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Responsible development of any technology, including nanotechnology, requires protecting workers, the first people to be exposed to the products of the technology. In the case of nanotechnology, this is difficult to achieve because in spite of early evidence raising health and safety concerns, there are uncertainties about hazards and risks. The global response to these concerns has been the issuance by authoritative agencies of precautionary guidance to strictly control exposures to engineered nanomaterials (ENMs). This commentary summarizes discussions at the "Symposium on the Health Protection of Nanomaterial Workers" held in Rome (25 and 26 February 2015). There scientists and practitioners from 11 countries took stock of what is known about hazards and risks resulting from exposure to ENMs, confirmed that uncertainties still exist, and deliberated on what it would take to conduct a global assessment of how well workers are being protected from potentially harmful exposures.

(75)Se-selenite transfer was investigated in a phytoplankton-mussel-rat food chain model consisting of Scenedesmus obliquus (Turpin) Kützing, Unio mancus Lamark and Rattus norvegicus Berkenhout. (75)Se-metabolized forms were investigated in order to identify potential critical steps in the food chain, as well as its relative bioavailability looking also at intracellular, cellular and organ partitioning. Tissue and intracellular distribution of (75)Se in mussels fed with (75)Se-S. obliquus was different compared to those exposed only to inorganic (75)Se-selenite. The intracellular distribution of (75)Se in the hepatopancreas and mantle of mussels fed (75)Se-microalgae was similar to hepatic and renal distributions in rats, suggesting that their stomach dissociated larger (75)Se-containing molecules. The (75)Se partitioned from water (culture medium) to microalgae showing a bioconcentration factor of 435. The bottleneck in the trophic transfer of (75)Se occurred between S. obliquus-U. mancus. From microalgae to mussels and subsequently to rats no bioaccumulation was verified.

Los metales son ubicuos y su acumulación cada vez mayor en el ambiente conduce a serias preocupaciones en términos de seguridad ambiental, ocupacional y del consumidor. Entre otros efectos potenciales sobre la salud, la carcinogenicidad y la neurotoxicidad inducidas por los metales representan un riesgo importante para la sociedad humana y, por lo tanto, merecen ser determinadas completamente. En este contexto, se necesita llevar a cabo un amplio proyecto de investigación in vitro en estas áreas en compuestos metálicos seleccionados. El trabajo se refiere a investigaciones en metalómica destinadas a estudiar las rutas metabólicas de compuestos caracterizados de As, Cd, Cr, Pt, Mn y V mediante modelos experimentales desarrollados en ECVAM, como las líneas celulares de fibroblasto de ratón (Balb/3T3), las variedades de células del feocromocitoma de la rata (PC12) y reagregados de cerebro de rata y sus tipos celulares individuales. Los estudios se han realizado usando técnicas nucleares y radioanalíticas (análisis por activación de neutrones (NAA), radiotrazadores con alta radiactividad específica) y técnicas espectrométricas avanzadas (HPLC-ICPMS y GFAAS). Incluyen la especiación en relación al comportamiento de los compuestos metálicos en los medios de cultivo celular, su absorción, distribución intracelular del metal, y unión con los componentes celulares.Etapas del proyecto de investigación:(i) preparación de los radiotrazadores para etiquetar las diferentes concentraciones de los compuestos metálicos(ii) exposición de modelos in vitro estandardizados a los compuestos estables y/o metales marcados radioactivamente para diferentes periodos de tiempo y rango de concentración(iii) estudios mecanísticos que permitan establecer la relación dosis-efecto en cuanto a la absorción del metal estudiado por todos los compartimentos celulares, como se obtiene por centrifugación diferencial y por técnicas de filtración de gel. Determinación del estado de oxidación del metaloma en los compartimentos de la célula (iv) tratamiento estadístico de los datos y desarrollo de modelos metabólicos., Metals are ubiquitous and increasing accumulation in the environment raises serious concerns in terms of environmental, occupational and consumer safety. Among other potential health effects, metal-induced carcinogenicity and neurotoxicity represent a major risk to the human society and therefore deserves to be fully assessed. In this context, a comprehensive in vitro research project in these areas needs to be conducted on selected metal compounds.The work concern in vitro metallomics investigations concerning metabolic pathways of chemically-characterized As, Cd, Cr, Pt, Mn and V compounds by experimental models developed at ECVAM, such as mouse fibroblast (Balb/3T3), rat pheochromocytoma (PC12) cell lines and rat brain re-aggregates and their individual cell types. The studies will be carried out by using nuclear, radioanalytical (neutron activation analysis (NAA) and use of radiotracers with high specific radioactivity) and advanced spectrochemical (HPLC-ICPMS and GFAAS) techniques. They will include metal speciation concerning behaviour of test metal compounds in cell culture media, uptake, intracellular distribution, binding with cell components.Steps of the research project:(i) preparation of radiotracers for labelling of different concentrations of metal compounds(ii) exposure of standardised in vitro models to stable and/or radiolabelled metal compounds for different time periods and range of concentration(iii) mechanistic studies involving the establishment of dose-effect relationship in relation to uptake of metal tested by whole cell compartments as obtained by differential centrifugation as well as gel filtration techniques. Determination of the oxidation state of metallome in cell compartments(iv) statistical treatment of the data and development of metabolic models.

