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English abstract of the Master Thesis compiled within the FED-AMR project. Linked theses in portugesehttps://repositorio.ul.pt/handle/10451/53801&nbsp

After publication of this work [1], we noticed that information regarding the university is missing in the affiliation for Bin Yang, Leilei Cui and Lusheng Huang (affiliation 1). The correct affiliation should be: National Key Laboratory for Pig Genetic Improvement and Production Technology, Jiangxi Agricultural University, Nanchang, China.

Tese de mestrado. Biologia (Biologia Humana e Ambiente). Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2011 Submitted by Lurdes Saramago (lurdes.saramago@fc.ul.pt) on 2012-04-05T15:00:21Z No. of bitstreams: 1 ulfc092907_tm_david_cruz.pdf: 1400012 bytes, checksum: f834bc1b850216e0b8e2ee42d3bb35ac (MD5) Made available in DSpace on 2012-04-05T15:00:32Z (GMT). No. of bitstreams: 1 ulfc092907_tm_david_cruz.pdf: 1400012 bytes, checksum: f834bc1b850216e0b8e2ee42d3bb35ac (MD5) Previous issue date: 2011

Poster apresentado no 9th ISABS Conference on Forensic and Anthropologic Genetics,22 a 26 de junho de 2015, ilha de Brač, Croácia SNP phenotypic markers are being studied by several groups worldwide. As a result, phenotypic loci such as the ones responsible for human eye, hair and skin color are starting to get known. These may provide information for identification of unknown sample donors in criminal casework when there are no suspects. This kind of information may be even more relevant when the sample donor possesses phenotypic characteristics which distinguish him from the population in which he is inserted. Nevertheless, this approach may be used in similar scientific areas. In this work, a DNA sample from a mummified corpse with historical and scientific interest was studied in order to discover more information about who this corps belonged to. One of the tools used in this investigation was IrisPlex, designed for eye color prediction. This study presents one example on how this methodologies may be useful, not only in forensic investigation but also in areas such as physical anthropology. N/A

Poster apresentado na 1ª Conferência do Instituto Nacional de Medicina Legal e Ciências Forenses, 30 a 31 de Outubro de 2014, Coimbra, Portugal Os marcadores fenotípicos, do tipo SNP, têm vindo a ser estudados por vários grupos a nível mundial, pelo que começam a ser conhecidos marcadores para características fenotípicas não só para a cor dos olhos, mas também para a cor do cabelo e pele, os quais podem fornecer um conjunto valioso de informação para a identificação do dador da amostra em estudo. Este tipo de informação poderá ser tanto mais relevante se o dador da amostra possuir características fenotípicas que o distingam da população na qual se encontra inserido. Neste trabalho, foi estudada uma amostra de uma peça museológica com interesse histórico-científico que exemplifica como este tipo de novas metodologias poderá ter interesse em áreas como a investigação criminal ou como a antropologia física. N/A

Tese de mestrado. Biologia (Biologia Humana e Ambiente). Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2013 Submitted by Lurdes Saramago (lurdes.saramago@fc.ul.pt) on 2014-01-28T16:04:04Z No. of bitstreams: 1 ulfc103181_goncalo_lidonio.pdf: 2035456 bytes, checksum: ad2ad3cf5a7eb16a4ca0c9a7ca31f753 (MD5) Made available in DSpace on 2014-01-28T16:04:17Z (GMT). No. of bitstreams: 1 ulfc103181_goncalo_lidonio.pdf: 2035456 bytes, checksum: ad2ad3cf5a7eb16a4ca0c9a7ca31f753 (MD5) Previous issue date: 2013

Dissertação de mestrado em Biologia Humana e Ambiente, entregue à Faculdade de Ciências da Universidade de Lisboa em 2018 e discutida e oficialmente concluída em 2019. The human exposure to plasticizers is continuous, since their pervasiveness in a vast range of plastic consumer products (e.g. food packages, healthcare products and textiles). Their ability to migrate and leach to the environment or food was previously demonstrated, therefore, increasing the risk of exposure as well as the risk of potential adverse health outcomes, with a subsequent socioeconomical impact. During the last decades, the adverse health effects of phthalates (e.g. DEHP, DINP), which are the main group of plasticizers used by the industry, has been demonstrated namely the disruption of the male reproductive system development, and the onset of carcinogenesis in humans. So, their application in many consumer products was restricted or even prohibited, which lead to the development of greener alternative plasticizers; within this group, DINCH is the main alternant used to increase the flexibility and durability of polymeric matrices. Concomitantly, the detection of DINCH in human surroundings and in biological matrices has increased during the last decade. This prompt the establishment of biomonitoring guidance values for DINCH metabolites in urine, as a measure of precaution; however, the studies about potential adverse effects of DINCH in humans are still scarce. Given the broad applications and the increasing levels of human exposure, the aim of this study was to analyse the cytotoxicity and genotoxicity of DINCH in human liver (HepG2) and kidney (HK-2) cell lines. Accordingly, the assays used herein were the colorimetric MTT assay, to determine cell viabilities; the modified alkaline comet assay, to detect DNA damage and repair; and the micronucleus assay, to examine chromosomal permanent damages. The results showed that DINCH did not affect cell viabilities, however, was able to induce mild mitogenic effects in human renal cells. After a prolonged exposure, there were mild to moderate cytotoxic and cytostatic effects, in both cell lines. In human hepatic cells, the plasticizer caused transient oxidative DNA damaging effects, but did not cause primary DNA damage, in both cell lines, regardless the exposure periods. Concerning the chromosomal damage, DINCH and its metabolites did not increase the micronucleus levels in both cell lines, with and without metabolic activation. Other biomarkers of genotoxicity were significantly increased after exposure, without a dose-response effect. These results are in line with previous in vivo and in vitro studies, which concluded that DINCH is a non-genotoxic compound, but can induce cytotoxic effects after prolonged exposure. Furthermore, this work is a valuable contribute to the assessment risk of DINCH in humans, because it is the first genotoxic study, to the best of our knowledge, using human cell lines. Nonetheless, more studies are needed to confirm these results, as well as to further investigate the long-term effects of oxidative damage in human health, since the human exposure to DINCH is expected to increase in the future. A exposição humana a substâncias químicas presentes no ambiente ocorre constantemente, pois estas constituem a matéria prima para o fabrico de uma vasta gama de produtos, proporcionando o desenvolvimento tecnológico e a modernização do estilo de vida quotidiano, que é cada vez mais complexo tendo em conta o modo de vida das gerações passadas. A introdução dos plásticos, em larga escala, é coincidente com este movimento que culminou com o desenvolvimento de uma elevada diversidade, disponibilidade e acessibilidade de materiais consumíveis. A nível macromolecular, os materiais de plástico podem ser definidos como misturas complexas de várias substâncias químicas, que incluem por exemplo diversos aditivos (corantes e conservantes), agentes plastificantes (DEHP, DINP, DINCH e bisfenóis), assim como, antibióticos. A aplicação de agentes plastificantes, na maioria ftalatos e bisfenóis, é fundamental durante o processo de manufatura porque permitem otimizar determinadas propriedades físicas dos produtos de plástico como por exemplo, a flexibilidade e a durabilidade, encontrando-se, por conseguinte, numa vasta gama de artigos, incluindo materiais de construção, alimentos embalados, artigos e brinquedos infantis, assim como, em produtos de higiene (cosméticos e perfumes). O aumento da disponibilidade de artigos de plástico, que contêm os respetivos agentes plastificantes, assim como, o potencial risco de migração e contaminação química dos alimentos e do ambiente doméstico, aumentam o risco de exposição e efeitos adversos na saúde humana. O impacto nocivo dos agentes plastificantes, nomeadamente dos ftalatos e bisfenóis, tanto a nível da saúde quanto a nível socioeconómico já foi comprovado, através de vários estudos in vitro, estudos epidemiológicos e de monitorização biológica; de maneira geral, os efeitos adversos observados são mais severos durante as etapas mais vulneráveis do desenvolvimento humano, daí que as grávidas, crianças e idosos constituam subgrupos populacionais mais suscetíveis. Atualmente a aplicação de alguns ftalatos na produção de artigos e brinquedos infantis foi restrita ou até mesmo proibida, devido ao seu elevado risco para a saúde mais especificamente, devido à capacidade de disrupção endócrina e potencial cancerígeno. Devido às restrições implementadas, verificou-se uma necessidade de desenvolvimento de plastificantes alternativos aos ftalatos, com menor risco toxicológico, o que teve como consequência uma mudança no padrão de uso e aplicação de agentes plastificantes a nível industrial. Neste sentido, observou-se um aumento da adoção do plastificante Hexamoll®DINCH® (DINCH), que foi desenvolvido para substituir os ftalatos DEHP e DINP, que foram classificados como disruptores do desenvolvimento reprodutivo e carcinogénicos; em simultâneo este agente apresenta funções semelhantes (flexibilidade, durabilidade), o que permite manter a qualidade do produto final. O plastificante DINCH é aplicado maioritariamente em polímeros de PVC e de poliestireno, que são usados para produzir por exemplo, equipamentos médicos, embalagens de alimentos e artigos e brinquedos infantis. Na última década, observou-se um aumento significativo na deteção do plastificante DINCH em ambientes domésticos (amostras de pó) e em amostras biológicas (urina, unhas), através dos estudos de biomonitorização, realizados a nível europeu, constatando-se que os níveis de exposição da população geral são, ainda, muito baixos. No entanto, como medida de precaução, foram estabelecidos valores limite de exposição, para crianças e adultos, referentes ao somatório dos metabolitos secundários do DINCH na urina, de 3.0 mg/L e 4.5 mg/L, respetivamente. No mesmo sentido, o composto DINCH foi recentemente introduzido numa lista de substâncias prioritárias que devem ser monitorizadas. No entanto, os dados existentes acerca dos potenciais efeitos adversos do DINCH na saúde humana ainda são escassos. Os efeitos deste agente plastificante foram, em contrapartida, extensamente analisados em modelos animais, de acordo com as regras internacionais para testar os efeitos de substâncias químicas, e autorização da sua aplicação em produtos destinados ao consumo humano. Em estudos in vivo, em ratinhos, observou-se a ocorrência de efeitos de toxicidade renal, após uma ingestão crónica de concentrações elevadas de DINCH, nomeadamente efeitos de morte celular, vacuolização do citoplasma e presença de sangue na urina. Por conseguinte, a EFSA estabeleceu uma dose diária tolerável para a população geral de 1 mg/Kg de peso corporal por dia; porém, alguns autores sugeriram um valor de referência oral mais baixo, como forma de prevenção, de 0.7 mg/Kg de peso corporal por dia. Foi ainda demonstrado, em ratinhos cronicamente expostos, a ausência de efeitos de toxicidade reprodutiva, de toxicidade genética e carcinogénicos. No entanto, verificou-se um aumento da proliferação celular e peso de alguns órgãos animais como por exemplo, do fígado, rins e tiroide após ingestão de doses elevadas de DINCH. Relativamente aos poucos estudos in vitro, observou-se após uma exposição prolongada ao DINCH, de pelo menos 48h até 7 dias, uma redução significativa da viabilidade e proliferação celular em células de ratinho. Da mesma forma, foi demonstrado que o seu metabolito primário (MINCH) causou uma redução da viabilidade celular, e na expressão de determinados recetores nucleares, sugerindo que o composto parental (DINCH), após ativação metabólica, potencialmente origina subprodutos eletrofílicos. Assim sendo, com o aumento da aplicação do DINCH em diversos artigos, com os quais lidamos diariamente, tem havido também um aumento da sua deteção e dos níveis de exposição da população, porém, desconhecem-se os efeitos que provocam na saúde humana. Como tal, o presente estudo teve como objetivo analisar a citotoxicidade e genotoxicidade do DINCH, em linhas celulares humanas. Escolhe-se uma linha celular de hepatócitos (HepG2), representativa do fígado, e uma linha celular do epitélio renal (HK-2), representativa dos rins, pois estes órgãos humanos são responsáveis pelos processos de biotransformação e excreção dos compostos químicos exógenos no organismo, estando por isso, continuamente expostos a potenciais substâncias carcinogénicas. Outro motivo desta escolha deveu-se à elevada suscetibilidade a efeitos tóxicos nestes órgãos, apresentados em estudos in vivo em ratinhos, de exposição crónica ao DINCH. Seguindo as recomendações internacionais para avaliar a genotoxicidade de potenciais compostos carcinogénicos, utilizou-se uma gama de concentrações finais de DINCH situadas entre 1 e 500 μg/mL; desta forma, analisou-se dois efeitos genotóxicos: o dano no DNA e os danos cromossómicos. O dano no DNA foi avaliado com recurso ao ensaio do cometa em meio alcalino e cometa em meio alcalino modificado com a enzima FPG (formamidopirimidina DNA N-glicosilase), após 3h e 24h de exposição permitindo, deste modo, a deteção de dano e reparação do DNA. Os danos cromossómicos foram avaliados com recurso ao ensaio do micronúcleo, após 6h de exposição com e sem ativação metabólica e após 48h de exposição sem ativação metabólica. Os efeitos citotóxicos, por sua vez, foram determinados através da análise da viabilidade celular, com o ensaio colorimétrico do MTT, após 24h de exposição. Relativamente à genotoxicidade com o ensaio do cometa, nas células hepáticas, observou-se que após 3h de exposição o DINCH não induziu dano primário no DNA, porém quando a enzima FPG foi adicionada, houve um aumento significativo da % de DNA na cauda em todos os tratamentos; que correspondem ao aumento de lesões alquilantes no DNA, que por sua vez, reflete a conversão de purinas oxidadas em quebras de cadeia no DNA. Com o aumento do tempo de exposição para 24h, observou-se que o DINCH também não induziu dano primário no DNA e de maneira geral, houve uma diminuição das lesões alquilantes em todos os tratamentos, com exceção da concentração 100 μg/mL de DINCH. Nas células renais, o DINCH não causou a indução de dano primário ou lesões alquilantes no DNA, independentemente do tempo de exposição. Portanto, com este ensaio verificou-se uma indução transiente de dano oxidativo nas células hepáticas, que pode ser explicado pela formação endógena de espécies reativas de oxigénio, durante o processo de biotransformação. Esta hipótese parece estar de acordo com os resultados dos estudos in vivo, em que o DINCH ativou as enzimas da fase I e II, e constituiu substrato enzimático. Relativamente à genotoxicidade com o ensaio do micronúcleo, observou-se que o composto parental e os seus metabolitos (primários e secundários) não aumentaram a frequência de micronúcleos induzidos, em ambas as linhas celulares e independentemente do tempo de exposição, logo, não causaram dano cromossómico estável em células binucleadas. Adicionalmente, verificou-se uma indução significativa de outros biomarcadores de dano cromossómico (NBUDs e NPB), todavia não houve um efeito de dose-resposta. Relativamente à citotoxicidade, o DINCH não reduziu a viabilidade celular em ambas as linhas celulares humanas, no entanto induziu efeitos mitogénicos em elevadas concentrações, nas células renais. Após uma exposição prolongada sem ativação metabólica, o DINCH causou efeitos citotóxicos e citostáticos, ligeiros a moderados, em ambas as linhas celulares, o que vai de encontro com os resultados existentes dos poucos estudos in vitro em linhas celulares animais, bem como, dos estudos in vivo em ratinhos. Em conclusão, este trabalho constitui um contributo valioso para a avaliação do risco toxicológico do composto DINCH no homem, pois até à não existem estudos de citotoxicidade e genotoxicidade em linhas celulares humanas. Todavia, é fundamental que no futuro se realizem mais estudos sobre os efeitos do DINCH, não só para confirmar estas conclusões, mas também para compreender-se os possíveis efeitos do dano oxidativo a longo prazo na saúde humana, pois, é esperado que a exposição humana aumente drasticamente nos próximos anos. Tudo isto, de forma a minimizar possíveis efeitos prejudiciais na saúde, principalmente nos subgrupos populacionais mais vulneráveis, como é o caso das crianças e dos trabalhadores da produção deste agente plastificante. N/A

