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Programa de Doctorado en Biotecnología, Ingeniería y Tecnología Química, Línea de Investigación: Biología del Desarrollo, Clave Programa: DBI, Código Línea: 9, La diferenciación de tejidos y órganos requiere que las células intercambien información en el espacio y el tiempo. La información espacial se transmite a través de los morfógenos: moléculas que difunden a lo largo de las células receptoras en forma de gradiente espacial. Las células traducen el gradiente en patrones de expresión de genes espacio/dependientes y comportamiento celular. Pero ¿Pueden los gradientes de concentración conferir, también, información temporal? En esta tesis estudiamos el papel del morfógeno Hedgehog (Hh) en el desarrollo de la retina ocelar de Drosophila. Demostramos, por primera vez, que una fuente estática de morfógeno confiere información espacio/temporal y desencadena un proceso dinámico de diferenciación. Ésta ocurre en forma de ola de FRs, reclutados con velocidad constante como respuesta a un gradiente no-lineal de Hh. La señalización de Hh promueve la expresión de su principal receptor, patched (Ptc), que es reprimido a nivel transcripcional y eliminado de la membrana celular de los FRs a medida que éstos se diferencian. Es la dinámica de expresión/represión de Ptc lo que confiere a las células la propiedad de transformar la señal no-lineal en una respuesta lineal organizada, donde el gradiente de Hh marca el ritmo de diferenciación. Este hecho fue confirmado al incluir la represión de Ptc en un modelo matemático que representa la señalización de Hh en los ocelos. Además de los FRs encontramos otro fenotipo no neuronal originado por la coordinación de la vía de Hh con la de EGFR que señaliza a través de vein (Vn) y activa pointed (Pnt) en la región competente. Finalizada la diferenciación, los FRs conectan con el cerebro central donde se localiza el árbol neural ocelar, el cual hemos descrito genéticamente demostrando que es mucho más diverso y complejo al estudiado en otros insectos., Universidad Pablo de Olavide de Sevilla. Escuela de Doctorado

Tesis doctoral inédita leída en la Universidad Autónoma de Madrid, Facultad de Ciencias, Departamento de Física de la Materia Condensada. Fecha de lectura: 15-04-2021, Esta tesis tiene embargado el acceso al texto completo hasta el 15-04-2022, Embryonic development begins with a cell formed by the union of two sex cells, and ends with a multicellular organism with specialized and diverse functions and shapes. Organogenesis is the integration of spatial and temporal programs with the purpose to generate the mature version of the organ. Concretely, some tissues as the Neural Retina, the Pigmentary Epithelium of the Retina, the Spinal Cord or the Neocortex comes from the anterior region of the neural tube, a structure whose origin is the anterior axis of the embryonic layer of the ectoderm (neuroectoderm). For an important part of all these tissues, the molecular processes that underlie cellular decisions have been extensively characterized. Basically, three activities must happen in the tissue development: the growing in size (proliferation), the specialization in one or more specific functions (differentiate) and the coordination of cell movements to acquire a specific final shape (morphogenesis). Progenitor cells are those cells that have the ability to divide and increase the number of cells, while differentiated cells are those that have acquired a specific function and they are not able to divide into new cells. The action of the whole set of progenitor cells is the responsible to regulate the number of new differentiated and progenitor cells (proliferation), while the sets of differentiated cells is the responsible of the acquisition of specific function. In fact, the function of the organ and the ability to increase in growth or produce more cells (i.e balance between growth and differentiation) can not only be interpreted as the sum of function of each cell. Therefore, research about the behaviour, regulation and properties for all populations of progenitor cells is key to understanding the balance between proliferation (the system generates new progenitor cells) and differentiation (the system generates new differentiated cells) of the embryo development. The descents of the progenitor cells pool along the development regulates the rate between proliferation and differentiation of the tissue. Therefore, it is not only essential to understand the biology of progenitor and differentiated cells, but it is also essential to understand how the union of many progenitor cells works to form a complex system, such as a tissue or an organ. In this thesis, I will intend to answer two major questions: how the proliferation and differentiation of progenitor cell pools is regulated in space-time? And how can we use quantitative tools to analyze this balance?. To do this, we have used two model organisms (Danio rerio and Mus musculus), a theoretical approach based on Markov’s chains, and we have developed computational analysis tools for biological images

Tesis doctoral inédita leída en la Universidad Autónoma de Madrid, Facultad de Ciencias, Departamento de Biología Molecular. Fecha de lectura: 26-06-2020

[SPA] El sistema CRISPR/Cas9 se ha convertido en la tecnología más útil para obtener alelos nuevos al estar basada en el proceso local de reparación de ADN activado localmente por la rotura del ADN. El complejo CRISPR/Cas9 es guiado por una molécula guía de ARN que le da especificidad de acción sobre una secuencia de ADN concreta. El objetivo del trabajo es desarrollar una colección de alelos en genes de interés relacionados con el desarrollo de la flor y fruto. [ENG] The CRISPR/cas9 system has taken over the methodologies to obtain new alleles as it is based on DNA repair mechanisms activated locally by DNA breakage. The CRISPR/Cas9 complex is driven by a guide RNA conferring specificity of action on a given DNA sequence. The aim of the work is to develop a set of alleles in genes of interest involved in flower and fruit development. The experiments will be conducted in Institute of Plant Biotechnology (IBB), Cartagena within Polytechnic University of Cartagena. This work is supported by BFU2017-88300-C2-1-R.

La extremidad de vertebrados presenta 3 segmentos diferenciados: el estilopodio, con 1 elemento esquelético, el zeugopodio, con 2 elementos esqueléticos, y el autopodio, con una fórmula variable de elementos esqueléticos. El desarrollo de las diferentes partes de la extremidad sucede de forma progresiva, de proximal a distal. De esta forma, en la extremidad anterior, se establecen primero los progenitores del húmero luego los del radio y el cúbito y finalmente los huesos de la mano. En el presente, se desconoce la existencia de programas genéticos específicos de cada uno de los 3 segmentos de la extremidad. Por este motivo hemos generado el transcriptoma temporal de los progenitores de la extremidad de ratón, basándonos en estudios previos de mapeado de la yema de la extremidad. Nuestros datos han permitido dilucidar los perfiles transcripcionales de diversos genes dirigiendo la progresiva especificación de factores reguladores del desarrollo de la extremidad. A su vez, durante nuestro análisis, hemos detectado la activación colineal de los genes Hoxc en el ectodermo de la extremidad en desarrollo. Un hecho inesperado, dado que los genes Hoxc se describieron como dispensables durante el desarrollo de la extremidad. Nuestra investigación muestra el circuito genético con el que los genes Hoxc se activan en el ectodermo, dirigiendo el desarrollo del pelo y la uña. Estos hallazgos son de suma relevancia para comprender el desarrollo de órganos ectodérmicos, como la uña y el pelo.

Programa de Doctorado en Biotecnología, Ingeniería y Tecnología Química, Línea de Investigación: Biología del Desarrollo, Clave Programa: DBI, Código Línea: 9, Los procesos morfogenéticos están dirigidos por fuerzas mecánicas generadas, mayoritariamente, por el citoesqueleto de actomiosina. El citoesqueleto de actomiosina se organiza en diferentes formas dependiendo de señales intracelulares y de las uniones célula-célula y célula-matriz. Sin embargo, estas formas de organización de actomiosina no son estáticas y se ha propuesto que las transiciones de una a otra son claves en la morfogénesis. Actualmente, los mecanismos que regulan la dinámica de estas formas de organización durante la morfogénesis son poco conocidos. En este trabajo, empleamos el epitelio folicular de Drosophila, imágenes in vivo, técnicas de ablación láser y análisis de imagen cuantitativos para estudiar el papel de las integrinas en la regulación de las redes de actomiosina basales y su dinámica, así como la potencial contribución de estas a la forma celular. Encontramos que la eliminación de integrinas de las células foliculares impide la formación y mantenimiento de las fibras de estrés de actomiosina basales. La F-actina disponible, se redistribuye a las llamadas estructuras tipo ¿whip¿ presentes en las uniones tricelulares y en un nuevo tipo de protrusiones que emanan del córtex basal y se proyectan hacia la región medial. Estas protrusiones de F-actina son dinámicas y los cambios en su área se correlacionan con los ciclos de acumulación de miosina y con los pulsos de contracción de la membrana celular. Finalmente, encontramos que las células foliculares que carecen de integrinas muestran un incremento en la tensión de la membrana y una superficie basal reducida. Además, las protrusiones ricas en F-actina son responsables de estos fenotipos, ya que su eliminación en las células foliculares mutantes de integrinas rescatan tanto la tensión como los defectos en la superficie basal. Así, proponemos que el papel de las integrinas como regulador de las fibras de estrés actúa controlando la forma en células epiteliales a través de la reorganización de la F-actina en otros tipos de redes de actomiosina, de forma que interfiere con la expansión correcta de la superficie basal de las células epiteliales., Universidad Pablo de Olavide de Sevilla. Departamento de Biología Molecular e Ingeniería Bioquímica, Postprint

Spa: El objetivo del proyecto fué desarrollar una estrategia de apropiación social del conocimiento en epigenética y neurodesarrollo que fomente una transformación cultural y política hacia el posicionamiento de saberes relacionados con la importancia de la gestación y de los primeros seis años, como el periodo más importante de la vida, lo cual tiene implicaciones directas en la educación, la economía, la paz, la equidad de género y el desarrollo sostenible.

[SPA] El creciente aumento demográfico a nivel mundial, está provocando la necesidad de incrementar la producción agrícola. Científicos y productores buscan obtener variedades genéticas más productivas, resistentes y menos exigentes en cuanto a consumo de recursos se refiere. Los avances tecnológicos de las últimas décadas, ha permitido de una forma rápida y económica, la obtención de multitud de nuevas líneas genéticas. Es necesario, además, validar –fenotipar– esas nuevas líneas y comprobar que su comportamiento fenotípico se ajusta a lo esperado en función del genotipo creado. Sin embargo, el gran cuello de botella de todo este proceso se produce precisamente en el fenotipado de las líneas. El ritmo de generación de nuevas variedades ha estado superando con creces nuestra capacidad para identificar sus fenotipos. En los últimos años, el desarrollo del fenotipado de alto rendimiento –High Throughput Phenotyping o HTP– ha logrado que se acorten esas distancias, gracias en parte al creciente interés mostrado por grandes multinacionales y gobiernos. El fenotipado basado en visión artificial es un método no invasivo en la mayoría de los casos, tiene multitud de configuraciones posibles en función de los objetivos planteados, cada vez es más asequible gracias al abaratamiento de la tecnología y es multiescala, pudiendo ser implementado desde una pequeña cámara de cultivo hasta grandes extensiones agrícolas. Por todo ello, este trabajo plantea el desarrollo de un sistema de fenotipado basado en visión artificial, para ser implementado en una cámara de cultivo, con el objetivo último de estudiar la cinética de crecimiento de diferentes líneas genéticas –silvestres y transgénicas–. Este sistema no solo incluye dispositivos y el desarrollo de software de control, sino también la implementación de metodologías de procesamiento de imágenes y análisis del crecimiento. Así, en esta tesis se presenta un método de segmentación de hojas sobre fondo de sustrato, mediante la creación de vectores de características basados en espacios de color –Red, Green, Blue– o en transformadas Wavelet –Near infrared–, como base para entrenar clasificadores de aprendizaje automatizado. En ambos casos se obtienen unos rendimientos de clasificación cercanos al 100 % para el conjunto de imágenes probadas. Por otro lado, la aplicación del sistema al estudio del crecimiento de distintos ejemplares de Antirrhinum majus y de Petunia x hybrida, ha permitido implementar una metodología de modelización –Generalized Additive Models–, que facilita el estudio de las curvas de este crecimiento y permite determinar parámetros como tasa máxima y media de crecimiento. El empleo de los sistemas de fenotipado basado en visión artificial, muestran un gran potencial para el estudio de respuestas hasta ahora poco conocidas, fruto de cambios genómicos y epigenéticos producidos en las plantas. Finalmente, sería deseable, dirigir esfuerzos económicos y humanos hacia un campo que puede aportar no sólo conocimiento científico, sino también soluciones a nivel agroalimentario. [ENG] The growing world population is causing the need to increase crop production. Scientists and farmers are seeking to obtain genetic varieties that are more productive, stress resistant and less demanding in terms of resource consumption. The technological advances of recent decades have made it possible to obtain a multitude of new genetic lines rapidly and economically. It is also necessary to validate these new lines and check whether their phenotypic behaviour complies with what is expected according to the genotype created. However, the bottleneck of this process occurs precisely in the phenotyping of the lines. The rate of generation of new varieties has been greatly outpacing our ability to identify their phenotypes. In recent years, the development of the High Throughput Phenotyping (HTP) has been able to shorten these distances, due to the growing interest shown by corporations and governments. Computer vision-based phenotyping is a noninvasive method in most cases. It has a multitude of possible configurations depending on the objectives set. It is becoming more affordable thanks to the lower cost of technology and is multiscale and can be implemented from a small cultivation chamber to large agricultural areas. Therefore, this work proposes the development of a phenotyping system based on computer vision, to be implemented in a growth chamber, with them main aim of studying the growth rate of different genetic lines –wild type and transgenic–. This system not only includes devices and the development of control software, but also the implementation of image processing methodologies and growth analysis. Thus, in this thesis we present a method of segmentation of leaves over substrate background, by creating feature vectors based on color spaces –Red Green Blue– or Wavelet transforms -Near Infrared –, as a basis for training machine learning classifiers. In both cases, classification yields of close to 100 for the set oftested images. On the other hand, the application to the study of the growth of different lines of Antirrhinum majus and Petunia x hybrida, has allowed the implementation of a modelling methodology –Generalized Additive Models–, which facilitates the study of the growth curves and allows the determination of parameters such as maximum and mean growth rates. The application of phenotyping systems based on artificial vision, shows a great potential for the study of uncharacterized germplams, as a result of genomic and epigenetic changes produced in plants. Finally, it would be desirable to focus economic and human efforts towards a field that can provide not only scientific knowledge, but also solutions for the agriculture and food industry. Escuela Internacional de Doctorado de la Universidad Politécnica de Cartagena Universidad Politécnica de Cartagena Programa de Doctorado en Técnicas Avanzadas en Investigación y Desarrollo Agrario y Alimentario por la Universidad Politécnica de Cartagena

[eng] The main goal of the present thesis has been to shed light into the processes that shape the genetic diversity of organisms, focussing in the following factors: the type of reproduction, the morphological diversity of genitalia, the karyological diversity, and the paleogeographic and paleoclimatic events. To do so, we have used as model organisms two different genera of freshwater planarians, viz. the genus Schmidtea and several Dugesia species from the Western Mediterranean region, focussing on the species D. subtentaculata. The analysis of the impact of the type of reproduction into the genetic characteristics of D. subtentaculata revealed that asexual fissiparous reproduction generates outstanding levels of intraindividual genetic diversity by the putative accumulation of mutations in the planarian stem cells. Importantly, the obtained results indicate that this intraindividual genetic diversity takes place in a mosaic context, something that has never been reported before. Thus, this genetic effect has been newly described as the mosaic Meselson effect, representing a variation of the well-known Meselson effect but at the mosaic level. Moreover, we have also found evidence that events of occasional sex in fissiparous populations of D. subtentaculata (facultative reproduction) allow the transmission to descendants of different combinations of the alleles generated by the mosaic Meselson effect through processes of segregation and outcrossing. This situation is not only crucial for increasing the genetic diversity between the individuals of fissiparous populations but also may allow fissiparous populations to get rid of the deleterious mutations that have not been eliminated at the intraindividual level. The integrative analysis of the molecular, morphological, and karyological characteristics within D. subtentaculata and between the different Schmidtea species has revealed that, in both groups, the degree of morphological variation in the anatomy of the copulatory apparatus is extremely low compared with the degree of molecular and karyological variation. These results indicate that the anatomy of the copulatory apparatus in planarians might be under a general state of morphological stasis, putatively due to hermaphroditism. Moreover, the high incidence of chromosomic rearrangements that has been found between the different populations of D. subtentaculata linked with their high genetic divergence, suggests that chromosomic rearrangements may play an important role driving speciation processes in planarians, principally in sexual populations showing a diploid karyotype. In agreement with this, the phylogenetic relationships inferred between the different Schmidtea species give support to a previous hypothesis of speciation between S. nova and S. lugubris due to chromosomic rearrangements. Importantly, these results have unveiled the existence of three new species within D. subtentaculata, viz. D. aurea, D. corbata, and D. vilafarrei, which are cryptic at the morphological level but can be perfectly diagnosed by molecular and karyological data. All these results point to the need of reconsidering the taxonomic framework that is currently being used to describe planarian species, which is principally based on morphological characters. Finally, we have found that the paleogeographic history of the Western Mediterranean during the last 30 million years have had a huge impact driving the genetic diversification of the different Dugesia species from this region, either by promoting vicariant events or by connecting previously isolated areas. Moreover, the divergence time estimation performed for Schmidtea points out that the low species richness of this genus together with the high genetic divergence between the different species could be a result of the harsh paleogeographic history of Europe during the Cretaceous period., [spa] El objetivo principal de esta tesis ha sido estudiar los procesos que modelan la diversidad genética de los organismos, centrándonos en el tipo de reproducción, la diversidad morfológica, la diversidad cariológica y los eventos paleogeográficos y paleoclimáticos. Para ello, hemos escogido como organismo modelo dos géneros diferentes de planarias de agua dulce, el género Schmidtea y varias especies de Dugesia de la región del Mediterráneo Occidental, trabajando principalmente con la especie Dugesia subtentaculata. Los resultados obtenidos en el análisis de los efectos genéticos del tipo de reproducción en D. subtentaculata han revelado que la reproducción asexual por fisión genera unos niveles muy elevados de diversidad genética intraindividual, posiblemente a causa de la acumulación de mutaciones en las células madre de las planarias. Es importante señalar que esta diversidad genética intraindividual ocurre en un contexto de mosaicismo, representando una variación del famoso "efecto Meselson". Por lo tanto, hemos descrito este nuevo fenómeno genético como el "efecto Meselson en mosaico". El análisis molecular, morfológico y cariológico de las diferentes poblaciones de D. subtentaculata y de las diferentes especies de Schmidtea ha revelado que, en ambos grupos, el grado de variación morfológica del aparato copulador (que es el principal carácter taxonómico en planarias) es extremadamente bajo en comparación con el grado de variación molecular y cariológica. Estos resultados no solo han respaldado una hipótesis previa de especiación cariológica en Schmidtea, sino que también han revelado la existencia de tres especies crípticas de Dugesia, las cuales han sido descritas bajo los nombres de D. aurea, D. corbata y D. vilafarrei. Todos estos resultados apuntan a la necesidad de reconsiderar el marco taxonómico que se está utilizando actualmente para describir las especies de planarias. Finalmente, los distintos análisis filogeográficos realizados indican que la historia paleogeográfica del Mediterráneo Occidental durante los últimos 30 millones de años ha tenido un gran impacto en la diversificación genética de las diferentes especies del género Dugesia en esta región. En el caso de Schmidtea, hemos visto que tanto la baja riqueza de especies de este género como la alta divergencia genética encontrada entre sus diferentes especies podrían ser el resultado de la historia paleogeográfica de Europa durante el período Cretácico.

