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Cancer immunotherapy has been established as standard of care in different tumor entities. After the first reports on synergistic effects with radiotherapy and the induction of abscopal effects-tumor shrinkage outside the irradiated volume attributed to immunological effects of radiotherapy-several treatment combinations have been evaluated. Different immunotherapy strategies (e.g., immune checkpoint inhibition, vaccination, cytokine based therapies) have been combined with local tumor irradiation in preclinical models. Clinical trials are ongoing in different cancer entities with a broad range of immunotherapeutics and radiation schedules. SDF-1 (CXCL12)/CXCR4 signaling has been described to play a major role in tumor biology, especially in hypoxia adaptation, metastasis and migration. Local tumor irradiation is a known inducer of SDF-1 expression and release. CXCR4 also plays a major role in immunological processes. CXCR4 antagonists have been approved for the use of hematopoietic stem cell mobilization from the bone marrow. In addition, several groups reported an influence of the SDF-1/CXCR4 axis on intratumoral immune cell subsets and anti-tumor immune response. The aim of this review is to merge the knowledge on the role of SDF-1/CXCR4 in tumor biology, radiotherapy and immunotherapy of cancer and in combinatorial approaches.

Additional file 3: Figure S3. Spectratype analysis of patient PBMCs without prior short term culture. TCR repertoire analysis including 34 TCRα and 24 TCRβ families. Numbers indicate CDR3 sequencing data gained in direct sequencing approaches (see Table 3). Peak numbers marked in grey harbor CMV-specific sequences.

The lifelong generation of αβT cells enables us to continuously build immunity against pathogens and malignancies despite the loss of thymic function with age. Homeostatic proliferation of post-thymic naïve and memory T cells and their transition into effector and long-lived memory cells balance the decreasing output of naïve T cells, and recent research suggests that also αβT-cell development independent from the thymus may occur. However, the sites and mechanisms of extrathymic T-cell development are not yet understood in detail. γδT cells represent a small fraction of the overall T-cell pool, and are endowed with tremendous phenotypic and functional plasticity. γδT cells that express the Vδ1 gene segment are a minor population in human peripheral blood but predominate in epithelial (and inflamed) tissues. Here, we characterize a CD4(+) peripheral Vδ1(+) γδT-cell subpopulation that expresses stem-cell and progenitor markers and is able to develop into functional αβT cells ex vivo in a simple culture system and in vivo. The route taken by this process resembles thymic T-cell development. However, it involves the re-organization of the Vδ1(+) γδTCR into the αβTCR as a consequence of TCR-γ chain downregulation and the expression of surface Vδ1(+)Vβ(+) TCR components, which we believe function as surrogate pre-TCR. This transdifferentiation process is readily detectable in vivo in inflamed tissue. Our study provides a conceptual framework for extrathymic T-cell development and opens up a new vista in immunology that requires adaptive immune responses in infection, autoimmunity, and cancer to be reconsidered.

