relação ao grupo CBD + AM251. Como um todo, os resultados mostram que o CBD é neuroprotetor, aumentando a sobrevivência neuronal e reduzindo a reação glial após axotomia. Da mesma maneira, a ação seletiva de receptores canabinoides pode resultar em neuroproteção, mesmo na ausência do CBD Abstract: Sciatic nerve crush in neonatal rats mimics the obstetric axonotmesis, leading to an extensive death or motor and sensory neurons, enabling the evaluation of neuroprotective effects of new molecules, such as the ones related to endocannabinoid system, which is spontaneously activated in response to injury. Thus, it is possible that cannabidiol (CBD), through activation of the endocannabinoid system, leads to increased regenerative response. The present work investigated the neuroprotective effect of CBD and its action through endocannabinoid receptors after peripheral nerve lesion in neonatal rats. For this, 2days-old Wistar rats were divided into the following experimental groups: sciatic nerve crush (SNC) +Vehicle treatment (Vehicle group); SNC + CBD treatment (CBD group); SNC + CBD + AM 251 (Cb1 inhibitor) treatment (CBD + AM 251 group); SNC + CBD + AM 630 (CB2 inhibitor) treatment (CBD + AM 630 group); SNC + AM 251 treatment (AM 251 group); SNC + AM 630 treatment (AM 630 group) and SNC + AM 251 + AM 630 treatment (AM 251 + AM 630 group). Motoneuron survival, 5 days and 8 weeks after injury, showed that CBD enhances in about 54% neuronal survival, both 5 days and 8 weeks after injury. The other experimental groups showed higher motoneuron preservation than the vehicle group, but when both Cb1 and CB2 receptors were blocked, the motoneuron survival was the same then after CBD treatment. In long term, only CB1 blockade reversed the CBD positive effect. The blockade of cannabinoid receptors increases the sensory neuron death as a result of apoptosis or lesion. Although CBD treatment did not protect sensory neurons of death, it attenuates the death caused by cannabinoid receptors blockade. CBD treatment also preserved 35% of synapses in the ventral horn and this effect was partially reversed by CB 2 inactivation. Antagonists-only treatments showed synaptic preservation equivalent to Vehicle group. Corroborating with this, the microglial reaction in the acute phase was also reduced by CBD in 62%, being higher in the experimental groups that were treated only with cannabinoid receptors antagonists. Additionally, CBD or AM 251 + AM 630 treatment decreased the reactive astrogliosis 5 days after lesion. Gene transcripts expression for CB1 was higher in Vehicle group. Both CBD alone or combined with CB1 and CB2 receptors antagonists resulted in higher CB2 expression, when compared to control, being even lower when compared to Vehicle. In the dorsal root ganglia (DRG), CBD + AM 630 treatment increased CB1 levels, while CBD + AM 251 decreased it. Still, we did not detect statistical differences in neurotrophins expression in the spinal cord, both 5 days or 8 weeks after lesion, in the experimental groups that received CBD. However, CB1 and CB2 antagonists administration, alone or together, reduced BDNF expression. In DRG, CBD + AM 630 increased and CBD + AM 251 decreased BDNF expression, and 15 days after lesion, only GDNF had elevated levels, especially on CBD group. Lastly, functional motor recovery revealed that, 8 weeks after lesion, CBD group presented improved recovery when compared to CBD + AM 251 group. In general, the data herein shows that CBD is neuroprotective, enhancing neuronal survival and decreasing the glial reaction induced by axotomy. In the same way, the selective action of cannabinoid receptors can also result in neuroprotection, even in the absence of CBD Doutorado Anatomia Doutor em Biologia Celular e Estrutural FAPESP 2012/22751-5

CNPq - Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico FAPEMIG - Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Minas Gerais CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior A dor patológica é uma condição clínica importante que afeta 30% dos indivíduos em alguma fase de suas vidas. A terapêutica da dor depende de um repertório diverso de abordagens farmacológicas, porém os medicamentos em geral empregados não são tão eficazes e apresentam efeitos colaterais. Apesar dos esforços para o desenvolvimento de novos fármacos, existem abordagens distintas que buscam se beneficiar da coadministração de analgésicos já existentes, na tentativa de se maximizar o efeito terapêutico em detrimento de reações adversas. De fato, essa abordagem visa se beneficiar do sinergismo farmacológico, definido como resultado de efeitos supra-aditivos associados a alguma resposta biológica. Neste trabalho, avaliou-se através de isobolografia a ação sinérgica de três agentes antinociceptivos, administrados em doses binárias, no teste algesimétrico de retirada de pata. Também se buscou a caracterização molecular da ocorrência de heterodímeros de GPCRs, por PLA, em neurônios cultivados de DRGs lombares. Foram utilizados camundongos Swiss machos, tratados com um agonista canabinoidérgico CB1R (anandamida, AEA), um agonista opioidérgico MOR (DAMGO) e/ou um agonista adrenérgico α2R (xilazina, XYL), coadministrados via intraplatar em animais sensibilizados com prostaglandina E2 (PGE2). Procedeu-se com avaliação de limiar nociceptivo e os resultados obtidos foram comparados com a predição teórica de aditividade de efeitos. Observou-se profundo sinergismo farmacológico na ação antinociceptiva de AEA+XYL e AEA+DAMGO, para os quais se registram índices de combinação (IC) menores que 1. Para a combinação DAMGO+XYL, observou-se efeitos aditivos (IC = 1). Os efeitos experimentais foram significativamente maiores que os preditos teoricamente, baseando-se nos princípios de aditividade de Loewe, para todos os níveis de efeito testados (10, 30 e 50% EMP), considerando os pares AEA+XYL e AEA+DAMGO. Para o par DAMGO+XYL, os efeitos experimentais foram significativamente maiores apenas para 10 e 50% EMP. Buscou-se compreender a fundamentação molecular desse sinergismo, investigando-se a expressão de CB1R e MOR em neurônios aferentes primários de DRGs lombares (L3-L5). Ambos os receptores são constitutivamente expressos nessa população de neurônios. Além disso, esses GPCRs aparecem co-localizados em culturas celulares desses neurônios, como revelado por um PLA indireto, capaz de detectar a formação de heterocomplexos de proteínas. Em conjunto, esses resultados sugerem forte efeito antinociceptivo sinérgico para diferentes combinações de fármacos, sobretudo agonistas canabinoidérgicos e opioidérgicos, e tal efeito pode estar correlacionado a ocorrência de heterodímeros de GPCRs em neurônios de DRGs. Pathologic pain is a relevant clinical condition that affects 30% of individuals at least once in life. The therapeutic management of pain relies on a diverse repertoire of pharmaceuticals, but most of them are not enough effective or leads to diverse side effects, justifying the urge for new treatments. Despite the efforts to develop new pharmaceuticals, diverse approaches seek benefits on the co-administration of already existing analgesics, an attempt to maximize therapeutic effects and concurrently reduce side effects. In fact, that approach seeks benefits on pharmacological synergism, which can be defined as supra-additive effects associated to a certain biological response. The aim of this work was to evaluate, using isobolgraphic analysis, the synergistic effects of three antinociceptive substances, administered in binary doses, on the algesimetric test of paw withdrawal. The occurrence of GPCR heterodimers on lumbar DRG neurons was also evaluated. For that aim, Swiss male mice were treated with a cannabinoidergic CB1R agonist (anadimide, AEA), an opioidergic MOR agonist (DAMGO) and/or an adrenergic α2R agonist (xylazine, XYL), co-administered in the hindpaw of mice previously sensitized with prostaglandin E2 (PGE2). The nociceptive threshold was evaluated, and the results obtained were compared with the additive predicted effects. It was observed a profound pharmacological synergism for the antinociceptive effects of AEA+XYL and AEA+DAMGO, with combination indexes (IC) lower than 1. For DAMGO+XYL combination, the effects were additive (IC = 1). The experimental effects were significantly higher than those predicted based on Loewe’s additive principles, for all the effect levels tested (10, 30 and 50% MPE), considering the pairs AEA+XYL and AEA+DAMGO. For the pair DAMGO+XYL, experimental effects were significantly higher only for 10 and 30% MPE. The molecular foundation of such synergism was evaluated by investigating the expression of CB1R and MOR on primary afferent neurons of lumbar (L3-L5) DRGs. Both receptors are constitutively expressed on this neuron population. Moreover, those GPCRs are co-localized on cell cultures of those neurons, as revealed by an indirect Proximity Ligation Assay (PLA), capable of detect the assembly of protein heterocomplexes. Taken together, the results presented suggest synergistic antinociceptive effects for distinct combinations of substances, especially cannabinoidergic and opioidergic agoists, and such effect could be correlated to the occurrence of GPCR heterodimers.

