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Doutoramento em Bioquímica Submitted by Alexandra Bastos (alexandrabastos@ua.pt) on 2014-04-02T14:34:14Z No. of bitstreams: 1 tese.pdf: 46121867 bytes, checksum: 8e0af40ba816ecacc14ca0a1747e3221 (MD5) Made available in DSpace on 2014-04-02T14:34:14Z (GMT). No. of bitstreams: 1 tese.pdf: 46121867 bytes, checksum: 8e0af40ba816ecacc14ca0a1747e3221 (MD5) Previous issue date: 2013

Doutoramento em Bioquímica Both skeletal and cardiac muscles daily burn tremendous amounts of ATP to meet the energy requirements for contraction. So, it is not surprising that the maintenance of mitochondrial morphology, number, distribution and functionality in striated muscle are important for muscle homeostasis. In these tissues mitochondria present the added dimension of two populations, the intermyofibrillar (IMF) and the subsarcolemmal (SS) mitochondria, being IMF the most abundant one. In the present thesis, the molecular mechanisms harboured in mitochondria of striated muscles were studied using animal models, to better comprehend the role of mitochondrial plasticity in several pathophysiological conditions such as aging, diabetes mellitus and bladder cancer. The comparative analysis of IMF and SS populations isolated from heart evidenced a higher respiratory chain activity of mitochondria interspersed in the contractile apparatus. The higher susceptible of SS respiratory chain complexes subunits to carbonylation, but not to nitration, seems to justify the lower respiratory chain activity observed in this mitochondrial population. Our results showed that in heart from aged mice there is an accumulation of dysfunctional mitochondria. The age-related decrease of oxidative phosphorylation activity seems to be justified, at least partially, by the increased proneness of mitochondrial proteins as OXPHOS subunits and MnSOD to oxidative modifications. Moreover, a sedentary lifestyle seems to worsen the functional consequences of aging in heart by increasing mitochondrial proteins susceptibility to nitration. In skeletal muscle from rats with type 1 diabetes mellitus induced by streptozotocin administration, we verified the accumulation of dysfunctional mitochondria due, at least in part, to the impairment of PQC system. Indeed, the decreased activity of AAA proteases was accompanied by the accumulation of oxidatively modified mitochondrial proteins with impact in respiratory chain activity. The diminishing of mitochondria activity also underlies cancer-induced muscle wasting. Indeed, using a rat model of chemically induced urothelial carcinoma we verified that the loss of gastrocnemius mass was related to mitochondrial dysfunction due to, at least partially, the down-regulation of PQC system involving the mitochondrial proteases paraplegin and Lon. PQC impairment resulted in the accumulation of oxidatively modified mitochondrial proteins. In overall, regardless the pathophysiological stimuli that promote mitochondrial alterations, there are similarities in the pattern of disease-related mitochondrial plasticity. The diminished capacity for ATP production in striated muscle seems to be due to increased oxidative damage of mitochondrial proteins, namely subunits of respiratory chain complexes, metabolic proteins and MnSOD. Our data highlighted, for the first time, the impact of mitochondrial PQC system impairment in the accumulation of oxidized proteins, exacerbating the dysfunction of this organelle in striated muscle in several pathophysiological conditions. O músculo-esquelético e o músculo cardíaco consomem diariamente grandes quantidades de ATP para a contração, pelo que não é de surpreender que a morfologia, a distribuição e a funcionalidade mitocondrial sejam importantes para a manutenção da sua homeostasia. Mais ainda, o músculo estriado apresenta duas populações de mitocôndrias, as intermiofibrilares (IMF), presentes em maior quantidade, e as subsarcolemais (SS). Na presente tese foram estudados, utilizando modelos animais, os mecanismos moleculares localizados na mitocôndria do músculo estriado para melhor compreender o papel da plasticidade mitocondrial em resposta a várias condições patofisiológicas nomeadamente o envelhecimento, a diabetes mellitus e o cancro. A análise bioquímica das populações de mitocôndrias isoladas do coração evidenciou uma maior atividade da cadeia respiratória nas mitocondriais IMF em comparação com as SS. A maior suscetibilidade das subunidades dos complexos da cadeia respiratória das mitocôndrias SS à carbonilação, mas não à nitração, parece justificar a menor atividade da cadeia respiratória observada nesta população de mitocôndrias. No estudo da adaptação mitocondrial ao envelhecimento verificou-se a acumulação de mitocôndrias disfuncionais no coração. A diminuição da atividade da cadeia respiratória parece ser justificada, pelo menos em parte, pelo aumento da suscetibilidade de proteínas mitocondriais a modificações oxidativas. Adicionalmente verificou-se que um estilo de vida sedentário tem um impacto negativo na funcionalidade mitocondrial do coração de animais idosos. No músculo-esquelético de animais com diabetes mellitus tipo 1 induzida pela administração de streptozotocina, verificou-se uma acumulação de mitocôndrias disfuncionais devido, pelo menos em parte, ao comprometimento do sistema de controlo de qualidade proteica