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Antisense oligonucleotides (ASO) can be used to direct some steps in mRNA maturation as splicing and polyadenylation in order to modulate gene expression. During lymphoid B-lineage development, maturation of immunoglobulin (Ig) transcripts involves alternative splicing and polyadenylation mechanisms. My thesis work has shown that ASO can be used to dissociate the two interconnected steps of transcription and splicing in order to study the sole impact of splicing of Ig germinal transcripts (GLT) during Ig class switch recombination. The submission of patent n°EP19305716.3 also allowed me to make a proof of concept for ASO usage to influence the polyadenylation of a specific Ig isotype by targeting the alternative polyadenylation sites (PAS) responsible for the production of membrane or secreted Ig. In fact, targeting the PAS used for the secreted IgE transcript with an ASO has made it possible to reduce IgE secretion and could be a new therapeutic strategy in IgE-dependent allergies. Finally, I developped a knock down method using splice switching oligonucleotide (SSO) that induces exon skipping during splicing and the appearance of alternative transcripts carrying a reading frameshift and a premature stop codon. This method could be used to target many genes expressed in eukaryotic cells, like B or plasma cells.Despite their limitations in terms of biodistribution, ASOs constitute innovative avenues for the development of new therapies against B lineage related diseases and lymphoproliferations., Les oligonucléotides antisens (ASO) peuvent être utilisés pour diriger certaines étapes de la maturation des ARN comme l’épissage et la polyadénylation afin de moduler l’expression génique. Durant le développement des cellules de la lignée lymphoïde B, la maturation des transcrits d’immunoglobulines (Ig) fait intervenir des mécanismes d’épissage et de polyadénylation alternatifs. Mes travaux de thèse ont montré que les ASO peuvent être utilisés pour découpler les deux étapes interconnectées que sont l’épissage et la transcription des transcrits germinaux (GLT) des Ig afin d’étudier l’impact de l’épissage seul sur la commutation de classe d’Ig. Le dépôt du brevet n°EP19305716.3 m’a également permis de faire une preuve de concept dans l’utilisation des ASO pour influencer la polyadénylation d’un isotype spécifique d’Ig en ciblant les sites de polyadénylation (PAS) alternatifs responsables de la production d’Ig membranaire ou sécrétée. En effet, cibler le PAS utilisé pour le transcrit de l’IgE sécrétée avec un ASO a permis de réduire la sécrétion d’IgE et pourrait constituer une nouvelle piste thérapeutique dans les allergies IgE dépendantes. Enfin, j’ai développé une méthode de knock down par oligonucléotide modulant l’épissage (SSO) qui induit un saut d’exon lors de l’épissage et l’apparition d’un transcrit alternatif portant un décalage du cadre de lecture et un codon stop prématuré. Cette méthode permettrait de cibler de nombreux gènes exprimés dans les cellules eucaryotes comme la cellule B ou le plasmocyte.En dépit de leurs limitations en termes de biodistribution, les ASO constituent des pistes innovantes pour le développement de nouvelles thérapies contre les maladies impliquant la lignée lymphoïde B ou les lymphoproliférations.

WOS:000467333800001; International audience; Swine lymph nodes (LN) present an inverted structure compared to mouse and human, with the afferent lymph diffusing from the center to the periphery. This structure, also observed in close and distant species such as dolphins, hippopotamus, rhinoceros, and elephants, is poorly described, nor are the LN macrophage populations and their relationship with B cell follicles. B cell maturation occurs mainly in LN B cell follicles with the help of LN macrophage populations endowed with different antigen delivery capacities. We identified three macrophage populations that we localized in the inverted LN spatial organization. This allowed us to ascribe porcine LN M 8 to their murine counterparts: subcapsular sinus M 8, medullary cord M 8 and medullary sinus M 8. We identified the different intra and extrafollicular stages of LN B cells maturation and explored the interaction of M 8, drained antigen and follicular B cells. The porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV) is a major porcine pathogen that infects tissue macrophages (M 8). PRRSV is persistent in the secondary lymphoid tissues and induces a delay in neutralizing antibodies appearance. We observed PRRSV interaction with two LN M 8 populations, of which one interacts closely with centroblasts. We observed BCL6 up-regulation in centroblast upon PRRSV infection, leading to new hypothesis on PRRSV inhibition of B cell maturation. This seminal study of porcine LN will permit fruitful comparison with murine and human LN for a better understanding of normal and inverted LN development and functioning.

Ku70-dependent canonical nonhomologous end-joining (c-NHEJ) DNA repair system is fundamental to the genome maintenance and B-cell lineage. c-NHEJ is upregulated and error-prone in incurable forms of chronic lymphocytic leukemia which also displays telomere dysfunction, multiple chromosomal aberrations and the resistance to DNA damage-induced apoptosis. We identify in these cells a novel DNA damage inducible form of phospho-Ku70. In vitro in different cancer cell lines, Ku70 phosphorylation occurs in a heterodimer Ku70/Ku80 complex within minutes of genotoxic stress, necessitating its interaction with DNA damage-induced kinase pS2056-DNA-PKcs and/or pS1981-ATM. The mutagenic effects of phospho-Ku70 are documented by a defective S/G2 checkpoint, accelerated disappearance of gamma-H2AX foci and kinetics of DNA repair resulting in an increased level of genotoxic stress-induced chromosomal aberrations. Together, these data unveil an involvement of phospho-Ku70 in fast but inaccurate DNA repair; a new paradigm linked to both the deregulation of c-NHEJ and the resistance of malignant cells.

La glutamate déshydrogénase (GDH) est une enzyme mitochondriale qui convertit l'a-ketoglutarate produit par le cycle de Krebs en glutamate, et vice et versa. Nous avons généré une lignée de souris dont les cellules bêta-pancréatiques n'expriment plus cette enzyme (ßGlud1-/-) et avons observé qu'une sécrétion optimale d'insuline n'est pas requise pour maintenir l'homéostase du glucose lorsque ces animaux sont sous diète normale. Nous avons soumis ces animaux à une diète hautement calorique, situation requérant une demande accrue en insuline, et observé une résistance à l'obésité. Dans le cas ou l'inactivation de la GDH dans les cellules b aurait lieu une fois que les souris sont obèses, la question est de savoir si la perte de cette enzyme pourrait induire une perte de poids ou provoquer le diabète. Nous avons donc généré un modèle de souris inductible permettant d'inactiver la GDH dans les cellules b une fois ces souris rendues obèses. L'inactivation de cette enzyme ne provoque pas de perte de poids, néanmoins, les souris dont les cellules b n'expriment plus la GDH suite à l'injection de tamoxifène semblent limiter leur accumulation de masse graisseuse et semblent être protégées contre l'intolérance au glucose qui va généralement de paire avec le développement de l'obésité.