RESUMO Objetivo: Investigar os efeitos da administração de canabidiol em um modelo de isquemia/reperfusão renal em animais. Métodos: Foi induzida uma lesão renal, por meio de 45 minutos de isquemia renal seguida por reperfusão. Administrou-se canabidiol (5mg/kg) imediatamente após a reperfusão. Resultados: A isquemia/reperfusão aumentou os níveis de interleucina 1 e fator de necrose tumoral, o que foi atenuado pelo tratamento com canabidiol. Além disso, o canabidiol foi capaz de diminuir o dano oxidativo de lipídios e proteínas, mas não os níveis de nitrito/nitrato. A lesão renal após isquemia/reperfusão pareceu ser independente da expressão dos receptores canabidiol-1 e canabidiol-2, já que não houve aumento significante desses receptores após a reperfusão. Conclusão: O tratamento com canabidiol teve um efeito protetor contra a inflamação e o dano oxidativo em um modelo de isquemia/reperfusão renal. Esses efeitos parecem não ocorrer via ativação dos receptores canabidiol-1/canabidiol-2. ABSTRACT Objective: This work aimed to investigate the effects of the administration of cannabidiol in a kidney ischemia/reperfusion animal model. Methods: Kidney injury was induced by 45 minutes of renal ischemia followed by reperfusion. Cannabidiol (5mg/kg) was administered immediately after reperfusion. Results: Ischemia/reperfusion increased the IL-1 and TNF levels, and these levels were attenuated by cannabidiol treatment. Additionally, cannabidiol was able to decrease lipid and protein oxidative damage, but not the nitrite/nitrate levels. Kidney injury after ischemia/reperfusion seemed to be independent of the cannabidiol receptor 1 and cannabidiol receptor 2 (CB1 and CB2) expression levels, as there was no significant increase in these receptors after reperfusion. Conclusion: The cannabidiol treatment had a protective effect against inflammation and oxidative damage in the kidney ischemia/reperfusion model. These effects seemed to be independent of CB1/CB2 receptor activation.

Orientador: Carlos Amilcar Parada Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia Resumo: Contexto e objetivo: A dipirona é um analgésico utilizado no controle da dor moderada. É rapidamente metabolizada em dois metabolitos bioativos: 4¿metil-aminoantipirina (4-MAA), por hidrólise, o qual é metabolizado em 4-aminoantipirina (4-AA), por reação enzimática. O objetivo deste estudo foi verificar a participação dos receptores canabinoides CB1 e CB2 e sua relação com os receptores TRPV1 e opióides do tecido periférico no efeito analgésico da dipirona, 4-MAA ou 4-AA. Métodos: PGE2 (100 ng), carragenina (100 µg) ou capsaicina (0.12 µg) foram administradas na pata de ratos Wistar. A hiperalgesia mecânica induzida por carragenina foi avalidada por von-Frey eletrônico e a nocicepção avaliada pela contagem de flinches. Para investigar o envolvimento dos receptores canabinóides CB1, CB2, opióides e TRPV1, seus antagonistas (respectivamente, AM251, AM630, naloxona e capsazepina) foram administrados 30 min antes da dipirona, 4-MAA e 4-AA. Espectrometria de massa foi utilizada para analisar a hidrolise da dipirona para 4-MAA. O efeito do 4-AA no receptor TRPV1 foi analisado por ensaio de Ca2+ em neurônios do gânglio da raiz dorsal (DRG) mantidos em cultura. Resultados: Os resultados demonstraram que a hiperalgesia induzida por carragenina foi reduzida de maneira dose-dependente pelo tratamento local com dipirona ou 4-MAA. Os dados também demonstraram que a dipirona foi localmente metabolizada em 4-MAA no tecido subcultâneo. Administração local de AM630, Naloxona ou norBNI, mas não de Naltrindole ou CTOP, reverteu totalmente o efeito anti-hiperalgésico da dipirona ou do 4-MAA. A administração local de 4-AA reduziu a nocicepção e o aumento de [Ca2+]i induzido por capsaicina em neurônios do DRG. O efeito anti-nociceptivo e a redução do [Ca2+]i promovidos por 4-AA foram revertidos por AM251. PGE2 aumentou a nocicepção induzida por capsaicina, a qual foi revertida por 4-AA. Em cultura de neurônios sensibilizados por PGE2 o metabolito 4-AA induziu aumento [Ca2+]i que foi revertido pela admininistração de capsazepina (antagonista de TRPV1). AM251 reduziu ambos, o [Ca2+]i induzido por 4-AA e por capsaicina. Conclusão: Os resultados demonstram que a dipirona é localmente metabolizada em 4-MAA. Os dados sugerem que este metabólito promove analgesia pela interação entre o sistema canabinóide e opióide em particular pela ativação dos receptores CB2 e Kappa opioide. Por sua vez, o metabólito 4-AA reduziu a atividade das fibras TRPV1+ por dessensibilizarem os receptores TRPV1 via ativação dos receptores canabinóides CB1 Abstract: Background and aim: Dipyrone is an analgesic used to control moderate pain. It is metabolized in two bioactive metabolites: 4-methylaminoantipyrine (4-MAA) by hydrolysis and 4-aminoantipyrine (4-AA) by enzymatic reaction. The aim of this study was to investigate the involvement of peripheral cannabinoid CB1 and CB2 receptors and their relation with TRPV1 and opioid receptors, respectively, in the anti-hyperalgesic effect of Dypirone, 4-MAA or 4-AA. Methods: PGE2 (100 ng), carrageenan (100 µg) or capsaicin (0.12) were administered in the hind paw of male Wistar rats. The carrageenan-induced mechanical hyperalgesia was evaluated by electronic von-Frey and capsaicin-induced nociception was evaluated by counting flinches. To analyze the involvement of cannabinoid CB1, CB2, TRPV1 and opioid receptors their antagonist (respectively AM251, AM630, naloxone and capsazepine) were administered 30 min before dipyrone, 4-MAA or 4-AA. Mass spectrometry was used to analyse dipyrone¿s hydrolysis to 4-MAA. The effect of 4-AA on TRPV1 was analyzed by Calcium-influx assay in Dorsal root ganglian (DRG) keept in culture. Results: The results showed that the hyperalgesia induced by the inflammatory agent carrageenan was reduced in a dose dependent-manner by 4-MAA or dipyrone. Dipyrone was locally metabolized to 4-MAA in the subcutaneous tissue of hind paw. Local administration of AM630, Naloxone or norBNI but not of naltrindole or CTOP reduced the analgesic effect of dipyrone or 4-MAA. The local administration of capsaicin induced nociception and [Ca2+]i that was reduced by 4-AA. 4-AA reduces nociception and the calcium influx was reduced by AM251. PGE2 increases the capsaicin-induced nociception that was reversed by 4-AA. 4-AA increased [Ca2+]i in neurons sensitized by PGE2 that was reduced by capsazepine, a TRPV1 antagonist. AM251 reduced the [Ca2+]i induced by 4-AA or capsaicin. Conclusion: These results demonstrated that dipyrone is locally hydrolyzed to 4-MAA. Also, these data suggested that this metabolite induced analgesic effect through an interaction of cannabinoid and opioid system. 4-AA reduced the activity of the TRPV1+ (fiber C) by desensitization of TRPV1 through cannabinoid CB1 receptor. These data also suggested that the efficacy analgesic of dipyrone is increased in inflammatory conditions Doutorado Fisiologia Doutor em Biologia Funcional e Molecular CAPES

