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Somatic embryogenesis (SE) is a propagation tool of particular interest for accelerating the deployment of new high-performance planting stock in multivarietal forestry. However, genetic conformity in in vitro propagated plants should be assessed as early as possible, especially in long-living trees such as conifers. The main objective of this work was to study such conformity based on genetic stability at simple sequence repeat (SSR) loci during somatic embryogenesis in maritime pine (Pinus pinaster Ait.). Embryogenic cell lines (ECLs) subjected to tissue proliferation during 6, 14 or 22 months, as well as emblings regenerated from several ECLs, were analyzed. Genetic variation at seven SSR loci was detected in ECLs under proliferation conditions for all time points, and in 5 out of 52 emblings recovered from somatic embryos. Three of these five emblings showed an abnormal phenotype consisting mainly of plagiotropism and loss of apical dominance. Despite the variation found in somatic embryogenesis-derived plant material, no correlation was established between genetic stability at the analyzed loci and abnormal embling phenotype, present in 64% of the emblings. The use of microsatellites in this work was efficient for monitoring mutation events during the somatic embryogenesis in P. pinaster. These molecular markers should be useful in the implementation of new breeding and deployment strategies for improved trees using SE.

Doutoramento em Biologia Slash Pine (Pinus elliottii var. elliottii) and the hybrid (Pinus elliottii var. elliottii x Pinus caribaea var. hondurensis) have a great economic value due to their high growth ratio and resin production. Therefore, it is important to achieve a strategy to propagate this species and the hybrid more rapidly maintaining their characteristics. This project aims to preserve/enlarge the Pinus germplasm collection, provided by the company KLÓN, Innovative Technologies from Cloning, by micropropagation and cryopreservation techniques and analyze the putative changes (genetic stability) in micropropagated plants by flow cytometry, to study plant survival rates, growth and photosynthetic performance after acclimatization. In Chapter I, general aspects of the species and hybrid under study are presented, as well as a brief description of the breeding programs in Pinus spp. and the contribution that innovative techniques of in vitro propagation can give, leading to decades of anticipation on the breeding programs results. It was also described some major aspects to the different micropropagation and cryopreservation techniques, always presenting a review of current knowledge on the use of these techniques in the genus Pinus. Finally, the research objectives of this thesis are presented. Chapter II is dedicated to the application of a micropropagation protocol by proliferation of axillary shoots in the specie Pinus elliottii var. elliottii. This Chapter was divided in two sections. In section II.1 a protocol was optimized for large-scale P. elliottii micropropagation, which describes all the steps from disinfection and seed germination to the production of seedlings in vitro, which were used as explants for shoot induction. Various conditions for induction, shoot elongation and rooting were tested, and a protocol enabling the production of micropropagated plantlets 20 to 22 weeks after germination in vitro has been established. In section II.2 was performed the genetic and physiological characterization of P.elliottii plants micropropagated by the methodology developed in the previous section, in comparison with seedlings. The physiological performance of the plants was evaluated by determination of various parameters associated with photosynthesis and carbon metabolism, such as: chlorophyll a fluorescence; relative water content; gas exchange; pigment and carbohydrate contents. In turn, the genetic characterization was performed by analysis by flow cytometry of putative alterations in DNA content, ploidy level and in cell cycle dynamics. The results indicate that the developed micropropagation protocol for P. elliottii did not induce significative changes, both at physiological and genetic level, in the plants. Chapter III focuses on the optimization of a somatic embryogenesis process for the hybrid Pinus elliottii var. elliottii x Pinus caribaea var. hondurensis, from the initiation to the plants regeneration produced from somatic embryos. For initiation of embryogenic cultures of this hybrid, immature megagametophytes obtained from five open-pollinated plus trees were used as explants. To optimize the process, the effect of genotype in both the initiation and maturation, as the influence of different formulations of basal media and growth regulators in the various stages of the process were evaluated. Throughout the process was assessed the genetic stability of embryogenic masses with different time in culture, and at the end of the produced emblings, in comparison with the mother-trees needles. This protocol allows the production of emblings from somatic embryos not having been detected variability in the DNA content and ploidy level. Chapter IV is dedicated to the preservation of germplasm bank produced for the hybrid under study. Cryopreservation of embryogenic masses is beneficial not only for the preservation of germplasm during the breeding programs development, as well as to avoid the loss of the potential of the embryogenic masses. For the optimization of an embryogenic masses cryopreservation protocol using the slow freezing method, different variations were tested in pretreatments and in the duration of slow freezing step. Pretreatments to which the embryogenic tissue was subjected, did not compromise the maturation capacity of cryopreserved masses. On the contrary, cryopreservation had in some genotypes a beneficial effect. The optimized protocol allowed the regeneration