T-Zellen spielen bei der Aufrechterhaltung des Gesundheitszustandes des Körpers eine entscheidende Rolle, die durch ein möglichst breites Antigenerkennungspotiential, also einen diversen TZR-Pool, gewährleistet wird. Durch thymische Involution und Selektionsmechanismen sinkt mit zunehmendem Alter, vor allem auch nach klinisch indizierter Immundeprivation, jedoch sowohl die Rate der T-Zell-Neogenese als auch die T-Zell-Diversität, wodurch das Risiko einer schweren Erkrankung zunimmt. Es konnte in der Vergangenheit gezeigt werden, dass sich naive T-Zellen unter klar definierten Bedingungen (z.B. in sek. Lymphorganen oder durch TZR-Revision) auch extrathymisch entwickeln können. Die Rekonstitution des T-Zellrepertoires über die extrathymische/in vitro Entwicklung autologer T-Zellen stellt damit einen Rescuemechanismus mit hohem therapeutischem Potential dar. Für den hauptsächlich gewebeständigen Subtyp der γδT-Zellen, Vδ1+CD4+T-Zellen, konnte der Klassenwechsel von γδ zu αβT-Zelle (Transdifferenzierung) bereits gezeigt werden. Die Parameter, die diesen Vorgang triggern, konnten bisher allerdings noch nicht identifiziert werden. In der vorliegenden Arbeit sollten deshalb Vδ1+CD4+T-Zell-Progenitoren weiter charakterisiert und das für sie beschriebene Potential der Transdifferenzierung in αβT-Zellen untersucht werden. Die möglichen Analogien der Transdifferenzierung zur thymischen T-Zellenwicklung und TZR-Revision wurden dabei in der inflammatorischen Standardkultur und in Experimenten mit konditionierten Zellkulturüberständen genauer untersucht. Die Charakterisierung der Vδ1+CD4+T-Zell-Klone auf Genexpressions- und Proteinebene (v. a. via qPCR, Durchflusszytomerie, Sequenzierung) zeigten, dass Vδ1+CD4+T-Zellen ein heterogener Progenitorpool sind, dass nicht alle Vδ1+CD4+T-Zellen ex vivo kultivierbar sind, dass diese Zellen vielfältige Liganden/Rezeptor-Paare tragen (z.B. Notch/Notch-Liganden, Integrine, CD58/CD2) über die eine homotypische Interaktion möglich ist und dass sie in der Standardkultur, die eine milde Inflammation darstellt, nicht spontan transdifferenzierten. Die experimentellen Ansätze mit von Immunzellen präkonditionierten Zellkulturmedien zeigten, dass Komponenten des darin enthaltenen Sektretoms und eine hohe räumliche Nähe (3D-Kontext) der Progenitoren die Transdifferenzierung wahrscheinlicher machen, dass dafür akzessorische Zellen nicht obligat sind und dass weder ein inflammatorisches Milieu noch die Stimulation über den TZR allein die Transdifferenzierung initiieren können. Die Ergebnisse der Untersuchungen lassen den Schluss zu, dass die Transdifferenzierung durch eine Sequenz multifaktorieller Trigger, durch die Kombination von Rezeptor-Interaktionen und universellen Sekretomkomponenten, möglicherweise im Kontext der Wundheilung, hervorgerufen wird. Dies hebt die Bedeutung von Vδ1+CD4+T-Zellen für die Homöostase hervor und ist sowohl mit ihrer Eigenschaft in entzündetes Gewebe zu migrieren als auch ihrem „innate-like“ Charakter gut vereinbar.

Hämatologische Erkrankungen wie Leukämien sowie solide Tumore mit Metastasenbildung haben häufig eine schlechte Prognose. Standardisierte Therapien, wie Chemo- und Strahlentherapie, können initial Remissionen erzeugen sind aber häufig mit einem Rezidiv verbunden und in Folgetherapien weniger wirksam, da die Tumorzellen einen erworbenen Selektionsvorteil gegen diese Therapie entwickelt haben. Die Immuntherapie wird immer wichtiger in der Tumortherapie. Basierend auf der Physiologie der Immunzellen kann spezifisch mit dem eigenen Immunsystem oder nach hämatopoetischer Stammzellentransplantation (HSCT) mit allogenen Immunzellen der Tumor/ die Leukämie bekämpft werden. Eine Form der Therapie ist die anti-Tumor-Vakzinierung. Aus Tumorgewebe werden die Mutationen mit Next-Generation Sequencing (NGS) identifiziert, entsprechende Impfpeptide designt und diese, analog zu den klassischen Impfungen, dem Patienten in Kombination mit einem Adjuvans appliziert und so die T-Zellen des Patienten gegen den eigenen Tumor gerichtet. Eine weitere Form der Immuntherapie, besonders bei Leukämiepatienten angewandt, ist die