Os sistemas endocanabinóide e colinérgico muscarínico têm um importante papel modulador sobre a atividade neural tanto excitatória, quanto inibitória no sistema nervoso central, participando de inúmeros processos, entre eles, os mecanismos de aprendizagem e memória. Partindo do fato de que os receptores canabinóides CB1 têm alta concentração em áreas relevantes para a memória, como o hipocampo (responsável pelo componente contextual), ou o córtex infralímbico (envolvido na manutenção da extinção), inicialmente investigamos os efeitos do potente agonista CB1, CP55,940 sobre a consolidação e a reconsolidação da memória: essa área cortical ainda não fora estudada nesta etapa do processamento de memórias, nem aquele fármaco havia sido adequadamente investigado. A seguir, visando compreender o possível sinergismo entre os sistemas endocanabinóide CB1 e colinérgico muscarínico M4 no processamento de memórias aversivas em ratos, estudamos os efeitos da infusão concomitante de concentrações subefetivas do agonista CB1 e da toxina muscarínica seletiva para M4 (MT3 - extraída da peçonha da serpente mamba verde africana), na área CA1 do hipocampo, sobre a consolidação da memória, verificando também seus efeitos sobre a plasticidade neural de ratos Wistar machos adultos. Os resultados do presente trabalho mostraram uma clara modulação endocanabinóide, tanto da consolidação quanto da reconsolidação da memória, envolvendo igualmente receptores CB1 no hipocampo e no córtex infralímbico: o efeito amnéstico duradouro foi diferente do obtido por nosso grupo usando a menos seletiva Anandamida em outra tarefa, aversiva inibitória (de Oliveira Alvares et al., 2008b): as diferenças farmacológicas e entre tarefas explicariam, em parte, esses achados contrastantes. Na segunda parte, onde estudamos o sinergismo apenas na consolidação, constatamos uma forte interação complementar dos subsistemas CB1 e M4 afetando a resposta comportamental, com efeito amnéstico observado apenas na presença dos dois fármacos juntos (CP55,940+MT3, cada qual em concentração subefetiva). A infusão concomitante de ambos, nessas mesmas concentrações, também foi capaz de inibir a indução e a manutenção da potenciação de longa duração (LTP) na mesma região CA1 hipocampal, reforçando a hipótese de que a semelhança farmacológica observada nos efeitos de cada subsistema, com agonistas ou antagonistas, em cada uma das diferentes fases da memória, sugere que cada subsistema atua como “sobressalente”, complementar ao outro. The endocannabinoid and muscarinic cholinergic systems play a pivotal role in the modulation of neural activity, both excitatory and inhibitory, in the central nervous system, taking part in numerous processes, among which are mechanisms of learning and memory. Based on the fact that cannabinoid receptors CB1 have high concentration in areas relevant to memory, such as the hippocampus (responsible for the contextual component), or the infralimbic cortex (involved in the maintenance of extinction), we initially investigated the effects of the potent CB1 agonist CP55,940 on the consolidation and reconsolidation of memory: neither has this cortical area been studied in this phase of memory processing nor has this drug been adequately investigated. In order to understand the possible synergism between the endocannabinoid CB1 and the muscarinic cholinergic M4 systems in the processing of aversive memories in rats, we studied the effects of the concomitant infusion of subthreshold concentrations of the CB1 agonist and the selective muscarinic toxin for M4 (MT3 – extracted from the venom of the African green mamba snake), in the CA1 region of the hippocampus, on the consolidation of memory, also verifying their effects on the neural plasticity of adult male Wistar rats. The results of the present study evidenced a clear endocannabinoid modulation, both in the consolidation and reconsolidation of memory, equally involving CB1 receptors in the hippocampus and infralimbic cortex: the long-lasting amestic effect differed from that obtained by our group using the less selective Anandamide in another behavioral experiment, the aversive inhibitory task (de Oliveira Alvares et al., 2008b): pharmacological differences and those between tasks would explain, in part, these contrasting results. In the second part, in which we studied the synergism only in consolidation, we found a strong complementary interaction between CB1 and M4 subsystems affecting the behavioral response, with an amestic effect only observed in the presence of both drugs together (CP55,940+MT3, each in a subthreshold concentration). The concomitant infusion of both, in these same concentrations, was also able to inhibit the induction and maintenance of long term potentiation (LTP) in the same CA1 region of the hippocampus, reinforcing the hypothesis that the pharmacological similarities observed in the effects of each subsystem, using agonists or antagonists, in each of the different memory phases, suggest that each subsystem acts as a “spare”, complementary to each other.

É bem conhecido que o exercício físico apresenta efeitos positivos sobre funções cognitivas e a plasticidade hipocampal. Entretanto, as bases moleculares relacionadas aos seus efeitos sobre a memória ainda não são completamente compreendidas. Neste estudo nós investigamos a hipótese de que a melhora da memória promovida pelo exercício físico depende da facilitação do sistema endocanabinóide. Nós observamos que a memória espacial (mas não a de trabalho), avaliada pelo teste de reconhecimento espacial de objeto, não persiste em camundongos sedentários, mas o exercício físico realizado durante uma semana foi capaz de melhorá-la. Além disso, o exercício foi capaz de promover aumento na expressão hipocampal do receptor CB1 (mas não do receptor CB2), do BDNF (mas não de, NT3, NT4 e NGF) assim como induziu aumento na proliferação celular, astro-gliogênese e neurogênese no giro denteado. Nenhuma alteração foi encontrada em comportamentos tipo-ansiedade, tipo-depressão e atividade locomotora. Para verificar se as alterações observadas necessitavam da ativação do receptor CB1, nós tratamos os animais com um antagonista seletivo, AM251, antes de cada sessão de exercício físico. De acordo com a nossa hipótese, essa droga preveniu a melhora da memória induzida pelo exercício e o aumento da expressão do BDNF. Além disso, o AM251 bloqueou o aumento da expressão de CB1 e impediu a ocorrência da proliferação celular, astro-gliogênese e neurogênese. Para testar se a facilitação da sinalização endocanabinóide poderia mimetizar os efeitos observados após o exercício, nós tratamos os animais sedentários, durante uma semana, com uma droga que impede a hidrólise da anandamida, o URB597 (inibidor da FAAH). Os animais tratados com essa droga melhoraram a memória espacial e aumentaram a expressão de CB1 e BDNF no hipocampo assim como a proliferação celular, astro-gliogênese e neurogênese, mostrando que a potencialização da sinalização canabinóide igualmente beneficia a memória. Em resumo, nossos resultados mostraram que os efeitos do exercício físico sobre a memória espacial, expressão de BDNF, proliferação celular, astro-gliogênese e neurogênese dependem da sinalização do receptor CB1, o que pode ser mimetizado, em animais sedentários, pela inibição da hidrólise da anandamida. Assim, nossos resultados sugerem que, pelo menos em parte, o efeito promnésico do exercício físico depende da ativação do receptor CB1 e é mediado pelo BDNF, possivelmente, por ele induzir um processo de neurogênese hipocampal. It is well known that physical exercise has positive effects on cognitive functions and hippocampal plasticity. The underlying mechanisms, however, have remained to be further investigated. Here we tested the hypothesis that the memory-enhancement promoted by physical exercise relies on facilitation of the endocannabinoid system. We observed that the spatial memory (not working memory) tested in the object location paradigm did not persist in sedentary mice, but could be improved by 1 week of treadmill running. In addition, exercise up-regulated both CB1 receptor (but not CB2) and BDNF expression (but not NT3, NT4 and NGF) in the hippocampus. It also induced increase in cellular proliferation, astrogliogenesis and neurogenesis in the dentate gyrus. No alterations were observed regarding anxiety- and depression-like behavrious and locomotor activity. To verify if the changes observed required the CB1 activation, we treated the mice with the selective antagonist, AM251, before each period of physical activity. In line with our hypothesis, this drug prevented the exerciseinduced memory enhancement and BDNF expression. Furthermore, AM251 blocked the increase of the CB1 expression and prevented the cellular proliferation, astrogliogenesis and neurogenesis. To test if facilitating the endocannabinoid system signaling would mimic the alterations observed after exercise, we treated sedentary animals during 1 week with the anandamide-hydrolysis inhibitor, URB597 (FAAH inhibitor). Mice treated with this drug improved spatial memory and have increased levels of CB1 and BDNF expression in the hippocampus as well as increased cellular proliferation, astrogliogenesis and neurogenesis, showing that potentiating the endocannabinoid system equally benefits memory. In summary, our results showed that the favorable effects of exercise upon spatial memory, BDNF expression, gliogenesis and neurogenesis depend of CB1 receptor signaling, which can be mimic, in sedentary animals, by inhibition of anandamide hydrolysis. Thus, our results suggest that, at least in part, the promnesic effect of the exercise is dependent of CB1 receptor activation and is mediated by BDNF, possibly by increased hippocampal neurogenesis.