Dissertação de mestrado em Biologia Humana e Ambiente, apresentado à Faculdade de Ciências da Universidade de Lisboa, Departamento de Biologia Animal, 2018. Trabalho de investigação realizado no Departamento de Promoção da Saúde e Prevenção de Doenças Não Transmissíveis, Unidade de Investigação e Desenvolvimento, Grupo de Neurogenética e Saúde Mental do Instituto Nacional de Saúde Doutor Ricardo Jorge, IP (novembro de 2017 a setembro de 2018) Defendida e aprovada em 9 de novembro de 2018 Autism Spectrum Disorder (ASD) is a pervasive and clinically heterogeneous neurodevelopmental disorder by deficits in social communication and interactions skills, and repetitive and stereotyped behaviours. It has becomes apparent that ASD has a strong genetics component. However, the level of heritability is still debated: compared to older and smaller studies, results from recent studies estimate a lower heritability percentage (83%), thus leaving a meaningful percentage of the risk that could be explained by environmental factors. Exposure to potentially harmful environmental factors can result in neurodevelopmental issues, due to neurotoxicity. Such environmental factors include endocrine disruptive chemicals like BPA, PBDEs, phthalates, PAHs, pesticides, and heavy metals, which disrupts optimal hormonal function, as well as pharmaceutical drugs which are able to cross physiological barriers and come into contact with the fetus. Moreover, the incorrect metabolization of these xenobiotics due to defective enzymatic activity may be linked to an increased risk of ASD. It has been suggested that individuals carrying polymorphisms that hinder the activity of cytochrome p450 enzymes, responsible for phase I metabolism, as well as UDP-glucuronosyltransferases and glutathione S-transferase enzymes responsible for phase II metabolism, will be more susceptible to potentially toxic chemicals. Therefore, considering the role played by environmental factors, this pilot study aims to investigate and contribute to the understanding of gene-environment interactions in ASD. In order to do this, we explored the usage of the Early Life Exposure Assessment Tool (ELEAT): a questionnaire which indirectly examines child’s exposure to exogenous factors that could be related to ASD from 3 months before conception, during pregnancy, to the first year of the child’s life, by analyzing maternal exposure. We aimed to investigate the type of data that could be obtained from this questionnaire, how it could be treated, and ultimately how it could be related to genetic information obtained from probands. The questionnaire was filled by 20 Portuguese mothers who had been part of a previous study. Additionally, we were able to obtain 14 biological samples from the children whose mothers filled out the questionnaire, who were then screened for various functional polymorphisms in genes known to interact with the environmental factors investigated in ELEAT. Finally, we related probands’ genotype to exposure reported in the ELEAT. Our results suggest that mothers were indeed exposed to some of the environmental factors being studied by the ELEAT in these critical periods of neurodevelopment. Additionally, genotyping results showed that this group of probands did carry a number of the polymorphisms being investigated in this pilot study, which could make them more susceptible to certain xenobiotics. When we merged probands’ genotype to reported exposure, we concluded that probands may have been exposed to the chemicals they were sensitive to during neurodevelopment. Most of the variants investigated in this study have not been yet related to ASD, but have the potential to indirectly contribute to the disorder’s onset. Our results demonstrate that meaningful results can be obtained from combining the ELEAT with genetic information. Seeing as the general population is somewhat regularly exposed to some levels of these chemicals, genetic factors play a crucial role in increasing susceptibility and thus leading to negative consequences such as increased ASD risk. This pilot study is an important step for future studies that intend to use the ELEAT to identify environmental risk factors for ASD. These should include a large population sample, and an equal number of controls, in order to obtain statistical power when calculating the multiplicative effect of given environmental exposures with genetic liability. In conclusion, the ELEAT could play a vital role in the understanding of geneenvironment interactions, and the development of preventive strategies for autism. Introdução: A Perturbação do Espectro do Autismo (PEA) é uma perturbação do neurodesenvolvimento clinicamente heterogénea caracterizada por défices na capacidade de comunicação e interação social, interesses repetitivos e comportamentos estereotipados. A PEA inclui indivíduos que possuem desde baixo até alto funcionamento e pode apresentar-se acompanhada de um vasto número de co-morbilidades, como a Síndrome do X Frágil, epilepsia e problemas gastrointestinais, que contribuem para a sua heterogeneidade fenotípica. A PEA tem uma forte componente genética, com estudos recentes a estimarem uma heritabilidade na ordem dos 83%. Estes valores sugerem também, que uma parte do risco seja explicada por causas não-genéticas, nomeadamente a presença de concentrações séricas baixas de certos factores nutricionais como a vitamina D e o ácido fólico já foram relacionados com o aumento do risco de desenvolver a perturbação. Também a exposição a tóxicos ambientais, potencialmente prejudiciais e neurotóxicos, pode resultar em problemas no neurodesenvolvimento, Estes incluem: disruptores endócrinos como o bisfenol A (BPA), éteres de difenila polibromados (PBDEs), ftalatos, hidrocarbonetos aromáticos policíclicos (PAHs), pesticidas e metais pesados (nomeadamente chumbo e mercúrio), que interferem com o funcionamento hormonal normal, bem como medicamentos capazes de atravessar as barreiras fisiológicas (hematoencefálica e placentária) e interferir com o feto. Estudos recentes suportam, com diferentes níveis de evidência, a associação entre a exposição a xenobióticos e o risco de desenvolver PEA. Tem sido sugerido que indivíduos portadores de polimorfismos que alteram a atividade das enzimas do citocromo p450, responsáveis pelo metabolismo de fase I, bem como as enzimas UDP-glucuronosiltransferases e glutationa S-transferases, responsáveis pelo metabolismo de fase II, serão mais suscetíveis a substâncias químicas potencialmente tóxicas. Normalmente, os estudos na PEA tendem a focar-se somente em factores genéticos ou em fatores não-genéticos, havendo uma necessidade urgente de desenvolver abordagens que integrem conjuntamente as duas componentes. Objetivo: Considerando que alguns casos de PEA poderão resultar da combinação entre a susceptibilidade genética individual e a exposição a fatores ambientais durante o neurodesenvolvimento, com este estudo piloto pretende-se investigar e contribuir para um melhor conhecimento das interações gene-ambiente na etiologia da PEA. Métodos: Foi explorada a aplicação do instrumento de investigação denominado: Estudo Longitudinal da Exposição Ambiental a Toxinas (ELEAT) - um questionário detalhado que examina indiretamente a exposição das crianças a fatores exógenos que podem estar relacionados com a PEA, desde os 3 meses antes da conceção, no decurso da gestação e estendendo-se ao longo do primeiro ano de vida. Nesta fase pretendemos investigar que tipo de dados podem ser obtidos a partir deste questionário, o modo como os dados podem ser tratados e, finalmente, como podem ser relacionados com a informação genética subsequentemente obtida de probandos. Responderam ao questionário 20 mães portuguesas com pelo menos um filho com PEA, recrutadas através de um estudo anterior. Na avaliação da componente genética do estudo, 14 amostras de DNA de crianças com PEA (cujas mães preencheram o questionário) foram testadas para a presença de vários polimorfismos funcionais em 14 genes: ABCB1, ACHE, AHR, CYP2D6, CYP2C19, CYP3A4, GSTM1, MTHFR, PLCG1, PON1, TNFRSF11B, UGT1A, UGT2B15, VDR. Este conjunto de genes foi selecionado pela sua relação com os fatores ambientais investigados no ELEAT, e os polimorfismos investigados têm potencial de influenciar a forma como os indivíduos portadores respondem à exposição a esses fatores. Finalmente, relacionámos o genótipo dos probandos com a exposição a xenobióticos reportada no referido questionário. Resultados: Os resultados obtidos do ELEAT sugerem que as mães e respetivos filhos(as) foram expostos a alguns dos fatores ambientais estudados, durante períodos críticos para o neurodesenvolvimento. Os resultados da genotipagem mostraram que o grupo de probandos é portador de variantes em vários dos genes investigados neste estudo, o que poderá torná-los mais suscetíveis a certos xenobióticos. Foram identificados portadores de alelos de menor frequência em genes como o ABCB1, ACHE, AHR, CYP2R1, CYP2C19, CYP3A4, PON1, UGT2B15 e VDR. Foram também encontrados indivíduos homozigóticos para o alelo alternativo em polimorfismos dos genes ACHE, AHR, PON1 e UGT2B15. Estes genes são particularmente importantes na resposta à exposição a pesticidas, PAHs e BPA, o que poderá ter um impacto na forma como os seus portadores respondem a tais exposições. Indivíduos com estes genótipos poderão exibir um maior risco de desenvolvimento de problemas no neurodesenvolvimento, como a PEA. Quando cruzamos o genótipo dos probandos com a exposição reportada, verificamos que os probandos portadores de alguns dos polimorfismos podem ter sido expostos aos produtos químicos aos quais são sensíveis durante períodos críticos do desenvolvimento neurológico. Discussão: Os nossos resultados demonstram que se podem obter dados importantes da combinação do ELEAT com informação genética. Apesar de extenso, o questionário relevou-se uma ferramenta útil para a recolha de informação relativa à exposição ambiental. A genotipagem de vários polimorfismos comuns na população geral, mas que poderão afetar a metabolização de vários fatores ambientais, poderá constituir uma abordagem apropriada para a identificação de indivíduos em maior risco de desenvolver PEA. Uma vez que a população geral está regularmente exposta a alguns dos produtos químicos analisados, os factores genéticos desempenham um papel crucial no aumento da suscetibilidade e, portanto, podem levar a consequências negativas, como o aumento do risco a PEA. Algumas variantes investigadas neste estudo ainda não foram relacionadas com a PEA, mas têm o potencial de contribuir indiretamente para o desenvolvimento da patologia. Este estudo piloto é um passo importante para futuros trabalhos de investigação que pretendam usar o ELEAT para identificar fatores de risco ambientais para a PEA. Tais estudos deverão incluir uma amostra populacional grande e igual número de controlos, a fim de obter poder valor estatístico para calcular o efeito combinado de exposições ambientais e suscetibilidade genética. Conclusão: Apesar da sua limitada dimensão, o estudo aqui apresentado é de particular relevância pois é um ponto de partida para o estudo conjunto de fatores genéticos e não-genéticos na PEA. Dado que o contacto com fatores ambientais poderá ser modificado de forma a evitar a exposição por indivíduos particularmente suscetíveis, o estudo de fatores de risco ambientais é de extrema importância. Em conclusão, a integração de informação recolhida através do ELEAT com informação genética poderá contribuir para a compreensão das interações gene-ambiente e para o desenvolvimento de estratégias preventivas para a Perturbação do Espetro do Autismo. N/A