Programa de Doctorado en Biotecnología, Ingeniería y Tecnología Química, Línea de Investigación: Biología del Desarrollo, Clave Programa: DBI, Código Línea: 9, La regulación transcripcional es el primer y quizás más importante paso de la regulación génica, una compleja serie de dinámicas que, en última instancia, controla qué cantidad de producto génico se expresará en una célula en cada momento. Los distintos niveles de actividad transcripcional y la acumulación diferencial de tránscritos resultante conducen a la diferenciación celular, la piedra angular de la vida multicelular. La transcripción se regula mediante la interacción de distintas proteínas (factores en trans) que se unen al ADN en sitios específicos del genoma (elementos cis). Las primeras llamadas Factores de Trancripción y a los segundos Elementos Reguladores en Cis (TFs y CREs respectivamente, por sus siglas en inglés). Estudiada desde la perspectiva de la evolución genómica, la regulación transcripcional es excepcionalmente interesante. Los CREs pueden evolucionar con relativa rapidez y se considera que sus cambios son el motor principal de la evolución morfológica en animales. Así, una pequeña modificación que afecte a un sitio de unión de un TF durante el desarrollo embrionario podría dar lugar a efectos en cascada y alterar profundamente la forma del organismo. En este trabajo, nos enfrentamos a dos aspectos de este amplio campo de investigación. Para la primera parte del trabajo, investigaremos la evolución de la regulación en cis en el origen de los vertebrados. Para ello, empleamos el exhaustivo conjunto de datos genómicos, transcriptómicos y epigenómicos que generamos para el anfioxo mediterráneo (Branchiostoma lanceolatum). El anfioxo es un organismo ideal para tales investigaciones ya que, por varias razones tanto genómicas como morfológicas, se puede considerar que es el linaje existente que guarda una mayor similitud con el ancestro común de todos los cordados. Contrapondremos los datos de anfioxo con la igualmente extensa colección de datos que hemos generado para el pez cebra, así como con datos adicionales de peces medaka y de ratón. Para la segunda parte, nos centramos en el problema de identificar sitios de unión de TFs en el genoma. Aplicamos un enfoque matemático de vanguardia, una red de convolución o red neuronal (NN) que integra al mismo tiempo información de secuencia genómica con información de señal de ATACseq, para predecir con precisión sitios reales de unión de TFs usando únicamente experimentos de ATACseq. En este trabajo presentaremos nuestra NN y los resultados obtenidos al compararla con otras técnicas actuales. Estos resultados muestran que nuestro método puede resultar muy valioso en análisis genómicos actuales, ya que permite reemplazar con un solo experimento de ATACseq múltiples experimentos de ChIPseq, reduciendo de manera muy significativa los costes y el tiempo de los experimentos de secuenciación. Además, nuestra NN puede ser entrenada primero en una especie con datos de ChIPseq previamente disponibles y usarse después en otras especies diferentes, un enfoque que es particularmente atractivo para realizar comparaciones evolutivas, especialmente en el caso de nuevos organismos modelo., Universidad Pablo de Olavide de Sevilla. Centro de Estudios de Posgrado, Postprint

[spa] Las tecnologías de secuenciación de próxima generación (NGS) proporcionan datos potentes para investigar cuestiones biológicas y evolutivas fundamentales, como estudios relacionados con la genómica evolutiva de la adaptación y la filogenética. Actualmente, es posible llevar a cabo proyectos genómicos complejos analizando genomas completos y / o transcriptomas, incluso de organismos no modelo. En esta tesis, hemos realizado dos estudios complementarios utilizando datos NGS. En primer lugar, hemos analizado el transcriptoma (RNAseq) de los principales órganos quimiosensoriales del quelicerado Macrothele calpeiana, Walckenaer, 1805, la única araña protegida en Europa, para investigar el origen y la evolución del sistema quimiosensorial (SQ) en los artrópodos. El SQ es un proceso fisiológico esencial para la supervivencia de los organismos, y está involucrado en procesos biológicos vitales, como la detección de alimentos, parejas o depredadores y sitios de ovoposición. Este sistema, está relativamente bien caracterizado en hexápodos, pero existen pocos estudios en otros linajes de artrópodos. El análisis de nuestro transcriptoma permitió detectar algunos genes expresados en los supuestos órganos quimiosensoriales de los quelicerados, como cinco NPC2 y dos IR. Además, también detectamos 29 tránscritos adicionales después de incluir en los perfiles de HMM nuevos miembros del SQ de genomas de artrópodos recientemente disponibles, como algunos genes de las familias de los SNMP, ENaC, TRP, GR y una OBP-like. Desafortunadamente, muchos de ellos eran fragmentos parciales. En segundo lugar, también hemos desarrollado algunas herramientas bioinformáticas para analizar datos de RNAseq y desarrollar marcadores moleculares. Los investigadores interesados en la aplicación biológica de datos NGS pueden carecer de la experiencia bioinformática requerida para el tratamiento de la gran cantidad de datos generados. En este contexto, principalmente, es necesario el desarrollo de herramientas fáciles de usar para realizar todos los procesos relacionados con el procesamiento básico de datos NGS y la integración de utilidades para realizar análisis posteriores. En esta tesis, hemos desarrollado dos herramientas bioinformáticas con interfaz gráfica, que permite realizar todos los procesos comunes del procesamiento de datos NGS y algunos de los principales análisis posteriores: i) TRUFA (TRanscriptome User-Friendly Analysis), que permite analizar datos RNAseq de organismos que no modelos, incluyendo la anotación funcional y el análisis de expresión génica diferencial; y ii) DOMINO (Development Of Molecular markers In Non-model Organisms), que permite identificar y seleccionar marcadores moleculares apropiados para análisis de biología evolutiva. Estas herramientas han sido validadas utilizando simulaciones por ordenador y datos experimentales, principalmente de arañas., [eng] The Next Generation Sequencing (NGS) technologies are providing powerful data to investigate fundamental biological and evolutionary questions including phylogenetic and adaptive genomic topics. Currently, it is possible to carry out complex genomic projects analyzing the complete genomes and/or transcriptomes even in non-model organisms. In this thesis, we have performed two complementary studies using NGS data. Firstly, we have analyzed the transcriptome (RNAseq) of the main chemosensory organs of the chelicerate Macrothele calpeiana, Walckenaer, 1805, the only spider protected in Europe, to investigate the origin and evolution of the Chemosensory System (CS) in arthropods. The CS is an essential physiological process for the survival of organisms, and it is involved in vital biological processes, such as the detection of food, partners or predators and oviposition sites. This system, which has it relatively well characterized in hexapods, is completely unknown in other arthropod lineages. Our transcriptome analysis allowed to detect some genes expressed in the putative chemosensory organs of chelicerates, such as five NPC2s and two IRs. Furthermore, we detected 29 additional transcripts after including new CS members from recently available genomes in the HMM profiles, such as the SNMPs, ENaCs, TRPs, GRs and one OBP-like. Unfortunately, many of them were partial fragments. Secondly, we have also developed some bioinformatics tools to analyze RNAseq data, and to develop molecular markers. Researchers interested in the biological application of NGS data may lack the bioinformatic expertise required for the treatment of the large amount of data generated. In this context, the development of user-friendly tools for common data processing and the integration of utilities to perform downstream analysis is mostly needed. In this thesis, we have developed two bioinformatics tools with an easy to use graphical interface to perform all the basics processes of the NGS data processing: i) TRUFA (TRanscriptome User-Friendly Analysis), that allows analyzing RNAseq data from non-model organisms, including the functional annotation and differential gene expression analysis; and ii) DOMINO (Development of Molecular markers in Non-model Organisms), which allows identifying and selecting molecular markers appropriated for evolutionary biology analysis. These tools have been validated using computer simulations and experimental data, mainly from spiders.

Programa de Doctorado en Biotecnología, Ingeniería y Tecnología Química Línea de Investigación: Bioinformatica en Biotecnología y Biomedicina Clave Programa: DBI Código Línea: 7 Animal morphological diversity is astonishing and it is partially due to differences in gene expres- sion between different species during development. Recently, the genome folding in Topologically Associated Domains (TADs) found in most animals has been shown to be critical in the control of transcription during development. Distal enhancers are able to interact with the promoters of developmental genes only when they belong to the same 3D environment or TAD. Therefore, we investigated how changes in the 3D folding of the genome could have impacted the changes in gene regulation responsible for the evolution of vertebrates. In order to do so we combined syntenic analysis with Chromatin Conformation Capture experiments such as 4C-seq and HiChIP. First we compared the chromatin folding around the zebrafish HoxD and the amphioxus Hox loci using 4C-seq experiments coupled to computational modelling. The chromatin architecture around the vertebrate HoxD locus is peculiar, with al the HoxD genes located at the boundary between two TADs allowing them to switch to respond to distal enhancers located in either of the two TADs during the patterning of the limbs. In contrast, all the amphioxus Hox genes belong to the same TAD. However, the region located downstream from Hox1 is homologous to the vertebrate anterior TAD and is wired both in 3D and functionally to the regulation of Hox genes also in amphioxus. This suggests a stepwise evolution of the chromatin folding in two TADs found in extant vertebrates, with the anterior TAD being already wired to Hox genes in the last common ancestor of chordates. Second we performed a genome wide comparison of the chromatin folding between zebrafish and amphioxus using HiChIP and antibodies against different histone modifications. Using H3K4me3 HiChIP experiments we were able to identify the Regulatory Landscapes (RLs) of all active devel- opmental promoters using a single experiment. By doing so we were able to identify almost four hundred cases of chromosomal rearrangements that potentially altered the boundaries of a TAD and were susceptible to generate regulatory novelties in the vertebrate lineage. Also, we found that the two events of whole genome duplication that occurred at the root of vertebrates allowed some of the paralog genes originated to increase their RLs both in size and in number of enhancers. Universidad Pablo de Olavide de Sevilla. Centro de Estudios de Posgrado Postprint

Programa de Doctorado en Biotecnología, Ingeniería y Tecnología Química, Línea de Investigación: Bioinformatica en Biotecnología y Biomedicina, Clave Programa: DBI, Código Línea: 7, Animal morphological diversity is astonishing and it is partially due to differences in gene expres- sion between different species during development. Recently, the genome folding in Topologically Associated Domains (TADs) found in most animals has been shown to be critical in the control of transcription during development. Distal enhancers are able to interact with the promoters of developmental genes only when they belong to the same 3D environment or TAD. Therefore, we investigated how changes in the 3D folding of the genome could have impacted the changes in gene regulation responsible for the evolution of vertebrates. In order to do so we combined syntenic analysis with Chromatin Conformation Capture experiments such as 4C-seq and HiChIP. First we compared the chromatin folding around the zebrafish HoxD and the amphioxus Hox loci using 4C-seq experiments coupled to computational modelling. The chromatin architecture around the vertebrate HoxD locus is peculiar, with al the HoxD genes located at the boundary between two TADs allowing them to switch to respond to distal enhancers located in either of the two TADs during the patterning of the limbs. In contrast, all the amphioxus Hox genes belong to the same TAD. However, the region located downstream from Hox1 is homologous to the vertebrate anterior TAD and is wired both in 3D and functionally to the regulation of Hox genes also in amphioxus. This suggests a stepwise evolution of the chromatin folding in two TADs found in extant vertebrates, with the anterior TAD being already wired to Hox genes in the last common ancestor of chordates. Second we performed a genome wide comparison of the chromatin folding between zebrafish and amphioxus using HiChIP and antibodies against different histone modifications. Using H3K4me3 HiChIP experiments we were able to identify the Regulatory Landscapes (RLs) of all active devel- opmental promoters using a single experiment. By doing so we were able to identify almost four hundred cases of chromosomal rearrangements that potentially altered the boundaries of a TAD and were susceptible to generate regulatory novelties in the vertebrate lineage. Also, we found that the two events of whole genome duplication that occurred at the root of vertebrates allowed some of the paralog genes originated to increase their RLs both in size and in number of enhancers., Universidad Pablo de Olavide de Sevilla. Centro de Estudios de Posgrado, Postprint

Thus, the hypothesis of this thesis is that visceral adipose tissue (VAT) epigenetics could be de-regulated in obese, metabolic syndrome and colorectal cancer subjects contributing to the etiology of these disorders. To answer this hypothesis, the objective was to study the DNA methylation and histone H3K4me3 modification in VAT from Obese and Metabolic Syndrome Subjects as well as DNA methylation from VAT of Colorectal Cancer patients. Two main techniques were used: DNA methylation was measured by DNA bisulfite conversion and pyrosequencing using the Pyromark Q96 system (Qiagen, Corea); and to study histone modifications, a chromatin immunoprecipitation (ChIP) protocol was first established. After that we apply this ChIP method to quantify tri-methylation at lysine 4 of histone 3 (H3K4me3) modifications. Moreover, standard molecular technics were used such as qPCR for the quantification of mRNA and enriched DNA after chromatin immunoprecipitation, western blot for protein quantification or ELISA assays. We observed differences in some studied CpG islands in metabolic syndrome, extreme obese subjects and colorectal cancer subjects such as LPL, TNF, C3, VDR or NFκB1 promoters. Besides, some of these marks presented negative correlations with mRNA levels suggesting an epigenetic control of the transcriptional activity. These marks were also associated to variables related to the etiology of obesity as well as the metabolic syndrome worsening, and to inflammation in colorectal cancer. Besides, H3K4me3 was positively associated to the body mass index and to insulin resistance states, being higher the promoter enrichment for most of the studied genes in extreme obese people with glucose intolerance. Furthermore, some of these marks were positively related to mRNA levels, fact that could suggest that these mRNA levels could be regulated by this histone mark. Thus, this thesis dissertation shows that adipose tissue epigenetics might be contributing to adipose tissue function and to the etiology of obesity, metabolic syndrome and colorectal cancer. Fecha de lectura de Tesis Doctoral: 15 Enero 2019. Obesity and metabolic syndrome are increasing epidemic worldwide, especially in developed countries. Obesity and metabolic disease increase the risk of suffering certain diseases such as diabetes, cardiovascular disease, NASH, neurodegenerative disorders or some type of cancers like colorectal cancer. Adipose tissue is nowadays considered as an important organ that can regulate body homeostasis and modulate other tissues function through the delivery of a wide range of molecules. It has been shown that in obesity and metabolic disease context an adipose tissue dysfunction exists, producing changes in the adipokine secretion profile that in turn can prone to the disorders usually associated to these conditions. Besides, metabolic disease and obesity development are closely related to environmental factors such as food, smoking, sedentary habits, etc. However, obesity and metabolic syndrome also have a genetic and an epigenetic component, being regarded the epigenetic landscape as a mediator between environmental and genetic factors. In this sense, epigenetics mechanisms can be shaped by nutrition, smoking or exercise among other lifestyle factors. There are two main epigenetics mechanism: 1) DNA methylation, which occurs in the C5 of a cytosine pyrimidine near to a guanine (position called CpG); and 2) histone modifications, which mainly occurs in the N terminal of histone proteins and that have a more diverse nature (acetylation, methylation, phosphorylation, sumoylation, ubiquitination, glycosylation,…). Both mechanism have been shown to be deregulated in metabolic syndrome and obesity, and could be implied in the etiology and associated risks observed in these conditions.