HSCT. In Vorbereitung auf die Transplantation werden die Patienten aufgrund der maximalen Chemotherapie immundefizient, da die hoch konzentrierte Chemotherapeutika alle hämatopoetischen Zellen zerstört. Nach anschließender allogener HSCT bilden transplantierte Stammzellen, nach dem Anwachsen, der Differenzierung und Proliferation in dem Patienten, ein gesundes Immunsystem. Dieses reagiert im optimalen Fall gegen die Leukämiezellen. Beide Therapien, die HSCT sowie die Patienten-individuelle anti-Tumor-Vakzinierung nutzen das Potenzial aktivierter T Zellen und können dem Patienten mit Krebs einen Überlebensvorteil ermöglichen. Im Gegensatz zu den erwünschten T-Zellantworten sind aktivierte T-Zellen, die nach einer HSCT, das Gewebe und die Organe des Empfängers angreifen und eine Autoimmunerkrankung oder eine graft-versus-host disease (GvHD) induzieren unerwünscht. Therapien mit Kortison und Immunsuppressiva führen häufig zu lebensbedrohlichen Infektionen und reduzieren den Behandlungserfolg. Neue Therapiestrategien für Abstoßungsreaktionen fehlen und Forschungen bezüglich neuer Medikamente sind aufgrund fehlender Tiermodelle mit humaner chronischer GvHD schwierig. Für den ersten Teil der Arbeit, die Analyse immunreaktiver T-Zellen nach individueller anti-Tumor-Vakzinierung untersuchten wir, bei einem, an Pankreaskarzinom erkrankten 62-jährigen Patienten, nach Resektion und Detektion zweier Missense -Mutationen in einer Lebermetastase, über Exomsequenzierung, ob die darauf abgestimmten vier synthetisierten Impfpeptide mit Tumor-spezifischer Mutation, unter Berücksichtigung der MHC-Restriktion des Patienten, eine anti-tumorale T-Zellantwort induzieren konnten. Die Impfung erfolgte monatlich in einem Zeitraum von 5 Jahren. Die durch Impfpeptide reaktivierten T-Zellen, isolierten und untersuchten wir an 3 verschiedenen Zeitpunkten, nach 12, 17 und 34 Impfungen und konnten eine erfolgreich etablierte anti-tumorale Impfpeptid- und T-Zell-spezifische Immunantwort nachweisen. Basierend auf den molekular identifizierten CDR3-Regionen dieser T Zellen konnten wir sowohl Persistenz und Breite der induzierten Immunantwort zeigen sowie durch konvergente CDR3-Regionen der TCRs Rückschlüsse auf die Immunogenität der Impfpetide schließen. Der Patient profitierte von der Vakzinierung, er zeigte keine Nebenwirkungen und lebte 6 Jahre ohne Rezidiv. Im zweiten Teil der Arbeit, untersuchten wir 15 CD34+ selektionierte / CD3+ depletierte humane Stammzelltransplantate in NSG Mäusen auf ihr Potenzial eine Abstoßung zu induzieren. Wir konnten zeigen, dass transplantierte CD34+ humane Stammzellen in den Mäusen anwachsen und in 2 der 15 Transplantaten ab der 24. Woche sich eine systemische, autoimmune cGvHD entwickelte, die in Lunge, Leber, Haut, Gingiva und Darm auftrat. Die beiden Transplantate unterschieden sich von den Transplantaten der anderen 13 Spendern in den HLA-Merkmalen, das heißt beide GvHD induzierende Transplantate zeigten einen Haplotyp, der mit einem erhöhten Risiko für die Entwicklung einer GvHD oder Autoimmunerkrankung assoziiert ist. Beide Haplotypen werden definiert als HASEH engl.: human autoimmunity susceptibility extended HLA haplotypes. Die reaktiven T-Zellen, CD4+ TH2-Zellen, mit autoreaktiven CDR3-Regionen, exprimieren in den betroffenen Geweben der erkrankten Mäuse, verstärkt die profibrotischen Zytokine IL-13 und IL-4 und verursachen sclerodermatöse Haut, eine fibrotische Lunge, verschiedene Hepatitis und massive Zahndeformationen bis hin zum Zahnverlust. Die Besonderheit dieses CD34+ NSG-Modells, weder Thymus oder Thymus-abgeleitete regulatorische T-Zellen (nTreg) noch B-Zellen konnten nachgewiesen werden, was die Rolle des genetischen Polymorphismus und der Zytokine bezüglich der Pathogenese der cGvHD verdeutlicht. Die Etablierung eines solchen Modells, das erstmals die chronische, autoimmune Variante der Abstoßungsreaktion in seiner multiorganen Pathologie induziert, eignet sich für Untersuchungen, die zur Aufklärung der Pathophysiologie humaner Autoimmunität und cGvHD beitragen und bietet die Möglichkeit, neue Behandlungsstrategien zu entwickeln und zu untersuchen.