Los ensayos in vitro de transformación celular abarcan el proceso multifásico que va desde la conversión neoplásica hasta el establecimiento del fenotipo tumorigénico. En la presente tesis doctoral, el ensayo in vitro Balb/3T3, con una línea celular inmortalizada de fibroblastos de ratón, ha sido aplicado para determinar la citotoxicidad y el potencial carcinogénico de una serie de compuestos metálicos seleccionados por su interés ambiental, laboral y biomédico, adoptando una estrategia específica de trabajo en varias etapas. Esto ha implicado una optimización muy precisa del protocolo para determinar la reproducibilidad intralaboratorios del protocolo del ensayo y para asegurar la estabilidad de las condiciones experimentales de aplicación del ensayo Balb/3T3.Por consiguiente, después de la optimización del protocolo adoptado, el proyecto de tesis se desarrolló siguiendo una estrategia de cuatro etapas: a) determinación de la citotoxicidad a unas concentraciones de exposición fijadas (100 µM, 65 compuestos metálicos individuales). Esto permitió la selección de los compuestos metálicos que tendrían prioridad para las investigaciones subsiguientes; b) establecimiento de las relaciones dosis-efecto para 35 compuestos metálicos identificados como de primera prioridad en la etapa (a), para determinar los correspondientes valores de IC50 y un rango adecuado de concentraciones de exposición para ser utilizado en los pasos siguientes; c) determinación del potencial carcinogénico de los compuestos metálicos seleccionados a partir de la etapa (b); d) estudios sobre los mecanismos de transformación de las especies metálicas identificadas en la fase (c). En este contexto, una aproximación mecanística inicial fue la evaluación de la respuesta apoptótica inducida por los compuestos metálicos seleccionados en las células Balb/3T3. Este estudio sobre la apoptosis ha mostrado que se debería utilizar más de un ensayo para establecer inequívocamente la inducción de apoptosis por alguno de los compuestos metálicos en el sistema de ensayo escogido. Esto es debido a la complejidad del problema y a las dificultades para interpretar los datos experimentales. Por otra parte, los hallazgos sobre la respuesta apoptótica inducida por As(III), Cr(VI) y algunos compuestos de Pt sugieren la hipótesis de la existencia de una relación entre los procesos apoptótico, genotóxico y carcinogénico.Con respecto a los estudios mecanísticos y de metabolismo de los metales, los resultados obtenidos aplicando técnicas analíticas únicas y peculiares como el uso de radiotrazadores, espectrometría de masas con plasma de acoplamiento inductivo, y resonancia magnética nuclear han hecho posible obtener interesantes datos metabólicos sobre la entrada y el reparto intracelular de los metales incorporados en las células. Éste es un aspecto generalmente olvidado en los estudios in vitro a pesar de ser un punto clave para la interpretación mecanística de la citotoxicidad y de la actividad transformante inducidas por los compuestos químicos.Además, se encontró un buen nivel de concordancia al comparar los resultados obtenidos de la aplicación del ensayo Balb/3T3 con los modelos in vitro seleccionados de roedores y humanos.En conclusión, la presente tesis representa una importante contribución para hacer que la línea celular Balb/3T3 sea un valioso modelo in vitro para investigar la correlación entre absorción, biotransformación, citotoxicidad y potencial carcinogénico de los compuestos metálicos. Se puede afirmar que el ensayo Balb/3T3 tiene el potencial para ser adecuado para un estudio futuro de validación., In vitro morphological cell transformation tests encompass the multi-step process from neoplastic conversion to the established tumorigenic phenotype. In the present PhD thesis the in vitro Balb/3T3 assay, an immortalised mouse fibroblast cell line, was applied for assessing cytotoxicity and carcinogenic potential of selected metal compounds of environmental, occupational and biomedical interest by adopting a specific multi-stage work strategy. This has involved a very accurate protocol optimisation in order to assess intralaboratory reproducibility of the test protocol