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Recognition between proteins and carbohydrates is fundamental in many biological processes, such as viral, bacterial and parasitic infections, separation of cells and soluble components, fertilization, growth, differentiation and cancer metastasis. Changes in glycosylation patterns present in these affected cells are striking evidence of these disorders and disease progression. Within this problematic the use of lectin can facilitate, therefore, the discovery of new biomarkers, considering that they are proteins able to bind specifically and reversibly to carbohydrates. Among the plant lectins, the most extensively studied are those isolated from the legume family species, with emphasis in this work the lectin of Canavalia bonariensis (CaBo), a lectin glucose/mannose specific. In the present work, we report the crystalline structure of CaBo determined in atomic resolution in the presence of α-methyl-mannoside, a specific ligand. Similar to the structural characteristics of other legume lectins, CaBo presented the jellyroll motif and a metal binding site occupied by calcium ions and manganese near the carbohydrate recognition domain (CRD). The cytotoxic potential of CaBo on glioma cell cultures of C6 lines (rat) was investigated and the results demonstrated its ability to affect cell viability and migration by autophagy induction and cell death, suggesting the potential antiglioma for the lectin. In order to investigate the mechanisms of action of this protein, the structural aspects of the lectin were analyzed through the tools of docking and molecular dynamics. The results corroborate with previous data indicating that the biological activity of lectin occurs mainly through interactions with glycoproteins, since lectin interacted favorably with several N-glycans and also demonstrated its interaction stability with mannose-type binders. Thus, in view of the biotechnological potential already reported for this lectin, the production of the recombinant form of CaBo in a heterologous system was also sought through this work, so that rCaBo was properly expressed using E. coli cells. O reconhecimento entre proteínas e carboidratos é fundamental em muitos processos biológicos, tais como infecções virais, bacterianas e parasitárias, separação de células e componentes solúveis, fertilização, crescimento, diferenciação e metástase do câncer. Modificações nos padrões de glicosilação presentes nessas células afetadas são indício marcantes dessas patologias e progressão da doença. Dentro dessa problemática o uso de lectina pode facilitar, portanto, a descoberta de novos biomarcadores, tendo em vista que são proteínas capazes de se ligar de modo específico e reversível a carboidratos. Dentre as lectinas vegetais, as mais extensivamente estudadas são as isoladas a partir das espécies pertencentes à família das leguminosas, com destaque neste trabalho a lectina de Canavalia bonariensis (CaBo), uma lectina glicose/manose específica. No presente trabalho, relatamos a estrutura cristalina de CaBo determinada em resolução atômica na presença de α-metil-manosídeo, um ligante específico. Similar às características estruturais de outras lectinas de leguminosas, a CaBo apresentou o motivo jelly-roll e um sítio de ligação de metal ocupado por íons de cálcio e manganês próximos ao domínio de reconhecimento de carboidratos (CRD). O potencial citotóxico da CaBo sobre culturas celulares de glioma das linhagens C6 (rato) foi investigado e os resultados demonstraram a sua capacidade de afetar a viabilidade celular e a migração por indução de autofagia e morte celular, sugerindo o potencial de antiglioma da lectina. Em busca de investigar os mecanismos de ação dessa proteína, os aspectos estruturais da lectina foram analisados através das ferramentas de docking e dinâmica molecular. Os resultados corroboram com dados anteriores, indicando que a atividade biológica da lectina ocorre principalmente através de interações com glicoproteínas, uma vez que a lectina interagiu favoravelmente com vários N-glicanos e ainda demonstrou sua estabilidade de interação com ligantes do tipo manose. Assim, diante do potencial biotecnológico já relatado para essa lectina buscou-se também através deste trabalho produção da forma recombinante da CaBo em sistema heterólogo, de modo que a rCaBo foi devidamente expressa em utilizando-se células de E. coli.