During embryogenesis, the developing cerebral cortex undergoes a dramatic expansion and folding. Alterations in cortical folding cause intellectual impairment and epileptogenic disorders, demonstrating its significant functional relevance. Some of the most common pathologies are polymicrogyria, the formation of multiple small folds; and periventricular nodular heterotopia (PVNH), where neurons accumulate ectopically in the vicinity of the telencephalic ventricles forming nodules, which act as epileptic foci. Mutations in PIK3R2 and FLNA are found causative for these pathologies, respectively. A novel gain-of-function mutation was identified in PIK3R2, a gene coding for a regulatory subunit in the (PI3K)-AKT-mTOR pathway, causing bilateral polymicrogyria in patients. To understand the cellular mechanisms underlying this pathology, we performed functional experiments in developing mice and ferrets by overexpressing PIK3R2 with a mutation found in patients, or its wild-type counterpart. We found that overexpression of PIK3R2 in mouse embryos by in utero electroporation caused an increase in proliferation of Radial Glia (RGCs) and Intermediate Progenitor Cells (IPCs), leading to their greater selfamplification. Migration of cortical neurons was also impaired, resulting in their accumulation of cells in deep cortical layers at embryonic and postnatal stages. Similarly, in ferret visual cortex the overexpression of Pik3r2 causes a delay in neuronal migration, a defect observable in longterm experiments in which juvenile animals showed an increase in cells populating cortical layers V and VI with respect to controls. In contrast, when the manipulation was performed in the parietal cortex, we detect a greater neurogenesis and an ectopic positioning of neurons at embryonic stages, which was consolidated in juvenile ferrets, presenting neuronal periventricular heterotopias and an overmigration defect altering cortical surface. Our findings demonstrate that increased levels of PIK3R2 alters progenitor cell proliferation and neuronal migration during cortical development in an area-specific manner, which suggests a different robustness of cortical areas. Periventricular nodular heterotopia (PVNH) has been associated to mutations in the FLNA gene.Here, we analyzed the expression pattern of FlnA in cortical development of mouse and ferret, and we observed the highest levels of expression in germinal layers in both animal models. Importantly, FlnA expression in ferret was heterogeneous along the Outer Subventricular Zone (OSVZ), being higher in the prospective gyri compared to sulci. Next, we performed overexpression and knock down experiments by in utero electroporation of full length FlnA and FlnA-shRNA, respectively, in mouse embryos. Overexpression of FlnA causes a delay in neuronal migration at embryonic stages. Additionally, this retention is maintained postnatally (P21), when we can find accumulation of neurons resembling periventricular nodules. Upon FlnA knock down, we find that those neurons that finally migrate fail to acquire their proper laminar position, ending misplaced in superficial positions. An alteration in neuronal migration was observed also in postnatal ferrets electroporated with FlnA knock down, but not in overexpression conditions. However, overexpression of FlnA causes a disruption of the apical lamina resulting in premature cell delamination or death, although this do not cause the formation of periventricular nodules. Finally, we analyzed the expression pattern of a gene involved in subcortical band heterotopia, Eml1, during ferret cortical development. We observed that it is expressed in germinal layers and in the cortical plate, but in contrast to the other gene that we have analyzed, the highest expression in the germinal layers starts later in development, contrary to what has been previously observed in mouse. Overexpression experiments performed in ferret visual cortex showed a slight neuronal migration defect at early postnatal stages that was selfcorrected later during development. Durante la embriogénsis, el desarrollo de la corteza cerebral sufre una dramática expansión y plegamiento. Alteraciones en el plegamiento cortical causan discapacidad intelectual y desórdenes epilépticos, demostrando su importancia funcional. Algunas de las patologías más comunes son polimicrogiria, la formación de múltiples pequeños giros; y heterotopia nodular periventricular, en la que las neuronas se acumulan ectópicamente en la vicinidad de los ventrículos telencefálicos formando nódulos que actúan como foco epiléptico. Mutaciones en PIK3R2 y FLNA se han definido causantes de estas patologías, respectivamente. Una nueva mutación de ganancia de función ha sido identificada en PIK3R2, un gen codificante para la subunidad reguladora de la cascada PI3-AKT-mTOR, causando polimicrogiria bilateral en pacientes. Para entender los mecanismos celulares que subyacen en esta patología, realizamos experimentos en ratones y hurones en desarrollo sobreexpresando PIK3R2 con la mutación hallada en pacientes, o su forma “salvaje”. Hemos visto que la sobreexpresión de PIK3R2 en embriones de ratón mediante electroporación in utero causa un incremento en proliferación de células de glia radial (RGCs) y células progenitoras intermedias (IPCs), dando lugar a una mayor auto-amplificación. La migración de las neuronas corticales también está afectada, resultando en una acumulación de células en las capas corticales profundas en estadios embrionarios y postnatales. De forma similar, la sobreexpresión de PIK3R2 en la corteza visual del hurón causa un retraso en la migración neuronal, un defecto observable en experimentos de largo tiempo de supervivencia en los que animales juveniles muestran un incremento en las células poblando las capas corticales V y VI respecto a los controles. En cambio, cuando la manipulación se realizó en la corteza parietal detectamos una mayor neurogénesis y una posición ectópica de las neuronas en estadios embrionarios, algo consolidado en hurones juveniles, presentando heterotopias periventriculares de neuronas y una sobremigración que altera la superficie cortical. Nuestros resultados desmuestran que el incremento de los niveles de PIK3R2 altera la proliferación de progenitores corticales y la migración neuronal durante el desarrollo cortical de forma área-específica, lo que sugiere una diferente robustez de las áreas corticales. La heterotopia nodular periventricular (PVNH) se ha asociado a mutaciones en el gen de FLNA. Aquí, analizamos el patrón de expresión de FlnA durante el desarrollo cortical de ratón y hurón, y observamos mayores niveles de expresión en las capas germinales de ambos modelos animales. Lo que es más importante, la expresión de FlnA en hurón es heterogénea a lo largo de la zona subventricular externa (OSVZ), siendo mayor en el giro prospectivo que en el surco. A continuación, realizamos experimentos de sobreexpresión y reducción de expresión mediante electroporación in útero de FlnA y FlnA-shRNA, respectivamente, en embriones de ratón. La sobreexpresión de FlnA causa un retraso en la migración neuronal a estadios embrionarios. Adicionalmente, esta retención se mantiene postnatalmente (P21), donde encontramos una acumulación de neuronas que logran parecerse a nódulos periventriculares. Respecto a reducción de expresión de FlnA, encontramos que esas neuronas que escapan de la ectopia en la materia blanca fallan en adquirir su posición laminar correcta, acabando inapropiadamente localizadas en posiciones superficiales. Una alteración en la migración neuronal también es observable en hurones postnatales electroporados para la pérdida de función, pero no en condiciones de ganancia de función. Sin embargo, la sobreexpresión de FlnA causa disrupción de la lámina apical, lo que resulta en una prematura delaminación celular o muerte, aunque esto no causa la formación de nódulos periventriculares. Finalmente, analizamos el patrón de expresión de un gen involucrado en la formación de bandas heterotópicas subcorticales, Eml1, durante el desarrollo corticald el hurón. Observamos que está expresado en las capas germinales y en la placa cortical, pero, adiferencia de los otros genes, la mayor expresión en las capas germinales empieza a estadios tardios del desarrollo, contrariamente a lo que se ha observado anteriormente en ratón. Experimentos de ganancia de función en la corteza visual del ratón muestran un leve defecto de migración neuronal en tempranos estadios postnatales que es corregido más tarde durante el desarrollo.

Adequate neuronal development is essential for communication between organs and, consequently, for the vital functions of animals. Neurogenesis is a process by which neurons are generated from stem cells (SCs) or other progenitor cells, and it is during the initial stages of development of an organism when this process is most active. SCs of the nervous system are derived from neuroepithelial cells (NECs), which are rapidly and symmetrically amplified during the early stages of embryonic development in order to increase the number of SCs. Regulation of proliferation and the transition from NECs to SCs is extremely important. Alterations in the control of this process can have serious consequences for the final size of the adult brain. These problems can lead to brain diseases such as hyper- and hypoplasia, microcephaly and tumour generation, among others, which can also lead to severe neurodegenerative diseases. Previous studies have shown that internal dysregulation of progenitor cells can be caused by factors from their environment, in other words, from a cellular niche. The environment created by other cells close to the progenitors can influence, via extrinsic factors, the intrinsic factors that promote the transition from NECs to SCs. Studies done by our laboratory using Drosophila melanogaster as a model for brain development have described a glial niche that controls neurogenesis in larval stages. In this research, a type of glial cell defined by the expression of the microRNA miR-8, the homolog of miR-200 in vertebrates, was identified and characterized, and it was determined that it control the neuroepithelium-stem cell transition by regulating the TGF-α/EGFR pathway. The similarity between the NEC-neuroblast transition (the fruit fly neuronal SC) and the NEC-radial glia transition (the mammalian neuronal SC) evidence a conservation in the cellular elements that control the neurogenesis. In addition, this aspect highlights that deregulation of gliogenesis, the generation of glial cells, may have side effects on the formation of neuronal cells and can cause the development of gliomas which are one of the most common and aggressive tumours related to glia in the central nervous system (CNS). The aim of this doctoral thesis is to contribute to the knowledge of the mechanisms that regulate brain maturation and early neurogenesis through the aforementioned glial niche. However, at the beginning of this study, the laboratory identified a new marker for niche glial cells (cg25c+) that was more specific than the one used before (miR-8+). Consequently, the first part of my work focuses on characterizing this new marker, along with the marker for NECs (c855a+), using the Gal4/UAS expression system and fluorescence microscopy techniques. To address the main objective of this thesis, I used a multidisciplinary genetic approach that includes several state-of-the-art techniques. Firstly, I carried out the precise separation of the two brain cell populations using fluorescence-activated cell sorting (FACS). Then, I sequenced each population’s transcriptome (RNA-seq) and analysed them bioinformatically during a stay in the laboratory of Dr. Vladimir Benes (EMBL-Heidelberg, Germany). The 151 genes obtained from the bioinformatics screening are related to ligands and receptors (or other intercellular signalling molecules) and are potentially differentially expressed at different larval ages. The genes were validated in vivo using the binary Gal4/UAS system and transgenic fly lines for regulating the gain (UAS) and loss (RNAi) of function of these genes. From the validation, I found 51 genes that function both as ligands and receptors in different signalling pathways involved in, for example, tissue growth (EGFR, Spitz, Argos, Echinoid, and Crumbs), synapses (Neurexin-IV and Inebriated), oncogenes (Ret oncogene), integrins (Myospheroid and Tiggrin), the Hedgehog pathway (Patched) or the Wnt pathway (Wnt2, Wg, Pebble, and Off-track2). In addition, I found other molecules involved in the neurotransmission of nerve impulses (Inebriated), serotonin (5-HT2B), acetylcholine (nAChRalpha3) and glutamate (Mangetout), among others. These 51 genes were identified as producing anomalies during development, including malformations of the CNS, when under- or overexpressed in the niche cells. The analysis of the genes whose altered expression produced the most interesting anomalies allowed me to identify a series of genes that are important for organism development. Individuals with altered expression of these genes undergo delay or arrest at a specific larval stage, which can cause differences between body and brain size and result in lethality. There is a group of receptors among those genes that is associated with the signalling pathway of the octopamine (OA) neurohormone, which is equivalent to noradrenaline in mammals. The characterization of these receptors (Oamb, Octβ1R and Octβ3R) by histochemical techniques enabled me to define the impact they have on the cells of the niche, on their progeny (neurons and neural circuits) and on other tissues (imaginal discs, fatty tissue, ring gland, etc.), as well as the signalling pathways by which receptors cause a deregulation of the cell cycle that ultimately affects the whole organism's growth. The receptors of the OA pathway have been commonly studied in octopaminergic neural circuits, where the production of OA itself has also been described. Studies in epithelial cells from the oviduct of Drosophila have demonstrated the function of the OA receptors Oamb and Octβ3R, which control the secretion of activity effector molecules in other nearby cell types to establish an epithelial niche. Although a function of this type of receptors in insect glial cells has been hypothesized for years, few evidences are found on this subject. For instance, some studies in Drosophila show that astrocytes of the CNS have Oct-TyrR receptors and stimulate the activity of multiple sensory behaviours through internal regulation of Ca2+. Thus, the findings obtained in this doctoral thesis can provide new conclusions about the role of the OA pathway in the glial niche that controls the brain growth and the development of the organism.

El capítulo II (Results and Discussion) está sujeto a confidencialidad por el autor. 112 p. Ezaguna da hortz muin helduak zelula ama populazio garrantzitsu bat duela barnean, hauei, hortz muineko zelula amak deritze (ingelesez, dental pulp stem cells, DPSCs). Oinarrizko egoeran aurkezten dituzten zelula neuralen markatzaileak, zelula ama neuralek baino irisgarritasun handiagoa, jatorrizko organoaz kanpo hedatzeko ahalmena eta neurodesberdintzapen ahalmenak, bakarrak bilakatzen dituzte giza DPSCs-ak (gDPSCs-ak) gorputz helduan aurkitu daitezkeen beste zelulekiko. Izan ere, birsorkuntza neuraleko terapia zelular autologoetan erabilgarriak izan daitezke. Normalean erabiltzen diren hazkuntza eta mantentze medioek behi serum fetala (BFS) dute konposatu garrantzitsuena bezala, zeinek gDPSCs-en hazkuntza azkarra eta azalerako geruza bakar itxurako hazkuntza zelularra eragiten duen. Era berean, BFS-aren presentziak alergiak, zein erreakzio immunearen aktibazioa eragin ditzakela deskribatua dagoin vivo, konposatu honen erabilera tratamendu klinikoetatik baztertzea ezinbestekoa delarik. BFS-ak sor ditzakeen arazo medikotik at erabilgarritasun arazoak ere sor ditzake, izan ere, serumaren presentzian gDPSCs-ak leinu mesenkimaletara bideratzen direla, eta beraz, potentzial neurogenikoa galera dagoela aztertu dute zenbait autorek literaturan. BFS-aren erabilerak dakartzan eragozpen guztiek ezinbestekoa egiten dute serum gabeko eragile neurogeniko berritzaileen diseinua eta hobekuntza.Hurrengo lanean, serum gabeko hazkuntza mediotan ereindako zelulen ezaugarriak ezagutzea izan da gure xedea. Lortutako emaitzek inolako aldaketa genetiko edo epigenetikorik jasan izan ez duten gDPSCs-ak, zelula ama neuralek (ingelesez, neural stem cells, NSCs) sortzen dituzten neuro-esfera egituren antzeko hortz-esferak sortzeko duten ahalmena berretsi zuten. Hortaz aparte, bai serum gabeko zein serum-dun hazkuntza mediotan hazitako gDPSCs-ek zelula ama mesenkimal izaera eta ezaugarri pluripotentzialak mantentzeko gai zirela frogatu genuen. Hala ere, erabili genituen serum gabeko hazkuntza ingurune espezifikoek ezaugarri desberdinak erantsi zizkien gDPSCs-ei. gDPSCs-ak Neurocult¿ desberdintzapen neurogeniko medioan, NSCs-ak egunerokotasunez desberdintzeko erabiltzen den serum gabeko hazkuntza medioa, izan zirenean haziak, hauek glia eta neurona markatzaile helduak adierazteko gaitasuna zutela ikusi genuen. Honetaz aparte, markatzaile ama mesenkimal eta neural goiztiarrak adierazten dituzten genetikoki aldatu bariko gDPSCs-ez gain, CD31, markatzaile endoteliala, adierazten zuten gDPSCs-ak deskribatzen lehenak izan gara serum gabeko hazkuntza ingurunea erabiliz. Kasu honetan, Neurocult¿ hedapenerako medioa erabili genuen. Gainera, timo-gabeko xagu biluzietan garezur barneko gDPSCs-en txertaketa eta hilabete baten ostera, CD31+, Nestina + zelulak burmuineko odol-hodien zelula endotelialekin batera elkarbizitzen eta hauen laminina adierazpena areagotzen aurkitu ziren. Bestalde, gDPSC-ak StemPro MSCTM (STP) izeneko, zelula ama mesenkimalentzako hazkuntza ingurune komertzialean haziak izan zirenen. Era berean, STP-k zelulei eskainitako aldaketa molekular eta fisiologikoak erabiliz, markatzaile pluripotentzialen eta gandor neuralen (GN) markatzaileen handipen bat antzeman genuen gDPSCs-ek aurkeztutako ahalmen neurogenikoaren igotzearekin batera. Honek guztiak, gandor neuraleko ama zeluletarantz (ingelesez, neural crest stem cells, NCSCs), hau da leinu primitibo baterantz atzera pausu bat iradokitzen du.Gure emaitzek, serum gabeko erabilera gDPSC-ak hazteko egokia dela adierazten dute. Ez ziren bakarrik serum-aren erabilerarekin erlazionatutako arazoak ekidin, baizik eta leinu neuraletara asko erraztu dezakeen gandor neuraleko ama izaeraren agerpena lortu zen. Neurodesberdintzapenetik harago, serum gabeko eragileak erabiliz gDPSCs-tatik eratorritako zelula endotelial funtzionalak, burmuinean integratzeko eta odol hodiak sortzeko gaitasuna erakutsi zuten, lortzen lehen taldea izan gara .Laburbilduz, gDPSCs-en zelulen bideragarritasunarekin, amatasunarekin, ahalmen neurogenikoarekin zein sistema biziekin izan dezaketen elkarrekintzekin zerikusia duten serum gabeko zelula hazkuntzek sor ditzaketen zalantzak argituak izan dira. Gorago aipatutako ezaugarriekin batera gDPSCs-ek erakutsitako gaitasun neurogeniko eta berriki aztertutako zelula endotelialetara desberdintzeko ahalmenak ikusita, gDPSCs-ak nerbio-ehun birsortze terapietan erabiltzeko gizaki helduetan aurki daitezkeen zelula ama aproposenak direla ondorioztatu daiteke.