and to assure stability of the experimental conditions in which the Balb/3T3 assay was applied.Therefore, after optimisation of the adopted protocol the present PhD project was carried out following a "four steps approach": a) determination of cytotoxicity at a fixed concentration exposure (100 µM, 65 individual metal compounds). This allowed the selection of metal compounds to which priority is given for subsequent investigations; b) setting of dose-effect relationships for 35 metal compounds identified as first priority in step (a), in order to establish the corresponding IC50 values and a suitable exposure range of concentrations to be used in the subsequent steps; c) determination of carcinogenic potential of selected metal compounds from step (b); d) mechanistic studies on transforming metal species as identified in step (c). In this context, an initial mechanistic approach was the evaluation of the apoptotic response induced by selected metal compounds on the Balb/3T3 cells. This study on apoptosis has shown that more than one assay should be used in order to establish unequivocally the induction of apoptosis by a metal compound on the selected test system. This is due to the complexity of the problem and the difficulties to interpret the experimental data. Moreover, the findings on the apoptotic response induced by As(III), Cr(VI) and some Pt-compounds suggest the hypothesis of an existing relationship among apoptotic, genotoxic and carcinogenic processes.With regard to mechanistic studies and metal metabolism, the results obtained applying unique and peculiar analytical techniques like the use of radiotracers, Inductively Coupled Plasma-Mass Spectrometry and Nuclear Magnetic Resonance have made possible to get interesting metabolic data on uptake and intracellular repartition of metals incorporated into cells. This is an aspect generally neglected in in vitro studies although it is a key point for mechanistic interpretation of cytotoxicity and transforming activity induced by chemicals.In addition, a good level of concordance was achieved by comparing the results obtained from the application of the Balb/3T3 assay with selected in vitro rodent and human models.In conclusion, the present PhD project represents an important contribution to make the Balb/3T3 cell line as a valuable in vitro model to investigate correlation between uptake, biotransformation, cytotoxicity and carcinogenic potential of metal compounds. It is to state that the Balb/3T3 assay has the potential to be suitable for a future validation study.

En esta Tesis se han utilizado diferentes modelos de toxicidad in vitro para estudiar los efectos citotóxicos inducidos por metales. Se han usado cuatro líneas celulares, HaCat, PC12, ES D3 y BALB/3T3, como modelos de dermotoxicidad, neurotoxicidad, embriotoxicidad y carcinogénesis y se han llevado a cabo los siguientes estudios:- HaCata) Determinación de la toxicidad inducida por compuestos de platino ((NH4)2PtCl6, PtCl2, y PtCl4) mediante la medida de la eficiencia en la formación de colonias (CFE). PtCl2 y (NH4)2PtCl6 mostraron un efecto citotóxico mayor que PtCl4 y (NH4)2PtCl4. Las respuestas citotóxicas de los compuestos de platino resultaron dependientes del tiempo de exposición y de la forma química del elemento.b) Estudio del efecto citotóxico inducido por 51 metales a una concentración fija de 100 mM durante 72 horas. Este ensayo permitió clasificar las especies de metales en tres grupos según el grado de la respuesta citotóxica obtenida.- PC12Estudio del efecto citotóxico inducido por 24 metales a una concentración fija de 100 mM durante 24 y 72 horas de exposición y utilizando el MTT como ensayo de citotoxicidad. Los experimentos se llevaron a cabo en células cultivadas en ausencia o presencia de tetraciclina, en modo de favorecer (Tet-on) o impedir (Tet-off) la expresion de la p53. Los metales que afectaron la viabilidad celular fueron Ag, As, Cd, Cr, Pt, Se, y Te.- ES D3Estudio del efecto inducido por metilmercurio en la frecuencia de latido de las células ES. La citotoxicidad del compuesto metálico se evaluó durante la primera fase de diferenciación.