mitocondrial. Efetivamente, a diminuição da atividade e da expressão de proteases AAA foi acompanhada pela acumulação de proteínas mitocondriais oxidadas. No músculo-esquelético de animais com caquexia associada ao carcinoma urotelial também se verificou a ocorrência de disfunção mitocondrial associada ao comprometimento do sistema de controlo de qualidade proteica, envolvendo as proteases mitocondriais paraplegina e Lon, com consequente acumulação de proteínas mitocondriais oxidadas. A disfunção mitocondrial observada no músculo gastrocnemius de animais com cancro ocorreu em paralelo com o aumento do catabolismo muscular e consequente perda de massa corporal. No global, os resultados sugerem que independentemente do estímulo patofisiológico que promove uma resposta adaptativa da mitocôndria no músculo estriado existem semelhanças no padrão de plasticidade mitocondrial. A redução da capacidade de produção de ATP parece ser devida ao aumento dos danos oxidativos das proteínas mitocondriais, nomeadamente das subunidades dos complexos da cadeia respiratória, de proteínas metabólicas e da MnSOD com consequente comprometimento das vias moleculares em que estão envolvidas. Os nossos resultados evidenciaram, pela primeira vez, a contribuição da disfunção do sistema de controlo de qualidade proteica mitocondrial para a acumulação de proteínas oxidadas e, consequentemente, para a disfunção mitocondrial.

Mestrado em Métodos Biomoleculares Os mecanismos celulares e bioquímicos subjacentes à disfunção cardíaca associada ao envelhecimento encontram-se pouco esclarecidos e, menos compreendido é o papel do estilo de vida neste processo. No sentido de avaliar a influência do estilo de vida ao longo da vida na potencial perda de funcionalidade das proteínas cardíacas, em particular do citocromo c, utilizaram-se ratinhos C57BL/6 machos que foram sujeitos a um protocolo experimental para simular o envelhecimento sedentário e activo. Os animais foram depois sacrificados, isolaram-se as mitocôndrias do coração e procedeu-se à análise de vários parâmetros bioquímicos com o intuito de (i) avaliar a funcionalidade da cadeia respiratória mitocondrial, (ii) identificar as proteínas susceptíveis à carbonilação e/ou nitração, (iii) caracterizar as PTMs do citocromo c de coração. Os resultados obtidos sugerem a existência de uma relação entre a perda de funcionalidade mitocondrial associada ao envelhecimento e o aumento do teor de proteínas carboniladas e/ou nitradas. Como proteínas alvo destas modificações pós-traducionais (PTMs) foram identificadas várias subunidades dos complexos da fosforilação oxidativa. Pela sua importância neste sistema metabólico, analisou-se mais exaustivamente a susceptibilidade do citocromo c a PTMs resultantes de processos oxidativos e de que forma o estilo de vida regula este processo. Apesar de se ter verificado um aumento da expressão do citocromo c com o envelhecimento, o número e o tipo de PTMs identificadas por LC-MS/MS não seguiu a mesma tendência. Efectivamente, identificou-se um maior número de PTMs no citocromo c do homogeneizado total dos ratinhos jovens (12 PTMs) do que nos ratinhos velhos. Considerando o efeito do estilo de vida, verificou-se a existência nos animais activos de um maior número de resíduos de aminoácidos modificados (10 PTMs) do que nos sedentários (6 PTMs). Curiosamente, a oxidação da Met65 foi a única modificação oxidativa identificada no citocromo c da fracção mitocondrial, tendo sido observada nos ratinhos velhos sedentários. ABSTRACT: Cellular and biochemical mechanisms underlying the age-related cardiac dysfunction are not fully understood and, even less clarified is the influence of lifestyle in this process. In order to evaluate the role of lifelong lifestyle in the mitochondrial plasticity and in the potential functionality loss of cardiac proteins, in particular cytochrome c, to post-translational modifications (PTMs), C57BL/6 male mice were subjected to an experimental protocol simulating sedentary and active aging. After animal sacrifice, mitochondria from cardiac muscle were isolated and several biochemical parameters were measured (i) to evaluate the mitochondrial respiratory chain functionality, (ii) to identify the susceptible proteins to carbonylation and/or nitration, (iii) to characterize the PTMs of cardiac cytochrome c. The results suggest a link between the age-related decrease in mitochondrial functionality and the higher susceptibility of cardiac muscle proteins to oxidative damage. Indeed, we observed a significant increase in the content of carbonylated and/or nitrated proteins in old mice, being the oxidative phosphorylation subunits the most affected. Given the importance of cytochrome c as the final mobile electron carrier in this metabolic process, its susceptibility to PTMs induced by oxidative stress was characterized more exhaustively. Despite the age-induced upregulation of cytochrome c, the number of oxidative PTMs identified by LC-MS/MS was not increased. Indeed, a higher number of PTMs was identified in citochrome c from young mice total homogenate (12 PTMs) compared to old mice. Regarding the effect of lifestyle, old active mice presented more PTMs (10 PTMs) than their sedentary counterparts (6 PTMs). Interestingly, the Met65 oxidation was the only PTM identified in mitochondrial cytochrome c and only in old sedentary mice.