Dissertação de mestrado em Biologia Humana e Ambiente, apresentada à Faculdade de Ciências da Universidade de Lisboa, 2017. Orientadora Paula Bajanca Lavado, Departamento de Doenças Infeciosas do INSA. Trabalho experimental realizado no Laboratório Nacional de Referência de Haemophilus influenzae do Departamento do Doenças Infeciosas do INSA. Haemophilus influenzae é um microrganismo responsável por infeções invasivas graves no Homem, apesar de ser frequentemente encontrado como colonizador do trato respiratório. Este agente patogénico é dinâmico e a sua epidemiologia tem vindo a mudar desde a introdução da vacina nos anos 90. Até à data, foram identificados 6 tipos capsulares (a-f), apesar de a maioria das estirpes caracterizadas atualmente serem não capsuladas (HiNC). Estudos anteriores caracterizaram a doença invasiva em Portugal, entre 1989-2001 e entre 2002-2010. O objetivo do presente estudo foi caracterizar fenotípica e molecularmente os isolados clínicos de doença invasiva em Portugal, durante um período de 6 anos (2011-2016), e comparar os resultados obtidos com os de estudos realizados anteriormente, bem como identificar a presença/ausência de 6 dos fatores de virulência destas estirpes. Durante o período de estudo considerado foram analisadas 174 estirpes invasivas, provenientes de 32 hospitais. A cápsula e o serotipo capsular foram identificados e caracterizados através de amplificação por PCR. A produção de β-lactamase foi pesquisada com nitrocefin, e a suscetibilidade aos antibióticos foi determinada pelo método da microdiluição em placa, de acordo com as diretrizes do European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing (EUCAST). De modo a avaliar a relação genética entre os isolados, foi realizada a técnica de Multilocus Sequence Typing (MLST), para amplificar e sequenciar os fragmentos internos dos 7 genes ‘housekeeping’ – adk, atpG, frdB, fucK, mdh, pgi, e recA. O sequence type (ST) foi atribuído através da base de dados de MLST para H. influenzae (https://pubmlst.org/hinfluenzae/), e as distâncias alélicas entre os STs foram representadas através da análise do algoritmo goeBURST, na plataforma PHYLOViZ. A presença/ausência dos fatores de virulência pilA, ompP5, hmw1A/hmw2A, hifA, e hia foi determinada por amplificação por PCR. As estirpes HiNC foram as principais responsáveis por doença invasiva (143/174; 82%); no entanto, 31 estirpes (31/174; 17,8%) eram capsuladas e foram caracterizadas como: 4 do serotipo a (2,3%), 21 do serotipo b (12,1%), 2 do serotipo e (1,1%), e 4 do serotipo f (2,3%). A maior parte das estirpes eram suscetíveis aos antibióticos estudados, com 12% (21/174) de estirpes resistentes à ampicilina por produção de β-lactamase. O MLST foi realizado para 136 estirpes e revelou elevada variabilidade genética entre 106 HiNC, com 71 STs diferentes (71/106; 67%). Pelo contrário, as estirpes capsuladas eram clonais: Hib-ST6 e ST-190, Hia-ST23, Hie-ST18, e Hif-ST124. Em Portugal, as estirpes HiNC suscetíveis aos antibióticos e apresentando elevada diversidade genética são as principais responsáveis pela doença invasiva a H. influenzae, apesar de estirpes Hib ainda circularem numa percentagem considerável no nosso país. Estirpes do serotipo não-b têm vindo a emergir, após a introdução da vacina contra o Hib, nomeadamente os serotipos a e f. Os fatores de virulência estudados, essenciais na fase de adesão ao hospedeiro, não se encontram obrigatoriamente em todas as estirpes e a sua presença não está associada a uma maior gravidade da infeção. No entanto, eventos como recombinação genética, ou variação de fase, estão entre os fatores que mais contribuem para o fitness do microrganismo, aquando da colonização da nasofaringe, contribuindo para uma maior patogenicidade, principalmente das estirpes HiNC. Devido à sua dinâmica evolutiva, é necessária a continuação da vigilância da doença invasiva a H. influenzae em Portugal, para que se possam desenvolver estratégias de prevenção adequadas. Haemophilus influenzae is an important pathogen, responsible for invasive disease, despite being one of the most common upper respiratory tract colonizers. This pathogen is dynamic and its epidemiology has been changing since vaccine introduction in 1990s. Six capsular types (a-f) have been identified, although now most characterized strains are non-capsulated (HiNC). Previous studies have characterized invasive isolates recovered in Portugal, between 1989-2001 and 2002-2010. We aim to phenotypically and molecularly characterize invasive isolates recovered in Portugal, over a 6-year period (2011-2016), compare these results with the previous ones, and identify the presence/absence of 6 selected virulence factors. During the study period, as part of a laboratory-based surveillance system, we received 174 invasive isolates, from 32 different Portuguese hospitals. Capsular status and serotype was identified and characterized by PCR amplification. β-lactamase production was assessed with nitrocefin, and antibiotic susceptibility was determined by the microdilution assay, according to the European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing (EUCAST) guidelines. To assess genetic relatedness among isolates Multilocus Sequence Type (MLST) was performed by amplifying and sequencing internal fragments of the 7 housekeeping genes – adk, atpG, frdB, fucK, mdh, pgi, and recA. Sequence type (ST) was assigned at https://pubmlst.org/hinfluenzae/, and the allelic distances between the STs were displayed using goeBURST analysis, through PHYLOViZ platform. The presence/absence of the virulence factors pilA, ompP5, hmw1A/hmw2A, hifA, and hia was determined by PCR amplification. Invasise disease was mainly due to HiNC strains (143/174; 82%); 31 isolates (17.8%) were capsulated and characterized as follows: 4 serotype a (2.3%), 21 b (12.1%), 2 e (1.1%), and 4 f (2.3%). Most strains were susceptible to antibiotics, with 12% (21/174) being β-lactamase producers. MLST, performed for 136 isolates, revealed high genetic variability among 106 HiNC isolates, with 71 different STs (67%). Capsulated isolates were clonal: Hib-ST6 and ST-190, Hia-ST23, Hie-ST18, and Hif-ST124. In Portugal, invasive disease is predominantly due to susceptible, highly genetically diverse HiNC strains, although Hib strains are still circulating in the country. Non-b serotype strains have also been emerging, after Hib vaccine introduction. The 6 studied virulence factors, which are important for adherence to host cells, are not necessarily found in all strains, nor are associated with a higher level of infection. Genetic recombination events and phase variation are among the factors that contribute to the overall fitness of the pathogen, mainly among HiNC strains. Due to its evolving dynamics, ongoing surveillance is needed, in order to better understand the burden of the disease and develop appropriate public health prevention strategies. N/A

Dissertação de mestrado em Biologia Humana e Ambiente, apresentada à Faculdade de Ciências da Universidade de Lisboa, 2012. Maria João Silva: Departamento de Genética do INSA, IP [POR]O Estuário do Sado é um ecossistema de elevado valor ecológico e económico, devido às várias atividades de pesca que suporta. Contudo, esses valores estão ameaçados pela contaminação dos sedimentos e da água do estuário por compostos com um reconhecido potencial mutagénico e carcinogénico. Este trabalho pretendeu contribuir para a avaliação do risco para a saúde humana decorrente da contaminação do Estuário do Sado, através da caracterização do potencial citotóxico e genotóxico de extratos fracionados obtidos a partir de amostras de sedimentos. Para além disso, pretendeu-se implementar um ensaio de avaliação das propriedades de desregulação endócrina das mesmas amostras. Os sedimentos recolhidos em três locais de pesca do Estuário do Sado (A, C e P) foram fracionados com solventes de diferentes polaridades: n-hexano (fração 2), diclorometano (fração 3) e metanol (fração 4). Tentou implementar-se o ensaio E-screen em células MCF-7, utilizando-se o 17-β-estradiol e o Bisfenol A, como controlo positivo. A caracterização da citotoxicidade e da genotoxicidade foi realizada em células HepG2, recorrendo-se, respetivamente, ao ensaio do vermelho neutro e ao ensaio cometa. As células MCF-7 foram expostas durante um período de 5 dias a várias concentrações dos controlos positivos, de modo, a se medir a proliferação celular. Não se conseguiu no entanto obter nos diferentes ensaios realizados uma reprodutibilidade do método. No ensaio do vermelho neutro foi observada uma diminuição da viabilidade celular principalmente nas frações A4, P3 e P4 o que sugere a existência de contaminantes nestas frações com capacidade de induzir citotoxicidade. No que diz respeito aos efeitos ao nível do ADN, observou-se uma elevação significativa do nível de lesões no ADN apenas nas frações 2 e 4 da amostra P. As diferenças registadas nos efeitos citotóxicos e genotóxicos entre as frações e as várias amostras sugerem que existem diferentes contaminantes nestas amostras, e além disso que diferentes contaminantes são extraídos com cada um dos compostos usados na preparação das diferentes frações. Estes resultados refletem as diferentes pressões exercidas ao longo do Estuário do Sado, e salientam a importância de estabelecer associações entre a identificação e quantificação dos contaminantes presentes nas amostras com os seus efeitos biológicos de modo a tentar tirar ilações sobre um potencial impacto na saúde humana. [ENG] The Sado Estuary is an ecosystem of high ecological and economic value, due to the fishing activities performed by the local population. Nevertheless, these values are threatened by the contamination of the estuary’s sediments and waters, by compounds with a recognized mutagenic and carcinogenic potential. This study aims to contribute to the evaluation of the potential risk to the human health, associated with the Sado Estuary’s contamination, through the characterization of the cytotoxic and genotoxic potential of fractionated extracts obtained from sediment samples. Furthermore, it was intended to implement an assay to evaluate the endocrine disrupting properties of the same samples. The collected samples from 3 fishing sites of the Sado Estuary (A, C and P) were fractionated with solvents of different polarities: n-hexane (fraction 2), dichloromethane (fraction 3) and methanol (fraction 4). The implementation of the E-screen assay in MCF-7, using 17-β-estradiol and Bisphenol A, as positive controls was attempted. The characterization of cytotoxicity and genotoxicity was performed in HepG2 cells by the Neutral Red and Comet assays, respectively. MCF-7 cells were exposed for 5 days to differences concentrations of the positive controls, in order to measure cellular proliferation. The method reproducibility was not achieved in the different assays performed. In the Neutral Red assay, a decrease in cell viability was observed, mainly for fractions A4, P3 and P4, which suggests the existence of contaminants in these fractions, with the ability to induce cytotoxicity. Regarding the effects at the DNA level, a significant increase in the level of DNA damage was observed for fractions 2 and 4 of sample P. The observed difference in cytotoxic and genotoxic effects, between fractions and samples, suggests the existence of different contaminants in these samples, and, furthermore, that different contaminants are extracted with each solvent used in the extraction process. These results reflect the different anthropogenic pressures along the Sado Estuary’s margins, and emphasize the importance of establishing associations between the identification and quantification of contaminants in sediments and their biological effects, in order to assess the potential impact of the human health.

