Search

Significant changes have occurred in plant cell wall composition during evolution and diversification of tracheophytes. As the sister lineage to seed plants, knowledge on the cell wall of ferns is key to track evolutionary changes across tracheophytes and to understand seed plant-specific evolutionary innovations. Fern cell wall composition is not fully understood, including limited knowledge of glycoproteins such as the fern arabinogalactan proteins (AGPs). Here, we characterize the AGPs from the leptosporangiate fern genera Azolla, Salvinia, and Ceratopteris. The carbohydrate moiety of seed plant AGPs consists of a galactan backbone including mainly 1,3- and 1,3,6-linked pyranosidic galactose, which is conserved across the investigated fern AGPs. Yet, unlike AGPs of angiosperms, those of ferns contained the unusual sugar 3-O-methylrhamnose. Besides terminal furanosidic arabinose, Ara (Araf), the main linkage type of Araf in the ferns was 1,2-linked Araf, whereas in seed plants 1,5-linked Araf is often dominating. Antibodies directed against carbohydrate epitopes of AGPs supported the structural differences between AGPs of ferns and seed plants. Comparison of AGP linkage types across the streptophyte lineage showed that angiosperms have rather conserved monosaccharide linkage types; by contrast bryophytes, ferns, and gymnosperms showed more variability. Phylogenetic analyses of glycosyltransferases involved in AGP biosynthesis and bioinformatic search for AGP protein backbones revealed a versatile genetic toolkit for AGP complexity in ferns. Our data reveal important differences across AGP diversity of which the functional significance is unknown. This diversity sheds light on the evolution of the hallmark feature of tracheophytes: their elaborate cell walls., The Plant Journal, 114 (4), ISSN:0960-7412, ISSN:1365-313X

Additional file 1.

Galectins represent β-galactoside-binding proteins with numerous functions. Due to their role in tumor progression, human galectins-1, -3 and -7 (Gal-1, -3 and -7) are potential targets for cancer therapy. As plant derived glycans might act as galectin inhibitors, we prepared galactans by partial degradation of plant arabinogalactan-proteins. Besides commercially purchased galectins, we produced Gal-1 and -7 in a cell free system and tested binding capacities of the galectins to the galactans by biolayer-interferometry. Results for commercial and cell-free expressed galectins were comparable confirming functionality of the cell-free produced galectins. Our results revealed that galactans from Echinacea purpurea bind to Gal-1 and -7 with KD values of 1–2 µM and to Gal-3 slightly stronger with KD values between 0.36 and 0.70 µM depending on the sensor type. Galactans from the seagrass Zostera marina with higher branching of the galactan and higher content of uronic acids showed stronger binding to Gal-3 (0.08–0.28 µM) compared to galactan from Echinacea. The results contribute to knowledge on interactions between plant polysaccharides and galectins. Arabinogalactan-proteins have been identified as a new source for production of galactans with possible capability to act as galectin inhibitors.

Many plants especially from the families of Asteraceae, Boraginaceae, Heliotropiaceae, Fabaceae and Orchidaceae produce pyrrolizidine alkaloids (PAs) that are often toxic to fend off herbivores. Till this work only the first step of PA biosynthesis was elucidated. The entry-step of the PA biosynthesis is performed by an enzyme called homospermidinesynthase (HSS) which transfers an aminobutyl moiety of spermidine onto putrescine and creates the symmetric triamine, homospermidine. This enzyme, resulting from a duplication of the gene encoding the enzyme deoxyhypusine synthase (DHS) was shown to have developed several times independently. Using common comfrey (Symphytum officinale, Boraginaceae) as a model, different aspects of PA biosynthesis have been studied. It was shown that PA biosynthesis, though constitutive, is dynamic with respect to its regulation. A second site of PA biosynthesis was identified in planta within leaves subtending the reproductive parts (inflorescence) of the plants. Furthermore the work showed that this variability is also found on the intraspecific and intraindividual level by analyzing PA distribution and amounts in common comfrey. This result was validated also in another model system the Indian heliotrope (Heliotropium indicum, Heliotropiaceae) in respect to the variability of PA levels. This variability of PA levels was mirrored by the expression levels of HSS, an observation that was also valid for a copper-containing amine oxidase (CuAO). This CuAO was regarded as a candidate for a further step in PA biosynthesis, i.e. the oxidation of homospermidine. The sequence of the CuAO candidate was used to design virus-induced gene silencing (VIGS) experiments to knock down the candidate CuAO. Successful knock-downs showed reduced PA levels confirming the hypothesis of this CuAO is involved in PA biosynthesis. Chemical elucidation of the homospermidine transformation by the candidate CuAO resulted in the identification of a double oxidized and already double cyclized PA precursor. This result was further validated by tracer-feeding experiments to further support the involvement of the candidate CuAO, now named homospermidine oxidase in PA biosynthesis