Mestrado em Bioquímica - Bioquímica Clínica A caquexia associada ao cancro é uma síndrome multifatorial que representa um grande desafio em oncologia clínica. Esta síndrome é caracterizada por uma perda de peso significativa, principalmente devido ao catabolismo acentuado na massa muscular esquelética e, por isso, tem um impacto negativo na qualidade de vida, na tolerância à terapêutica e no tempo de sobrevivência dos pacientes. A disfunção mitocondrial tem sido sugerida como um evento precoce associado à atrofia muscular induzida pelo cancro. Mais especificamente, o comprometimento do turnover mitocondrial (biogénese, dinâmica e mitofagia), a diminuição da síntese de ATP, aumento do stresse oxidativo e um aumento da suscetibilidade à apoptose parecem mediar a disfunção contrátil e o catabolismo muscular subjacentes à caquexia associada ao cancro. O exercício físico tem vindo a ser estudado como uma abordagem terapêutica, devido aos seus efeitos potencialmente benéficos advindos da adaptação mitocondrial e muscular na caquexia associada ao cancro. No sentido de averiguar o efeito do cancro e do exercício físico terapêutico na adaptação muscular esquelética, foi usado um modelo animal de carcinoma urotelial induzido por exposição a BBN e submetido a 13 semanas de corrida em tapete rolante após o diagnóstico. Constatou-se um decréscimo do peso corporal nos animais expostos a BBN, indicativo de caquexia. Paralelamente, ocorreu uma diminuiçao da área da secção transversal do músculo gastrocnemius e aumento de fibrose intersticial, sugestivos de um perfil inflamatório generalizado e catabolismo muscular, atenuados com a prática de exercício físico. Para além disso, o carcinoma urotelial promoveu a disfunção mitocondrial ao nível do sistema de fosforilação oxidativa, diminuindo a expressão de subunidades dos complexos I e II da OXPHOS e a capacidade de síntese de ATP. Verificou-se de igual modo um comprometimento da biogénese mitocondrial, traduzida por uma redução nos níveis de PGC-1α e Tfam, sem impacto na (auto)mitofagia. O exercício físico realizado após o diagnóstico promoveu o restabelecimento da síntese de ATP e da expressão de subunidades dos complexos I e II da OXPHOS, para além de aumentar os marcadores da biogénese mitocondrial (incluindo a Sirt3), assim como da mitofagia (com envolvimento da Bnip3). Os resultados obtidos indicam que a prática de exercício físico após o diagnóstico promove uma remodelação benéfica ao nível do músculo gastrocnemius por regular a plasticidade mitocondrial nos animais com caquexia associada ao cancro. Deste modo, evidências obtidas no presente estudo suportam a recomendação da prática de exercício físico a pacientes oncológicos. Cancer cachexia is a multifactorial syndrome that presents a great challenge in clinical oncology. This syndrome is characterized by significant weight loss, mainly due to severe skeletal muscle wasting, which has a negative impact on quality of life, tolerance to treatment and life expectancy of patients. Mitochondrial dysfunction has been suggested as an early event associated with cancer induced muscle atrophy. Specifically, impaired mitochondrial turnover (biogenesis, dynamics and mitophagy), reduced ATP synthesis, higher levels of oxidative stress and higher susceptibility to apoptosis seem to compromise muscle contraction and promote catabolism associated with cancer cachexia. Recently, exercise training has been studied as a therapeutic approach due to its potentially beneficial effects in mitochondrial and muscle adaptation in cancer cachexia. In order to determine the impact of cancer and exercise training in skeletal muscle adaptation, an animal model of bladder cancer induced by exposure to BBN was submitted to 13 weeks of treadmill running after the establishment of the disease. Bladder cancer alone promoted a decrease in total body weight, suggesting the presence of cachexia. At the same time, a reduction in the cross sectional area of gastrocnemius muscle and an increase in interstitial fibrosis were noticed, suggesting an inflammatory profile and catabolism, which were attenuated by exercise training. Moreover, bladder cancer compromised oxidative phosphorylation in muscle mitochondria, reducing the levels of complex I and II OXPHOS subunits and causing impaired ATP synthesis. Mitochondrial biogenesis was reduced, evidenced by lower levels of PGC-1α and Tfam, without impact in (auto)mitophagy. Exercise training promoted the reestablishment of ATP synthesis and the expression of complex I and II OXPHOS subunits, as well as an increase in mitochondrial biogenesis markers (including Sirt3) and mitophagy (through Bnip3). Present data highlight the beneficial effects of endurance exercise on cancer cachexia-related muscle remodeling through the regulation of mitochondrial plasticity. As such, our data support the recommendation of physical activity to cancer patients for the management of cachexia.