Tesis doctoral 296 páginas, figuras y tablas, [EN] Specific cell identities are defined by the expression of selected transcriptomes that allow the cell to fulfill its distinctive functions. It is broadly stablished that transcriptomes are selected by specific combinations of transcription factors (TF) that bind selectively to the regulatory regions of the DNA, promoters and enhancers. In fact, it is the combinatorial and cooperative binding of transcription factors what promotes the expression of specific cell features. However, the mechanisms that allow TFs to identify regulatory regions remain poorly understood. One of the niches that gathers more cell diversity is the nervous system, thus, this tissue becomes one of the best scenarios to study how distinct cell fates are acquired. In this Thesis we focus on monoaminergic system (MA), composed of distinct subpopulations of neurons that use biogenic amines as neurotransmitters, such as dopamine (DA), serotonin (5-HT) and adrenaline (A) and noradrenaline (NA), in vertebrates, or octopamine (OA) and tyramine (TA) in invertebrates. Monoaminergic system is conserved in all eumetazoans and regulates a plethora of complex behaviors, from locomotion to mood or appetite. An unbalance in the production or release of these neurotransmitters leads to diseases such as Parkinson or mental disorders such as bipolar disorder, depression or anxiety. In this Thesis we took advantage of the phylogenetic conservation of monoaminergic neurons to use the nematode Caenorhabidtis elegans as a model system. C. elegans monoaminergic system is composed of four pairs of DA neurons (CEPV/D, ADE and PDE), four pairs (NSM, ADF, HSN and AIM) and a unilateral (RIH) serotonergic neurons; a pair of TA neurons (RIM) and another OA pair (RIC)., All these neurons express a battery of genes that encode for enzymes and transporters that produce, carry and release the neurotransmitter which are also phylogenetically conserved. Using this nematode, our goal in this Thesis was to unravel which, among the 876 transcription factors present in C. elegans genome, play a key role in specification of monoaminergic neurons. To accomplish this aim, we optimized the RNAi strategy to perform an RNAi screen to knockdown the expression of all C. elegans TFs and look for defects in specific features of MA neurons, such us in the battery of genes required to synthesized the neurotransmitter. This strategy provided 91 TFs candidates involved in MA specification, we selected the ones that retrieved the most penetrant phenotypes and validate the results according to the MA subpopulation affected. Our results showed that, for DA population, unc-62, vab-3 and unc-55 are essential in the regulatory complex that drives the specification of these neurons. Regarding 5-HT neurons, the combined action of lag-1 and hlh-14 promote the expression of ADF mature features and are determining in the behaviors exhibited by this neuron. Finally, the bZIP factor, zip-5, has been identified as the first TF known to be involved in the specification of RIC and RIM neurons. To conclude, our work shed light into the transcriptional regulation of monoaminergic neurons, identifying key TFs that control the expression of identity genes of this population and that can be used to find functional orthologs in more evolved organisms that control monoaminergic specification., [ES] La identidad celular se define mediante la expresión de transcriptomas seleccionados que permiten a la célula cumplir sus funciones características. Los estudios en este campo señalan que un transcriptoma se selecciona mediante combinaciones específicas de factores de transcripción (FT) que se unen selectivamente a las regiones reguladoras del ADN, promotores y enhancers. De hecho, es la unión cooperative y en combinación de los factores de transcripción lo que promueve la expresión de características celulares específicas. Sin embargo, los mecanismos que permiten a los FT identificar regiones reguladoras siguen siendo poco conocidos. Uno de los nichos que reúne más diversidad celular es el sistema nervioso, por lo tanto, este tejido se convierte en uno de los mejores escenarios para estudiar cómo se especifican los distintos destinos celulares. En esta Tesis nos centramos en el estudio del sistema monoaminérgico (MA), compuesto por distintas subpoblaciones de neuronas que utilizan aminas biógenas como neurotransmisores, entre los que se incluyen la dopamina (DA), la serotonina (5-HT) y la adrenalina (A) y noradrenalina (NA), en vertebrados, u octopamina (OA) y tiramina (TA), en invertebrados. El sistema monoaminérgico está conservado en todos los eumetazoos y regula una gran variedad de comportamientos complejos, desde la locomoción hasta el estado de ánimo o el apetito. Un desequilibrio en la producción o liberación de estos neurotransmisores conduce a enfermedades como el Parkinson o trastornos mentales como el trastorno bipolar, la depresión o la ansiedad. En esta Tesis, aprovechamos la conservación filogenética de las neuronas monoaminérgicas para utilizar el nematodo Caenorhabidtis elegans como sistema modelo. El sistema monoaminérgico de C. elegans se compone de cuatro pares de neuronas DA (CEPV / D, ADE y PDE), cuatro pares (NSM, ADF, HSN y AIM) y una neurona serotoninérgica unilateral (RIH); un par de neuronas TA (RIM) y otro par de OA (RIC)., Todas estas neuronas expresan una batería de genes que codifican enzimas y transportadores que producen, transportan y liberan el neurotransmisor y que también está filogenéticamente conservada. Usando este nematodo, nuestro objetivo en esta Tesis fue desentrañar cuáles, entre los 876 factores de transcripción presentes en el genoma de C. elegans, juegan un papel clave en la especificación de las neuronas monoaminérgicas. Para lograr este objetivo, optimizamos la estrategia de ARN de interferencia (ARNi) para realizar un cribado de ARNi con el fin de disminuir la expresión de todos los FT de C. elegans y buscar defectos en las características específicas de las neuronas MA, como la batería de genes necesarios para sintetizar el neurotransmisor. Esta estrategia proporcionó 91 FT candidatos implicados en la especificación MA. Posteriormente seleccionamos aquellos que proporcionaron los fenotipos más penetrantes y validamos los resultados de acuerdo con la subpoblación MA afectada. Nuestros resultados mostraron que, para la población DA, unc-62, vab-3 y unc-55 son esenciales en el complejo regulador que impulsa la especificación de estas neuronas. En cuanto a las neuronas 5-HT, la acción combinada de lag-1 y hlh-14 promueve la expresión de las características de madurez de la neurona ADF y son determinantes en los comportamientos exhibidos por la misma. Finalmente, el factor bZIP, zip-5, ha sido identificado como el primer FT relacionado con la especificación de las neuronas RIC y RIM. Para concluir, nuestro trabajo arrojó luz sobre la regulación transcripcional de las neuronas monoaminérgicas, identificando FT clave que controlan la expresión de genes de identidad de esta población y que pueden usarse para encontrar ortólogos funcionales en organismos más evolucionados que también controlen la especificación monoaminérgica.

[cat] El creixent nombre de genomes seqüenciats està posant de manifest que la pèrdua gènica és un fenomen recurrent que pot haver generat diversitat al llarg de la història evolutiva dels diferents grups d’organismes. En aquest sentit, un dels grans reptes en el camp de la EvoDevo és entendre l’impacte de la pèrdua gènica en l’evolució dels mecanismes del desenvolupament animal considerant diferents escenaris evolutius. En escenaris de selecció positiva, la pèrdua hauria comportat canvis morfològics o fisiològics que haurien permès l’adaptació de les espècies a noves condicions ambientals. En escenaris de selecció neutre (o quasi neutre), la pèrdua hauria afectat a gens que haurien esdevingut prescindibles per l’existència de robustesa mutacional o perquè les condicions ambientals haurien canviat. Saber si una pèrdua gènica ha estat adaptativa o neutre és generalment molt complex ja que molts cops es difícil establir relacions directes de causalitat entre la pèrdua d’un gen i l’aparició d’una nova característica evolutivament avantatjosa. Malgrat aquesta dificultat, en aquesta tesi doctoral vàrem voler estudiar l’impacte de la pèrdua gènica en l’EvoDevo a partir d’analitzar l’evolució de les vies de senyalització de l’àcid retinoic (RA) i de Wnt -vies essencials pel desenvolupament de tots els cordats- a l’urocordat Oikopleura. dioica com a sistema model de referència. Per establir O. dioica com a model animal, però, a més de les característiques biològiques que la fan atractiva per aquests tipus estudis –desenvolupament embrionari i cicle de vida extremadament ràpid, simplicitat i transparència corporal, genoma reduït i totalment seqüenciat, possibilitat de manipulació gènica per estudis funcionals– ha estat fonamental desenvolupar unes instal·lacions per cultivar-la en el laboratori, així com protocols de manteniment assequibles (low-cost) per qualsevol grup d’investigació. Gràcies a aquest sistema de cultiu, em pogut analitzar els components de la xarxa gènica del metabolisme de l’RA (RA-MGN), així com els lligands de la via de senyalització per Wnt. En referència a la RA-MGN, el nostre treball ens permet concloure que les pèrdues gèniques que han afectat a aquesta via durant l’evolució de O. dioica han tingut lloc en un sistema genètic no robust, on el desballestament de la via no han tingut un impacte dramàtic en el pla corporal típic de cordats que preserva aquest organisme. Per altre banda, l’anàlisi de la família Wnt a cordats, ens ha permès concloure que a més de la duplicació gènica o de la redundància funcional per processos d’evolució convergent, els fenòmens de reassignació de funcions (function shuffling) augmenten també la robustesa mutacional i faciliten les pèrdues gèniques en les famílies de gens. En resum, els resultats d’aquesta tesi doctoral posen de manifest que O. dioica és un model animal atractiu per estudiar tant aspectes bàsics de l’impacte de les pèrdues gèniques en l’evolució dels mecanismes del desenvolupament, com en aspectes aplicats en que certes pèrdues confereixen a O. dioica la condició de knockout evolutiu que pot ser interessant per l’estudi de mecanismes moleculars concrets com la toxicitat de les PUAs en el desenvolupament embrionari d’organismes marins., [eng] The bloom of genomics is revealing gene loss as a pervasive evolutionary force generating genetic diversity that shapes the evolution of species. In this sense, one of the great challenges in the field of EvoDevo is to understand the impact of gene loss on the evolution of animal developmental mechanisms. In this doctoral thesis we wanted to study the impact of gene loss in EvoDevo, using the analysis of the evolution of retinoic acid (RA) and Wnt signaling pathways - essential pathways in the development of all the chordates- in the urochordate Oikopleura. dioica as a model reference system. To establish O. dioica as an animal model, in addition to the biological characteristics that make it attractive for his type of studies-embryonic development and extremely fast life cycle, simplicity and body transparency, reduced and fully sequenced genome, possibility of gene manipulation for functional studies - It has been essential to develop a facility to grow O. dioica in the laboratory, as well as low-cost maintenance protocols affordable for any research group. Thanks to this culture system, we were able to analyze the components of the RA metabolic gene network (RA-MGN), as well as the ligands of the Wnt signaling pathway. In reference to the RA-MGN, our work allows us to conclude that the gene losses that have affected this pathway during the evolution of O. dioica have taken place in a non-robust genetic system, where the dismantling of the network has not had a dramatic impact on the typical body plan of chordates that preserves this organism. On the other hand, the analysis of the Wnt family in chordates, has allowed us to conclude that in addition to gene duplication or functional redundancy due to processes of convergent evolution, function shuffling also increase the mutational robustness and facilitate gene losses in gene families. In summary, the results of this doctoral thesis show that O. dioica is an attractive animal model for studying both basic aspects of the impact of gene losses in the evolution of development mechanisms, and in applied aspects. For instance, certain losses give to O. dioica an evolutionary knockout condition that may be interesting for the study of concrete molecular mechanisms such as the toxicity of PUAs in the embryonic development of marine organisms.

Programa de Doctorado en Biotecnología, Ingeniería y Tecnología Química, Línea de Investigación: Modelos Animales en Biotecnología y Biomedicina, Clave Programa: DBI, Código Línea: 22, Prohibitins (PHBs) are a class of conserved mitochondrial proteins that profoundly influence ageing. PHB depletion shortens the lifespan of wild type animals, while it causes a dramatic extension in metabolically compromised daf-2(e1370) mutants. This opposing lifespan phenotype is attributed to alterations in mitochondrial function and metabolism, but the exact function of PHBs is yet to be deciphered. This project was developed to better understand the function of the essential mitochondrial prohibitins in the regulation of ageing. To elucidate novel signalling mechanisms mediating the metabolic adjustments that lead to opposite ageing outcomes in response to PHB depletion, we performed a kinase RNAi screen using prohibitin deletion mutants. First, we characterized prohibitin deletion mutants. As these mutants are sterile, they are maintained balanced heterozygous. We accomplished a sorting protocol for selection of homozygous PHB mutants. We used vital Nile Red (NR) staining as a read-out as PHB depletion reduces NR staining. In order to quantify the intensity of NR staining, we developed an image analysis protocol. From the screen, we identified the conserved Glycogen Synthase Kinase-3 (GSK-3), as a strong suppressor of the reduced NR staining phenotype caused by prohibitin deletion mutants. Beyond its role as a regulator of insulin-dependent glycogen synthesis, GSK-3 also controls critical cellular functions. We investigated how GSK-3 influences longevity in conditions of compromised insulin signalling and mitochondrial impairment. We demonstrate that GSK-3 depletion decreases wild type lifespan but does not affect phb-2 mutants. However, the long lived daf-2 and phb-2;daf-2 mutants show strong suppression in lifespan upon loss of GSK-3. We show that GSK-3 is ubiquitously expressed via CRISPR-Cas9 endogenous gene tagging. We examined several parameters, including alterations in energy stores - glycogen/triglycerides, mitochondrial respiration and lipid composition to deduce how metabolic alterations upon GSK-3 depletion influence lifespan and found that these varied in a genetic background specific manner. Additionally, we also prove that the activity of GSK-3 is essential in the intestine for normal ageing and especially for the long lived daf-2 mutants. Our data thus, delineates a novel role for GSK-3 in metabolism and its interplay with IIS and mitochondrial metabolism in ageing regulation., Universidad Pablo de Olavide de Sevilla. Departamento de Biología Molecular e Ingeniería Bioquímica, Postprint

[eng] The tracheal (respiratory) system of the Drosophila embryo is a network of interconnected epithelial tubes that supplies and exchanges the gas to maintain the homeostasis of the entire organism. Maintaining a controlled tube diameter and fitting tube length are two major requirements for proper tube function. The Epidermal growth factor receptor (EGFR), a Tyrosine Kinase Receptor (RTK), triggers one of the principal conserved signalling pathways operating in development and homeostasis. EGFR is known to be use reiteratively for organ and tissue formation in the fruitfly. One of the aims of this work was to gain new insights into the activity of EGFR during Drosophila development. We focused on the requirements of EGFR during the formation of the tracheal system. EGFR was previously known to be required for different aspects of tracheal development, such as for invagination, branching and epithelial integrity. In this work, we identify a new requirement for EGFR during tracheal formation in controlling the length of the tracheal tubes. We found that EGFR regulates the size of the Dorsal trunk (DT), the main branch of the Drosophila tracheal network. The constitutively activation of EGFR (EGFRCA) displays shorter tubes whereas a downregulation of EGFR (EGFRDN) activity leads to an overelongated and convoluted DT. This phenotype correlates with cell shape regulation, resulting in more cuboidal cells in the case of EGFRCA and more elongated cells in EGFRDN. This work shows that EGFR act as a hub to coordinate cell intrinsic and extrinsic tube elongation mechanisms. This role is performed through the regulation of the luminal deposition of the extracellular matrix regulator Serpentine (Serp) (extrinsic factor) and of the apical determinant Crumbs (Crb) in the DT (intrinsic factor). In EGFR downregulation conditions the accumulation of both proteins is altered, and this may lead to the defective control of tube size observed. We show that Crb and Serp are loaded in common endosomes, which require EGFR activity for the proper organisation, ensuring delivery of both cargoes to their final destination. The regulation of endosomal sorting of cargoes could be one of the molecular mechanisms downstream of EGFR, and therefore could regulate different morphogenetic and pathological EGFR-mediated events. We also report that during tracheal development Crb undergoes a complex pattern of recycling, which involves internalisation and different sorting pathways that ensures its apical subcellular accumulation. We propose that Crb recycles using the Rab11-Recycling Endosome route to accumulate preferentially to the Subapical Region (SAR) and a Rab4/Retromer short-loop from the endosome to the plasma membrane to enrich in the Apical free region (AFR). Concerning the accumulation of Crb in the SAR, our results indicate that Crb is not equally distributed in all cellular junctions, but instead it is more clearly accumulated in longitudinal cell junctions (LCJ) than in circumferential cell junctions (CCJ). Crb has been proposed to control tube length through apical membrane expansion, so we hypothesize that Crb promotes a polarised longitudinal/axial tube growth. Because Src42A was previously proposed to mediate polarised cell shape changes in DT cells by regulating membrane growth in the longitudinal/axial axis, we evaluated a possible Crb/Src42A interaction. We find that in loss of function conditions for Src42A, in which the DT remains shorter, Crb is more evenly distributed in all cellular junctions. The results suggest that Src42A may contribute to Crb preferential accumulation in the LCJ. FRAP experiments point to a role of Src42A in controlling the dynamics of Crb protein accumulation in junctions. Conversely, in conditions of constitutive activation of Src42A, where there is an overelongation of the DT, we find that Crb is lost from all junctions. In addition, Serp accumulation in the lumen is also severely affected. Altogether, these results suggest a possible role for Src42A in regulating trafficking., [spa] El sistema traqueal embrionario de Drosophila está compuesto por una red de tubos epiteliales interconectados, los cuales necesitan una regulación constante tanto del diámetro como de la longitud para su correcto funcionamiento. Durante el desarrollo traqueal, el receptor de EGF (Epidermal Growth Factor Receptor) está implicado en la regulación de la invaginación e integridad epitelial de las diferentes ramas traqueales. Uno de los principales objetivos de este trabajo es obtener nuevos conocimientos sobre la implicación de EGFR en el desarrollo traqueal. Nuestros datos indican que EGFR regula la longitud del tronco dorsal (DT), ya que en embriones con una disminución de su actividad (EGFRDN), la longitud del DT se ve afectada produciendo una elongación de éste. Asimismo, cuando alteramos la actividad de EGFR, observamos que la localización apical de Crumbs (Crb) y la acumulación luminal de Serpentine (Serp), dos proteínas que regulan el crecimiento del DT, se ven afectadas. La alteración en la acumulación de ambas proteínas desencadena un defecto en el control de la elongación del tubo, tal y como se observa en embriones EGFRDN. Observamos que Crb y Serp localizan en endosomas comunes que necesitan de la actividad de EGFR para organizarse correctamente y transportar las proteínas a su destino final. Además, nuestros resultados demuestran que Crb sufre un complejo proceso de transporte y reciclaje durante el desarrollo traqueal. En estadios tardíos de la embriogénesis, Crb se localiza en la región Subapical (SAR) pero lo hace de manera anisotrópica: Crb presenta mayor acumulación en las uniones longitudinales (LCJ) que en las circunferenciales (CCJ). Cuando disminuimos la actividad de Src42A, un regulador axial del crecimiento del tubo, Crb se distribuye homogéneamente, pero en condiciones de sobreactividad, Crb desaparece de esas uniones. Nuestros resultados indican que Src42A contribuye a una mayor acumulación de Crb en las LCJ regulando su dinámica, y sugieren una posible implicación de Src42A en el reciclaje de proteínas.