Malaria stellt mit über 200 Millionen Fällen im Jahr 2018 eine der schlimmsten Infektionskrankheiten weltweit dar. Von der Malaria tropica, ausgelöst durch Plasmodium falciparum, ist vor allem Afrika betroffen. Die vier anderen humanpathogenen Erreger – Plasmodium vivax, Plasmodium knowlesi, Plasmodium ovale und Plasmodium malariae – führen im Rest der Welt vermehrt zu Infektionen. Die Behandlung wird durch eine zunehmende Resistenzbildung immer schwieriger. Es ist deshalb wichtig weitere targets für die Behandlung zu erschließen. Seit den neunziger Jahren werden dazu Substanzbibliotheken an vielversprechenden targets getestet. Die plasmodialen FNTs sind für den Abtransport des Stoffwechselendproduktes Laktat zuständig. Wird der FNT gehemmt, stirbt der Malariaerreger ab. Der FNT zeigt sich also als neues target durchaus erfolgsversprechend. Zu Beginn dieser Arbeit waren schon eine Leitstruktur sowie Analoga bekannt. Um das Repertoire zu erweitern und möglichst an einem anderen Teil des Proteins zu wirken, wurde in dieser Arbeit eine phänotypische Screening-Methode entwickelt, mit der viele Substanzen in kurzer Zeit auf ihre Hemmung des FNTs getestet werden können. Dieses Screening wurde dabei an der forcierten Resistenzmutante, G107S, für die bisherige Leitstruktur durchgeführt, um eine weitere Bindungsstelle zu identifizieren. Mit dieser Methode wurde die TCAMS-Substanzbibliothek, bestehend aus knapp 13.000 Verbindungen, getestet. Im primären Screening waren zunächst 92 Substanzen als hits identifiziert worden. Nach Überprüfung in einem biophysikalischen Assay, welcher direkt die Aufnahme von radioaktiv markiertem Laktat messen kann, konnte keiner der hits bestätigt wer-den. Es konnte demnach unter den getesteten 13.000 Substanzen keine gefunden werden, welche den FNT besser hemmt als die bereits bekannte Kontrolle. Des Weiteren wurden die FNT der humanpathogenen Plasmodien miteinander verglichen. Aufgrund ihrer hohen Aminosäuren-Sequenzanalogie lag die Vermutung nahe, dass diese Transporter ähnlich transportieren. Wichtiger, dass sie ähnlich gut gehemmt werden können. Es wurde dabei gezeigt, dass vor allem der FNT aus P. falciparum und der aus P. malariae in der Transportrate einen signifikanten Unterschied aufweisen. Bei den anderen Proteinen konnte dieser signifikante Unterschied nicht festgestellt werden. Bei der Hemmung bekannter Substanzen konnten Unterschiede im Hemmprofil der Transport-Proteine festgestellt werden.