A capacidade de sentir dor é fundamental para manutenção da vida, sem ela o trauma tecidual não seria detectado, ou mesmo evitado, podendo ocasionar lesões teciduais e nervosas importantes. A descoberta de novos mecanismos analgésicos é objetivo de várias pesquisas, como por exemplo, as pesquisas relacionadas à ketamina, um fármaco descoberto na década de 60 e utilizado originalmente como anestésico geral dissociativo que passou recentemente a ser utilizada também como analgésico em dores crônicas. O presente estudo avaliou o envolvimento dos endocanabinóides no efeito antinociceptivo periférico, espinhal e supraespinhal, induzido pela ketamina frente à hiperalgesia evocada pela prostaglandina E2 (PGE2) 2 µg/pata. A atividade antinociceptiva foi avaliada através do teste algesimétrico mecânico de retirada da pata do rato submetida à compressão. A ketamina causou um efeito antinociceptivo dose-dependente nas vias periférica (10, 20, 40 e 80 µg), intratecal (20, 40 e 80 µg) e intracerebroventricular (1, 2, 4 e 8 µg), com pico de ação de cinco minutos. Medidas feitas na pata contralateral revelaram que na dose de 80 µg/pata, a ketamina não altera o limiar nociceptivo da pata não tratada nos experimentos na periferia. A utilização do antagonista do receptor CB1 (AM251) reverteu o efeito antinociceptivo dose-dependente da ketamina nas três vias, periférica (20, 40 e 80 µg), espinhal (20, 40 e 80 µg) e supraespinhal (1, 2 e 4 µg). Entretanto o antagonista de receptor CB2 (AM630) reverteu o efeito antinociceptivo somente pela via supraespinhal de maneira dose-dependente (1, 2 e 4 µg), demonstrando o envolvimento de receptores CB1 na periferia, na via espinhal e na via supraespinhal e nesta última via, também se observou o envolvimento do receptor canabinóide do tipo CB2. O inibidor da enzima (amida hidrolase de ácido graxo), FAAH, (MAFP) (2, 4 e 0,2 µg) e o inibidor da recaptação de anandamida (VDM11) (20, 20 e 4 µg) para as seguintes vias periférica, intratecal e intracerebroventricular respectivamente, responderam sinergicamente junto à ketamina na sua dose intermediária (20, 40 e 2 µg) na antinocicepção para as respectivas vias. O inibidor da enzima (monoacilglicerol lipase), MGL (JZL184) foi utilizado somente na via espinhal (14 µg) e supraespinhal (7 µg) e foi capaz de intensificar o efeito antinociceptivo da ketamina (40 e 2 µg), respectivamente. Além dos experimentos comportamentais, foi também estudada a presença dos endocanabinóides anandamida (AEA), 2-araquidonoil glicerol (2- AG), palmitoiletanolamida (PEA) e o oleiletanolamida (OEA), na pata dos ratos após tratamento com ketamina, através da técnica de cromatografia gasosa e espectrometria de massa. Foi encontrado um aumento de AEA em patas tratadas com PGE2 + ketamina, mas não dos outros endocanabinóides. O efeito antinociceptivo periférico, espinhal e supraespinhal da ketamina possivelmente está relacionado com mecanismos antinociceptivos alternativos que não envolvam o receptor NMDA. Ela poderia mobilizar o sistema canabinóide nas diferentes vias estudadas através das hipóteses: Ligação direta em receptores canabinóides; Liberação direta de endocanabinóides ou mesmo a liberação de peptídeos opióides endógenos que por sua vez, induzem a liberação de endocanabinóides; e finalmente por mecanismos que envolvam a ativação do complexo receptor opióide-canabinóide. Sendo assim, nosso estudo verificou a participação do sistema canabinóide no evento da antinocicepção periférica, intratecal e intracerebroventricular da ketamina. The ability to feel pain is essential for maintenance of the life, without her tissue trauma would not be detected or prevented, causing significant tissue and nerve damage. The discovery of new analgesic mechanisms is the goal of several studies, such as researches related to ketamine, a drug discovered in the 60's and originally used as a dissociative general anesthetic that has recently come to be also used as an analgesic in chronic pain. The present study evaluated the involvement of endocannabinoids in the antinociceptive effect peripheral, spinal and supraspinal, induced by ketamine against the hyperalgesia evoked by prostaglandin E2 (PGE2) 2 µg/paw. The antinociceptive activity was evaluated using mechanical paw withdrawal rat test subjected to compression. Ketamine caused a dose-dependent antinociceptive effect in the peripheral (10, 20, 40 and 80 µg), intrathecal (20, 40 and 80 µg) and intracerebroventricular (1, 2, 4 and 8 µg), with peak action in five minutes. Measurements made in the contralateral paw showed that at a dose of 80 µg/paw, ketamine not alter the nociceptive threshold in the untreated paw in peripheral pathway. CB1 receptor antagonist (AM251) reversed dose-dependent the antinociceptive effect of ketamine in peripheral (20, 40 and 80 µg), spinal (20, 40 and 80 µg) and supraspinal (1, 2 and 4 µg) pathways. However, the CB2 receptor antagonist (AM630) reversed the antinociceptive effect only the supraspinal pathway of dose-dependent manner, demonstrating the involvement of CB1 receptors in the peripheral, spinal and supraspinal pathways, and this last route, involvement with the CB2 cannabinoid receptor type was also observed. The fatty acid amide hydrolase enzyme inhibitor, FAAH, (MAFP) (2, 4 and 0,2 µg) and the inhibitor of reuptake of anandamide (VDM11) (20, 20 and 4 µg) for peripheral, intrathecal and intracerebroventricular pathways respectively, responded synergistically with ketamine in the intermediate dose (20, 40 and 2 µg) in the antinociception for the respective routes. The MGL (monoacylglycerol lipase) enzyme inhibitor (JZL184) was used only in spinal (14 µg) and supraspinal (7 µg) pathways, and was able to enhance the analgesic effect of ketamine (40 and 2 µg), respectively. In addition to the behavioral experiments, was also studied the presence of the endocannabinoids anandamide (AEA), 2-araquidonoil glicerol (2-AG), palmitoiletanolamida (PEA) and oleiletanolamida (OEA), in the paw of rats after treatment with ketamine through the technique of gas chromatography and mass spectrometry. Was found an increase of AEA in paws treated with PGE2 + ketamine, but not the other endocannabinoids. The peripheral, spinal and supraspinal antinociceptive effect of ketamine is possibly related to alternative antinociceptive mechanisms not involving the NMDA receptor. It’s can mobilize the cannabinoid system in the different study pathways through the hypotheses: Binding directly in cannabinoid receptors; Direct release of endocannabinoids or even the release of endogenous opioid peptides which in turn, induce the release of endocannabinoids; and finally by mechanisms involving the activation of opioid-cannabinoid receptor complex. Thus, our study examined the involvement of the cannabinoid system in the peripheral, intrathecal and intracerebroventricular antinociception of ketamine. This study further strengthens the possibility of use of ketamine as an analgesic in clinical practice of pain control, as well as fostering the possibility of further studies that may elucidate how these systems interact in several analgesic pathways studied.

Orientador: Carlos Amilcar Parada Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia Resumo: A dipirona (metamizol) é um pró-fármaco analgésico utilizado no controle da dor moderada, sendo metabolizada em dois metabolitos bioativos: 4-metil-aminoantipirina (4-MAA) e 4-aminoantipirina (4-AA). O objetivo deste estudo foi investigar a participação de receptores canabinóides periféricos, CB1, CB2 e canais de KATP sobre o efeito anti-hiperalgésico da dipirona, 4-MAA ou 4- AA. Para indução de hiperalgesia, PGE2 (100 ng/pata ) foi administrada localmente na pata traseira de ratos Wistar machos, e o limiar hiperalgésico mecânico foi quantificado por Von- Frey eletrônico, antes e três horas após a injeção. Dipirona, 4-MAA ou 4-AA foram administrados 30 minutos antes do Von Frey. Os antagonistas seletivos do receptor CB1 (AM251), CB2 (AM630) e glibenclamida, um bloqueador KATP (80 ug) ou ODQ um inibidor de cGMP (32 ?g) foram administrados 30 minutos antes da Dipirona, 4-MAA ou 4 -AA. O ODN-antisense para reduzir a expressão do receptor CB1 (30 ?g) foi administrado por via intratecal, uma vez por dia durante quatro dias consecutivos. A hiperalgesia mecânica induzida pela PGE2 foi reduzida pela dipirona, 4-MAA, e 4-AA de maneira dose-dependente. AM251 ou ODN-antisense contra o receptor neuronal CB1, mas não AM630, reduziu o efeito anti-hiperalgésico mediado por 4-AA, mas não da dipirona ou 4-MAA. Por outro lado, o efeito anti-hiperalgésico da dipirona, ou 4-MAA foi revertido por glibenclamida ou ODQ. Os resultados sugerem que a ativação de receptores neuronal CB1, mas não do receptor CB2, no tecido periférico esteja envolvido no efeito anti-hiperalgésico do metabólito 4-AA. Além disso, a dipirona e 4-MAA possui um efeito anti-hiperalgesico dependente de cGMP e consequente abertura KATP Abstract: Dipyrone (metamizole) is an analgesic pro-drug used to control moderate pain. It is metabolized in two bioactive metabolites: 4-methylaminoantipyrine (4-MAA) and 4-aminoantipyrine (4-AA). The aim of this study was to investigate the participation of peripheral CB1 and CB2 cannabinoid receptors activation on the anti-hyperalgesic effect of Dypirone, 4-MAA or 4-AA. For induction of hyperalgesia, PGE2 (100 ng) was locally administrated in hindpaw of male Wistar rats, and the mechanical nociceptive threshold was quantified by electronic von-Frey, before and 3 hours after its injection. Dypirone, 4-MAA or 4-AA was administrated 30 minutes before the von-Frey test. The selective CB1 receptor antagonist AM251, CB2 receptor antagonist AM630, cGMP inhibitor ODQ (32 ?g) or KATP blocker glibenclamide (80 ?g) was administrated 30 minutes before Dypirone, 4-MAA or 4-AA. The antisense-ODN against CB1 receptor expression (30 ?g) was intrathecally administrated once a day during four consecutive days. PGE2-induced mechanical hyperalgesia was inhibited by dypirone, 4-MAA, and 4-AA in a dose-response manner. AM251 or ODN anti-sense against neuronal CB1 receptor, but not AM630, reversed the antihyperalgesic effect mediated by 4-AA, but not by dypirone or 4-MAA. On the other hand, the anti-hyperalgesic effect of dypirone or 4-MAA was reversed by Glibenclamide or ODQ. These results suggest that the activation of neuronal CB1, but not CB2 receptor, in the peripheral tissue is involved in the anti-hyperalgesic effect of 4-aminoantipyrine. In addition, 4- methylaminontipyrine mediates anti-hyperalgesic effect by the cGMP activation and the KATP opening Mestrado Fisiologia Mestre em Biologia Funcional e Molecular