Mestrado em Bioquímica - Bioquímica Clínica Submitted by Alexandra Bastos (alexandrabastos@ua.pt) on 2016-04-20T11:42:35Z No. of bitstreams: 1 tese.pdf: 2833848 bytes, checksum: 947881f212fa633b195cbc39ca1b8cf6 (MD5) Made available in DSpace on 2016-04-20T11:42:35Z (GMT). No. of bitstreams: 1 tese.pdf: 2833848 bytes, checksum: 947881f212fa633b195cbc39ca1b8cf6 (MD5) Previous issue date: 2015-12-11

Mestrado em Bioquímica - Bioquímica Clínica A perda excessiva e involuntária de peso corporal associada à perda de massa muscular esquelética, uma síndrome correntemente denominada por caquexia, constitui uma manifestação comum em pacientes com cancro associada a um pior prognóstico. Com o objetivo de melhor perceber a relação tumor-hospedeiro no carcinoma mamário e o impacto do exercício físico na regulação desta interação, no presente estudo avaliou-se a contribuição de vias de sinalização anabólicas e catabólicas na regulação da massa do músculo gastrocnemius e relacionou-se com o perfil de mediadores pró-inflamatórios e catabólicos. Para o efeito utilizou-se um modelo animal de rato com carcinoma mamário induzido pela injeção intraperitoneal de uma dose única de 1-metil-1-nitrosureia (MNU). Animais saudáveis e com carcinoma mamário foram submetidos a um programa de exercício físico de reduzida tensão mecânica e longa duração (ERTMLD) em tapete rolante a uma velocidade de 20m/min, 1h/dia, 5dias/semana durante 35 semanas. No final do protocolo verificou-se que cerca de 60% dos animais com carcinoma mamário apresentaram uma perda de peso corporal maior ou igual a 5% associada a uma diminuição superior ou igual a 9% de massa de gastrocnemius. Estes animais apresentaram ainda níveis elevados de marcadores inflamatórios e catabólicos que a nível muscular se refletiram num aumento significativo dos níveis da citocina catabólica miostatina e da proteólise mediada pela E3 ligase atrogina-1. A prática de ERTMLD ao longo da vida promoveu nos animais com tumores mamários uma atenuação do perfil sérico inflamatório e a nível do músculo gastrocnemius observou-se um aumento significativo da expressão de mTOR que parece justificar, pelo menos em parte, o aumento de massa muscular e de peso corporal observado nestes animais. Em conclusão, a prática de exercício físico de reduzida tensão mecânica e longa duração parece constituir uma abordagem terapêutica não farmacológica eficaz para regular a resposta tumor-hospedeiro e assim prevenir, pelo menos parcialmente, a caquexia associada ao cancro. Excessive and involuntary weight loss related to the decrease of skeletal muscle mass, a syndrome known as cachexia, is a common manifestation in cancer patients being related to a poor disease prognosis. Aiming to better understand tumor-host interplay in mammary carcinoma and the impact of exercise training on it regulation, in the present study we evaluate the contribution of anabolic and catabolic signaling pathways to the regulation of gastrocnemius muscle mass and related it with the serum profile of pro-inflammatory and catabolic markers. To fulfill this, an animal model of mammary carcinoma induced by a single intraperitoneal injection of 1-methyl -1- nitrosourea (MNU) was used. Healthy animals and ones with mammary tumors were submitted to a training program in a treadmill at a speed of 20m/min, 1h/day, 5days/week for 35 weeks. At the end of the protocol 60% of the animals with mammary tumors showed a weight loss higher or equal than 5%, which was related to a decrease of gastrocnemius mass higher or equal than 9%. These animals presented higher levels of serum inflammatory and catabolic markers than healthy ones that were related to a significant increase of myostatin and of the E3 ligase atrogin-1 content in the gastrocnemius. Lifelong exercise training prevented the marked serum inflammatory profile noticed in animals with mammary tumors, which was associated to a significant increase of mTOR content at gastrocnemius justifying, at least in part, the increase of its mass and of body weight. Taken together, lifelong endurance training seems an attractive non-pharmacological therapeutic approach to positively modulate tumor-host interplay, preventing, at least in part, cancer cachexia.