of plants from cryopreserved masses and the process did not induce major genetic changes (embryogenic masses cryo and non cryopreserved were analyzed by flow cytometric). Finally, Chapter V presents the final conclusions of this PhD thesis, gathering the results of this thesis on the propagation and preservation methodologies for the species and hybrid in study and discussion this contribution to the state of art in this field. Future challenges for further research in these areas are presented in this Chapter. Pinus elliottii var. elliottii e o híbrido, Pinus elliottii var. elliottii x Pinus caribaea var. hondurensis, têm um grande valor económico, devido à sua elevada taxa de crescimento e produção de resina. Surge assim a necessidade de desenvolver estratégias de propagação mais eficientes desta espécie e do híbrido, mantendo as suas características. Este estudo tem como objetivos preservar / aumentar o banco de germoplasma de Pinus, fornecido pela empresa KLÓN, Innovative Technologies from Cloning, utilizando técnicas de micropropagação e de criopreservação, analisar possíveis alterações na estabilidade genética das plantas micropropagadas através de citometria de fluxo, estudar a taxa de sobrevivência de plantas, crescimento e desempenho fotossintético após aclimatização. No Capítulo I foram abordados aspetos gerais da espécie e híbrido em estudo, assim como uma breve descrição dos programas de melhoramento em Pinus spp. e da contribuição que técnicas inovadoras de propagação in vitro podem dar levando a décadas de antecipação dos resultados dos respectivos programas de melhoramento. Foram também descritos alguns aspetos mais importantes relativos às diferentes técnicas de micropropagação e criopreservação existentes, apresentando sempre uma revisão do conhecimento atual sobre o uso destas técnicas no género Pinus. Para finalizar este capítulo, os objetivos de investigação desta Tese são apresentados. O Capítulo II é dedicado à aplicação de uma metodologia de micropropagação (por proliferação de rebentos axilares) da espécie Pinus elliottii var. elliottii. Este capítulo foi dividido em duas secções. Na secção II.1 foi otimizado um protocolo para micropropagação em larga escala de P. elliottii desde a desinfecção e germinação de sementes para a produção de plântulas in vitro. Estas por sua vez são utilizadas como explantes para a indução de rebentos. Foram testadas várias condições para a indução, alongamento e enraizamento de rebentos, tendo sido estabelecido um protocolo que permite a produção de plântulas micropropagadas 20 a 22 semanas após germinação in vitro. Na secção II.2 foi realizada a caracterização genética e fisiológica de plantas de P. elliottii micropropagadas pela metodologia desenvolvida na secção anterior, em comparação com plantas provenientes de sementeira. O desempenho fisiológico das plantas foi avaliado pela determinação de diversos parâmetros relacionados com a fotossíntese e o metabolismo de carbono, tais como a fluorescência de clorofila a, o teor relativo em água, as trocas gasosas, o teor de pigmentos e de carbohidratos. Por sua vez a caracterização genética foi realizada pela análise do conteúdo em DNA e nível de ploidia, e ainda as dinâmicas do ciclo célular, com recurso à citometria de fluxo. Os resultados obtidos indicam que o protocolo de micropropagação desenvolvido para P. elliottii não provoca alterações significativas tanto a nível fisiológico como genético nas plantas. O Capítulo III centra-se na otimização de um processo de embriogénese somática para o híbrido Pinus elliottii var. elliottii x Pinus caribaea var. hondurensis, desde a iniciação até à regeneração de plantas produzidas a partir de embriões somáticos. Para a iniciação de culturas embriogénicas deste híbrido foram utilizados como explantes megagametófitos imaturos obtidos a partir de polinização aberta de cinco árvores plus. Para a otimização do processo foi avaliado o efeito do genótipo tanto na iniciação como na maturação, tal como o influência de diferentes formulações de meios basais e reguladores de crescimento nas diversas fases do processo. Ao longo do processo foi avaliada a estabilidade genética das massas embriogénicas com diferentes tempos de cultura, e no final das plântulas produzidas, em comparação com as agulhas das árvores-mãe, concluindo-se que foi desenvolvido um protocolo que permite a produção de plantas provenientes de embriões somáticos não tendo sido detectada variabilidade ao nível de conteúdo em DNA e nível de ploidia. O Capítulo IV é dedicado à preservação do banco de germoplasma produzido para o híbrido em estudo. A criopreservação de massas embriogénicas é benéfica não só para a preservação de germoplasma durante o desenvolvimento de programas de melhoramento, como para evitar a perda do potencial embriogénico das massas. Para a otimização de um protocolo de criopreservação de massas embriogénicas pelo método de congelamento lento, foram testadas diferentes variações nos pré-tratamentos e na duração do passo de congelação lenta. Os pré-tratamentos a que o tecido embriogénico foi submetido não influenciaram negativamente a capacidade de maturação das massas criopreservadas, apresentando-se a criopreservação até em alguns genótipos com um efeito benéfico. O protocolo otimizado permitiu a regeneração de plantas a partir de massas criopreservadas, para as quais se comprovou que o processo não provocou alterações genéticas, através da análise por citometria de fluxo de massas embriogénicas crio e não criopreservadas. Finalmente, no Capítulo V são apresentadas as conclusões finais da Tese de Doutoramento, onde são realçados os avanços realizados como resultado desta tese nas metodologias de propagação e preservação para a espécie e híbrido em estudo. Neste capítulo são também apresentados os desafios futuros para a continuação da investigação nas áreas de propagação e preservação de Pinus.

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