[eng] Some animals have incredible regenerative abilities which kept researchers fascinating during decades. How these animals are able to regenerate missing parts and restore damaged tissues can give researchers insights in the regenerative medicine field. Here, we use the planarian Schmidtea mediterranea, specie which is able to fully regenerate every missing part, to deeper understand the regeneration and the tissue renewal processes. Both processes share several mechanisms which are essentials for their correct development. In this Thesis, we described some aspect of the balance between proliferation and apoptosis, the stem cell differentiation and the positional instructions required all of them to properly regenerate any structure and produce the tissue turn over required during the normal homeostasis of the animals. To study the balance between proliferation and apoptosis, we were focused in the description of Krüppel-like factor 10/11, which in other organisms is also involved in these mechanisms. Here we show that klf10/11 is required for the proper regulation of proliferation and apoptosis in regeneration and that they are essential for the correct remodelling of the organism structures, probably downstream c-Jun N-terminal kinase. On the other hand, we have been focused on the study of the transcriptional complex Nuclear Factor Y in order to understand its role during differentiation events in planarian. We have shown that planarian NF-Y is essential for regeneration and homeostasis and that its inhibition generates neoblast accumulation and absence of epidermal progenitors which demonstrates that NF-Y is involved in the early differentiation of epidermal lineage progenitors. Finally, the positional instructions which are essential for the correct positioning of cells and organs during regeneration and homeostasis have been studied. Here, we have been focused in the control of the medio-lateral organization of the central nervous system in planarian, where Wnt5 and Slit play an essential role. Wnt5, Slit and their receptors create a self-regulatory system to establish the medio-lateral pattern in planarians which guide the CNS to be positioned in this axis, [spa] Algunos animales tienen habilidades regenerativas increíbles, las cuales han mantenido a los investigadores fascinados durante décadas. Cómo estos animales son capaces de regenerar partes perdidas y recuperar los tejidos dañados podría dar a los investigadores claves en el campo de la medicina regenerativa. Aquí, nosotros usamos la planaria Schmidtea mediterránea, una especie que es capaz de regenerar completamente cada parte perdida, para entender más profundamente el proceso de regeneración y recambio tisular. Ambos procesos comparten varios mecanismos los cuales son esenciales para su correcto desarrollo. En esta Tesis, describimos algunos aspectos del balance entre la proliferación y la apoptosis, la diferenciación de células madre y las instrucciones posicionales, requeridas todos ellos para regenerar cualquier estructura y producir el recambio tisular requerido durante la homeostasis normal de los animales. Para estudiar el balance entre la proliferación y la apoptosis, nos hemos centrado en la descripción del factor Krüppel-like 10/11, el cual se ha relacionado con estos procesos en otros organismos. Aquí hemos visto que, klf10/11 se requiere durante la regeneración para la correcta regulación de la proliferación y de la apoptosis y que es necesario para el correcto remodelaje de las estructuras del organismo, probablemente aguas abajo de la kinasa c-Jun N-terminal. Por otra parte, nos hemos centrado en el estudio del complejo transcripcional Nuclear Factor Y para así comprender su papel durante los eventos de diferenciación en la planaria. Hemos visto que el NF-Y presente en planaria es esencial para la regeneración y homeostasis y que su inhibición produce la acumulación de neoblastos y la pérdida de progenitores epidérmicos, lo cual demuestra que NF-Y está involucrado en la diferenciación temprana de los progenitores tempranos epidérmicos. Finalmente, se han estudiado las instrucciones posicionales, las cuales son esenciales para el correcto posicionamiento de las células y órganos durante la regeneración y homeostasis. Aquí, nos hemos centrado en el control de la organización medio-lateral del sistema nervioso central en la planaria, donde Wnt5 y Slit juegan un papel esencial. Wnt5, Slit y sus receptores crean un sistema auto-regulativo para establecer el patrón medio-lateral en las planarias, el cual guía al SNC para ser posicionado en este eje.

[ES]El análisis de la cascada de señalizacion molecular activada por la morfina puede permitir el descubrimiento de nuevas dianas terapéuticas que puedan ser usadas para paliar los efectos derivados del uso de opioides, Los receptores opioides han sido ampliamente estudiados, y su regulación después de su activación podría explicar las bases moleculares de la adicción. De entre todos los cambios ejercidos tras la administración de morfina, los cambios en los niveles de expresión de algunos miRNAs podría explicar como se modifican la expresión de diversos genes tras la activación del receptor opioide mu. Por otra parte, la cascada de señalización Notch está envuelta en la proliferación y diferenciación celular. Estas dos cascadas pueden modular la diferenciación de neuronas dopaminérgicas, directamente relacionados con los centros nerviosos de recompensa y placer. Este trabajo ha demostrado un mecanismo de regulación entre la activación del receptor opioide mu por la morfina y el miRNA-212, que modula la expresión de este receptor. Por otra parte, el dominio intracelular de Notch (NICD) induce cambios en la expresión de este miRNA a través de la unión de la proteína CREB fosforilada (forma activa) a al promotor de ésta molécula. Del mismo modo, la morfina, a través de la proteína NF-kß induce cambios en la expresión del miR-29a, una molécula que es capaz de reducir la actividad de la vía Notch. De esta manera, podemos concluir que estas dos cascadas moleculares muestran una regulación recíproca, y que esta esta mediado por los dos miRNAs estudiados. Por otra parte, hemos demostrado que la vía opioide y la cascada de señalización Notch regulan la diferenciacion dopaminergica en células R1 ES de ratón, mediante la alteración en la expresión de diversos factores de transcripción tales como SIRT1, NGN2, FOXA2, PITX3, NURR1 o TH. Además, estos cambios fueron analizados durante en desarrollo de embriones de pez cebra. Por último, los cambios en los niveles de expresión de estas proteínas pueden explicar la diferencia en la susceptibilidad de estas neuronas al MPTP, una toxina empleada comúnmente como modelo farmacológico de Parkinson. Todos los resultados de esta tesis doctoral tienen como objetivo ampliar las bases moleculares que cursan con la aparición de la adicción, modulando tanto la actividad de la vía opioide como la diferenciación dopaminergíca. Estos resultados son de extremada importancia en la sociedad actual, debido a la problemática causada por el abuso de opioides, especialmente en estados unidos. Por otra parte, estos resultados pueden permitir el desarrollo de nuevas terapias de modulación de la expresión genica en el tratamiento de la enfermedad de Parkinson.

Tesis llevada a cabo para conseguir el grado de Doctor por la Universidad de Barcelona.--2017-09-14, [EN] During early development of bilaterian animals, specific body structures are formed and body axes are established. The establishment of body axes requires the precise and coordinated function of signalling pathways and transcription factors that induce changes at the level of genetic material. The formation of the dorsoventral (DV) axis in the early embryo of Drosophila melanogaster is controlled mainly by the nuclear factor Dorsal (Dl), which forms a ventral to dorsal gradient and both activates and represses genes along the presumptive DV axis. In this thesis we have focused on the transcriptional repression occuring during DV axis establishment. Through genetic and biochemical analysis we have dissected the function of an additional nuclear factor, Capicua (Cic) in the repression of Dl target genes. Cic had been previously suggested to be involved in the repression of Dl targets, however this possible function was obscured by its function in DV patterning during oogenesis. During oogenesis, Cic acts as a member of the signalling pathway that establishes the formation of the Dl gradient in the embryo, thus affects both Dl-dependent activation and repression. We have found that, independently of its function in the ovary, Cic is involved in repression occuring DV patterning of the embryo, and that these two functions are carried by distinct isoforms of the protein. The main embryonic isoform, which was previously characterized, participates in DV patterning of the embryo, while the function of oogenesis is exerted by a different, yet uncharacterized isoform. Repression of genes in the DV axis depends on short enhancer elements (VRE elements), that contain Dl binding sites and AT-rich sequences that highly resemble the consensus binding site for Cic in its other targets in the early embryo. We have detected a direct interaction between the embryonic Cic protein and the AT-rich sequences adjacent to the Dl binding sites in the VRE elements of two genes repressed by Dl: zerknüllt (zen) and tolloid (tld). This interaction is of low affinity and, as a consequence, depends on the presence of Dl in the nuclei. Therefore, repression occurs only in ventral regions, where both Cic and Dl are active, distinguishing repression of DV genes from other Cic targets. Furthermore, we have shown that Cic is the key factor for the recruitment of the Groucho (Gro) corepressor to the regulatory sequences of zen. Finally, we have shown that Cic acts as a sensor of the Torso RTK pathway during repression of genes along the DV axis., [ES] Durante el desarrollo temprano de los animales bilaterales se forman estructuras específicas y se establecen ejes corporales. El establecimiento de los ejes corporales requiere el funcionamiento preciso y coordinado de vías de señalización y factores de transcripción que producen cambios a nivel genético. En esta tesis, nos hemos centrado en la formación del eje dorsoventral (DV) en el embrión temprano de Drosophila melanogaster, que esta regulado mayoritariamente por el factor nuclear Dorsal (Dl). Nos hemos enfocado en la represión transcripcional que ocurre durante dicho proceso. Mediante análisis genéticos y bioquímicos hemos descrito el papel de otro factor nuclear, el represor Capicua (Cic) en la represión de genes dianas de Dl. Nuestro estudio demuestra una implicación directa de Cic en la represión de los genes diana de Dl. Hemos visto una unión directa de Cic en cis-elementos que están adjuntos a los sitios de unión de Dl en los promotores de los genes diana. La unión de Cic a estos sitios ocurre con baja afinidad y, como consecuencia, depende de la presencia de Dl en el núcleo. Además, hemos demostrado que Cic es el elemento clave para el reclutamiento del corepresor Groucho (Gro) a las secuencias reguladoras de los genes reprimidos en el eje DV. Por último, hemos visto que la regulación de Cic por la vía de señalización RTK Torso es el mecanismo principal de modulación de la represión de los genes diana de Dl en las extremidades del embrión

Programa de Doctorado en Biotecnología y Tecnología Química, La presente tesis se divide en dos capítulos relacionados entre sí. El nexo de unión o principio básico que se persigue en ambos estudios no es otro que el de ampliar el conocimiento sobre la coordinación entre los procesos de crecimiento y diferenciación de los tejidos para formar un órgano. En ambos casos se utiliza como modelo de estudio los tejidos que forman el sistema visual. En un primer capítulo se aborda el estudio de una red de regulación génica altamente conservada en el desarrollo del sistema visual desde invertebrados a vertebrados, conocida como ¿red de genes de especificación del ojo¿. Si bien se conoce cuan conservada está la red de genes de especificación del ojo, hasta ahora su estudio en Drosophila se ha centrado en su función durante el desarrollo de la retina. En Drosophila, la retina contiene únicamente los fotorreceptores y células accesorias, siendo las neuronas que procesan la información visual emplazadas en un órgano que recibe el nombre de globo óptico. Cada uno de los ojos compuestos o retinas es inervado por un globo óptico (¿Optic Lobes¿ OL) en estrecho contacto con el hemisferio cerebral, donde en última instancia se recibe la información visual. Cada OL está compuesto por diferentes ganglios, de interior a exterior son: el complejo de la lóbula, la médula y la lámina. Lámina y médula forman un anillo abierto en forma de herradura sobre el complejo de la lóbula. Si bien hay varios estudios sobre el desarrollo de la médula y la diferenciación de los neuroblastos para formar este ganglio, poco se sabe sobre el proceso de diferenciación de la lámina, a pesar de ser el primer centro neuronal con el que contactan los axones de los fotorreceptores. El ojo compuesto de Drosophila tiene 6 fotorreceptores externos y dos internos (7 y 8). De ellos, los 6 primeros inervan la lámina directamente y los otros dos atraviesan la lámina para llegar a la médula donde contactan con sus respectivas neuronas diana de forma estereotipada. En esta tesis, se ha hecho un estudio comparativo sobre el papel de la red de regulación génica que opera durante el desarrollo de la retina en Drosophila y también en el desarrollo de ojo de vertebrados, para ver analizar su relevancia durante el desarrollo de la lámina. Esta red de genes de especificación del ojo está compuesta por los genes Pax6>Eya=Six1/2>Dach. Así mismo otras vías de señalización importantes para el desarrollo del sistema visual fueron testadas por su relación con la anterior, como puedan ser las vías de señalización Hh/Shh, Dpp/BMP y Wg/Wnt. Como resultado de este estudio, encontramos muchas similitudes y también ciertas diferencias remarcables. Durante el desarrollo de la lámina, Eya y Six1/2 (en Drosophila sine culis, so) se regulan mutuamente, al igual que lo hacen durante el desarrollo de retina y a su vez activan la expresión de dac que es requerido junto a la vía Hh para la diferenciación de las neuronas de la lámina y para la activación de sim (single-minded). Este último, es esencial para la correcta organización de las neuronas en los correspondientes cartuchos o columnas que forman la lámina. Sin embargo, aún no hemos identificado qué determina la expresión de Eya y Six1/2, ya que sus activadores en retina, los genes Pax6, ey y toy no parecen afectar la expresión de estos dos genes en el desarrollo de la lámina. No obstante, ey parece tener un papel importante durante el desarrollo de la médula, pero no así durante la lámina. En líneas generales, el casete Eya/So/Dac juega un papel muy importante en la determinación y diferenciación de las células precursoras de la lámina, así como lo es para los fotorreceptores de la retina. Del mismo modo, otro gen bien conservado evolutivamente, Meis, conocido en Drosophila como homothorax (hth), tiene un patrón de expresión en los precursores de la lámina que recuerda a su expresión en la región proliferativa del primordio de ojo de Drosophila donde se encuentran las células precursoras de la retina en un estado proliferativo. Así, hth se expresa en las células proliferativas del neuroepitelio del OL, el cuál en su lado más lateral produce las células precursoras de la lámina, que ya presentan la expresión de Eya y So. Además, Hth y Eya/So se reprimen mutuamente para controlar la proliferación y diferenciación de los precursores de la lámina, manteniendo así el tamaño de este órgano en crecimiento durante los estadios larvarios. Con este trabajo hemos puesto de manifiesto las similitudes y diferencias en cuanto a las redes génicas necesarias para el desarrollo de la lámina en el OL en comparación con el desarrollo de la retina. No es de extrañar que encontremos tantas similitudes, pues se trata de dos estructuras íntimamente relacionadas durante el desarrollo y en cierta forma dependientes, teniendo así que sincronizar su diferenciación. Además, en vertebrados tanto los fotorreceptores como las neuronas que procesan la información visual, forman parte de la retina (multiestratificada) y el desarrollo de la retina al completo obedece a la misma red de genes de especificación del ojo. El Segundo capítulo de la tesis, se centra en el estudio de una única familia génica, Fezf, compuesta por dos genes en vertebrados Fezf1 y Fezf2 y en Drosophila por un sólo representante Dfezf. Se trata de una familia génica altamente conservada y cuyo estudio se ha centrado en el desarrollo de cerebro, revelando su importancia para el desarrollo de las subdivisiones del cerebro rostral. Son muchas las funciones que se les atribuyen a estos genes en el ámbito del desarrollo neuronal en el cerebro, siendo importantes en la diferenciación de diferentes tipos neuronales, como puedan ser las neuronas dopaminérgicas y serotoninérgicas. A pesar de todos los estudios funcionales llevados a cabo para esta familia génica, poco se sabe sobre su papel en el desarrollo del sistema visual de vertebrados. Sin embargo, en la base de datos de ZFIN encontramos que Fezf2 se expresa en la retina en desarrollo del pez cebra Danio rerio. En este capítulo se muestra la expresión del homólogo del gen Fezf2 de pez cebra durante el desarrollo de ojo en pollo y ratón, previo clonaje de estos genes. Por primera vez en pollo (Gallus gallus), clonamos el gen y mostramos su expresión en la retina en desarrollo. El patrón de expresión de Fezf2 en retina parece ser consistente entre las diferentes especies y proporciona información sobre su posible función durante el desarrollo de ojo. Recientemente, ha sido demostrado que Fezf2 es esencial para la correcta diferenciación de las células ganglionares de la retina en ratón (Chunsheng Qu et al., 2016). Con esta comparativa, además de mostrar la expresión de Fezf2 en la retina en desarrollo de tres especies de vertebrados, representantes de 3 taxa diferentes (mamíferos, teleósteos y aves) frecuentemente utilizados como modelos de estudio del desarrollo de ojo, mostramos algunos datos de interés sobre la expresión de Fezf2 en el cerebro adulto de ratón. Estos datos, junto con datos funcionales recogidos en la literatura, nos permiten sugerir que Fezf2 parece tener un papel genérico en cuanto a la diferenciación celular de precursores neuronales, independientemente del tejido neuronal de que se trate, siendo clave para mantener un estado intermedio de los precursores, en el que se inhibe la proliferación y la des-diferenciación y se asegura el paso hacia la diferenciación neuronal. También centrado en esta familia génica, mostramos en otro apartado de este capítulo, los resultados sobre la expresión del gen Dfezf durante el desarrollo embrionario de Drosophila, describiendo por primera vez su patrón de expresión. Usando la expresión relativa de Dfezf con respecto a los genes Irx, demostramos que Drosophila, no sólo tiene una estructura tripartita del cerebro, sino que la expresión de los genes anteriormente mencionados es limítrofe. Estos datos junto a la expresión relativa con respecto a otros marcadores de la organización tripartita del cerebro, permiten posicionar en el embrión de Drosophila la región homóloga a la Zona Limitans Intratalamica (ZLI) de vertebrados. Por tanto, la aparición de la ZLI, uno de los centros organizadores del cerebro de vertebrados, se remonta evolutivamente a un ancestro común entre protóstomos y deuteróstomos. Si bien, ambos genes Fezf resultan esenciales en el establecimiento de la ZLI del diencéfalo de vertebrados, y la represión recíproca entre los genes Fezf e Irx es esencial para la correcta formación de la ZLI, en Drosophila no encontramos alteración alguna del patrón de Dfezf en mutantes Irx, no pudiendo concluir si la función de estos genes está conservada evolutivamente. En este apartado describimos también por primera vez la expresión de Dfezf durante el estadio larvario L3 de Drosophila., Universidad Pablo de Olavide de Sevilla. Departamento de Biología Molecular e Ingeniería Bioquímica, Postprint