- BALB/3T3Estudio del potencial citotóxico y carcinogénico de especies orgánicas e inorgánicas de arsénico. A diferencia de NaAsO2 y Na2HAsO4, las formas orgánicas, arsenobetaina y arsenocolina, no produjeron efectos citotóxicos en las células. Sólo las especies inorgánicas de As dieron resultados positivos en el ensayo morfológico de transformación celular. Estos resultados confirman, por una parte, que los compuestos inórganicos de As son biológicamente más activos que los orgánicos y, por otra, la importancia fundamental de la especiación en la respuesta toxicológica., The present research concerns the use of in vitro toxicity testing methods for studying the cytotoxic effects of metal compounds induced in four different cell lines such as HaCaT, PC12, ES D3 and BALB/3T3 as models of dermal toxicity, neurotoxicity, embryotoxicity and carcinogenic potential of xenobiotics. The following studies have been carried out:- HaCaTa) Determination of cytoxicity of Pt compounds ((NH4)2PtCl4, (NH4)2PtCl6, PtCl2 and PtCl4) as measured by Colony Forming Efficiency (CFE). PtCl2 and (NH4)2PtCl6 were more cytotoxic compared to PtCl4 and (NH4)2PtCl4. The cytotoxic responses of the four platimun species was dependent of the time of exposure and on the chemical form of the element.b) Screening test of the cytotoxic induced by 100 mM of 51 metal compounds at 72h post-exposure. This allowed a classification of the metal species tested as 3 groups according to the severity of the degree of their cytotoxic response.- PC12Screening test on the cytotoxic response in relation to the exposure to 100 mM of 24 metal compounds for 24h and 72h as determined by MMT test. The study has been carried out on cells that were grown in absence or presence of tetracycline, a technique that makes (Tet-on) or not (Tet-off) possible the expression p53 gene.Metal compounds which affect cell viability are Ag, As, Cd, Cr, Pt, Se and Te.- ES D3Effect of methyl mercury on the beating of ES cells, Cytotoxic effect of the metal compound was observed during the first step of differentiation.- BALB/3T3Inorganic and organoarsenic species have been studied for their cytotoxic and carcinogenic potential. Unlike NaAsO2 and Na2HAsO4 the organoarsenic forms arsenobetaine and arsenocholine failed to induce any significant cytotoxic effect in the cells, the inorganic As species (but not the organic ones) giving positive results in the morphological neoplastic transformation assay. These findings confirm that inorganic As compounds are biologically more active compared to organoarsenic species, and the great importance of the speciation as fundamental factor in determining the toxicological response.

Almost all people in developed countries are exposed to metal nanoparticles (MeNPs) that are used in a large number of applications including medical (for diagnostic and therapeutic purposes). Once inside the body, absorbed by inhalation, contact, ingestion and injection, MeNPs can translocate to tissues and, as any foreign substance, are likely to encounter the innate immunity system that represent a non-specific first line of defense against potential threats to the host. In this review, we will discuss the possible effects of MeNPs on various components of the innate immunity (both specific cells and barriers). Most important is that there are no reports of immune diseases induced by MeNPs exposure: we are operating in a safe area. However, in vitro assays show that MeNPs have some effects on innate immunity, the main being toxicity (both cyto- and genotoxicity) and interference with the activity of various cells through modification of membrane receptors, gene expression and cytokine production. Such effects can have both negative and positive relevant impacts on humans. On the one hand, people exposed to high levels of MeNPs, as workers of industries producing or applying MeNPs, should be monitored for possible health effects. On the other hand, understanding the modality of the effects on immune responses is essential to develop medical applications for MeNPs. Indeed, those MeNPs that are able to stimulate immune cells could be used to develop of new vaccines, promote immunity against tumors and suppress autoimmunity.