O sistema endocanabinóide tem um papel modulador sobre células excitatórias e inibitórias em diferentes áreas do sistema nervoso central (SNC), em particular naquelas envolvidas na formação, consolidação e evocação de novas memórias (Davies, Pertwee, and Riedel 2002). Os estudos mostram que a principal função dos endocanabinóides no encéfalo é a supressão da liberação de neurotransmissores como GABA e glutamato por meio da sinalização mediante mensageiros retrógrados (Fattore, Fadda, and Fratta 2007; Iversen 2003). O receptor canabinóides tipo 1 (CB1) apresenta uma alta densidade na área CA1 do hipocampo (Ashton et al. 2004; Hoffman, Riegel, and Lupica 2003). Poucos estudos têm sido realizados estudando o efeito da inibição do sistema endocanabinóide na evocação de memórias aversivas, e pouco se sabe acerca de seu efeito na evocação de memórias previamente extintas. Neste trabalho, investigamos o curso temporal dos efeitos do agonista inverso seletivo para o receptor CB1, AM251, sobre a evocação de memórias aversivas de longo prazo formadas ou extintas recente ou remotamente, bem como investigaremos os mecanismos subjacentes a eles. Assim, ratos Wistar foram treinados no condicionamento aversivo ao contexto (CAC), e alguns foram submetidos à extinção da memória e testados em três momentos diferentes. O AM251 CB1 foi administrado sempre 15 minutos antes do teste. Nossos resultados demonstraram diferentes efeitos dependentes do tempo do AM251 na evocação da memória. A infusão intra-hipocampal do AM251 antes de sessão de teste melhorou a evocação da memória de medo quando foi testada 72 horas após a sessão de treino, enquanto que a mesma dose de AM251 prejudicou a evocação da memória quando foi testada 15 dias após a sessão de treino. É importante ressaltar que quando o teste foi 30 dias após a sessão de treino o AM251 melhorou a evocação da memória. Também encontramos que quando a memória foi testada 24 horas após a sessão de extinção, o AM251 bloqueou a evocação da memória de extinção, mas, quando a sessão de extinção foi realizada 14 ou 30 dias após a sessão de treino e testada 24 horas depois, o AM251 não teve efeito. Desta forma, o efeito farmacológico da AM251 pode mudar com a extinção da memória e seu efeito é dependente do tempo. Acredita-se que o efeito oposto do AM251 sobre a evocação da memória, em diferentes momentos no tempo, é o resultado de alterações na expressão e localização do receptor CB1 em neurónios excitatórios piramidais, em interneurônios GABAérgicos ou em ambos os sistemas na região CA1 do hipocampo. Estudos de imunoistoquímica estão sendo realizados para avaliar as mudanças no número e localização dos receptores canabinóides CB1 em memórias recentes e remotas e assim fornecer uma explicação aos efeitos contraditórios na evocação da memória observados neste trabalho. Extensive evidence indicates that the endocannabinoid system plays a modulatory role on excitatory and inhibitory neural activity in central and peripheral nervous system. The CB1 cannabinoid receptors have a high concentration in important areas related to memory modulation, such as the hippocampus-responsible for the contextual component, and infralimbic cortex-involved in the maintenance of extinction. Few studies have been conducted studying the effect of inhibition of the endocannabinoid system in the recall of aversive memories, and little is known about its effect on retrieval of memories previously extinct. Here we have studied the effects of microinfusion of the CB1 receptor antagonist AM251 into the dorsal hippocampus upon the retrieval process of an aversive memory. Accordingly, Wistar rats were trained in contextual fear conditioning (CFC), in some experiments underwent memory extinction and were tested at 3 different time points. The CB1 antagonist AM251 was administered 15 minutes prior to the retrieval session. Our results showed different time-dependent effects of the AM251 on memory retrieval. Intra-hippocampal infusions of AM251 shortly before testing session improved retrieval of contextual fear memory when it was tested 72 hours after training, whereas the same dose of AM251 impaired retrieval of the memory when it was tested 15 days after training session. Importantly, when the testing session was 30 days after the training session, the AM251 improved the retrieval of the memory. We also found that, when memory was tested 24 hours after the extinction session, the AM251 blocked the retrieval of the extinction memory, but when the extinction session was performed 14 or 30 days after the training session and tested 24 hours later, the AM251 had no effect. Thus, the pharmacological effect of AM251 can change with the extinction of memory and its effect is time dependent. It is believed that the opposite effect of AM251 on memory retrieval at different moments in time, are the result of changes in the expression and localization of the CB1 receptor in excitatory pyramidal neurons, GABAergic interneurons or both systems in the CA1 region of the hippocampus. Immunohistochemistry studies are being done to evaluate the changes in the number and location of CB1 cannabinoid receptors in different moments in time to provide an explanation for the contradictory effects observed on memory retrieval.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-graduação em Farmacologia, Florianópolis, 2013 A atividade anti-inflamatória e antinociceptiva da mistura de a-amirina (aAMI) e ß-amirina (ßAMI), triterpenos pentacíclicos encontrados na resina de plantas do gênero Protium, parece relacionada a sua capacidade de estimular receptores canabinóides tipo 1 (CB1) e 2 (CB2). Apesar do potencial para manejo de dor e inflamação, canabinóides são pouco usados na clínica devido aos seus efeitos adversos psicotrópicos. A mistura de aAMI e ßAMI também parece interagir com o sistema vanilóide, uma vez que reverte a nocicepção induzida por capsaicina, o agonista protótipo de receptor de potencial transitório vanilóide tipo 1 (TRPV1). Há poucos estudos sobre o envolvimento dos receptores TRPV1 em psicopatologias. A inibição pré-pulso do reflexo de sobressalto (PPI) é uma medida operacional do filtro sensório-motor. Déficits de PPI são observados em esquizofrênicos, bem como humanos e animais sob efeito de drogas psicotomiméticas, como agonistas canabinóides e o antagonista do receptor NMDA de glutamato, MK801. O objetivo desse trabalho foi verificar os efeitos da aAMI no modelo de PPI, bem como investigar as influências do receptor CB1 e TRPV1 sobre suas ações. A aAMI causa déficit no PPI e habituação em doses abaixo da que afeta a locomoção. Essas alterações foram prevenidas com o bloqueio do receptor CB1, mas não do TRPV1. O déficit de PPI induzido pela aAMI e MK801 foi revertido pela ativação de TRPV1 por capsaicina, mas só o tratamento com esse vanilóide não alterou o PPI per se. Esses dados apontam para uma possível atividade psicotomimética da aAMI administrada centralmente, bem como confirma parcialmente sua ação canabimimética. A reversão das alterações comportamentais induzidas por um antagonista de NMDA e pela aAMI sugere uma ação antipsicótica para a ativação central de receptores TRPV1 Abstract: The anti-inflammatory and antinociceptive effects of the mixture of aamyrin (aAMI) and ß-amyrin (ßAMI), pentacyclic triterpenes found in resin of plants of the genus Protium, seem related to its capacity to stimulate cannabinoid receptor type 1 (CB1) and 2 (CB2). Despite the potential for management of pain and inflammation, cannabinoids are not used in practice because of its adverse psychotropic effects. The mixture aAMI and ßAMI also appears to interact with the vanilloid system since it reverses nociception induced by capsaicin, the prototype agonist for transient receptor potential vanilloid type 1 (TRPV1). There are few studies about the involvement of TRPV1 receptors in psychopathology. The prepulse inhibition of the startle reflex (PPI) is an operational measure of sensorimotor gating. PPI deficits are observed in schizophrenics, as well as in humans and animals under influence of psychotomimetic drugs, such as cannabinoid agonists and the glutamate NMDA receptor antagonist, MK801. The aim of this study was to ascertain the effects of aAMI in the PPI model and to investigate the influences of the CB 1 and TRPV1 receptors on its actions. The aAMI causes deficits in PPI and habituation in doses lower than that affects locomotion. Blocking the CB 1 receptor, but not TRPV1, prevented these alterations. The PPI deficit induced by aAMI and MK801 was reversed by capsaicin-induced activation of TRPV 1, but treatment only with this vanilloid did not influence PPI per se. These data point to a possible psychotomimetic activity for centrally administered aAMI and partially confirms its cannabimimetic action. Reversal of behavioral changes induced by a NMDA antagonist and aAMI suggests an antipsychotic- like action for central TRPV 1 receptors activation.

Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Farmacologia, Florianópolis, 2011 Muitos estudos têm demonstrado os efeitos analgésicos dos agonistas canabinoides em diferentes estudos pré-clinicos e clínicos de dor crônica e inflamatória. Dentre os modelos de dor crônica, a avulsão do plexo braquial (APB) é caracterizada por um rápido estabelecimento da resposta dolorosa, que pode ser observada por várias semanas e meses após a lesão. No presente estudo foi avaliada a ação antinociceptiva de diferentes agonistas canabinoides na hiperalgesia mecânica induzida pela APB no 5º e 30º dias após o procedimento cirúrgico, a fim de avaliar a relação dos canabinoides com os processos iniciais e/ou tardios da neuropatologia associada a APB. Os resultados do presente trabalho demonstram que o ACEA, agonista seletivo para o receptor canabinóide 1 (CB1), o JWH-015, agonista seletivo para o receptor canabinóide 2 (CB2), e o WIN 55,212-2, agonista não-seletivo para os receptores CB1/CB2, não alteraram a hiperalgesia mecânica induzida pela APB quando administrados localmente pela via intraplantar (i.pl.). Por outro lado, o tratamento sistêmico intraperitoneal (i.p.) reduziu significativamente a resposta nociceptiva no 5º e 30º dias após a APB, com uma maior inibição produzida pelo agonista não-seletivo, WIN 55,212-2. A fim de verificar o envolvimento das vias espinhais e supraespinhais na analgesia produzida pelos agonistas canabinóides no modelo de APB, foram avaliados os tratamentos com os agonistas canabinoides pela via intratecal (espinhal) e intracerebroventricular (supraespinhal). Nesse contexto, a administração dos agonistas canabinoides em ambas as vias produziu inibição significativa da resposta nociceptiva mecânica induzida pela APB, principalmente quando observada no 30º dia após a cirurgia. A atividade antinociceptiva produzida pela administração dos agonistas canabinoides pode estar associada com o aumento dos níveis de RNA mensageiro e da expressão dos receptores canabinoides no gânglio da raiz dorsal e medula espinhal, no 5º e 30º dias após a cirurgia, além do aumento significativo de ambos os receptores no córtex cerebral no 30º dia. Além disso, foi observado um aumento na ativação da microglia e astrócitos no 5º e 30º dias na medula espinhal. Ademais, este estudo sugere que a analgesia produzida pelos agonistas canabinoides ocorre de forma dependente com a inibição de MAP-quinases, como a p-JNK e p-p38, as quais se encontram aumentadas na medula espinhal no 30º dia após a APB. Por outro lado observou-se um aumento na expressão dos fatores de transcrição, CREB no 30º dia e da subunidade p65 NF-?B no 5º e 30º dias, na medula espinhal após a APB. Em contrapartida, o tratamento com o agonista não-seletivo para os receptores canabinoides não foi capaz de reverter este efeito. Em conjunto, os resultados do presente estudo demonstram o efeito antinociceptivo dos agonistas canabinoides no modelo de dor neuropática induzido pela APB e sugere seu potencial terapêutico para o tratamento de dores crônicas, especialmente lesões do plexo braquial.

Cannabis as been used as an addict drug. Its consequences are not completely known (ex. dependence, schizophrenia, airway diseases and male infertility). The investigation around its therapeutic potential as began in the 90’s. The endocannabinoid system and specific receptors were discovered: CB1, CB2, TRP and atypical receptors. Animal and human investigation shows that synthetic cannabinoids may prove to become very useful in acute and chronic pain treatment., A canábis tem sido utilizada como droga de abuso. As suas consequências são parcialmente compreendidas (ex. dependência, esquizofrenia, patologias da vias aéreas e infertilidade masculina). Na década de 90, foi iniciada a investigação sobre o seu potencial terapêutico. O sistema endocanabinóide foi descoberto e foram identificados recetores específicos: CB1, CB2,TRP e recetores atípicos. A investigação em animais e em humanos, mostra que os canabinóides sintéticos poderão ser muito úteis na terapêutica da dor aguda e da dor crónica.

Sabe-se que o sistema canabinóide endógeno está envolvido com os processos de formação e evocação da memória. Agonistas dos receptores CB1 exibem diferentes efeitos conforme a via de infusão, seja ela sistêmica, seja local, atingindo estruturas específicas do encéfalo. Neste estudo pretendemos estabelecer o perfil farmacológico-comportamental e eletrofisiológico do agonista CP55,940 quando administrado no hipocampo dorsal de ratos, estrutura em que há poucos estudos prévios com este fármaco: diferente de outros agonistas como a WIN55,212 e mesmo a pouco seletiva anandamida, o CP55,940 restringe-se a receptores canabinóides e chega a ser mais potente que o Δ9-THC, embora não discrimine entre os receptores CB1 (central) e CB2 (periférico). Os fármacos foram infundidos bilateralmente, em diferentes concentrações, na área CA1 do hipocampo, imediatamente após o treino ou antes do teste na tarefa de Condicionamento Aversivo ao Contexto (CAC), visando estudar seus efeitos, respectivamente, na consolidação e na evocação da memória. A CP55,940 pós-treino foi amnéstica apenas na concentração de 5 μg/μl, e esse efeito foi revertido pelo antagonista AM251, seletivo para CB1, em concentração sem efeito próprio, comprovando tal efeito dever-se à ação sobre os receptores CB1. O mesmo efeito foi observado 24h após o treino, na infusão pré-teste, se bem que agora a CP55,940 foi efetiva também em concentrações mais baixas, sugerindo que os receptores desse sistema endógeno tenham ficado mais sensíveis a seus ligantes em função do aprendizado; a seletividade por CB1 neste caso, porém, não ficou claramente atestada pois o efeito de 5 μg/μl de CP55,940 só foi revertido com uma concentração maior de AM251. Na eletrofisiologia, uma concentração de CP55,940 comparável à efetiva sobre a CAC (10μM), não foi capaz de inibir a indução da LTP, já que a potenciação só se sustentou por cerca de 30min – não passou de uma LTP. Esses resultados reforçam e diversificam estudos anteriores, inclusive de nosso grupo, que comprovam a participação dos receptores CB1 na formação e/ou evocação de novas memórias aversivas, bem como possíveis alterações plásticas na densidade desses receptores em função da experiência cognitiva, embora não necessariamente mediadas por eventos sinápticos plásticos como a LTP. The endogenous cannabiboid system is known to be involved memory formation and retrieval processes. CB1 agonists may cause different effects according to the administration pathway, be it systemic or local/intrastructure. Here we try to establish the behavioral-pharmacologic and electrophysiologic profile of the agonist CP55,940 infused into the rat dorsal hippocampus, a structure less studied with this drug: different from other agonists such as WIN55,212 or even the poorly selective anandamida, CP55,940 sticks only to cannabinoid receptors and is more potent than Δ9-THC, but does not distinguish between central CB1 and peripherical CB2 receptors. The drug was infused bilaterally in different concentrations into the CA1 area of the hippocampus, right after training or pre-test in the Context Fear Conditioning (CFC) task, in order to study its effects upon memory consolidation and retrieval, respectively. Post-training CP55,940 was amnestic only at 5 μg/μl, and the CB1-selective antagonist AM251 reverted this effect in a concentration without action per se, which proves that the original effect is mediated by CB1 receptors. The same amnestic effect was observed 24h after training, in the pretest infusion, only that now CP55,940 was affective also with lower concentrations, suggesting that these receptors are now more sensitive to its endogenous ligands due to learning; CB1-selectivity, however, is not clearly proven here since 5 μg/μl of CP55,940 was reverted only by a higher concentration of AM251. In electrophysiology, a concentration of CP55,940 compatible with that found effective upon CFC (10μM), was not able to block LTP induction, since the potentiation was not sustained for more than 30min – it was only a STP. These results teinforce and diversify previous findings, including some from our own lab, that prove the involvement of CB1 receptors in memory consolidation and/or recall, as well as possible plastic changes in receptor density due to the cognitive experience, despite not necessarily mediated by plastic synaptic events such as LTP.

Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas. Programa de Pós-Graduação em Farmacologia Os sistemas endocanabinóide e adenosinérgico, através dos receptores A1 e CB1, compartilham uma série de características. Ou seja, ambos os receptores ativam proteínas Gi/o para mediar suas principais ações, inibem a liberação de diferentes neurotransmissores e são expressos em grandes concentrações no córtex, hipocampo e cerebelo. Além disso, agonistas dos dois receptores prejudicam processos relacionados à memória espacial enquanto que antagonistas induzem melhora cognitiva. Apesar das semelhanças entre os dois sistemas e da importância da memória espacial na fisiopatologia de diferentes doenças, poucos estudos avaliaram a possível interação entre ambos os sistemas no controle da memória espacial. Desta forma o objetivo deste trabalho foi avaliar a interação entre os sistemas adenosinérgico e endocanabinóide, através dos receptores A1 e CB1, na modulação da memória espacial. Para isso validou-se o modelo da localização de objetos em camundongos, o qual pareceu sensível a drogas amnésicas ou pró-mnemônicas. Além disso, demonstrou-se que a região CA1 do hipocampo participa da aquisição da memória de localização de objetos em camundongos. Posteriormente, utilizou-se o modelo recém validado e o labirinto aquático para avaliar o efeito pró-mnemônico da co-administração de antagonistas dos receptores A1 e CB1. Esta interação melhora o aprendizado de camundongos em doses até 20 vezes menores do que aquelas utilizadas para produzir o mesmo efeito quando administradas isoladamente. Na sequência demonstrou-se que as ações da co-administração são mediadas, pelo menos em parte, pela liberação de glutamato e a interação deste com os receptores NMDA no hipocampo e no córtex pré-frontal. No último grupo de experimentos, demonstrou-se que os receptores A1 e CB1 do hipocampo interagem para modular a amnésia induzida por agonistas de ambos. Ou seja, o efeito amnésico do agonista A1 é bloqueado pelo antagonista CB1, enquanto que o prejuízo de aprendizado induzido pelo agonista CB1 é atenuado pelo agonista A1. Sugerindo que tanto o tônus adenosinérgico quanto o endocanabinóide interagem para a modulação da amnésia induzida por agonistas dos receptores CB1 e A1, respectivamente. Por fim, conclui-se que os sistemas adenosinérgico e endocanabinóide, através de seus receptores A1 e CB1, interagem para o controle de processos associados à memória espacial de camundongos. The adenosinergic and endocannabinoid systems share different characteristics through the A1 and CB1 receptors. For example, both are densely expressed in areas such as the cerebellum, prefrontal cortex, and hippocampus. The binding of agonists to them activates Gi/o proteins and similar mechanisms of signal transduction. Functionally, A1 and CB1 receptor activation inhibits the release of different neurotransmitters. In animal models of spatial learning, A1 and CB1 receptor agonists and antagonists have been reported to impair and to facilitate learning and memory, respectively. Despite these evidences, there are no studies evaluating the interaction between both systems in spatial memory processes. Initially, we have done a pharmacological validation of the object-location task in mice. This task is sensitive to amnesic and pro-mnemonic drugs, and the expression of memory seems to be dependent on the CA1 hippocampus. In a second set of results, we have shown that coadministration of subeffective doses of A1 and CB1 antagonists improves acquisition of spatial learning evaluated either in the water maze or in the object-location task. This effect was dependent on glutamate release into the hippocampus and prefrontal cortex. The blockade of NMDA receptors in the CA1 hippocampus and prefrontal cortex counteracts the effects of the coadministration evaluated in the object-location task. This suggests that the simultaneous blockade of the adenosinergic and endocannabinoid tonuses might enhance memory, and that the mechanism of this effect is dependent on glutamate release into the hippocampus and prefrontal cortex. The last group of experiments evaluated the interaction between A1 and CB1 receptors in the amnesia induced by the agonists of both. The result suggests that the amnesia induced by an A1 agonist is blocked by a CB1 receptor antagonist. On the other hand, the learning deficits induced by the CB1 receptor agonist are attenuated by the A1 receptor activation. This suggests that the adenosinergic and endocannabinoid systems might modulate amnesia induced either by A1 or CB1 agonists. Finally, these results also suggest that the adenosinergic and endocannabinoid systems interact to modulate behavioral processes associated with spatial memory.

Tese de doutoramento, Ciências Biomédicas (Neurociências), Universidade de Lisboa, Faculdade de Medicina, 2011 Submitted by Marta Nogueira (mnogueira@reitoria.ul.pt) on 2011-04-06T14:59:39Z No. of bitstreams: 1 ulsd060169_td_Vasco_Sousa.pdf: 11934235 bytes, checksum: 571debf329a3996c6b28363a846eddb1 (MD5) Made available in DSpace on 2011-04-06T14:59:47Z (GMT). No. of bitstreams: 1 ulsd060169_td_Vasco_Sousa.pdf: 11934235 bytes, checksum: 571debf329a3996c6b28363a846eddb1 (MD5) Previous issue date: 2010 Fundação para a Ciência e a Tecnologia (FCT), Portugal; European Union [European Cooperation in Science and Technology (COST) COST B30 concerted action, Neural Regeneration and Plasticity (NEREPLAS)].

Os receptores canabinóides CB1 estão presentes em grandes quantidades no sistema nervoso central, especialmente no hipocampo, estrutura encefálica essencial para a formação de memórias. Estudos recentes mostram o importante papel do sistema endocanabinóide hipocampal sobre a consolidação e evocação de memórias emocionalmente relevantes ou que envolvam algum grau de aversividade. Na primeira parte desta tese, estudamos os efeitos da administração intra-hipocampal de AM251, um antagonista seletivo para os receptores canabinóides CB1, ou anandamida, um agonista canabinóide endógeno, sobre as fases da reconsolidação e extinção da memória na tarefa do condicionamento aversivo contextual. Nossos resultados mostram que o antagonista CB1 facilitou a reconsolidação, porém inibiu a extinção. A anandamida inibiu a reconsolidação da memória e facilitou a extinção, e esses efeitos foram revertidos pela co-administração de uma dose subefetiva de AM251, mostrando que os efeitos são mediados pelos receptores CB1. Na segunda parte do trabalho, investigamos os mecanismos por trás do envolvimento do sistema endocanabinóide hipocampal sobre memórias emocionais/aversivas. Foram desenvolvidos dois protocolos com diferentes níveis de aversividade. O antagonista CB1 AM251 inibiu a consolidação da memória no protocolo de alta aversividade (choque forte), mas não no de baixa aversividade (choque fraco). Em seguida, os animais foram submetidos a uma sessão de estresse para mimetizar um aprendizado aversivo e então, treinamos no protocolo fraco. A infusão de AM251 inibiu a consolidação da memória nessas condições. O experimento seguinte avaliou se os glicocorticóides liberados durante o estresse ou num aprendizado com forte conteúdo emocional é o fator determinante para a ativação do sistema endocanabinóide no hipocampo. O AM251 inibiu a consolidação da memória quando os animais eram tratados com o glicocorticóide sintético dexametasona imediatamente antes do treino com choque fraco. Por fim, avaliamos se o local de ação dos glicocorticóides era o hipocampo. A administração intra-hipocampal de dexametasona não produziu efeito sobre a consolidação, sugerindo que a modulação dos glicocorticóides ocorre de maneira indireta. Esses resultados mostram que existe uma interação sinérgica entre o sistema canabinóide e glicocorticóide sobre a modulação da memória. CB1 cannabinoid receptors are abundantly present in the brain, with large concentration in the hippocampus, an essential structure for the memory processes. Experimental evidence suggests an important role of the endocannabinoid system (ECS) in aversively-motivated memories. Similarly, Glucocorticoids (GC) released in response to stress exposure also modulates memory formation, and both stress and dexamethasone activate the ECS. The scope of the first part is to investigate the potential role of the hippocampal endocannabinoid system on reconsolidation and extinction. Bilateral infusion of CB1 antagonist AM251 into the dorsal hippocampus after memory reactivation facilitated the reconsolidation of the contextual fear conditioning memory. In contrast, the local infusion in CA1 with anandamide blocked memory reconsolidation, an effect that was antagonized after the combined administration of anandamide with a CB1 antagonist, supporting a role of the hippocampal endocabinnoid system in the modulation of the reconsolidation. Local infusion with AM251 into CA1 blocked memory extinction whereas the administration of ananadamide facilitated memory extinction. However, when combined with a subthreshold dose of the antagonist the extinction remain unaffected. Our results demonstrated a modulatory role of the hippocampal endocannabinoid system in both processes after retrieval: reconsolidation and extinction In the second part, we investigated the interaction between the ECS and GCs in the hippocampus in the modulation of fear memory consolidation. Two protocols with different shock intensities were used in order to control the level of aversiveness. Local infusion of AM251 into the CA1 immediately after training was amnestic in the strong, but not in the weak protocol. Moreover, AM251 was amnestic in animals stressed prior to the weak protocol, reverting the stress-induced facilitating effect. In order to investigate if the stress effect was mediated by glucocorticoid, we performed dexamethasone injection before training. Intrahippocampal AM251 infusion reduced memory in these animals. Finally, we investigated if glucocorticoid action site was in hippocampus. Dexamethasone infused directly in CA1 was not able to mimic the systemic injection effect, suggesting an indirect GC modulation. In conclusion, ECS and GC seem to interact in a synergic way in order to modulate memory consolidation.