SILVA, Mayara Torquato Lima da. Determinação da estrutura primária e avaliação preliminar dos efeitos inflamatórios de uma lectina de Canavalia bonariensis lindl. 2015. 62 f. Dissertação (Mestrado em Biotecnologia de Recursos Naturais)-Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, 2015. Lectins are (glycol) proteins that bind specifically and reversibly to carbohydrates. These proteins, in particular those from plant, are important tools in glicobiochemistry and glycobiology. Canavalia bonariensis Lindl is a species of Leguminosae family, Papilionoideae subfamily, tribe Phaseoleae, subtribe Diocleinae, native of the southern region of the country. In this work was realized the analysis of the primary sequence of CaBo (Canavalia bonariensis lectin) and preliminary evaluation of the pro-inflammatory effects of the lectin. The purification of CaBo was realized through affinity chromatographic and the process was monitored by SDS-PAGE and hemagglutinating activity. It was observed that the purified lectin is characterized by an electrophoretic profile that consists of a higher band with approximately 29 kDa, and two bottom bands with apparent molecular mass of 14 and 12 kDa. CaBo was tested for the thermostability of their hemagglutinating activity after incubation for one hour at different temperatures, losing activity only at 80° C after one hour. Regarding its stability at different pH, CaBo was stable in a pH range between 7.0 and 9.0. The CaBo activity was also affected after serial dilution in the presence of the chelating agent EDTA and it was recovered significantly after addition of CaCl2 and MnCl2, proving to be dependent of divalent metal cations. The analysis by mass spectrometry indicated that CaBo has an α chain with molecular mass of 25512 kDa and and two subunits (β and γ chains) with molecular mass of 12999 Da and 12537 Da, respectively. The primary sequence of the lectin was determined by a combination of tandem mass spectrometry and molecular biology, by the translation of cDNA isolated from the lectin’s gene. CaBo presented high sequencial similarity with lectins from the same subtribe and the phylogenetic evaluation indicated that the protein must be the most primitive among lectins from the same gender. CaBo showed inflammatory activity in the rat paw edema model, and it is necessary to realize others test in order to elucidate the biological effect of the lectin. Lectinas são (glico) proteínas que se ligam de maneira específica e reversível a carboidratos. Essas proteínas, em particular as de origem vegetal, são consideradas importantes ferramentas nos estudos de glicobiologia. Canavalia bonariensis Lindl é uma espécie pertencente à família Leguminosae, subfamília Papilionoideae, tribo Phaseoleae, sub-tribo Diocleinae e nativa da região sul do país. Neste trabalho foi realizado a elucidação e análise da sequência primária da CaBo (Lectina de Canavalia bonariensis), bem como uma avaliação preliminar dos efeitos inflamatórios da lectina. A purificação da CaBo foi realizada por meio de cromatografia líquida e o processo foi monitorado por SDS-PAGE e atividade hemaglutinante. Se observou que a lectina purificada é caracterizada por um perfil eletroforético composto por uma banda superior de aproximadamente 25 kDa e duas bandas inferiores de massa molecular aparente de aproximadamente 14 e 12 kDa. CaBo foi testada quanto à termoestabilidade da sua atividade hemaglutinante após incubação por 1 hora em diferentes temperaturas perdendo atividade somente a 80°C após 1 hora. Quanto à estabilidade em diferentes pH, ela manteve-se estável em uma faixa de pH entre 7,0 e 9,0. A atividade da CaBo também foi afetada após diluição seriada na presença do agente quelante EDTA e foi recuperada significativamente após adição de CaCl2 e MnCl2, mostrando-se dependente de cátions metálicos bivalentes. A análise por espectrometria de massas indicou que a CaBo possui uma cadeia α de massa 25512 Da e duas subunidades (cadeias β e γ) de massa 12999 Da e 12537 Da, respectivamente. A sequência primaria da lectina foi determinada por associação das técnicas de espectrometria de massas sequencial e biologia molecular, pela tradução do cDNA do gene isolado da lectina. A CaBo apresentou alta similariedade sequencial com lectinas da mesma subtribo e a avaliação filogenética indicou que a proteína deva ser a mais primitiva dentre as lectinas do mesmo gênero. A CaBo apresentou atividade inflamatória no modelo de pata de rato, sendo necesssário realização de demais testes a fim de elucidar o efeito biológico da lectina.