Dissertação de mestrado em Biologia Humana e Ambiente, apresentada à Faculdade de Ciências da Universidade de Lisboa, 2022. Orientadora Doutora Henriqueta Louro (grupo de Toxicologia Genética do INSA) Os nanomateriais (NMs) de dióxido de titânio (TiO2) podem ser aplicados em diversas áreas, nomeadamente na indústria alimentar, o que torna a via oral uma das mais importantes vias de exposição a estes NMs. Após a ingestão, o trato gastrointestinal pode ser o primeiro local de contato com os NMs de TiO2. Vários estudos têm investigado se a exposição oral pode causar efeitos adversos locais ou sistémicos, tendo sido obtidos resultados contraditórios que poderão ser explicados através das alterações das propriedades físico-químicas que estes NMs sofrem durante o processo da digestão. O presente estudo tinha por objetivo contribuir para a avaliação do impacto celular dos NMs de TiO2, identificando perigos decorrentes da sua utilização no contexto gastrointestinal, e considerando o efeito do processo da digestão humana nas propriedades físico-químicas destes NMs. Para tal, foi avaliada a genotoxicidade de três NMs de TiO2 -o NM-102, NM-103 e o NM-105- em duas linhas celulares epiteliais intestinais, a Caco-2 e a HT29-MTX-E12, utilizando um modelo de digestão estática in vitro para simular a digestão humana destes NMs e ter em consideração eventuais modificações das características dos NMs que pudessem ocorrer durante este processo. Os resultados do ensaio do cometa convencional com uma exposição de 3h aos NMs de TiO2 (digeridos e não digeridos), realizado para a deteção de danos no DNA, revelaram que, no geral, não ocorreu um aumento relevante de quebras do DNA, embora anteriormente tenham sido observados efeitos genotóxicos com um tempo de exposição de 24h. Conclui-se, assim, que embora num período de exposição curta não ocorram efeitos genotóxicos, um período de exposição mais prolongado aos NMs de TiO2 ingeridos pode constituir um risco para a saúde humana. Relativamente ao ensaio do micronúcleo, realizado com os controlos negativos não digeridos e digeridos, verificou-se que a maior concentração do controlo negativo digerido induziu um aumento na frequência de micronúcleos, comparativamente ao controlo negativo não digerido, em ambas as linhas celulares, o que revela a influência do produto da digestão, mesmo sem NM, sugerindo a necessidade de otimizar o procedimento de digestão para futuras aplicações. Titanium dioxide nanomaterials (TiO2 NMs) can be applied in several areas, namely in the food industry, which makes the oral route one of the most important routes of exposure to these NMs. After ingestion, the gastrointestinal tract can be the first site of contact with TiO2 NMs. Many studies have investigated whether oral exposure can give rise to local or systemic adverse effects, with contradictory results that could be explained by changes in the physicochemical properties that these NMs undergo during the digestion process. The present study aimed to contribute to the assessment of the cellular impact of TiO2 NMs, identifying the dangers arising from its use in the gastrointestinal context, and considering the effect of the human digestion process on the physicochemical properties of these NMs. To this end, the genotoxicity of three TiO2 NMs -NM-102, NM-103 and NM-105- was evaluated in two intestinal epithelial cell lines, namely Caco-2 and HT29-MTX-E12, using an in vitro static digestion model to simulate the human digestion of TiO2 NMs. The results of the conventional comet assay with a 3h exposure to undigested and digested TiO2 NMs, revealed, in general, that there was no relevant increase in DNA breaks, although previously genotoxic effects have been observed with an exposure time of 24h. Therefore, it is concluded that a short period of exposure does not reveal genotoxic effects, while a longer period of exposure to ingested TiO2 NMs may present a risk to human health. Regarding the micronucleus assay performed with the undigested and digested negative controls, it was found that the higher concentration of the digested negative control induced an increase in the micronuclei frequency, compared to the undigested negative control, in both cell lines, which reveals the influence of the digestion product, even without NM, suggesting the need to optimize the digestion procedure for future applications. Este trabalho foi financiado com fundos nacionais através da FCT - Fundação para a Ciência e Tecnologia, I.P., no âmbito do projeto PTDC/SAU-PUB/29481/2017 e co-financiado pelo ToxOmicsCenter for Toxicogenomics and Human Health (UIDB/00009/2020; UIDP/00009/2020, FCT). N/A

Dissertação de mestrado em Biologia Humana e Ambiente apresentada à Faculdade de Ciências da Universidade de Lisboa, 2021. Orientadora Doutora Raquel Filipa Pinheiro Sabino (INSA). Discussão pública a 24 de novembro de 2021. Os dermatófitos são um grupo de fungos filamentosos com uma distribuição cosmopolita, que têm a capacidade de invadir tecidos queratinizados (pele, cabelo e unhas) de humanos e outros animais e provocar uma infeção superficial denominada de dermatofitose. As dermatofitoses são responsáveis por 3 - 4% dos casos afeções dermatológicas, sendo a infeção superficial mais comum em humanos (com uma prevalência entre os 20-25%). No entanto, espera-se que a sua prevalência continue a aumentar devido ao aparecimento de novos fatores de risco. As espécies do género Trichophyton são os principais agentes causadores de patologias como pé de atleta e onicomicose nas mãos e pés e estima-se que afete ~1.000.000.000 de pessoas em todo o mundo. T. rubrum e T. interdigitale são os principais agentes etiológicos com prevalências de 80% e 20%, respetivamente. Em Portugal, é estimado que 1.510.391 de portugueses sofram de dermatofitoses, correspondendo a uma incidência de 14.300 infeções por dermatófitos por cada 1.000.000 de habitantes. Para o tratamento das dermatofitoses, a primeira terapia a ser prescrita é, na grande maioria dos casos, a terbinafina. Desde 2017 que os casos de resistência a este antifúngico por parte de T. rubrum e T. interdigitale têm vindo a aumentar gradualmente. Os mecanismos de resistência à terbinafina são, essencialmente, descritos como mutações pontuais no gene que codifica a esqualeno epoxidase. Assim, neste estudo, procurámos perceber se a problemática de resistência ao antifúngico terbinafina em T. rubrum e T. interdigitale estaria ou não negligenciada em Portugal. Cento e sessenta e quatro isolados de T. rubrum e T. interdigitale foram identificados até à espécie através de tecnologias moleculares e também com recurso a espectoctrometria de massa (MALDI-TOF). De seguida, verificámos a presença da resistência ao antifúngico terbinafina nestes isolados e pesquisámos as mutações associadas a essa mesma resistência. Para tal, procedemos à otimização e implementação de metodologias que permitiram efetuar a avaliação da resistência de isolados de T. rubrum e T. interdigitale, quer por método cultural quer por metodologias moleculares com sequenciação do gene da esqualeno epoxidase (SQLE) seguida de deteção de mutações neste gene que conferem resistência a este composto. A caracterização dos padrões de suscetibilidade ao antifúngico terbinafina foi feita recorrendo a meios de screening (agar suplementado com terbinafina) e ao método das microdiluições em caldo. Numa primeira abordagem, de 102 isolados de T. rubrum, apenas 1 isolado (nº126) revelou ser resistente á terbinafina por meio de screening e dos 17 isolados T. interdigitale, apenas 3 demonstraram ser resistentes à terbinafina por meio de screening em ambas as concentrações utilizadas definidas pela norma EUCAST (0.06 mg/L e 0.125 mg/L). De acordo com a metodologia das microdiluições, 2,44% dos isolados apresentaram menor suscetibilidade à terbinafina. Os nossos resultados demonstram que o isolado nº126 (T. rubrum) revelou ser bastante resistente à terbinafina com uma CMI de 8 mg/L, os isolados nº 63 e nº94 (T. interdigitale) apresentaram CMIs superiores a 8 mg/L o que representa uma baixa suscetibilidade à terbinafina. O isolado T. interdigitale nº 59 apresentou uma CMI igual a 1 mg/L o que revela uma resistência moderada à terbinafina. A otimização da PCR de amplificação e sequenciação do gene da SQLE de T. rubrum e T. interdigitale permitiu a deteção de mutações pontuais apenas num isolado de cada espécie num total de quatro isolados classificados como resistentes. O isolado T. rubrum nº126, após análise da sequência do gene da SQLE, apresentou uma mutação pontual na posição 1189 na ORF do gene da SQLE o que corresponde a uma substituição de uma fenilalanina na posição 397 da sequência de aminoácidos da proteína por uma isoleucina. Apesar de as substituições mais comuns e que levam a uma maior resistência à terbinafina serem L393F e F397L, a substituição F397I detetada no isolado T. rubrum deste estudo, sugere causar uma elevada resistência à terbinafina. Relativamente aos isolados resistentes T. interdigitale, apenas o isolado nº 94 apresentou uma mutação pontual na posição 1189 na ORF do gene da SQLE, ocorrendo uma substituição de uma fenilalanina na posição 397 da sequência de aminoácidos da proteína por uma leucina, o que confirma a sua CMI superior a 8 mg/L. Nos restantes isolados resistentes pertencentes à espécie T. interdigitale, não foram encontradas quaisquer mutações no gene que codifica a SQLE. Este estudo, permitiu-nos efetuar uma caracterização da população amostrada, das amostras biológicas e dos isolados do género Trichophyton obtidos por cultura destas amostras. Foi também possível detetar, pela primeira vez, isolados do género Trichophyton resistentes à terbinafina em Portugal. Foi ainda possível estimar, dentro dos isolados estudados, uma frequência de resistência de 2,44%. A resistência à terbinafina por parte de T. rubrum e T. interdigitale é um problema real em todo o mundo e estima-se que os casos continuem em aumentar e por isso acreditamos que, a aplicação do método de screening e das microdiluições bem como a implementação da reação de PCR para pesquisa de mutações que conferem essa mesma resistência será uma mais valia e um contributo importante no que toca ao diagnóstico e posterior terapia das dermatofitoses reportadas em Portugal. Dermatophytes are a group of filamentous fungi with a cosmopolitan distribution, which have the ability to invade keratinized tissues (skin, hair and nails) of humans and other animals and cause a superficial infection called dermatophytosis. Dermatophytosis are responsible for 3 - 4% of cases of dermatological disorders, being the most common superficial infection in humans (with a prevalence of 20-25%). However, it is expected that this prevalence will continue to increase, due to the appearance of new risk factors. Species of the genus Trichophyton are the main causative agents of pathologies such as athlete's foot and onychomycosis in the hands and feet and are estimated to affect ~ 1,000,000,000 people worldwide. T. rubrum and T. interdigitale are the main etiological agents with a prevalence of 80% and 20%, respectively. In Portugal, it is estimated that 1,510,391 of Portuguese suffer from dermatophytosis, corresponding to an incidence of 14,300 infections by dermatophytes per 1,000,000 inhabitants. For the treatment of dermatophytoses, the first therapy to be prescribed is, in the majority of the cases, terbinafine. Since 2017, cases of resistance to this antifungal by T. rubrum and T. interdigitale have been gradually increasing. The mechanisms of resistance to terbinafine are essentially described as point mutations in the gene encoding squalene epoxidase. Thus, in this study, we sought to understand whether the problem of resistance to the terbinafine antifungal in T. rubrum and T. interdigitale would be neglected or not in Portugal. One hundred and sixty-four isolates of T. rubrum and T. interdigitale were identified up to the species using molecular technologies and also using mass spectrometry (MALDI-TOF). Then, we verified the presence of resistance to the antifungal agent terbinafine in these isolates and investigated the mutations associated with that same resistance. To this end, we proceeded to the optimization and implementation of methodologies that made it possible to evaluate the resistance of T. rubrum and T. interdigitale isolates, either by cultural method or by molecular methodologies with sequencing of the squalene epoxidase gene (SQLE) followed by detection of mutations in this gene that confer resistance to this compound. The characterization of the susceptibility patterns to the terbinafine antifungal was performed using agar screening medium (agar supplemented with terbinafine) and the broth microdilution method. In a first approach, of 102 isolates of T. rubrum, only one isolate (nº 126) showed to be resistant to terbinafine and of the 17 isolates of T. interdigitale, only 3 demonstrated to be resistant to terbinafine by screening agar medium in both concentrations used defined by EUCAST (0.06 mg/L and 0.125 mg/L). According to the microdilution method, 2,44% of the isolates were less susceptible to terbinafine. Our results demonstrate that isolate nº 126 (T. rubrum) proved to be quite resistant to terbinafine with a MIC of 8 mg/L, isolates nº 63 and 94 (T. interdigitale) had MICs greater than 8 mg/L, which represents a low susceptibility to terbinafine. The isolate T. interdigitale nº 59 presented a MIC equal to 1 mg / L, which reveals a moderate resistance to terbinafine. The optimization of the PCR for amplification and sequencing of the SQLE gene of T. rubrum and T. interdigitale allowed the detection of point mutations in only one isolate of each species in a total of four isolates classified as resistant. The isolate T. rubrum nº126, after sequence analysis of the SQLE gene, showed a point mutation at the position 1189 in the ORF of the SQLE gene, which corresponds to a substitution of a phenylalanine at the position 397 of the amino acid sequence of the protein with an isoleucine. Although the most common substitutions that lead to greater resistance to terbinafine are L393F and F397L, the F397I substitution detected in the isolate T. rubrum in this study, suggests causing a high resistance to terbinafine. Regarding resistant isolates T. interdigitale, only isolate 94 showed a point mutation at position 1189 in the SQLE gene ORF, with a substitution of a phenylalanine at position 397 of the protein's amino acid sequence for a leucine, which confirms the its MIC greater than 8 mg / L. In the remaining resistant isolates belonging to the species T. interdigitale, no mutations were found in the gene encoding SQLE. This study allowed us to characterize the sampled population, the obtained biological samples and characterize the isolates of the genus Trichophyton obtained by culture. It was also possible to detect, for the first time in Portugal, terbinafine resistant isolates belonging to the genus Trichophyton to . It was also possible to estimate, within the studied isolates, a resistance frequency of 2.44%. Resistance to terbinafine in T. rubrum and T. interdigitale is a real problem worldwide and it is estimated that cases continue to increase and that is why we believe that the application of the screening method and microdilutions, as well as the implementation of the PCR reaction to search for mutations that confer this same resistance will be an important contribution with regard to the diagnosis and subsequent therapy of the dermatophytosis reported in Portugal. N/A