[spa] La vía Wnt canónica es una vía de señalización muy conservada a lo largo de la evolución de los animales. Esta vía controla múltiples procesos como es la especificación del eje anteroposterior o el destino celular durante el desarrollo embrionario y, la regeneración y la homeostasis del adulto. Además la incorrecta regulación de la vía provoca diferentes enfermedades y canceres. Es por eso que conocer los mecanismos molecular que controlan la vía Wnt canónica es de vital importancia. Las planarias son organismos con una extraordinaria capacidad regenerativa y homeostática que las convierte en excelentes modelos de estudio del establecimiento del eje anteroposterior y del destino de los diferentes tipos celulares que componen la planaria. En los últimos años se ha caracterizado que la función de la vía Wnt canónica en las planarias es especificar la identidad posterior. Sin embargo muchas cuestiones continúan sin resolverse como por ejemplo el mecanismo molecular por el cual se especifica el eje anteroposterior o si tiene alguna función mas como especificar la identidad de diferentes tipos celulares, como en otros organismos. En esta tesis doctoral hemos identificado que un gradiente de actividad βcatenina es el encargado de establecer las diferentes identidades de la planaria. Ademas hemos caracterizado otras funciones de la vía Wnt canónica en la especificación de algunos órganos como es el cerebro o los ojos. Finalmente, debido a que en planarias la βcatenina se ha duplicado y subfuncionalizado en 4 proteínas con funciones diferentes, hemos podido identificar un nuevo mecanismo de regulación nuclear. Este mecanismo consiste en la modulación de la βcatenina-1 (implicada en transcripción) por otra βcatenina (la βcatenina-4) por la unión al factor de transcripción TCF. Esta competición provoca la modulación adecuada de la vía canónica en el ojo de las planarias para su correcto desarrollo. Además, hemos demostrado in vitro que este nuevo mecanismo de regulación puede suponer un ejemplo de evolución convergente ya que otros organismos poseen una duplicación de βcatenina o una forma de splicing alternativo que pueden modular a la βcatenina implicado en transcripción., [cat] La via Wnt canònica es una via de senyalització molt conservada al llarg de l’evolució dels animals. Aquesta via controla múltiples processos com l’especificació de l’eix anteroposterior o el destí cel·lular durant el desenvolupament embrionari i, la regeneració i l’homeòstasi de l’adult. A mes, la incorrecta regulació de la via provoca diferents malalties i càncers. Es per això que conèixer els mecanismes moleculars que controlen la via Wnt canònica es de vital importància. Les planaries son organismes amb una extraordinària capacitat regenerativa i homeostàtica que les converteix en excel·lents models d’estudi de l’establiment de l’eix anteroposterior i del destí dels diferents tipus cel·lular que composen la planaria. S’ha demostrat que la funció de la via Wnt canònica a les planaries es especificar la identitat posterior. No obstant, moltes qüestions continuen sense resoldre’s com per exemple el mecanisme molecular pel qual s’especifica l’eix anteroposterior o si la via Wnt te alguna funció mes com especificar l’ identitat d’altres tipus cel·lulars, com a altres organismes. En aquesta tesi doctoral hem demostrat que un gradient d’activitat βcatenina es l’encarregat d’establir les diferents identitats de la planaria. A mes, hem caracteritzat altres funcions de la via Wnt canònica en l’especificació d'alguns òrgans com el cervell o els ulls. D’altra banda hem caracteritzat la dinàmica de βcatenina-1 durant l’embriogènesi de la planaria. Finalment, degut a que a les planaries, la βcatenina s’ha duplicat i subfuncionalitzat en 4 proteïnes diferents, hem pogut identificar un nou mecanisme de regulació nuclear. Aquest mecanisme consisteix en la modulació de la βcatenina-1 (implicada en transcripció) per una altra βcatenina (la βcatenina-4) a través de la competició per la unió al factor de transcripció TCF. Aquesta competició provoca la modulació adequada de la via canònica al ull de les planaries pel seu correcte desenvolupament. A mes a ames, hem demostrat in vitro que aquest nou mecanisme de regulació pot suposar un exemple d’evolució convergent ja que altres organismes posseeixen una duplicació de βcatenina o una forma de splicing alternatiu que pot modular a la βcatenina implicada en transcripció.

[cat] La formació d’un sistema nerviós fou una innovació clau en l’evolució dels animals que va permetre desenvolupar una comunicació ràpida i eficient entre les cèl·lules d’un organisme a mesura que n’augmentava la complexitat. Analitzar la neurogènesi embrionària en el major nombre possible d’organismes és, per tant, necessari per reconstruir quin fou el mode ancestral de neurogènesi als metazous. Recentment s’ha descrit que el procés de formació d’aquest sistema d’òrgans pot ser acotat a una sèrie de passos discrets que estan controlats per xarxes gèniques comunes entre organismes model ben establerts. En general, el primer pas d’aquest procés es caracteritza per la separació de l’ectoderma neurogènic i epitelial durant la gastrulació de l’embrió; posteriorment, l’ectoderma neurogènic, o neuroectoderma, es regionalitza en els diferents eixos de coordenades i s’amplifica en quant a nombre de cèl·lules, i, finalment, dona lloc al sistema nerviós. Als Spiralia, un dels dos principals clades d’animals protòstoms, els estudis sobre les qüestions relacionades amb aquests processos s’han centrat als mol·luscs i anèl·lids mentre que poc se sap de la resta de fílums. Així doncs, en aquesta tesi ens hem plantejat utilitzar la planària d’aigua dolça Schmidtea polychroa, un platihelmint amb un sistema nerviós morfològicament simple, per a caracteritzar l’organogènesi dels sistemes nerviosos central, perifèric, i visual, i, posteriorment, analitzar alguns dels mòduls conservats de la neurogènesi dels organismes bilaterals. La nostra estratègia s’ha basat en l’estudi del marcatge amb anticossos neurals i amb l’anàlisi de l’expressió de gens pan-neurals i de subpoblacions neuronals per proposar un model de desenvolupament del sistema nerviós durant l’embriogènesi d’aquella espècie. Els resultats d’aquesta tesi demostren l’origen de novo a l’estadi 4 i a partir d’una població de cèl·lules embrionàries determinades d’aquell sistema d’òrgans; posteriorment, aquestes cèl·lules conjunten en un primordi nerviós bilateral situat al futur pol ventral de l’embrió que serà l’origen d’estructures nervioses com el cervell o els cordons nerviosos laterals i ventrals. A més, també hem determinat la dinàmica temporal i espaial de desenvolupament dels ulls durant l’embriogènesi més tardana; en concret, aquests òrgans es formen a la part més anterior de l’organisme i des d’una cèl·lula precursora comuna que, més tard, es separarà en els primordis de l’ull dret i esquerra. Finalment, hem aïllat i caracteritzat gens ortòlegs del grup soxB i un conjunt de membres dels bHLH proneurals, que són famílies gèniques amb un paper ben establert en la determinació de l’ectoderma neurogènic i l’especificació neuronal, així com també de gens associats amb la diferenciació dels ulls, com ara els membres de la xarxa gènica controlada per pax6 i també altres factors de transcripció com rx, otxA o atonal. L’anàlisi molecular d’aquests mostra, per una banda, que un ortòleg de la família soxB1 es detecta en el presumptiu neuroectoderma de l’embrió i en cèl·lules progenitores neuronals, mentre que els gens de les famílies soxB2, achaete-scute, neuroD i beta3, així com alguns dels gens relacionats amb el desenvolupament dels ulls, estan associats amb l’especificació de poblacions neuronals. En conjunt, els nostres resultats suggereixen que els principals mecanismes moleculars de control de la neurogènesi es troben substancialment conservats als tríclads, tot i que aquests animals mostren un patró embrionari que divergeix clarament de l’ancestral de la resta d’organismes espirals. En resum, la nostra tesi expandeix la comprensió actual de la neurogènesi dels animals bilaterals i, alhora, proporciona un marc bàsic per a futurs estudis sobre el desenvolupament embrionari de les planàries., [eng] The development of a nervous system is a key innovation in the evolution of metazoans, which is illustrated by the presence of a common developmental toolkit for the formation of this organ system. Neurogenesis in the Spiralia, and in particular the Platyhelminthes, is, however, poorly understood when compared with other animal groups. In this thesis we used the planarian Schmidtea polychroa, a free-living flatworm with a morphologically simple nervous system, as a model organism for studying the organogenesis of the central, peripheral and visual nervous systems. Using a combination of immunolabelling and gene expression analysis of neural-specific markers we show that the nervous system is formed de novo from a population of embryonic cells when the embryo adopts the definitive axial identities. Later on, these cells aggregate in a bilateral neural primordium which differentiates the brain, and the ventral and lateral nerve cords. Also, during this late embryonic phase, the eyes develop in the anterior-most part of the organism from a shared precursor. To further understand the early steps of neurogenesis, we isolate and characterize soxB and a set of bHLH genes, which are gene families with a well-established role in metazoan neural development, and genes associated with the specification of eye cell types -in particular, the pax6-gene network and transcription factors of the otx and rx families. Thus, we demonstrate that soxB1-1 is expressed in the putative neuroectoderm and neural progenitor cells, whereas soxB2, neural bHLH genes (achaete-scute, neuroD and beta3), and the eye-related genes so, eya and otxA are associated with the specification of neural subpopulations. Altogether, our findings suggest that the ancestral neural-specific gene regulatory network is substantially conserved in triclad, despite exhibiting a divergent mode of development. In summary, this thesis expands the current understanding of bilaterian neurogenesis and provides a basic framework for further studies in planarian embryonic development., [spa] La formación de un sistema nervioso fue una innovación clave en la evolución de los animales que permitió desarrollar una comunicación rápida y eficiente entre las células de un organismo a medida que aumentaba la complejidad. Analizar la neurogénesis embrionaria en el mayor número posible de organismos es, por lo tanta, necessario para reconstruir cual fue el modo ancestral de neurogénesis de los metazoos. Recientemente se ha descrito que ese proceso puede ser definido con un conjunto de pasos o etapas que están controlados por redes génicas comunes entre organismos modelo bien establecidos. En general, el primer paso de la neurogénesis implica la separación del ectodermo neurogénico y epitelial durante la gastrulación del embrión; posteriormente, el ectodermo neurogènico, o neuroectodermo, se regionaliza en los principales ejes de coordenadas y se amplifica en cuanto a número de células y, finalmente, da lugar a las células nerviosas. En los organismos del grupo de los Spiralia, uno de los dos principales clados de protóstomos, los estudios sobre temas relacionados con esas etapas se han centrado en los moluscos y anélidos mientras que poco se sabe del resto de filos del grupo. Así pues, en esta tesis doctoral nos hemos planteado utilizar la planaria de agua dulce Schmidtea polychroa, un platihelminto con un sistema nervioso morfológicamente simple, para caracterizar la organogénesis de los sistemas nerviosos central, periférico, y visual, y, posteriormente, analizar algunos de los módulos conservados de la neurogénesis de los organismos bilaterals. Inicialmente nuestra estrategia se basó en el estudio del marcaje con anticuerpos específicos neurales y con el análisis de la expresión de genes pan-neurales y de subpoblaciones neuronales para proponer un modelo de desarrollo del sistema nervioso durante la embriogénesis de esta especie. Los resultados de nuestra tesis demuestran el origen de novo en el estadio 4 y a partir de una población de células embrionarias determinadas del sistema nerviosos definitivo; más tarde, estas células se condensan en un primordio nervioso bilateral situado en el futuro polo ventral del embrión que será el origen de estructuras como el cerebro o los cordones laterales y ventrales. Además, también hemos determinado la dinámica temporal y espacial de desarrollo de los ojos durante las etapas más tardías de la embriogénesis: estos órganos se forman en la parte más anterior del embrión y a partir de unas células precursoras comunes que se separarán en los primordios de los ojos derecho e izquierdo. Por último, hemos aislado y caracterizado genes ortólogos del grupo soxB y un conjunto de miembros de los bHLH proneurales, que son familias génicas con un papel bien establecido en la determinación del ectodermo neurogénico y la especificación neuronal, y también de genes asociados con la diferenciación de los ojos, como por ejemplo los miembros de red génica controlada por pax6 y también otros factores de transcripción como rx, otx o atonal. Su análisis molecular muestra que un ortólogo del grupo soxB1 se detecta en el putativo neuroectodermo del embrión y en células progenitoras neuronales de S. polychroa, mientras que los genes de los grupos soxB2, achaete-scute, neuroD y beta3, así como algunos genes relacionados con el desarrollo de los ojos, están asociados con la especificación de diferentes poblaciones neuronales. En conjunto, nuestros datos sugieren que, a pesar de que los tríclados muestran un patrón de desarrollo del zigoto que difiere claramente del patrón típico de la segmentación espiral, los principales mecanismos moleculares de control de la neurogénesis se encuentran conservados en su grupo. En resumen, nuestra tesis doctoral expande la comprensión sobre el desarrollo del sistema nerviosos de los bilaterales a la vez que proporciona un marco básico para futuros estudios con embriones de planarias.

La gran mayoría de planarias son capaces de regenerar, y cuando lo hacen, invariablemente mantienen la polaridad de regeneración; es decir, siempre regeneran una cabeza en las heridas anteriores y una cola en las posteriores al ser amputadas transversalmente. Entender los mecanismos que subyacen dicho fenómeno ha sido objeto de investigación desde finales del siglo XIX. Asimismo, muchos investigadores se han interesado en comprender como una planaria mantiene las proporciones corporales durante la homeostasis, ya que estos organismos experimentan cambios continuos de tamaño. Con la ayuda del genoma secuenciado de la planaria de agua dulce Schmidtea mediterranea y de varios métodos de análisis genéticos (ARN de interferencia, inmunohistoquímica, etc), en esta tesis doctoral he abordado estas cuestiones desde una perspectiva molecular. En concreto, he caracterizado el papel de la vía Wnt/βcatenina en la regeneración y homeostasis del eje antero-posterior (AP) de la planaria S. mediterranea; puesto que durante el desarrollo embrionario de la mayoría de animales estudiados, así como durante la regeneración de cnidarios, esta vía establece el eje primario del cuerpo. Con el fin de analizar las consecuencias de una perdida de función de la vía Wnt/βcatenina en planarias, durante el primer tramo de la tesis doctoral he caracterizado dos parálogos de la βcatenina (Smed-βcatenina-1 y Smed-βcatenina-2). La βcatenina es una proteína típicamente bifuncional implicada en transducir la señal Wnt al núcleo y en mediar las uniones adherentes a la membrana celular. Sin embargo, el análisis de las secuencias aminoacídicas de Smed-βcatenina-1 y Smed-βcatenina-2, junto con los experimentos de ARNi en planarias y de sobreexpresión heteróloga en embriones de Xenopus, sugieren que los dos parálogos de S. mediterránea se han subfuncionalizado en dos proteínas monofuncionales que retienen solo una de estas dos funciones características. Notablemente, Smed- βcatenina-1, pero no la Smed- βcatenina-2, tiene conservada la función de transducir la señal Wnt y su pérdida de función en planarias resulta en la regeneración de una cabeza en vez de una cola (fenotipo two-headed) y en una anteriorización progresiva durante la homeostasis. En el segundo tramo de la tesis doctoral he analizado las consecuencias de una activación ectópica de la vía Wnt/βcatenina en planarias. A tal fin, he caracterizado dos parálogos de la Axina (Smed-axinA y Smed-axinB), puesto que este componente de la vía Wnt es un regulador negativo intracelular muy conservado a lo largo de la filogenia animal. Los experimentos de ARNi simple o conjunta sugieren que Smed-axinA y Smed-axinB actúan de manera sinérgica en planarias regulando negativamente la Smed-βcatenina-1. Así, la pérdida de función de ambas axinas resulta en un fenotipo two-tailed y el triple ARNi contra las axinas y Smed-βcatenina-1 resulta en un fenotipo two-headed. De manera interesante, la formación de una cola ectópica en heridas anteriores no inhibe la regeneración inicial del cerebro en la interfase blastema-postblastema; es más, muchos de los heteromorfos two-tailed con el transcurso del tiempo diferencian otro primordio de cerebro justo al lado de la faringe normal. En conjunto, los datos obtenidos en esta tesis demuestran que la vía Wnt/βcatenina es esencial para restablecer y mantener todas las estructuras del eje AP durante el desarrollo post-embrionario de la planaria S. mediterranea. Además, ponen de manifiesto que en un contexto posteriorizado, existen mecanismos que siguen instruyendo la diferenciación de un primordio de cerebro en el tejido preexistente de manera auto-reguladora. Estos resultados han sido publicados en dos revistas de impacto internacional (Iglesias et al., Development 2008; Iglesias et al., Developmental Biology 2011) contribuyendo significativamente al campo de la regeneración y al de la biología del desarrollo en general., The main objective of my thesis has been to characterize the role of Wnt/βcatenin pathway in anterior-posterior (AP) axis re-establishment and maintenance during planarian regeneration and tissue homeostasis. To address this issue, I characterized two βcatenin homologs in the planarian Schmidtea mediterranea, Smed-βcatenin-1 and Smed-βcatenin-2. Loss of function of Smed-βcatenin-1, but not Smed-βcatenin-2, in both regenerating and intact planarians, generates two-headed planarians that evolve to a radial-like hypercephalized phenotype in which the AP axis disappears but the DV axis remains unaffected. This anteriorized phenotype supports a conserved role for canonical Wnt signalling in AP axis specification, whereas the role of βcatenin in DV axis establishment would be a vertebrate innovation. When considered alongside the protein domains present in each Smed-βcatenin and the results of functional assays in Xenopus embryos demonstrating nuclear accumulation and axis induction with Smed-βcatenin-1, but not Smed-βcatenin-2, these data suggest that Smed-βcatenins could be functionally specialized and that only Smed-βcatenin-1 is involved in Wnt signalling (Iglesias et al. 2008). In a second set of experiments, I showed that 2-tailed planarians formed after loss-of-function of Smed-axinA/B (well known negative regulators of the Wnt/βcatenin signalling) but form a brain anlage at their anterior wound site. This shows that mechanisms underlying early brain regeneration can be uncoupled from the re-establishment of AP identity mediated by Wnt/βcatenin pathway in planarians. Interestingly, these brain primordia do not grow and develop into a well-elaborated brain illustrating a specific role of the Wnt/βcatenin pathway in later brain morphogenesis. The two-tailed phenotype eventually differentiate another brain primordia next to the normal pharynx and forms two opposed body axes composed of tail, pharynx and brain primordium tissues as a remodelling response (Iglesias et al. 2011). Taken together, these data shows that Wnt/βcatenin pathway is essential to re-establish and maintain the AP axis during planarian post-embryonic development.