Distintas evidências indicam que os endocanabinóides estão envolvidos no processamento de memórias. No entanto, a participação dos distintos subtipos de receptores canabinoides na memória de reconhecimento não é, ainda, muito clara. Esta Dissertação tem como objetivo avaliar as conseqüências da ativação dos receptores canabinóides hipocampais na consolidação da memória de reconhecimento de objetos. Com este intuito, ratos com cânulas estereotáxicamente implantadas na região CA1 do hipocampo dorsal foram treinados em uma tarefa de reconhecimento utilizando dois objetos estímulo. A retenção da memória foi avaliada em diferentes tempos após o treino. Para isto, na sessão de teste, um dos objetos apresentados durante o treino foi substituído por um objeto novo. Quando infundidos na região CA1 imediatamente após o treino, o agonista canabinóide não seletivo WIN-55,212-2, e o inibidor da recaptação celular de endocanabinóides VDM-11, impediram a retenção da memória de longa duração de reconhecimento de maneira dose-dependente sem, no entanto, afetar a memória de curta duração, a atividade exploratória e locomotora, o estado de ansiedade nem a integridade funcional do hipocampo. Os efeitos do WIN- 55,212-2 e VDM-11 foram completamente revertidos pela co-infusão de AM 251, um antagonista seletivo dos receptores CB1. Ainda, o agonista dos receptores CB1 ACEA, mimetizou os efeitos de WIN-55,212-2 e VDM-11, entanto que a administração intrahipocampal de dois agonistas diferentes dos receptores CB2, JWH-015 e palmitoiletanolamida, não tiveram efeito algum na retenção da memória em questão. Estes dados indicam que a ativação de receptores CB1 hipocampais imediatamente após o treino bloqueia a consolidação da memória de reconhecimento de objetos. Evidence indicates that brain endocannabinoids are involved in memory processing. However, the participation of CB1 and CB2 cannabinoid receptors in recognition memory has not been yet conclusively determined. Therefore, we evaluated the effect of the posttraining activation of hippocampal cannabinoid receptors on the consolidation of object recognition memory. Rats with infusion cannulae stereotaxically aimed to the CA1 region of the dorsal hippocampus were trained in an object recognition learning task involving exposure to two different stimulus objects. Memory retention was assessed at different times after training. In the test session, one of the objects presented during training was replaced by a novel one. When infused in the CA1 region immediately after training, the non-selective cannabinoid receptor agonist WIN-55,212-2 and the endocannabinoid membrane transporter inhibitor VDM-11 blocked long-term memory retention in a dose-dependent manner without affecting short-term memory, exploratory behavior, anxiety state or the functionality of the hippocampus. The amnesic effect of WIN-55,212-2 and VDM-11 was completely reversed by co-infusion of the CB1 receptor antagonist AM-251 and mimicked by the CB1 receptor agonist ACEA but not by the CB2 receptor agonists JWH-015 and palmitoylethanolamide. These data indicate that activation of hippocampal CB1 receptors early after training hamper consolidation of object recognition memory.

Os receptores canabinóides do tipo CB1 estão presentes em grandes quantidades no sistema nervoso central, especialmente no hipocampo, estrutura encefálica essencial para a formação de memórias e local onde o fenômeno eletrofisiológico da potenciação de longa duração (LTP) tem sido mais extensamente estudado. Neste trabalho, estudamos os efeitos da administração intrahipocampal de AM152, um antagonista seletivo para os receptores canabinóides CB1, ou da Anandamida, um agonista canabinóide endógeno, (a) sobre as etapas de aquisição, consolidação e evocação da memória, e (b) sobre a indução da LTP. Nossos resultados mostram que o antagonista CB1 prejudicou a consolidação, porém facilitou a evocação da memória; foi, também, capaz de inibir a indução da LTP. Já o endocanabinóide anandamida facilitou a consolidação da memória. As evidências sustentam um claro envolvimento do sistema CB1 endógeno na modulação dos processos plásticos subjacentes ao processamento do aprendizado e da memória. CB1 cannabinoid receptors are abundantly present in the brain, with large concentration in the hippocampus, an essential structure for the memory processes and extensively studied in LTP experiments. Here, we have studied the effect of the dorsal hippocampus infusion of the selective CB1 receptor antagonist AM251, or the endogenous cannabinoid anandamide, (a) upon the memory acquisition, consolidation and retrieval of the step-down inhibitory avoidance task in rats, and (b) upon LTP induction. Our results show that AM251 has caused a memory consolidation deficit, but a retrieval facilitation; it has also blocked the LTP induction. The endocannabinoid anandamide, otherwise, has caused a facilitation of the consolidation. Our evidence support a clear role for the CB1 endogenous cannabinoid system in the modulation of plastic events underlying the learning and memory processes.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas. Programa de Pós-Graduação em Farmacologia. Evidências sugerem que o sistema de neurotransmissão endocanabinóide modula o consumo de álcool. Trabalhos prévios do laboratório mostraram o desenvolvimento de tolerância rápida cruzada entre etanol e ?9-tetrahidrocannabinol, porém pouco se sabe sobre o envolvimento desse sistema de neurotransmissão na tolerância ao etanol. Diante disso, o presente estudo apresentou como objetivo inicial estudar o envolvimento dos receptores canabinóides (CB1) cerebrais nas tolerâncias rápida e aguda ao etanol. Observou-se que a administração sistêmica (i.p.) e intracerebroventricular (i.c.v.) do antagonista CB1 SR141716 (SR) bloquearam o desenvolvimento da tolerância rápida à incoordenação motora induzida por etanol, sendo esse efeito revertido pelo agonista CB1 WIN55,212-2. Nos experimentos de tolerância aguda, a administração i.c.v. de SR reduziu as concentrações plasmáticas de álcool, efeito revertido por WIN55,212-2, sem no entanto interferir no prejuízo motor. Para tentar compreender se a redução das concentrações plasmáticas de álcool era devida a uma maior eliminação da droga, foram realizadas avaliações cardiovasculares e dosagem de etanol na urina. A administração i.c.v. de SR não alterou o volume urinário, porém reduziu a concentração de etanol na urina do grupo tratado com a maior dose (4 g). A administração i.p. de etanol reduziu a pressão arterial (PA) de ratos anestesiados, não alterando a freqüência cardíaca (FC). A administração i.c.v. de SR (2 g) não alterou os valores cardiovasculares basais (PA e FC), porém aumentou significativamente a FC dos animais tratados com etanol. Tomados em conjunto, os dados do presente estudo sugerem um envolvimento importante dos receptores CB1 cerebrais na tolerância e sensibilidade ao etanol, bem como nas alterações cardiovasculares e nas concentrações plasmáticas de etanol.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas. Programa de Pós-Graduação em Farmacologia.