Dissertação de mestrado em Biologia Humana e Ambiente apresentada à Faculdade de Ciências, Universidade de Lisboa, 2021 Orientadores: Doutora Paula Faustino (INSA) e Professora Deodália Dias (FCUL) A anemia é um problema de saúde pública a nível mundial que ocorre quando o número de glóbulos vermelhos em circulação ou a sua capacidade de transporte de oxigénio é insuficiente para atender às necessidades do organismo. A anemia pode ter uma origem ambiental, derivada da carência nutricional em ferro, mas também pode ter uma origem genética, onde se enquadram as anemias hereditárias, derivadas de alterações nos genes das cadeias globínicas da hemoglobina. Estas anemias hereditárias são denominadas por hemoglobinopatias, têm transmissão autossómica recessiva e incluem as talassémias e as variantes da hemoglobina. As talassémias, no estado de portador, apresentam-se geralmente com um fenótipo de microcitose e/ou hipocromia e eventualmente anemia. Os últimos estudos de prevalência de hemoglobinopatias efetuados em Portugal foram realizados há duas décadas e nenhum deles incluiu a análise da população insular. Tendo em conta os movimentos populacionais existentes nos últimos tempos, sobretudo provenientes das regiões Africanas e Sul Americanas para a Europa, é de esperar que o padrão de distribuição destas patologias se tenha vindo a alterar. Deste modo, a presente dissertação tem como principal objetivo contribuir para o conhecimento da realidade atual das hemoglobinopatias em Portugal. Para isso, foram analisados molecularmente 204 indivíduos com fenótipo hematológico de hipocromia e/ou microcitose, residentes em Portugal continental e ilhas há pelo menos 12 meses. Estes indivíduos foram selecionados a partir de 4808 participantes no projeto “Inquérito Nacional de Saúde com Exame Físico” (INSEF), um estudo epidemiológico realizado pelo Instituto Nacional de Saúde Doutor Ricardo Jorge (INSA) em 2015, representativo da população residente em Portugal. De forma a determinar a base molecular das hemoglobinopatias na população portuguesa, foram analisados os DNAs dos 204 indivíduos acima referidos quanto aos genes HBA e HBB. Para a pesquisa de deleções/inserções, os genes HBA foram estudados através das metodologias de Gap-PCR e Multiplex Ligation-Dependent Probe Amplification (MLPA). Identificámos a presença da deleção α-talassémica de 3,7 kb em 53 indivíduos, da deleção de 4,2 kb em um indivíduo e ainda a presença de dois indivíduos com os genes da α-globina triplicados. O gene HBB foi estudado através de PCR seguido de Next-Generation Sequencing (NGS). Procedeu-se à análise bioinformática dos resultados de NGS, tendo sido identificadas 10 tipos diferentes de variantes genéticas possivelmente patogénicas. Para estas variantes, foram realizados estudos in silico através das ferramentas bioinformáticas PolyPhen-2, Sorting Intolerant From Tolerant (SIFT) e varSEAK, de modo a analisar o seu impacto ao nível da estrutura e função das respetivas proteínas e ao nível do splicing. As variantes consideradas patogénicas ou possivelmente patogénicas foram confirmadas por sequenciação de Sanger, tendo sido então identificadas sete tipos diferentes de mutações responsáveis por β-talassémia [Cd39 (C>T), IVS-I-6 (T>C), IVS-I-110 (G>A), IVS-I-1 (G>A), Cd15 (G>A), Cd6(-A) e Cd41/42 (-CTTT)] e três variantes de hemoglobina (Hb S, Hb C e Hb D-Portugal). Neste estudo também se pretendeu determinar a frequência das diferentes hemoglobinopatias detetadas na população portuguesa avaliada no projeto INSEF que apresentava um fenótipo hematológico de hipocromia e/ou microcitose. Obtivemos neste sub-grupo da população uma frequência de 26,6% para a α-talassémia, 10,8% para a β-talassémia e 1,5% para as variantes de hemoglobina. Assim, os nossos resultados revelaram que 38,9% destes casos sintomáticos têm uma origem genética – uma hemoglobinopatia. Este valor, bastante significativo, deverá alertar os clínicos, sobretudo da medicina geral e familiar para esta possibilidade aquando do processo conducente ao diagnóstico de um novo caso. Os nossos resultados permitiram, ainda, determinar uma prevalência de 0,5% de portadores de β-talassémia para a população residente em Portugal continental e ilhas. Descrevemos ainda as características demográficas e de saúde dos indivíduos analisados. De entre os 204 indivíduos com microcitose e/ou hipocromia, 76 também apresentavam anemia, mas apenas dois deles referiram ter conhecimento desta condição. A grande maioria dos portadores de talassémia detetados perceciona a sua saúde como sendo normal e, eventualmente, desconhece (não declarou ter conhecimento) de que é portador de uma doença genética. Em conclusão, acreditamos que através deste estudo contribuímos e aprofundámos o conhecimento atual da base molecular das hemoglobinopatias na população residente em Portugal. Acreditamos também que este conhecimento poderá contribuir para que sejam estabelecidas melhores estratégias de deteção e de acompanhamento dos casos de hemoglobinopatias em Portugal, permitindo melhorar a qualidade de vida dos portugueses. Anemia is a worldwide public health problem that occurs when the number of circulating red blood cells is low or their oxygen carrying capacity is insufficient to meet the body's needs. Its origin could be related with nutritional factors, such as an iron deficient diet or genetic factors, namely hereditary anaemias with an autosomal recessive inheritance. Hereditary anemias occur due to genetic alterations that lead to changes in the hemoglobin molecules and are called hemoglobinopathies, which can be divided in thalassemias or hemoglobin variants. In the carrier state, thalassemia usually presents with a phenotype of microcytosis and/or hypochromia and eventually anemia. The last studies regarding the prevalence of hemoglobinopathies in Portugal were carried out two decades ago and none of them included an analysis of the insular Portuguese population. In addition, given the population movements that took place in recent years, it is expected that the pattern of distribution of these pathologies has changed. Thus, the main objective of this dissertation is to contribute to the knowledge of the current reality of hemoglobinopathies in Portugal. With this goal in mind, we analysed molecularly 204 individuals selected from the project “Inquérito Nacional de Saúde com Exame Físico” (INSEF), an epidemiological study carried out in 2015 by Instituto Nacional de Saúde Doutor Ricardo Jorge representative of the resident population in Portugal. These individuals have a hematological phenotype of hypochromia and/or microcytosis and have been resident in mainland Portugal or islands for at least 12 months. To determine the molecular basis of the hemoglobinopathies present in the sample, we analysed the HBA and HBB genes. The HBA gene was studied for the search for deletions/insertions using Gap-PCR and Multiplex Ligation-Dependent Probe Amplification (MLPA) methodologies. We identified 53 individuals with the α-thalassemic 3.7 kb deletion, one with the 4.2 kb deletion and two with triplicated α-globin genes. The HBB gene was studied using PCR, followed by Next-Generation Sequencing (NGS). Through the bioinformatics analysis of the NGS results, we identified 10 possibly pathogenic variants. We carried out in silico studies using bioinformatics tools like varSEAK, PolyPhen-2 and Sorting Intolerant From Tolerant (SIFT) to analyse their impact in proteins’ splicing, structure and function. Variants considered pathogenic were confirmed by Sanger sequencing. We identified seven different types of mutations responsible for β-thalassemia [Cd39 (C>T), IVS-I-6 (T>C), IVS-I-110 (G>A), IVS-I-1 (G>A), Cd15 (G>A), Cd6(-A) e Cd41/42 (-CTTT)] and three hemoglobin variants (Hb S, Hb C e Hb D-Portugal). Based on these molecular findings, we discovered a frequency of 26.6% for α-thalassemia, 10.8% for β-thalassemia and 1.5% for hemoglobin variants. Thus, our results revealed that 38.9% of these symptomatic cases have a genetic origin – a hemoglobinopathy. Our results also allowed us to determine a prevalence of 0.5% of β-thalassemia carriers for the Portuguese population. We also described the demographic and health characteristics of the individuals with hemoglobinopathies. Among the 204 individuals with microcytosis and/or hypochromia, 76 also had anemia, but only two of them reported having knowledge of this condition. Thus, most carriers are unaware of their status as a carrier of a genetic disease. In conclusion, we believe that with this study we contributed to the current knowledge of the molecular basis of hemoglobinopathies in the population residing in Portugal. This knowledge can contribute to the establishment of better strategies for detecting and monitoring cases of hemoglobinopathies in Portugal, allowing to improve the quality of life of the Portuguese. Esta dissertação é um sub-estudo do estudo INSEF, desenvolvido no âmbito do Projeto Pré-definido do Programa Iniciativas em Saúde Pública, foi promovido pelo Instituto Nacional de Saúde Doutor Ricardo Jorge através do Departamento de Epidemiologia e beneficiou de apoio financeiro concedido pela Islândia, Liechtenstein e Noruega, através das EEA Grants. N/A

Submitted by Paula Guerreiro (passarinho@reitoria.ulisboa.pt) on 2021-11-23T13:49:01Z No. of bitstreams: 1 ulsd737080_td_Pedro_Teixeira.pdf: 11043703 bytes, checksum: 71a8314886367822d5c857e828d40e39 (MD5) Made available in DSpace on 2021-12-13T15:38:41Z (GMT). No. of bitstreams: 1 ulsd737080_td_Pedro_Teixeira.pdf: 11043703 bytes, checksum: 71a8314886367822d5c857e828d40e39 (MD5) Previous issue date: 2021-07 Câmara Municipal de Lisboa em colaboração com o Instituto Nacional de Saúde Doutor Ricardo Jorge

Tese de mestrado em Biologia Humana e Ambiente, Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2021 Submitted by Cristina Manessiez (camanessiez@fc.ul.pt) on 2021-06-21T14:06:05Z No. of bitstreams: 1 TM_Luís_Coelho.pdf: 1565847 bytes, checksum: c84bdbafc0f21e0dc324633d4f2e3669 (MD5) Made available in DSpace on 2021-06-21T14:06:17Z (GMT). No. of bitstreams: 1 TM_Luís_Coelho.pdf: 1565847 bytes, checksum: c84bdbafc0f21e0dc324633d4f2e3669 (MD5) Previous issue date: 2021

Tese de mestrado, Biologia Humana e Ambiente, Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2021 Submitted by Teresa Boa (tdboa@fc.ul.pt) on 2021-06-26T13:20:27Z No. of bitstreams: 1 TM_Rita_Marques.pdf: 1991170 bytes, checksum: c7bb84265d637e3cb1ea3b7d04a59d34 (MD5) Made available in DSpace on 2021-06-26T13:20:35Z (GMT). No. of bitstreams: 1 TM_Rita_Marques.pdf: 1991170 bytes, checksum: c7bb84265d637e3cb1ea3b7d04a59d34 (MD5) Previous issue date: 2021

Submitted by Paula Guerreiro (passarinho@reitoria.ulisboa.pt) on 2021-09-14T11:02:25Z No. of bitstreams: 1 ULSD736524_td_Maria_Dores.pdf: 44963943 bytes, checksum: c73c0a56dadf905a3ffac3692c14e3d3 (MD5) Made available in DSpace on 2021-09-30T17:23:32Z (GMT). No. of bitstreams: 1 ULSD736524_td_Maria_Dores.pdf: 44963943 bytes, checksum: c73c0a56dadf905a3ffac3692c14e3d3 (MD5) Previous issue date: 2020-12

Tese de mestrado em Biologia Humana e Ambiente, Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2020 Submitted by Cristina Manessiez (camanessiez@fc.ul.pt) on 2021-05-11T14:37:40Z No. of bitstreams: 1 ulfc126238_tm_Stephanie_Ramos.pdf: 2058126 bytes, checksum: 273bf745da64526ac95b76397c6e0645 (MD5) Made available in DSpace on 2021-05-11T14:37:54Z (GMT). No. of bitstreams: 1 ulfc126238_tm_Stephanie_Ramos.pdf: 2058126 bytes, checksum: 273bf745da64526ac95b76397c6e0645 (MD5) Previous issue date: 2020