233 p., La ruta de inducción temprana (o ruta UDA) transduce señales ambientales específicas e induce el desarrollo asexual del hongo filamentoso Aspergillus nidulans. FlbB es un factor de trancripción (FT) UDA que se localiza en la punta y el núcleo más apical de las hifas vegetativas, las células colonizadoras. Esta tesis doctoral se ha centrado en el estudio de su tranporte desde la punta al núcleo y su actividad transcripcional allí. La acumulación nuclear de FlbB está mediada por una señal de localización nuclear. También es importante la actividad de FlbD, otro FT de la ruta UDA cuya deleción deriva en la ausencia de acumulación nuclear de FlbB mientras que su sobreexpresión parece aumentarla. En el núcleo, FlbB activa la expresión de flbD y ambos FFTT inducen la expresión del primer regulador específico de la conidiación, brlA. La comparación de los transcriptomas de la cepa flbB y una cepa silvestre isogénica, sin embargo, relacionan la actividad FlbB también con la expresión del cluster metabólico dba, responsable de la síntesis de un compuesto con actividad antibacteriana, y con la activación de un probable FT necesario para reprimir el desarrollo sexual. Los resultados presentados, por lo tanto, extienden el conocimiento sobre los mecanismos de transporte basipetal de FlbB y el control de la expresión génica que ejerce.

Texto completo descargado en Teseo Las cianobacterias conforman un grupo de microorganismos caracterizados por un modo de vida fotoautotrófico en el que evolucionó la fotosíntesis oxigénica. Actualmente, las cianobacterias son importantes productores primarios en los océanos, y por tanto juegan un papel crucial en los ciclos biogeoquímicos del carbono y del nitrógeno en nuestro planeta. Algunas cianobacterias son capaces de desarrollar complejos procesos de diferenciación celular para adaptarse a los cambios que se producen en su ambiente. La diferenciación celular es un proceso por el que una célula se especializa, adquiriendo capacidad de desarrollar ciertas funciones y dejando de desarrollar otras. Estos procesos de diferenciación celular son parte esencial de los procesos de desarrollo que se producen en organismos multicelulares; en este sentido, algunas cianobacterias constituyen un modelo simple, ideal para estudiar los mecanismos moleculares que gobiernan estos procesos. Entre los procesos de diferenciación de cianobacterias, merecen una especial atención la diferenciación de unas células especializadas en la fijación del nitrógeno atmosférico, denominadas heterocistos, que se produce como respuesta a la deficiencia de nitrógeno combinado en algunas cianobacterias filamentosas (Wolk et al., 1994; Flores y Herrero, 2010). En las estirpes de Anabaena y Nostoc, los heterocistos se diferencian a intervalos semi regulares a lo largo del filamento, conformando una auténtica bacteria multicelular, con diferentes tipos de células especializadas en distintas tareas nutricionales, que intercambian nutrientes y reguladores y contribuyen al crecimiento del filamento como un organismo unitario (Flores y Herrero, 2010). La diferenciación de heterocistos a partir de células vegetativas conllevan unos drásticos cambios morfológicos y metabólicos, que están sustentados en un programa específico de expresión génica. Un componente crucial de este programa es una secuencia temporal de eventos de activación que permiten la expresión de algunos genes estructurales y reguladores específicos de los heterocistos. Dos reguladores tienen papeles clave en la activación de la transcripción durante la diferenciación: el factor de transcripción global NtcA y el factor específico de la diferenciación HetR. NtcA pertenece a la familia de los reguladores transcripcionales bacterianos tipo CRP (proteína receptora de AMP cíclico), que activa, y en algunos casos reprime, genes en respuesta a la limitación de nitrógeno. NtcA se une al DNA en sitios de secuencia específica conteniendo el consenso GTAN8TAC que está presente en los promotores regulados. La unión de NtcA al DNA se incrementa por la interacción con 2 oxoglutarato (2-OG), una señal metabólica de la deficiencia de nitrógeno. Aunque se sabe que HetR tiene cierta capacidad de interacción con el DNA in vitro, uniéndose por delante de algunos promotores regulados, todavía no se ha determinado una secuencia consenso precisa para su unión en estos promotores, y se desconoce el mecanismo exacto por el cual influye en la expresión génica durante el proceso de diferenciación de heterocistos. Una característica reseñable de algunos promotores caracterizados, que están involucrados en la diferenciación y función de los heterocistos es que poseen regiones promotoras complejas con múltiples promotores. Éstos incluyen promotores consenso activados por NtcA (los cuales no requieren HetR), promotores consenso tipo sigma 70, y un tipo especial de promotores que dependen in vivo de NtcA y HetR pero que no muestran ninguna característica reconocible, tan solo en algunos casos una posible caja -10. La expresión de estos promotores dependientes de HetR tiene lugar exclusivamente en las células que se están diferenciando, jugando un importante papel en la activación de genes específicos del proceso de diferenciación. El objetivo principal que nos planteamos al comienzo de este trabajo fue el estudio de los diferentes mecanismos de activación transcripcional que operan durante la diferenciación de los heterocistos de las cianobacterias.

Discovering the master genes necessary to build the eye in an invertebrate model such as S. mediterranea could help us to understand numerous retinopathies and age-related degeneration of the human eye. The aim of this study was to select and determine the functional activity of genes involved in the regeneration and development of the S. mediterranea eye. Gene ontology was the tool used to select the genes; while RNA interference and RNA hybridization provided the first approach towards establishing possible roles in the eye development process. From 45 genes studied, silencing of five opsins, Smed-rhodopsin1, Smed-rhodopsin2, Smed-rhodopsin10, Smed-melanopsin2 and Smed-melanopsin3; four transcription factors, Smed-exd (-pbx), Smed-hox2, Smed-mitf2 and Smed-mitf3; and two ABC transporters, Smed-white and Smed-mrp1-2, specifically inhibited normal eye regeneration in S. mediterranea. This suggested they are relevant for or involved in phototransduction, eye pigment biosynthesis, photoreceptor microtubule transport or eye developmental processes. Smed-melanopsin2 and Smed-melanopsin3 RNAi affected the regeneration of pigment cells and skin pigmentation. Smed-melanopsin3 RNAi produced misrouted photoreceptor axonal fibres and fused pigment cups. 13 out of the 14 opsin or light sensor genes studied had ubiquitous mRNA expression throughout the body, which might be explained by the presence of a dermal light sense, as observed in other flatworms. These proteins might serve as photoentrainment regulators or as photolyases responsible for the repair of photodamaged DNA. Smed-hox1 RNAi inhibited the proper development of anterior structures. Smed-VATP synthase, Smed-kinase, Smed-dye and Smed-centrin transiently inhibited eye regeneration before the inhibition of whole body regeneration. This was followed by death, which might indicate the existence of a photoreceptor ATP synthesis and microvilli transport specificity; or also the importance of these genes in cell survival. Smed-peropsin1, Smed-yy1, Smed-hmt, Smed-tpr1, Smed-tpr2, Smed-kinase, Smed-mrp1-2 and Smed-hox1 have eye expression patterns. Additionally, Smed-hox1 and Smed-mrp1-2 also present inhibition of anterior structures. Smed-white RNAi produced hypopigmented, fused eye cups and photoreceptor cell size reduction. This was probably induced via the damaged pigment cells, due to the dependence between these two cell types. Smed-melanopsin1, Smed-ver and Smed-hox2 have brain lobes-like expression patterns. These RNA sequences might be signalling neuronal cells. Smed-tpr1 mRNA injection induced rapid pharynx autotomy, also provoked by Smed-ver and Smed-white-sf2. All three are melanin biosynthesis-related genes. This ejection suggests the existence of an additional natural mechanism of tissue release, probably provoked for the action of a small amino acid. For the first time, the rabdomeres of the Schmidtea mediterranea eye have been photographed using electron microscopy. These structures are very similar to their homologues in other flatworms., El objetivo de este estudio ha sido encontrar genes implicados en la regeneración y por consiguiente en el desarrollo de los ojos de S. mediterranea. Para ello se han usado herramientas informáticas de selección de genes homólogos de otras especies, la interferencia con RNA mensajero y la hibridación in situ de mRNA. De los 45 genes estudiados, el RNAi de cinco opsinas Smed-rhodopsin1, Smed-rhodopsin2, Smed-rhodopsin10, Smed-melanopsin2 y Smed-melanopsin3; cuatro factores de transcripción Smed-exd (-pbx), Smed-hox2, Smed-mitf2 y Smed-mitf3; junto con dos transportadores ABC Smed-white y Smed-mrp1-2, inhiben la regeneración normal de los ojos de S. mediterranea. Aunque ninguno de estos genes se expresa en los ojos, la expresión ubicua del mRNA de las opsinas por todo el cuerpo de la planaria podría indicar la presencia de un sentido fotodermal previamente observado en otras planarias. Los mRNA de los genes Smed-peropsin1, Smed-yy1, Smed-hmt, Smed-tpr1, Smed-tpr2, Smed-kinase, Smed-hox1 y Smed-mrp1-2 se expresan en los ojos. La interferencia con RNA de los tres últimos provoca inhibición de las estructuras anteriores. Los genes Smed-kinase, Smed-VATP synthase, Smed-dye y Smed-centrin inhiben la regeneración de los ojos antes de provocar una destrucción celular masiva que desemboca en la muerte del animal. El RNAi de los genes Smed-white, Smed-melanopsin2 y Smed-melanopsin3 afecta a la pigmentación de la piel y en Smed-melanopsin3, además, a las rutas que los axones de los fotoreceptores siguen hasta llegar a los ganglios cerebrales. En los RNAi de Smed-white las células pigmentarias no desaparecen pero cambian de posición, se fusionan en el centro de la cabeza. Smed-melanopsin1, Smed-ver y Smed-hox2 tienen patrones de expresión parecidos a los ganglios cerebrales. RNAi de tres genes implicados con la biosíntesis de pigmentos, Smed-tpr1, Smed-ver y Smed-white-sf2, inducen la autotomía de la faringe. Efecto que sugiere la existencia de un mecanismo natural de expulsión de este órgano. Por primera vez los rabdómeros del ojo de Schmidtea mediterranea han sido fotografiados con microscopía electrónica, siendo éstos similares a los de otras planarias.

Texto completo descargado desde Teseo Anabaena sp. PCC 7120 es una cianobacteria multicelular capaz de producir dos tipos celulares diferentes cuando el ambiente lo propicia. En condiciones de bajo nivel de nitrógeno combinado, algunas células se diferencian a heterocistos, que están especializados en la fijación del nitrógeno molecular. Esta diferenciación sigue un patrón definido por el cual sólo una de cada 10 células se diferencia, lo cual requiere una regulación compleja en la que están involucradas más de 30 proteínas reguladoras. En esta tesis se han estudiado 6 de ellas, intentando obtener una visión global de sus relaciones durante el proceso de diferenciación. La proteína HetR está considerada el principal regulador de la diferenciación, siendo un factor de transcripción que se pensaba funcionaba en los primeros momentos del proceso. Aquí hemos demostrado que la proteína HetR ejerce su regulación desde antes de que el ambiente cambie. También se han estudiado los reguladores negativos del proceso, PatS y HetN. Se ha demostrado la función de cada aminoácido del péptido PatS, así como su procesamiento y posterior exporte y la concreta localización de HetN en los polos de los heterocistos. Por otro lado, se ha estudiado la proteína HetC, que ejerce un papel positivo en el desarrollo de los heterocistos y su relación con sus vecinos genómicos, HetP y Asr2819, también relacionados positivamente con la diferenciación de los heterocistos.

La presente tesis comprende una revisión del desarrollo de Rhodnius prolixus (Stähl, 1859); anotación de genes del desarrollo temprano y estudios de expresión y funcionales de dos de esos genes. El objetivo general ha sido aportar datos que contribuyan a establecer redes génicas como blanco de la evolución de la forma en los insectos. Los objetivos específicos fueron: Identificar y anotar en el genoma de R.prolixus genes ortólogos a los genes HOX de Drosophila melanogaster (Meigen, 1830); caracterizar el cluster HOX y determinar la función de genes HOX mediante genómica funcional. Se identificaron 70 genes, la mayoría de ellos correspondientes al grupo de TF con homeobox. Se analizaron, curaron y anotaron 26 secuencias; incluyendo a los ocho HOX canónicos. Se logró demostrar que los genes HOX de R.prolixus están agrupados en un cluster y se plantean cinco agrupamientos probables. Los ensayos funcionales se realizaron usando un gen HOX ‒scr‒ y un activador HOX ‒caudal‒ involucrado en el establecimiento del eje anteroposterior. Para ello, se pusieron a punto las técnicas de hibridación in situ de embriones completos ‒WMISH‒ y de ARNi parental. La expresión de scr mostró un patrón acorde a lo esperado en relación a las observaciones hechas en otros insectos. La ARNi mostró variantes en comparación con especies relacionadas, pero se ajusta muy bien a lo esperado. La expresión de caudal muestra las siguientes similitudes con respecto a otras especies estudiadas: (1) actúa tempranamente como gen de efecto materno, (2) se expresa en la región posterior del huevo en estado de blastodermo, (3) los efectos de la ARNi son semejantes a los encontrados en otros insectos de banda germinal corta. Sin embargo, en estados de banda germinal, los resultados de expresión difieren respecto a otras observaciones, esto puede estar en relación con mecanismos de sañalización aún no descriptos para este gen., This thesis deals with the embryology of Rhodnius prolixus (Stähl, 1859), the establishment of functional techniques in this new developmental model (whole mount in situ hybridization ‒WMISH‒ and parental RNAi), the annotation of early developmental genes, and the functional assay for two of those genes, Sex combs-reduced (Rp-Scr) and caudal (Rp-cad). The aim of the investigation is to contribute to define and understand the basic components of developmental genetic networks that are target of evolutionary processes that shape insect morphology. The goals are to indentify and annotate orthologs to the HOX genes of Drosophila melanogaster (Meigen, 1830) in the R .prolixus genome, characterize the HOX cluster and determine the HOX function in R. prolixus by means of functional genomics. Seventy genes were identified, mostly homeobox-containing transcription factors. Twentysix sequences were analysed in detail, cured and annotated, including the eight canonical HOX. The results showed that the HOX genes of R. prolixus are clustered and five plausible organizations were proposed. The functional assays were performed by using the HOX gene Rp-Scr and the activator Rp-cad , involved in the anteroposterior axis patterning. Rp-Scr expression was similar to other insects. Rp-Scr RNAi showed some variants compared to related species, but it was in agreement with its known function, which was relevant to validate the techniques developed. Rp-cad expression showed that (1) it function early as a maternal gene, (2) it is expressed in the posterior of the egg in blastoderm stage, (3) the RNAi effects shows a posterior-to-anterio effect. In the germband stage, the expression suggests a long distance signalling mechanism at work., Facultad de Ciencias Naturales y Museo