Tumor-spezifische T-Zellen, die definierte Epitope auf dem Tumor von Patienten erkennen, finden bereits seit mehreren Jahren therapeuthische Anwendung. Durch ihre Spezifität ist ihre Gabe mit einem hohem anti-tumoralem Effekt und geringen Nebenwirkungen verbunden. Durch die Generierung von T-Zellen, die Gewebe-spezifisch exprimierte Epitope erkennen, kann die zytolytische Wirkung ebenfalls gezielt auf ein Gewebe beschränkt werden. Nach Chemotherapie und Transplantation kann durch sie das Risiko eines Rezidivs gesenkt oder gar ganz vermieden werden. Da die T-Zellen spezifisch sind, können sie beispielsweise auch von einem haploidenten oder MUD (matched unrelated donor) Spender generiert werden. Nicht nur bei Tumorerkrankungen, auch bei Virusinfektionen wie z.B. ADV, CMV, EBV oder HIV spielen spezifische T-Zellen eine wichtige Rolle in der Immunkompetenz und damit für immunsupprimierte Patienten. Auf molekularer Ebene lassen sich T-Zellen anhand ihrer verwendeten TCR-Segmente und ihrer einzigartigen CDR3-Region diskriminieren, ebenso wie durch die selektive Bindung an Epitop beladene Tetramere. In wenigen Fällen werden Gemeinsamkeiten, bzw. idente TCRs bei nicht-verwandten Individuen beobachtet, die man als public TCRs bezeichnet. In der vorliegenden Arbeit wurden für die Validierung von in silico identifizierten Hämatopoese-restringierten potentiell immunogenen Epitopen initial naive, Antigen-unerfahrene CD45RO- CD8+ T-Zellen eingesetzt. Da keines der untersuchten Epitope bei verschiedensten jeweils Epitop-HLA-gematchten Spendern mit entsprechender SNP Konstellation eine T-Zellantwort induziert werden konnte, wurden Bulk Vδ1+ T-Zellkulturen oder Vδ1+ CD4+ T-Zellklone zur Generierung von Virus-spezifischen αβ T-Zellen verwendet. Ihre Differenzierung in der Kultur mit verschiedenen Virus- und Tumor-Peptid gepulsten autologen Feederzellen wurde gemonitort und die Transdifferenzierung zu αβ T-Zellen auf molekularer und zellbiologischer Ebene dokumentiert sowie ihre Spezifität untersucht. Da Vδ1+ CD4+ T-Zellklone das Potential eines αβ T-Zellprogenitors besitzen, wurden sowohl die CDR3-Region der eingesetzen Klone als auch die der transdifferenzierten αβ T-Zellen per Direktsequenzierung identifiziert. Keiner der Versuchsansätze konnte Tetramer-bindende Epitop-spezifische T-Zellen generieren. Die Diversität der jeweiligen CDR3-Sequenzen, die die generierten T-Zellen zeigten, war jedoch unerwartet hoch. Interessanterweise waren sie zwar für das eingesetze Peptid nicht spezifisch, jedoch wiesen sie überraschend häufig Gemeinsamkeiten mit CDR3-Regionen Tumor- oder Viruspeptid-spezifischer publizierter TCRs auf. Damit kann ein erheblicher Anteil an generierten und identifizierten TCRs der transdifferenzierten αβ T-Zellen als public deklariert werden. Um diesen Versuchsansatz für die Anwendung in der Klinik zur Generierung epitopspezifischer T-Zellen einsetzbar machen zu können muss jedoch die Progenitorfrequenz deutlich erhöht werden, damit die statistische Wahrscheinlichkeit gegeben ist, dass verläßlich ein αβ TCR generiert wird, der das eingesetzte Peptid erkennen kann. Begleitend dazu wurden funktionelle Studien zur Identifikation des Triggers der Transdifferenzierung durchgeführt. Dabei konnten Vδ1+ CD4+ T-Zellklone alleine oder im Kontext mit DN und CD8+ Vδ1+ T-Zellen erneut erfolgreich unter Standardkulturbedinungen zu αβ T-Zellen transdifferenziert werden. Ein formeller Beweis bzw. der ausschlaggebende Parameter, der diese Differenzierung induziert, konnte aber in dieser Arbeit erneut nicht identfiziert werden. Untersuchungen der Ligandenbindenden Region der Vδ1 TCRs der CD4+ Klone zeigten in den nicht Keimbahn-kodierten CDR3-Regionen der δ-Ketten teilweise identische Sequenzen in unterschiedlichen Probanden.