Tese de mestrado, Biologia Humana e Ambiente, Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2020 Submitted by Teresa Boa (tdboa@fc.ul.pt) on 2020-12-14T17:46:55Z No. of bitstreams: 1 ulfc126011_tm_Mariana_Oliveira.pdf: 5903291 bytes, checksum: 9e0b3b7c38b8c7a4d1e3847a752ab2fe (MD5) Made available in DSpace on 2020-12-14T17:47:09Z (GMT). No. of bitstreams: 1 ulfc126011_tm_Mariana_Oliveira.pdf: 5903291 bytes, checksum: 9e0b3b7c38b8c7a4d1e3847a752ab2fe (MD5) Previous issue date: 2020

Tese de mestrado, Biologia Humana e Ambiente, Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2020 Submitted by Teresa Boa (tdboa@fc.ul.pt) on 2021-06-22T12:22:00Z No. of bitstreams: 1 TM_Dina_Durão.pdf: 2653341 bytes, checksum: 1d883d43b766d756db2a0d33ab333d8f (MD5) Made available in DSpace on 2021-06-22T12:22:10Z (GMT). No. of bitstreams: 1 TM_Dina_Durão.pdf: 2653341 bytes, checksum: 1d883d43b766d756db2a0d33ab333d8f (MD5) Previous issue date: 2020

This thesis was conducted at the Molecular and RNA Cancer Unit (MaRCU), Center for Medical Education, Graduate School of Medicine, Kyoto University, Kyoto, Japan, in partnership with the mRNA Metabolism Group, Department of Human Genetics, Instituto Nacional de Saúde Doutor Ricardo Jorge (INSA), IP, Lisbon, Portugal, under the supervision of Doctor Marco Marques Candeias together with the internal designated supervisor in the scope of the Master in Human Biology and Environment, by Faculdade de Ciências da Universidade de Lisboa, Doctor Deodália Dias. The majority of mRNA translation is ensured by the canonical cap-dependent translation, which represents the cellular process with the biggest expense of energy and resources. Thus, in response to various adverse conditions such as hypoxia, viral infection, nutrients and growth factors starvation, endoplasmic-reticulum stress (ER-stress), among others, the canonical cap-dependent translation mechanism is supressed. However, in these adverse situations the expression of certain proteins that mediate adaptation and damage repair is of extreme importance. Under these limiting conditions some key mRNAs ensure the translation of these pivotal proteins through alternative non-canonical translation initiation mechanisms. One well-known example of a regulatory protein that is expressed even in very unfavourable conditions is the tumour suppressor p53. The TP53 gene, containing three promoters and together with alternative internal initiation and alternative splicing, expresses at least fifteen reported isoforms. The p53 isoforms have been shown to have unique transcription targets, often linked to non-redundant functions, and demonstrate responsiveness to different specific stress signals. These findings help to better understand how p53 integrates such a variety of pathways including DNA repair, cell cycle regulation, apoptosis, metabolism and even aging. Having such a wide range of functions that deeply impact the cellular survival, p53 expression is regulated through a variety of mechanisms that include the Hdm2 (murine double minute 2 human homolog) mediated poly-ubiquitination and 26S-mediated proteasomal degradation. However, despite its tight regulation, p53 proteins are frequently reported to grant cells with carcinogenic-like features, causing particularly aggressive and treatment-resistant tumours. Indeed, TP53 gene is the most commonly mutated gene in cancer, representing a strategic target for transformed cells, as the aberrant expression of the p53 protein isoforms offers the means to overcome the extremely challenging microenvironments, characteristic in cancer onset and tumour development. Our team's research has been greatly focused on the Δ160p53 isoform, specifically the study of the recently identified Δ160p53 IRES, as this isoform promotes, to a greater extent than other p53 isoforms, nefarious carcinogenic-like functions, namely invasion and cellular proliferation. One approach we propose to better understand the Δ160p53 IRES-mediated translation initiation mechanism is the identification of small drug compounds that inhibit Δ160p53 IRES. For this purpose, we started by establishing the optimal conditions, cell line and the system for this drug screening. Simultaneously, we cloned neomycin resistant plasmid constructs containing a bicistronic system with two reporter genes (Renilla Luciferase and Firefly Luciferase), using already available Δ160p53 IRES containing sequences, in order to select stable eukaryotic cells for the drug screening assays. Even though at the time of this thesis' experiments we did not have the chance to test the cloned plasmids and evaluate their performance in the drug screening assays, we present the best cloning strategy out of the two approaches used. In parallel, our laboratory has invested in the identification of other cancer-related IRES-translated mRNAs specifically regulated by Hdm2, as it is known that Hdm2 can act as an ITAF, positively regulating commonly deregulated proteins in cancer. With this in mind, we modified the Hdm2 sequence using site directed mutagenesis to create two missense mutations in the 395th codon. The 395th codon has a Serine that is phosphorylated upon DNA damage, triggering the Hdm2's activity as an ITAF. Thus, we altered the Serine to an Alanine, which cannot be phosphorylated, therefore it will not be able to bind to mRNAs. The second mutagenesis aimed the modification of the Serine to Aspartic acid. The aspartic acid mimics the phosphorylated Serine, thereby permanently inducing the Hdm2's activity as an ITAF. These sequences were sent to the partner laboratory of the Department of Human Genetics in Instituto Nacional de Saúde Doutor Ricardo Jorge (INSA), in Lisbon, Portugal, to perform co-immunoprecipitation (co-IP) assays of Hdm2-bound mRNAs.For a long time, researchers focused on the p53 regulation at the protein level however, attentions started to turn to the p53 mRNA as more evidences of mRNA's regulatory functions, beyond the well studied role in translation, appeared. Indeed, it was demonstrated that p53 mRNA has a protective function over p53 protein by blocking its degradation under cellular stress, resembling a regulatory "noncoding"-like function. Furthermore, recent findings have correlated the mammalian mRNA post-transcriptional modification on adenine bases by a methyl group in the nitrogen-6 position (m6A) with cap-independent translation initiation. We were intrigued by reports that pointed to the existence of m6A modifications located in the vicinities of IRESs, suggesting a potential correlation of this alteration with IRES-mediated translation initiation. Therefore, we proposed to determine if the adenine of the 213th codon, a commonly mutated codon of the Δ160p53 isoform, bears the m6A modification. To identify the methylation on Δ160p53 mRNA at one-nucleotide resolution we optimized hybrid-DNA probe binding and T3 ligase experiments, using total RNA extracted from HeLa (Human cervical cancer-derived cell line) and A549 (Human lung carcinoma-derived cell line). Two sets of probes were custom made for the Δ160p53 segment of interest containing the 213th codon, and also for both MALAT1 positive control and Δ160p53 sequence containing AUG160, used as negative control. The obtained products were amplified through PCR, and separated by agarose gel separation. Even though it was not possible to determine if the adenine of the 213th codon is methylated, we were able to demonstrate the designed probes are binding to the complementary sequences, and also that the T3 ligase is successfully joining the left and right probes. With the fulfilment of the objectives defined for the present thesis, we seek to discern which are the best approaches for the drug screening, targeted to the inhibition of the Δ160p53 IRES, as well as offer essential tools for the Hdm2-coIP assays and drug screening. Additionally, by undertaking a new method in our laboratory to determine the existence of the still poorly understood m6A mRNA modification in Δ160p53, we ambition to lay the foundations for further studies in regard to this modification's function in non-canonical mRNA translation. Ultimately, with the present thesis we hope to assist the valuable investigation regarding the mechanisms of IRES-mediated translation, and to provide new insights that support the development of new therapeutic strategies. A maioria da tradução do ácido ribonucleico mensageiro (mRNA, do inglês ribonucleic acid) é assegurada pela tradução canónica dependente da cap (guanina metilada adicionada à extremidade 5' do pré-mRNA), processo que constitui o maior gasto de energia e recursos na célula. Assim, em resposta a várias condições adversas, como hipóxia, infecção viral, privação de nutrientes e fatores de crescimento, stresse do retículo endoplasmático, entre outras, o mecanismo de tradução dependente da cap é suprimido. No entanto, nestas situações adversas, é de extrema importância a expressão de certas proteínas que regulam a adaptação e a reparação de danos na célula. Sob estas condições limitantes, alguns mRNAs garantem a tradução destas proteínas essenciais através de mecanismos alternativos de iniciação da tradução não canónica. O supressor tumoral p53, codificado pelo gene TP53, é uma proteína reguladora fulcral em condições celulares muito desfavoráveis. Através de processos de tradução canónica, iniciação interna da tradução e de splicing alternativo (excisão de diferentes exões do transcrito), o gene TP53 promove a expressão de pelo menos quinze isoformas da proteína p53. As isoformas da p53 têm alvos únicos de transcrição, geralmente vinculados a funções não redundantes, e demonstram capacidade de resposta a diferentes sinais de stresse. As diferentes características das isoformas da p53 permitem a sua participação em várias vias de regulação celular, nomeadamente a reparação do ácido desoxirribonucleico (DNA, do inglês deoxyribonucleic acid), regulação do ciclo celular, apoptose, metabolismo e envelhecimento. A expressão da p53 é regulada por vários mecanismos de degradação que incluem a poliubiquitinação mediada por Hdm2 (do inglês murine double minute 2 human homolog) e consequente degradação proteossomal. Apesar da rigorosa regulação da p53 é frequente a associação desta proteína com fenómenos carcinogénicos que levam à formação de tumores particularmente agressivos e resistentes a tratamentos. O gene TP53 constitui um alvo estratégico para as células transformadas, uma vez que a expressão aberrante das isoformas da p53 lhes permite superar as adversidades impostas pelo microambiente desfavorável característico no desenvolvimento tumoral. A investigação da nossa equipa está grandemente direcionada para o estudo da isoforma Δ160p53, especificamente o estudo do IRES (do inglês, internal ribosome entry site) da Δ160p53 recentemente identificado, uma vez que as células que sobre-expressam esta isoforma registam elevada proliferação celular e capacidade de invasão particularmente agressiva, em comparação com as características induzidas por outras isoformas. De acordo com a linha de investigação da nossa equipa, a abordagem que propomos para o estudo do mecanismo de iniciação da tradução mediado por IRES Δ160p53 prende-se na identificação de pequenos compostos farmacológicos que inibem o IRES Δ160p53. Com esse objectivo, começámos por estabelecer as condições ideais, a linha celular e o sistema mais indicado para a triagem desses compostos. Simultaneamente, clonámos plasmídeos resistentes à neomicina contendo um sistema bicistrónico com dois genes repórteres RLuc e FLuc (do inglês, Renilla Luciferase e Firefly Luciferase, respetivamente), usando sequências contendo Δ160p53 IRES já disponíveis no laboratório, a fim de obter células eucarióticas estáveis para os ensaios de seleção de compostos farmacológicos. No período em que decorreram estes procedimentos não foi possível testar os plasmídeos clonados e avaliar o seu desempenho em ensaios de seleção dos compostos farmacológicos, no entanto apresentamos a melhor estratégia de clonagem entre as duas abordagens aplicadas. Paralelamente, o nosso laboratório investe na identificação de outros mRNAs de proteínas que frequentemente se encontram alteradas no cancro, para além do mRNA da p53, e que são traduzidos através de IRES e especificamente regulados pelo Hdm2, uma vez que este pode atuar como ITAF (do inglês, IRES transacting factor), regulando positivamente estas proteínas. Deste modo, modificámos a sequência de Hdm2 disponível no laboratório através de mutagénese direcionada ao codão 395. O codão 395 possui uma Serina que é fosforilada após danos infligidos no DNA, o que por sua vez, desencadeia a atividade do Hdm2 como ITAF. Assim, alterámos a serina para uma alanina, que não pode ser fosforilada e portanto, não será capaz de se ligar aos mRNAs. A segunda mutagénese modificou a Serina para Ácido Aspártico, dado que este mimetiza a Serina fosforilada, induzindo permanentemente a atividade do Hdm2 como ITAF. Estas sequências foram enviadas para o laboratório do Departamento de Genética Humana do Instituto Nacional de Saúde Doutor Ricardo Jorge (INSA), em Lisboa, Portugal, para realizar co-imunoprecipitação (co-IP) dos mRNAs ligados a Hdm2. Inicialmente, os investigadores focaram-se na regulação da p53 ao nível proteico, no entanto com o surgimento de evidências relativas às funções reguladoras dos mRNAs, para além do seu conhecido papel na tradução, uma nova atenção direcionou-se para o mRNA da p53. De facto, foi demonstrado que o mRNA da p53 tem uma função protetora sobre a proteína p53, bloqueando a sua degradação sob stresse celular. Adicionalmente, descobertas recentes correlacionaram a modificação pós-transcripcional m6A (modificação do mRNA de mamíferos em bases de adenina por adição de um grupo metilo na posição 6 do nitrogénio) com o início de tradução independente da cap. Dado o recente surgimento de indícios que apontam para existência de modificações m6A localizadas nas proximidades de IRES, e a sua potencial relação com o início da tradução mediada por IRES, propusemos a determinação desta modificação na adenina do codão 213, um codão comummente mutado na isoforma Δ160p53. Para este fim, optimizámos a ligação de sondas de DNA híbrido (sondas de DNA modificadas com ribonucleótidos) ao RNA total extraído de HeLa (linha celular derivada de cancro de colo do útero humano) e A549 (linha celular derivada de carcinoma de pulmão humano). Foram desenhados dois conjuntos de sondas para cada uma de três sequências: para a sequência de interesse Δ160p53 contendo o codão 213, para o controlo positivo MALAT1 e para o controlo negativo composto pela sequência Δ160p53 contendo o codão de iniciação AUG160. Os produtos obtidos foram amplificados por PCR e separados por separação em gel de agarose, em que a observação de bandas indica a ausência de metilação da adenina nas sequências analisadas. Apesar de não ter sido possível determinar se a adenina do codão 213 se encontra metilada, demonstrámos que as sondas projectadas se ligam devidamente às sequencias seleccionadas e que ocorreu ligação entre as sondas por via da T3 ligase utilizada. Com o cumprimento dos objetivos definidos para a presente dissertação, procuramos discernir quais são as melhores abordagens para a triagem dos compostos farmacológicos direcionados à inibição do IRES Δ160p53, para além de produzir ferramentas essenciais para os ensaios de Hdm2-coIP e para a triagem dos fármacos. Por outro lado, com a adoção de um novo método para a determinação da modificação m6A em mRNA da isoforma Δ160p53, ambicionamos estabelecer as bases para os estudos da função desta modificação na tradução não-canónica do mRNA. Por fim, com a presente dissertação, esperamos contribuir para a valiosa investigação sobre os mecanismos de tradução mediada pelo IRES e fornecer novos dados que auxiliem o desenvolvimento de novas estratégias terapêuticas. This project was co-funded by PTDC/MED-ONC/32048/2017 and PTDC/BIMONC/4890/2014 from Fundação para a Ciência e a Tecnologia (FCT), by Grants-in-Aid 16K21111 and 18K07229 from the Ministry of Education, Culture, Sports, Science and Technology (MEXT) of Japan, by Takeda Foundation and Astellas Foundation. N/A