[spa] En el reino animal hay numerosos ejemplos de sistemas de órganos tubulares, como los pulmones y el sistema vascular de los mamíferos. En este estudio hemos usado el sistema traqueal de Drosophila melanogaster para estudiar el desarrollo de este tipo de órganos. En particular, nos centramos en los pliegues taenidiales, estructuras de quitina que rodean el lumen tubular y dan resistencia mecánica a los tubos traqueales. Formados por la secreción de quitina en la matriz extracelular apical, estos pliegues se extienden más allá de los límites de una sola célula, abarcando múltiples células. Esto implica un alto nivel de coordinación intra e intercelular. Hay una serie de genes cuya ausencia produce perturbaciones en los pliegues taenidiales. De éstos, nuestro estudio se centra en Blimp-1 y pri. En ausencia de cada uno de estos genes, los pliegues taenidiales no se desarrollan correctamente mientras que otros aspectos del desarrollo traqueal no se ven demasiado afectados. Hemos analizado el patrón de expresión de Blimp-1 y pri, y hemos encontrado que ambos genes se expresan en las células traqueales de Drosophila durante el desarrollo embrionario. Los pliegues taenidiales todavía se forman en ausencia de Blimp-1 o pri, pero no están organizados correctamente, lo que indica que Blimp-1 y pri contribuyen a su adecuada formación. Existen varios sistemas en Drosophila en que estructuras de actina contribuyen a la organización de la quitina, como los dentículos de la epidermis y el lumen el sistema traqueal. En los mutantes Blimp-1, no se forman los anillos de actina apical, que si que lo hacen en los mutantes pri pero con una mala orientacion, lo que indica que la función de Blimp-1 y pri se requiere para el ensamblaje de la F-actina. Por otra parte, nuestros resultados indican que perturbar la síntesis de quitina o su organización, desorganiza la F-actina apical que no forma haces. Por lo tanto, durante el desarrollo del sistema traqueal se establece una interacción mútua entre la organización de la F-actina y de las estructuras de quitina. Mediante la expresión de la forma silvestre del gen en una sola célula en un fondo mutante, hemos estudiado cómo las células individuales contribuyen a generar una estructura supra-celular. Los resultados de nuestro análisis revelan que la orientación de los pliegues taenidiales no es regulada de manera autónoma y que depende en gran medida de los pliegues taenidiales formados por las células vecinas. Por último, mostramos que perturbar las uniones entre células, a través de la reducción de los niveles de α-catenina, da lugar a que las células traqueales formen su pliegues taenidiales de forma independiente a sus vecinas., [eng] Examples of tubular organ systems like the mammalian lungs and vascular system abound in the animal kingdom. In this study we used the Drosophila melanogaster tracheal system to study tubular organ development. In particular, we focused on taenidial folds, chitin structures surrounding the tubular lumen that give mechanical strength to the tracheal tubes. Formed by the secretion of chitin into the apical extracellular matrix, these folds extend beyond the limits of a single cell spanning through multiple cells. This implies a high level of intra and intercellular coordination. There are a number of genes in the absence of which taenidial folds are disturbed. Among these, we focused on Blimp-1 and pri. In the absence of each of these genes, taenidial folds are disrupted while other aspects of tracheal development are unaffected. We have analyzed the expression pattern of Blimp-1 and pri and found that both genes are expressed in Drosophila tracheal cells during embryonic development. Taenidial folds are still formed in the absence of Blimp-1 or pri but they are not organized correctly, thereby indicating that Blimp-1 and pri contribute to their proper formation. Actin structures contributing to chitin organization have been reported for many systems in Drosophila, like denticle belts at the epidermis and the lumenal structure in the tracheal system. In Blimp-1 mutants, apical actin rings fail to form whereas in pri mutants they are formed but misoriented, suggesting that the function of Blimp-1 and pri is required for F-actin assembly. Interestingly, when we impair either chitin synthesis or chitin organization the apical F-actin is disorganized and does not form bundles. For the first time, we show that during tracheal system development there is a crosstalk between F-actin organization and chitin structures. By rescuing the mutant phenotype in single cells, we studied how individual cells contribute to generate a supra-cellular structure. Results of our analysis reveal that the orientation of taenidial folds is not cell-autonomously regulated and that it depends highly on the taenidial folds formed by the neighboring cells. Finally, we show that impairing cell-cell junctions, via down-regulation of α-catenin, gives rise to tracheal cells that form their taenidial folds independently.

[cat] La morfogènesi dels organismes multicel·lulars depèn de la coordinació de varies vies moleculars capaces de controlar i coordinar diverses característiques cel·lulars com ara la seva proliferació, diferenciació, morfologia i migració. En particular, la migració i el guiatge cel·lulars són dos processos essencials durant la morfogènesi que requereixen una coordinació temporal i espacial molt precisa per a que las cèl·lules puguin establir connexions a llargues distàncies. Conèixer la seva regulació és crucial per entendre el desenvolupament normal dels organismes multicel·lulars i els processos de carcinogènesi. La morfogènesi del sistema traqueal i del sistema nerviós de Drosophila melanogaster són models àmpliament utilitzats per estudiar la migració i el guiatge cel·lular en la morfogènesi. Es va procedir a l’anàlisi d’una col·lecció de mutants embrionaris identificats pels seus fenotips en el sistema nerviós a fi de detectar fenotips traqueals. Un d’aquests mutants es va mapejar com un al·lel de patched (ptc), receptor de la via de senyalització de Hedgehog (Hh), i hem analitzat la contribució d’aquest en el sistema traqueal, i en particular, la seva implicació durant la migració i el guiatge cel·lular. En concret, l’objectiu del nostre estudi va ser el fet que en els embrions mutants de ptc, les branques ganglionars (BGs) no estenen fins arribar al sistema nerviós central, tal i com passa en els embrions wt. Vam detectar que el nombre de cèl·lules que constitueix l’arbre traqueal en els mutants de ptc és un 35% menor que en els embrions wt, fet que no és degut a apoptosi, ja que no hem detectat activitat de la caspasa, i el fet de tenir menys cèl·lules tampoc és el causant de la falta de migració de les BGs. El fenotip traqueal dels embrions de ptc ja és visible a estadis primerencs de l’embriogènesi, com 12 i 13, en els que les BGs comencen a mostrar defectes de migració/extensió, i mostren un nombre més elevat de cèl·lules positives per DSRF (factor de transcripció que s’expressa en les cèl·lules terminals), en comparació amb els embrions wt. L’activació o la inactivació de la via de senyalització de Hh només en les cèl·lules de la tràquea, ja sigui utilitzant formes actives o inactives, no mostra cap fenotip, la qual cosa suggereix un requeriment no-autònom de les cèl·lules de la tràquea pel que fa la via de senyalització de Hh. A més, la sobreexpressió de Hh en la regió embriònica ventral, reprodueix el fenotip de la migració/extensió de les BGs. Per aquesta raó, vam analitzar l’expressió de branchless (bnl), el lligand de la via de FGF, en mutants embrionaris de ptc, on la migració no té lloc correctament. A través d’anàlisis d’hibridacions in situ i de quantificacions amb la RT-PCR, vam poder detectar nivells més alts d’expressió de bnl en embrions mutants de ptc en comparació amb el wt. En paral·lel al projecte de Ptc en el sistema traqueal, com que ja havíem observat alguns fenotips en el sistema nerviós, vam decidir analitzar més curosament les observacions que havíem fet en la sobreexpressió de Hh en la línia mitjana. És sabut que en vertebrats, el morfogen Shh actua com un quimioatraient d’axons que col·labora amb la Netrin-1 pel guiatge d’aquests en la placa del terra. Nosaltres hem pogut demostrar que en Drosophila es produeix el mateix efecte, ja que si sobreexpressem el morfogen tant en la línia mitjana utilitzant sim o fora de la línia mitjana utilitzant Apterous (Apt) com a driver, es confirma l’efecte de Hh com a molècula de guiatge axonal., [eng] We have analysed the tracheal phenotype of patched (ptc) mutant embryos to clarify the involvement of Ptc in tracheal development, in particular its role in cell migration and pathfinding. One of the main points of interest is the fact that in ptc mutants the ganglionic branches (GB) do not invade the ventral nerve cord as they do in the wild-type (wt). We found that the number of cells that constitute the tracheal tree in the mutant is slightly lower than in wt but these changes in cell number are not due to apoptosis, as we cannot detect any additional caspase activity in mutant embryos, and, in addition, these lower numbers of cells are not sufficient to prevent the extension of the GBs. The ptc tracheal phenotype is already visible by stage 12 and 13 of embryogenesis when the GBs start showing defects in migration/extension, and show higher number of DSRF positive cells, compared to the wt. Embryonic Ptc protein expression and activation or inactivation of the Hh pathway in tracheal cells alone, either using active or inactive forms, does not show a phenotype, suggesting a non-autonomous requirement for the Hh pathway in tracheal cells. In addition, overexpression of Hh in the embryonic ventral region, phenocopies the GB migration/extension phenotype. For these reasons, we have analysed the expression of Branchless (Bnl), the FGF ligand, in ptc mutant embryos, where migration is not properly occurring. By using in situ hybridisation and RT-PCR we have found that wt and ptc mutants show different levels of bnl expression, these being higher in ptc mutants than in wt embryos. In parallel of the Ptc project in the tracheal system, and since we already knew and have observed some phenotypes in the nervous system, we decided to further analyse some observations we have done while overexpressing Hh in the midline. It is reported that in vertebrates the morphogen Sonic Hedgehog acts as an axon chemoattractant that collaborates with Netrin-1 in midline axon guidance at the level of the floor plate. We have been able to demonstrate that the same is occurring in Drosophila. We could see the same effect while overexpressing the morphogen outside the midline using Apterous (Apt) as a driver, confirming the effect of Hh as a guidance molecule

Programa de Doctorado en Biotecnología y Tecnología Química, Esta tesis se ha centrado en el estudio del papel de las moléculas de adhesión integrinas en la morfogénesis de epitelios. En concreto, ha analizado la función de las integrinas en tres procesos: supervivencia celular, diferenciación y proliferación. Para ello se ha utilizado la mosca Drosophila melanogaster como sistema modelo Para el estudio de la función de integrinas en supervivencia celular, elegimos el disco de ala como modelo de estudio. Nuestros resultados muestran que las integrinas son esenciales para el mantenimiento de supervivencia celular en el ala, a través de la inhibición tanto de JNK como de Hid. Además, hemos encontrado una interaccion genética con el factor de crecimiento EGF, que también tiene un papel esencial en supervivencia celular. Encontramos también que otras moléculas de los complejos focales, como Talin, Paxilli, Src y Shc, tienen un papel esencial en mantenimiento de la supervivencia celular. Por otro lado, hemos empleado el epitelio folicular del ovario como modelo para estudiar el papel de integrinas en regulación de proliferación y diferenciación de dichas células. En este caso, hemos descubierto que las integrinas son esenciales para la salida de ciclo y entrada en diferenciación de las células foliculares. Para ello, las integrinas regulan negativamente proteínas de ciclo mitótico, como CiclinaB, Dacapo y Cut. Además, se encontró que las integrinas desempeñan esta función a traves de la modulación positiva de la ruta de Notch y que también la ruta de Hippo está positivamente regulada por las integrinas., Universidad Pablo de Olavide de Sevilla. Departamento de Biología Molecular e Ingeniería Bioquímica, Postprint

[spa] Las señales receptor tirosina kinasa (RTK) controlan un amplio abanico de decisiones durante el desarrollo de un animal, como la proliferación celular, diferenciación, morfogénesis y supervivencia. Muchas de estas señales se transducen a través de la cascada de Ras-MAPK que en última instancia fosforilan un factor de transcripción regulando la expresión de distintos genes. Los mecanismos moleculares por los que la señalización por RTKs inducen repuestas tan diversas permanecen aún sin esclarecer. Los efectores de la vía más estudiados en Drosophila son Pointed y Yan donde en ausencia de señalización, los genes diana se mantienen reprimidos por Yan, mientras que la actividad de la vía fosforila Pointed y Yan, resultando en la activación transcripcional a través de la asociación de Pointed al ADN. Estudios más recientes han mostrado que otro de los factores fosforilado por la vía es Capicua (Cic). Cic es un represor materno que es fosforilado por la MAPK y esta fosforilación dirige la desactivación de la proteína. En este trabajo, hemos mostrado que las secuencias de unión a Cic en sus genes diana representan un mecanismo general de interpretación de la señal por Ras-MAPK. Hemos descrito el mecanismo por el que la vía de Torso regula los genes huckebein (hkb) y tailless (tll) a través de la desactivación de Cic en los polos del embrión en el estadio de blastodermo sincitial. La expresión restringida de tll y hkb a los polos del embrión por la proteína Cic, permite la expresión de genes del tronco para la correcta segmentación del eje A/P del animal. Además, hemos definido una nueva diana de Cic en el eje dorsoventral (D/V) del embrión, intermediate neuroblast defective (ind), que alberga la función de diferenciar la células que dan lugar a los neuroblastos intermedios del sistema nervioso central. Experimentos adicionales nos han permitido describir el mecanismo por el que Cic regula el gen argos en repuesta a la señalización por EGFR, en el disco imaginal de ala. En este contexto, al contrario que en los casos del embrión, la desactivación de la proteína Cic en respuesta a la vía de EGFR no es el único mecanismo por el que se induce el gen diana. Trabajos posteriores tendrán que explicar esta red de regulaciones más compleja. Además de la identificación de la secuencia de unión de Cic a los elementos reguladores de sus genes diana, hemos estudiado el papel del correpresor Groucho (Gro) en la regulación de hkb. Trabajos anteriores habían implicado a Gro en la regulación de los genes hkb y tll ya que embriones mutantes para gro muestran un patrón expandido de estos genes terminales. Este patrón, es muy similar al que se observa en embriones mutantes cic por lo que se ha sugerido que Gro podría actuar junto a Cic para la regulación de hkb y tll. Nosotros hemos podido demostrar que los lugares de unión de Cic en el enhancer de hkb son importantes para reclutar Gro al ADN. Este resultado nos indica que Gro está actuando a través de Cic para mediar la represión y no a través de otro factor que también pudiera regular la expresión de hkb. La señalización por EGFR en las células dorsoanteriores del ovario está implicada en el establecimiento del eje D/V a través de la represión del gen pipe (pip) en esta región. Nosotros hemos podido demostrar que esta regulación ocurre de manera análoga a la del embrión. Cic reprime los represores inducidos por la vía de señalización, Tll y Mirror (Mirr) en el embrión y ovario respectivamente, para posibilitar la expresión de sus genes diana, Kruppel (Kr) y pip, y así determinar las regiones que les corresponden como el tronco en el embrión y la región ventral en el ovario. Por otro lado hemos descrito un nuevo mecanismo por el que los substratos de la MAPK compiten entre ellos por la fosforilación por debajo de la vía de Torso. Así, hemos explicado la razón por la que aún habiendo más MAPK fosforilada en el polo anterior del embrión, existe una menor desactivación de Cic y cómo este efecto puede afectar la regulación de los genes diana., [eng] "The function of Capicua repressor in the interpretation of RTK-Ras-MAPK signaling in Drosophila". Receptor tyrosine kinase (RTK) signaling pathways control multiple decisions during Drosophila development such as proliferation, differentiation, morphogenesis, and survival. Many RTKs signal through the very well conserved Ras-MAPK cassette that ultimately phosphorylate a nuclear factor altering the transcriptional output in many different contexts. The molecular mechanisms that lead to so many different outputs are still under study. In this work we have analyzed the molecular mechanism by which Capicua (Cic), a recently described downstream repressor of the pathway, regulates gene expression in different contexts. We found that the Cic binding sites represent a general mechanism of Ras-MAPK signaling interpretation. Cic is downregulated in the cells with active signaling pathway alleviating the repression on its target genes. In the cells with no active signaling, Cic is repressing its targets localizing their expression to restricted patterns. We showed that Cic regulates huckebein (hkb) and tailless (tll) expression at the poles of the blastoderm embryo allowing a correct A/P axis formation. hkb regulation by Cic requires the association to the global co-repressor Gro. We also found that Cic regulates intermediate neuroblast defective (ind) gene in the D/V axis of the embryo for the intermediate neuroblast formation and it regulates argos (aos) gene expression in the wing imaginal disc for a stereotyped wing vein pattern formation. We also showed that the mechanism by which the EGFR signaling pathway restricts pipe (pip) expression to the ventral follicle cells of the ovary is analogous to that occurring in the embryo: Cic restricts mirr expression to the cells with active EGFR signaling in the dorsoanterior follicle cells to allow the expression of its target, pip, in the ventral region. Finally, we also showed a novel mechanism by which MAPK substrates compete for the phosphorylation, and this mechanism explains why in the anterior pole of the embryo, containing higher concentration of phosphorylated MAPK, Cic protein concentration is higher.

El gineceo es, probablemente, el órgano más complejo de la planta, dado que está formado por muchos tipos celulares y tejidos diferentes; además tiene un papel fundamental, ya que está implicado en la recepción y germinación del polen, asegurando la fertilización de los óvulos, y el desarrollo del fruto y las semillas. Muchos genes están implicados en la diferenciación de los tejidos del gineceo de Arabidopsis thaliana, entre ellos, los genes NGATHA (NGA) y HECATE (HEC). Los genes NGA codifican factores de transcripción de tipo B3 implicados en el desarrollo del estilo (Álvarez et al., 2009; Trigueros et al., 2009), mientras que los genes HEC son factores de transcripción de tipo bHLH que cooperan junto con otros genes en el control del desarrollo del gineceo de Arabidopsis thaliana. (Gremski et al., 2007). En nuestro laboratorio, hemos observado que las líneas de sobreexpresión de HEC1, HEC3 y NGA3, presentan fenotipos similares. Los frutos de estas líneas tienen ovarios reducidos, regiones apicales aumentadas y ginóforos largos, fenotipos similares a los de mutantes afectados en la señalización de auxinas. En este trabajo se pretende determinar la relación funcional entre NGATHA y HECATE; y aportar datos sobre su modo de acción durante la morfogénesis del gineceo. Mediante análisis genético hemos determinado que los mutantes hec suprimen el fenotipo de sobreexpresión de NGA3, sugiriendo una relación entre ambos. Hemos determinado el patrón de expresión de los genes HEC en fondos con la función de NGA alterada, y en un ensayo de BiFC hemos observado que ambas proteínas interaccionan. Los resultados obtenidos indican que la relación entre NGA y HEC es compleja, y harían falta más pruebas para concluir su naturaleza concreta.