Unsere Versuche zur Generierung BZLF-1 Peptidspezifischer peripherer αβ T-Zellen in einer in-vitro-Umgebung ohne Thymus, haben wir mit αβ-depletierten PBMC (Peripheral Blood Mononuclear Cell) begonnen, in denen nur noch Vδ1+ T-Zellen das T-Zell-Kompartiment stellten. Als T-Zell-Spender dienten vier gesunde HLA-B35+ Probanden im Alter von 28 bis 45 Jahren (zwei Männer, zwei Frauen). HLA-B35+ Spender wurden gewählt, da das Peptid BZLF-1, das wir wöchentlich zum Standardmedium hinzugegeben haben, HLA-B35-restringiert ist. Bei dem Peptid BZLF-1 handelt es sich um das EBV-abgeleitete HLA-B*3501-restringierte BZLF154-64 (EPLPQGQLTAY) Peptid, welches vom ELS4 TCR erkannt wird. Die αβ-T-Zell-depletierte PBMNC Fraktion der vier unterschiedlichen Spender wurde wöchentlich mit bestrahlten autologen mononukleären Zellen des peripheren Blutes (Feeder-Zellen) der jeweiligen Spender versetzt. Im Laufe der vierwöchigen Zellkultur wurde den Zellen zudem - zusammen mit den bestrahlten Feeder-Zellen - wöchentlich ein Standard-Kulturmedium, das u.a. PHA, Il-2 und Il-7 enthielt, hinzugegeben. Während das Medium für die eine Hälfte der Ansätze BZLF-1 erhielt, wurde das Medium für die andere Hälfte nicht mit BZLF-1 versetzt (Kontrollansatz). Im Laufe des Versuches wurde ein wöchentliches FACS-Monitoring zur Observation der αβ-T-Zell-Population durchgeführt (bis zur 4. bzw. 5. Woche) und Zellmaterial für nachfolgende RNA-Isolierungen (bis zur 4. Woche) gesammelt. Aus den gewonnen Zellmaterialien wurde die RNA isoliert und komplementäre DNA (cDNA) hergestellt. Im Anschluss erfolgte die Analyse der Proben durch Vα- und Vβ-Spectratyping. Eindeutig identifizierbare Einzelpeaks wurden sequenziert, um die spezifischen Aminosäuresequenzen der TCRα bzw. TCRβ CDR3-Regionen zu ermitteln. Die Generierung von αβ-TCR-exprimierenden Zellen aus Vδ1+, αβ-TCR-depletierten Zellpopulationen konnte beobachtet werden. Dabei zeigte sich eine hohe interindividuelle Varianz der Anzahl der (Vδ1+-)Progenitoren und der Anzahl der αβ T-Zellen. Die native Vδ1+ CD4+ Population und die Anzahl der generierten αβ+ T-Zellen korrelieren in den Peptid-gepulsten Kulturansätzen, jedoch nicht in nicht-Peptid-gepulsten Kulturen. Interessanterweise konnten keine BZLF-1 Peptid-spezifischen T-Zellen nachgewiesen werden. Die Analyse erfolgte mit BZLF-1-Pentameren.