A Global Health Problem: Smoking kills more than 7 million people/year worldwide; More than 890,000 are deaths resulting from exposure to Second Hand Smoke (SHS); In adults, SHS is associated to cardiovascular and respiratory diseases, including coronary heart disease and lung cancer. N/A

Tese de mestrado, Biologia Humana e Ambiente, Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2019 Submitted by Teresa Boa (tdboa@fc.ul.pt) on 2019-07-15T13:09:46Z No. of bitstreams: 1 ulfc125445_tm_Raquel Carrilho.pdf: 7812025 bytes, checksum: e555162395cc2e27df8fc46635579c78 (MD5) Made available in DSpace on 2019-07-15T13:10:00Z (GMT). No. of bitstreams: 1 ulfc125445_tm_Raquel Carrilho.pdf: 7812025 bytes, checksum: e555162395cc2e27df8fc46635579c78 (MD5) Previous issue date: 2019

Tese de mestrado, Biologia Humana e Ambiente, Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2019 Submitted by Teresa Boa (tdboa@fc.ul.pt) on 2020-02-17T14:36:20Z No. of bitstreams: 1 ulfc125763_tm_Cláudia_Nunes.pdf: 1974382 bytes, checksum: e7101d6b58e9e1d68124f7c179269541 (MD5) Made available in DSpace on 2020-02-17T14:36:30Z (GMT). No. of bitstreams: 1 ulfc125763_tm_Cláudia_Nunes.pdf: 1974382 bytes, checksum: e7101d6b58e9e1d68124f7c179269541 (MD5) Previous issue date: 2019

Dissertação de mestrado em Biologia Humana e Ambiente, apresentada à Faculdade de Ciências da Universidade de Lisboa, 2019. Dissertação orientada por: Doutora Deborah Penque, PhD, Instituto Nacional de Saúde Doutorr Ricardo Jorge; Professora Doutora Deodália Dias, PhD, Universidade de Lisboa. O estudo em larga escala de proteínas, a proteómica, está a mudar amplamente a nossa compreensão das funções dos genes na era pós-genómica. Depois da revolução na genómica pelos métodos de sequenciação de ADN (ácido desoxirribonucleico), a proteómica tem vindo a aumentar o nosso conhecimento sobre a variabilidade, localização, função e vias metabólicas das proteínas na célula, tecido ou organismo. O desenvolvimento de biomarcadores, como uma componente relevante na tomada de decisões, tanto nos processos clínicos quanto no desenvolvimento de novos medicamentos, é uma área emergente onde a proteómica tem vindo a ganhar relevo. As tecnologias proteómicas permitem uma análise comparativa, qualitativa e quantitativa de milhares de proteínas de células/tecidos de doentes versus indivíduos controles, assim como, de doentes antes e depois de um determinado tratamento. As proteínas identificadas diferencialmente abundantes e/ou modificadas pós-traducionalmente na condição de doença ou em resposta a terapia, são possíveis candidatas a biomacardores destas condições. No entanto, a interpretação da enorme quantidade de dados proteómicos, gerados principalmente por experiências baseadas em espectrometria de massa (MS), requer suporte computacional para processamento e análise dos dados de forma efetiva e robusta. A Proteómica computacional estuda os métodos computacionais, algoritmos, bases de dados e metodologias utilizadas para processar, gerir, analisar e interpretar os dados produzidos em experiências proteómicas na identificação de potenciais biomarcadores. O Laboratório de Proteómica do INSA (Instituto Nacional de Saúde Doutor Ricardo Jorge), através da busca de biomarcadores proteómicos para compreensão de doenças tais como a Anemia das Células Falciformes (ACF), tem produzido grandes dados de MS que necessitam de análise computacional, sendo este o principal propósito deste projeto (ver abaixo objetivo deste estudo). A ACF, também denominada por drepanocitose ou anemia drepanocítica, é um distúrbio monogénico autossómico recessivo, clinicamente heterogéneo, caracterizado por episódios recorrentes de hemólise grave, vaso-oclusão e infecção. Vários modificadores genéticos e ambientais foram sugeridos para modular o início e o curso da ACF. Especificamente, os componentes vasculares da patologia (por exemplo, acidente vascular cerebral) foram submetidos a pesquisas intensivas e o uso de metodologias proteómicas promete oferecer novas percepções moleculares sobre a fisiopatologia da ACF. A mudança do estado estacionário para a crise ainda é em grande parte imprevisível. A fim de descobrir biomarcadores putativos para essa exacerbação, o laboratório do INSA analisou por proteómica de shotgun MS, amostras de plasma e glóbulos vermelhos (GV), de um grupo de pacientes com ACF em estado estacionário e em crise (episódio de vaso-oclusão). Objetivo do estudo: Este estudo teve como objetivo analisar os dados de shotgun MS gerados para a ACF através de plataformas de proteómica computacional de código aberto, nomeadamente o PatternLab e o MaxQuant , no sentido de identificar proteínas como possíveis candidatos a biomarcadores da ACF e em particular da ACF associada a vaso-oclusão. O PatternLab for Proteomics é um ambiente computacional integrado para análise de proteómica shotgun, formatando bancos de dados de sequências, que realizam a correspondência de espectro peptídico, filtrando estatisticamente e organizando dados por proteómica diferencial, exibindo resultados em formato de gráficos, realizando estudos orientados por similaridade com dados de sequenciação de novo, ajudando à compreensão do significado biológico dos dados à luz da Ontologia Genética (Gene Ontology). O MaxQuant é um conjunto de algoritmos, que inclui a detecção de picos e a pontuação de péptidos, realiza a calibração em massa e pesquisas em bancos de dados para identificação de proteínas, quantifica proteínas identificadas e fornece estatísticas resumidas. Para validar os achados proteómicos, algumas das proteínas identificadas diferencialmente na patologia por essas plataformas computacionais, foram selecionadas para validação (verificação) através de abordagens como Western blot. O Western blot é uma técnica bioquímica imunológica na qual uma mistura de proteínas é separada por gel 1DSDS-PAGE (Sodium Dodecyl Sulfate - PolyAcrylamide Gel Electrophoresis), transferida para uma membrana, posteriormente incubada com anticorpo específico contra a proteína de interesse. A reação, geralmente visualizada por quimioluminescência, pode ser quantificada por densitometria. De todas as 111 proteínas diferencialmente expressas identificadas (74 da fração citoplasmática e 37 da fração membranar) associadas ao evento de crise na ACF, a peroxiredoxina-2, a catalase, a Hsp70 e Hsp 90 foram validadas por Western blot. Destas 4 proteínas, apenas a peroxiredoxina-2 apresentou significância estatística. Das proteínas diferencialmente expressas que hipoteticamente podem estar associadas à ACF, um promissor biomarcador de crise, nomeadamente, a Voltagedependent anion-selective channel protein 1 (VDAC1) foi encontrada diminuída. Os resultados sugerem que episódios de vaso-oclusão em doentes com ACF podem estar associados à diminuição da VDAC1 nos glóbulos vermelhos. Os resultados deste projeto após apresentação e discussão podem contribuir para um melhor entendimento das vias moleculares associadas à ACF, bem como para a identificação de modulações proteicas específicas, como possíveis candidatos a biomarcadores para essas patologias. The Laboratory of Proteomics at INSA (Instituto Nacional de Saúde Doutor Ricardo Jorge) by searching biomarkers for Sickle-cell disease (SCD) has been produced considerable Mass Spectrometry (MS) data, needing computational analysis to process, manage, analyze and interpret the data to reveal relevant biomarkers. SCD is a clinically heterogeneous autosomal recessive monogenic disorder characterized by recurrent episodes of severe haemolysis, vaso-occlusion and infection. Several genetic and environmental modifiers have been suggested to modulate the onset and course of SCD. The vascular components of the pathology have been thus subjected to intensive research and the usage of proteomics methodologies promises to offer novel unbiased molecular insights into the pathophysiology of SCD. The objective of this project is to analyze by different bioinformatics tools the MS raw data that have been generated by INSA’s Lab in order to investigate biological/molecular mechanisms responsible for protein changes that might be related with the development of SCD. The most pertinent proteins identified by these computational approaches associated with those pathologies will be selected for further validation as candidate biomarkers by using western blot methods. From all the identified 111 differentially expressed proteins (74 cytoplasmatic fraction and 37 membrane fraction) associated with SCD crisis event, Peroxiredoxin-2, Catalase, 70-kDa Heat shock protein and Heat shock protein 90 were validated with Western blot. From these 4 proteins only Peroxiredoxin-2 showed statically significant. Of the differentially expressed proteins that hypothetically may be associated with SCD, a promise candidate biomarker of crisis namely the Voltage-dependent anion-selective channel protein 1 (VDAC1) was found decreased. Our results suggest that vaso-occlusion episodes in SCD patients may be associated with decreased VDAC1 in their RBCs. This study indicated that SCD patients at crisis-state are under oxidative stress and the proteins such as PRDX2 and VDAC1 are promising candidates biomarkers for SCD crisis-state. In summary, the main objective of this project is to contribute to a better understanding of the molecular mechanisms associated with these pathologies, as well as to discover new diagnostic, prognostic or monitoring biomarkers for these diseases, leading to the development of new methods that would increase the quality of life of these patients. N/A

Tese de mestrado em Biologia Humana e Ambiente, Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2019 Submitted by Cristina Manessiez (camanessiez@fc.ul.pt) on 2019-07-10T15:04:50Z No. of bitstreams: 1 ulfc125473_tm_Agueda_Semedo.pdf: 978150 bytes, checksum: f6d665f5926bb2c5ffeb952c1d03314b (MD5) Made available in DSpace on 2019-07-10T15:05:02Z (GMT). No. of bitstreams: 1 ulfc125473_tm_Agueda_Semedo.pdf: 978150 bytes, checksum: f6d665f5926bb2c5ffeb952c1d03314b (MD5) Previous issue date: 2019

Tese de mestrado, Biologia Humana e Ambiente, Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2019 Submitted by Cristina Manessiez (camanessiez@fc.ul.pt) on 2020-01-21T18:31:33Z No. of bitstreams: 1 ulfc125655_tm_Andre_Costa.pdf: 1706711 bytes, checksum: 9e831c61ec73da0ef2637ecf306203b8 (MD5) Made available in DSpace on 2020-01-21T18:31:46Z (GMT). No. of bitstreams: 1 ulfc125655_tm_Andre_Costa.pdf: 1706711 bytes, checksum: 9e831c61ec73da0ef2637ecf306203b8 (MD5) Previous issue date: 2019