Im Rahmen dieser Arbeit wurden erstmalig Arabinogalaktan-Proteine (AGPs) in der Familie der Geraniaceae - speziell von der Art Pelargonium sidoides - nachgewiesen, isoliert und charakterisiert. Dabei dienten getrocknete und frische Wurzeln sowie etablierte Zellkulturen, die ein optimales Wachstum in MS-Medium mit 1 mg/l 2,4-Dichlorphenoxyessigsäure, 0,2 mg/l Kinetin und je 50 mg/l Ascorbin- und Citronensäure zeigten, als Ausgangsmaterial. Die Isolierung von reinem AGP aus dem Wurzelmaterial erwies sich als schwierig, da die Glykoproteine mit den in der Pelargonium-Wurzel vorkommenden Proanthocyanidinen und hydrolysierbaren Gerbstoffen sowie der Stärke vermutlich nicht-kovalente Interaktionen ausbildeten. Im Gegensatz dazu war die Isolierung von reinen AGPs sowohl aus Kalluskulturen als auch aus den Zellen und dem Kulturmedium von Suspensionskulturen erfolgreich. Im Rahmen ihrer Charakterisierung konnte der 10% große Proteinanteil mit einer für klassische AGPs annähernd typischen Aminosäurezusammensetzung mit hohen Mengen an Ala (12%), Ser (11%), Asx (11%) und Thr (8%), sowie relativ niedrigen Anteilen von Pro (3%) und Hyp (4%) detektiert werden. Den Hauptteil des AGPs macht das Polysaccharid aus, welches ein stark verzweigtes Arabinogalaktan (AG) des Typ-II darstellt. Dabei bildet eine β-1,3-glykosidisch verknüpfte Galaktosekette das Rückgrat des AGs, welches über 1,3,6-Galp-Verzweigungspunkte mit 1,6-Gal-Seitenketten verbunden ist, die ihrerseits 1,2- und 1,5-verknüpfte furanosidische Arabinosen tragen. Mit ca. 28% bilden die terminalen Arabinosen neben 6-7% terminaler Glukuronsäure und ca. 4% terminaler Galaktose die dominierenden Endgruppen des Moleküls. Neben diesen stark verzweigten Arabinogalaktaneinheiten, die unterschiedliche Größen aufweisen, lassen sich auch kleine Oligosaccharide aus Arabinose finden. Die Zucker sind vor allem über O-glykosidische Bindungen via Hyp und eventuell auch via Ser und Thr mit dem Proteinteil verknüpft und bilden ein 90 kDa großes AGP. Neben der analytischen Charakterisierung wurden verschiedene biologische Aktivitäten der AGPs sowohl auf den menschlichen Organismus als auch auf die pflanzlichen Gewebe und ihre Entwicklung getestet. Im Gegensatz zu AGPs aus Echinacea purpurea konnte keine signifikante Inhibition oder Aktivierung des humanen Komplementsystems über die drei verschiedenen möglichen Wege (klassisch, alternativ und Lektin-abhängig) durch aufgereinigtes Pelargonium-Zellkultur-AGP ermittelt werden. Anhand von Suspensionskulturen wurde nachgewiesen, dass die Blockade von AGPs durch Zugabe von Yariv-Reagenz zum programmierten Zelltod (PCD) der behandelten Zellen führt. In speziell angefertigten Nasenkolben zeigten mit β-Glc-Yariv-Reagenz behandelte Zellkulturen von P. sidoides nicht nur eine konzentrations- und zeitabhängige Wachstumsinhibition, sondern auch die typischen morphologischen Veränderungen von Zellen, die dem PCD unterliegen, wie z.B. das Schrumpfen des Zytoplasmas. Des Weiteren konnte erfolgreich die beim PCD mittels Endonukleasen entstehenden DNA-Bruchstücke isoliert, gelelektrophoretisch aufgetrennt und als DNA-Ladder detektiert werden. Daneben wurde der Einfluss der AGPs auf die somatische Embryogenese bzw. in der Induktion der Embryonen an dem erstmals für P. sidoides etablierten Vermehrungsverfahren nachgewiesen.

Aus dem wässrigen Extrakt der Wurzeln von Echinacea purpurea (L.) MOENCH wurde eine hochmolekulare Fraktion, die Arabinogalactan-Proteine (AGPs) isoliert und aufgereinigt. Die AGPs wurden hinsichtlich ihres Proteinanteils und der Zusammensetzung des Kohlenhydratanteils charakterisiert. Das Proteoglykan enthielt 4,8% (m/m) Protein, wobei Glx, Hyp, Asx, Ser, Thr und Ala die dominierenden Aminosäuren darstellten. Der stark verzweigte Kohlenhydratanteil zeigte in der Bindungstyp-Analyse den Aufbau eines typischen AGPs mit einem 1,3-, 1,6- und 1,3,6-verknüpften pyranosidischen Galactosegrundgerüst, welches furanosidische Arabinosereste trägt. Diese traten als terminale oder 1,5-verknüpfte Arabinose auf. Des Weiteren wurden terminale Glucuronsäurereste gefunden. Neben der Strukturaufklärung wurde eine neue Methode der Lokalisierung von AGPs in pflanzlichen Geweben entwickelt. Das synthetische (β-D-Glc)3 Yariv Phenylgykosid (βGlcY) bindet spezifisch an AGPs. Zur Immunlokalisierung wurde ein polyklonaler Antikörper gegen βGlcY generiert. Mit diesem wurden mikroskopische Schnitte der sekundären Wurzel von Echinacea purpurea behandelt, die vorher mit βGlcY inkubiert wurden. Nach dem Zusatz von FITC-markierten Sekundärantikörpern wurden die Schnitte durch eine Konfokale Laser-Raster Mikroskopie (Confocal Laser Scanning Microscopy = CLSM) analysiert. Die AGPs wurden vornehmlich im Xylembereich des Zentralzylinders detektiert. Die Zellwände von Tracheen und Tracheiden sowie die Tüpfelkanäle waren deutlich markiert, insbesondere zum Zelllumen hin.