Tese de mestrado, Biologia humana e Ambiente, Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2019 Submitted by Teresa Boa (tdboa@fc.ul.pt) on 2019-05-17T14:43:06Z No. of bitstreams: 1 ulfc124919_tm_Andreia_Figueiredo.pdf: 1513518 bytes, checksum: 06d8909883628d40f855ed9c7166c9b9 (MD5) Made available in DSpace on 2019-05-17T14:43:17Z (GMT). No. of bitstreams: 1 ulfc124919_tm_Andreia_Figueiredo.pdf: 1513518 bytes, checksum: 06d8909883628d40f855ed9c7166c9b9 (MD5) Previous issue date: 2019

Tese de mestrado, Biologia Humana e Ambiente, Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2019 Submitted by Cristina Manessiez (camanessiez@fc.ul.pt) on 2019-12-17T19:16:04Z No. of bitstreams: 1 ulfc125192_tm_Sara_Brito.pdf: 1048516 bytes, checksum: fd09b53cc2b9a3fc3d054603146a682f (MD5) Made available in DSpace on 2019-12-17T19:16:18Z (GMT). No. of bitstreams: 1 ulfc125192_tm_Sara_Brito.pdf: 1048516 bytes, checksum: fd09b53cc2b9a3fc3d054603146a682f (MD5) Previous issue date: 2019

Tese de mestrado, Biologia Humana e Ambiente, Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2019 Submitted by Cristina Manessiez (camanessiez@fc.ul.pt) on 2019-09-16T17:19:10Z No. of bitstreams: 1 ulfc125032_tm_Carolina_Nunes.pdf: 2292691 bytes, checksum: e3f65cc572c8067c55e30da02b84c3fb (MD5) Made available in DSpace on 2019-09-16T17:19:36Z (GMT). No. of bitstreams: 1 ulfc125032_tm_Carolina_Nunes.pdf: 2292691 bytes, checksum: e3f65cc572c8067c55e30da02b84c3fb (MD5) Previous issue date: 2019

Dissertação de mestrado em Biologia Humana e Ambiente, apresentada à Faculdade de Ciências da Universidade de Lisboa, 2019 O trabalho apresentado nesta Dissertação de Mestrado foi realizado no Instituto Nacional de Saúde Doutor Ricardo Jorge sob a orientação direta da Doutora Elisabete Valério e contou com a coorientação do João Brandão. Os fungos filamentosos e as leveduras são omnipresentes na natureza, incluindo nas zonas balneares. A areia frequentada por pessoas e por animais tem uma população crescente de fungos específicos de humanos e específicos de animais, em comparação com a areia não frequentada por pessoas e animais. Contudo, certas espécies de fungos podem causar infeções ou alergias em humanos. Estudos anteriores mostraram que existem microrganismos patogénicos ou patogénicos oportunistas que sobrevivem e crescem na areia. O conjunto de doenças resulta da inalação e da ingestão de esporos fúngicos e de células vegetativas, ou do contato direto com células fúngicas. Uma vez que as zonas balneares são locais frequentados por um elevado número de pessoas, especialmente no verão, a qualidade microbiológica das areias e das águas balneares é particularmente importante. Assim sendo, o objetivo deste estudo é a recolha de dados sobre as espécies de fungos existentes nas três zonas balneares em estudo – Carcavelos, Alburrica e Praia Verde. A identificação dos isolados foi realizada através da observação de caracteres morfológicos e através de ferramentas moleculares. Para isto, foram analisadas 18 amostras de areia e 18 amostras de água. No total, nas amostras de areia foram identificados 1 538 isolados, ao passo que nas amostras de água foram identificados 180 isolados. Os isolados fúngicos detetados com mais frequência foram Cladosporium sp. (na Praia Verde e em Alburrica) e Acremonium kiliense (em Carcavelos). Foram também identificadas algumas espécies responsáveis por causar alergias e infeções, tais como Exophiala dermatitidis, Alternaria alternata, Trematosphaeria grisea e Aspergillus nidulans. No entanto, não foi possível identificar 19 isolados presentes nas amostras. A realização desta dissertação permitiu identificar os isolados fúngicos presentes nos locais em estudo, assim como a frequência de cada uma das espécies presente nas amostras. Permitiu também verificar a presença de determinadas espécies que podem provocar doenças graves, o que representa um risco para a saúde dos utilizadores das praias. Filamentous fungi and yeast are ubiquitous in nature, including bathing areas. Sand that is visited both by people and animals has a growing population of human and animal-specific fungi, in comparison to sand that is not. However, certain fungal species can cause infections or allergies in humans. Previous studies have shown that there are opportunistic or pathogenic microorganisms that can survive and grow in sand. The diseases can result from inhalation and ingestion of fungal spores and vegetative cells, or by direct contact with fungal cells. Since bathing areas are frequented by large numbers of people, especially during the summer months, the microbiological quality of sand and bathing water is particularly important. Thus, the aim of this study is to collect data on the fungal species present in the three bathing areas in this study - Carcavelos, Alburrica and Praia Verde. The identification of the isolates was performed by observing morphological characteristics and by using molecular tools. For this purpose, 18 sand samples and 18 water samples were analysed. The total number of colonies identified in sand samples was 1 538; the total number of colonies identified in water samples was 180. The most frequently isolated fungi were Cladosporium sp. (at Praia Verde and Alburrica) and Acremonium kiliense (at Carcavelos). Some species responsible for causing allergies and infections, such as Exophiala dermatitidis, Alternaria alternata, Trematosphaeria grisea and Aspergillus nidulans have also been identified. However, it was not possible to identify 19 isolates found on the samples. For this dissertation, it was possible to identify the fungal isolates present at the chosen locations. It was also possible to determine the frequency of each species present in the samples. Lastly, this work has made it possible to confirm the presence of certain species that can cause serious illness, which potentially poses a health risk to all beach users. N/A

Tese de mestrado, Biologia Humana e Ambiente, Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2019 Submitted by Cristina Manessiez (camanessiez@fc.ul.pt) on 2019-10-15T16:32:50Z No. of bitstreams: 1 ulfc125353_tm_Beatriz_Gomes.pdf: 13763651 bytes, checksum: 84d08da00b52eb4a6b6e55233d277123 (MD5) Made available in DSpace on 2019-10-15T16:33:11Z (GMT). No. of bitstreams: 1 ulfc125353_tm_Beatriz_Gomes.pdf: 13763651 bytes, checksum: 84d08da00b52eb4a6b6e55233d277123 (MD5) Previous issue date: 2019

Tese de mestrado, Biologia Humana e Ambiente, Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2019 Submitted by Cristina Manessiez (camanessiez@fc.ul.pt) on 2019-11-19T17:36:15Z No. of bitstreams: 1 ulfc125122_tm_Mafalda_Padua.pdf: 1957269 bytes, checksum: b414f8647a3b4b8ec77a844bef185794 (MD5) Made available in DSpace on 2019-11-19T17:36:29Z (GMT). No. of bitstreams: 1 ulfc125122_tm_Mafalda_Padua.pdf: 1957269 bytes, checksum: b414f8647a3b4b8ec77a844bef185794 (MD5) Previous issue date: 2019

Dissertação de mestrado em Biologia Humana e Ambiente, apresentada à Faculdade de Ciências da Universidade de Lisboa, 2018 A investigação dos determinantes genéticos da fertilidade masculina nos últimos anos tem-se concentrado principalmente na análise do genoma humano por microarray e, mais recentemente, na sequenciação do exoma por sequenciação de nova geração (NGS). Apesar dos esforços realizados, não têm sido detetadas alterações genómicas específicas nem alterações pontuais patogénicas, com com elevada frequência , associadas à patologia em causa. Recentemente foi identificado o gene TEX11 localizado em Xq13.1, no âmbito do qual um número reduzido de estudos demonstra a sua importância para a fecundidade/gametogénese masculina. Esses estudos moleculares, realizados em amostras de homens inférteis, selecionados de acordo com parâmetros espermáticos, identificaram alterações com frequências que variam entre de 1 a 15%. Complementarmente, foi também demonstrado que certas alterações estão associadas a paragem da meiose no estágio de paquíteno, não tendo sido observados espermatídios redondos ou espermatozóides maduros nos túbulos seminíferos. A proteína TEX11 intervém na formação do complexo sinaptonémico e no estabelecimento dos pontos de quiasma no crossing-over cromossómico durante a meiose. Dado o conhecimento atual e a importância/função do gene em questão e porque não há estudos na população portuguesa sobre este gene, este projeto visou analisar a nível molecular o gene TEX11 em homens azoospérmicos e avaliar as suas consequências para a fertilidade masculina. Para este fim, a estratégia de análise molecular compreendeu: i) otimização da PCR simples para os 29 exões do gene em questão; ii) otimização de PCR múltiplas para os diversos exões do TEX11 visando a pesquisa de deleções; iii) pesquisa de alterações moleculares no gene em causa por sequenciação de nova geração (usando os produtos das PCR múltiplas), visando a identificação de alterações moleculares que possam afetar a função do gene/proteína; iv) avaliação das consequências funcionais de alterações detetadas através de análise in silico; v) estabelecimento de correlações genétipo/fenótipo; vi) pesquisa das alterações potencialmente patogénicas em homens férteis, detetadas no âmbito ponto iii); vii) confirmação destas alterações através da PCR simples e posterior sequenciação de Sanger. Através desta abordagem foi possível analisar 85 homens azoospérmicos, tendo sido também incluídas três amostras controlo, dois homens normozoospérmicos e uma mulher. Detetaram-se 27 alterações em sequências flanqueadoras dos exões ou nos próprios exões, as quais, após análise in silico e avaliação da sua frequência em bases de dados e publicações científicas (HGMD; 1000 Genomes), culminaram com a seleção de 5 alterações presumivelmente patogénicas/provavelmente patogénicas devido a poderem afetar o processamento (splicing) do respetivo mRNA. Embora três destas alterações possam perturbar o splicing, dada a sua frequência na população é possível que não estejam associadas a consequências funcionais graves correspondendo a polimorfismos. Obteve-se assim, uma taxa de deteção de alterações com potencial patogénico de 2,5% (2/79), sendo ambas alterações sinónimas: c.924C>T (p.Gly314=) e c.450C>T (p.Ala150=), que ocorrem com baixa frequência (T (p.gly314=) and c.450C>T (p.Ala150=), occurring with low frequency (

Dissertação de mestrado em Biologia Humana e Ambiente, apresentada à Faculdade de Ciências da Universidade de Lisboa, 2018 Dissertação de mestrado orientada por Doutora Paula Faustino (Departamento de Genética Humana do INSA) A hipertensão é uma doença multicausal, multifatorial e poligénica, caracterizada pela presença de níveis elevados de tensão arterial e encontra-se frequentemente associada a distúrbios metabólicos e hormonais, com presença de hipertrofia cardíaca e elevação do tónus vascular. É também considerada uma síndrome por estar fortemente associada a um agregado de distúrbios metabólicos, tais como a obesidade, aumento da resistência à insulina, diabetes mellitus, e dislipidémias, que podem contribuir de forma significativa para o aumento da incidência da hipertensão e outras doenças cardiovasculares, bem como estarem na base do desenvolvimento das mesmas. Este trabalho teve como objetivo avaliar a suscetibilidade genética para o desenvolvimento de hipertensão na população portuguesa, mais especificamente pretendeu-se testar a associação de variantes nos genes NOS3, HBA e G6PD com a hipertensão (fenótipo distante) e com potenciais fatores de risco (fenótipos intermédios). Para tal foram analisadas amostras de sangue periférico de 377 indivíduos portugueses, com idade compreendida entre os 19 e 98 anos, dos quais 227 eram do sexo feminino e 144 do sexo masculino, sendo 243 hipertensos e 134 normotensos (população controlo).Foram ainda analisadas 22 amostras de uma população africana não hipertensa (Moçambique). Para a pesquisa do número de repetições de 27 bp em tandem (VNTR) no intrão 4 do gene NOS3 foi usada a PCR, para a pesquisa do SNP rs1050829 no gene G6PD foi usado a PCR-RFLP e para a pesquisa da deleção alfa-talassémica de -3,7kb no agrupamento génico da alfa-globina foi usada uma metodologia de Gap-PCR. Para a pesquisa de variantes no exão 2 dos genes HBA1 e HBA2 foi usada a PCR seguida de sequenciação de Sanger. Os cálculos estatísticos foram realizados no programa estatístico SPSS 25.0, sendo o nível de significância estatístico estabelecido para p-value