Search

High mobility group box protein 1 (HMGB1) is a nuclear DNA binding protein and a potent pro-inflammatory mediator when released from cells. Recently, it has become obvious that HMGB1 plays a role in the pathogenesis of both human and experimental diseases such as arthritis and sepsis. Investigations of HMGB1 in diverse pathological conditions, however, have been precluded due to the absence of a sensitive and reliable analytical system for the detection of HMGB1 in biological fluids. In the first part of this thesis sensitive ELISAs for the detection of HMGB1 in cell culture medium and cell lysates were established. However, these assays failed to reliably quantitate HMGB1 in human serum and plasma. We found that serum/plasma components, including autoantibodies to HMGB1, bind to HMGB1 and interfere with its detection by ELISA systems. In addition to complex formation and interference with HMGB1 detection by ELISA, these HMGB1-interacting proteins may also modulate cytokine activity of HMGB1. Pathogenic autoantibodies against double stranded (ds) DNA and nucleosomes represent a hallmark of systemic lupus erythematosus (SLE). However, the factors involved in breaking the immunological tolerance against these nuclear components are not fully understood. The “endogenous adjuvant” HMGB1 gets tightly attached to hypoacetylated chromatin during apoptotic cell death. In conditions of clearance deficiency, as it is the case in many patients with SLE, non-ingested apoptotic cells may undergo secondary necrosis, thereby releasing nucleosomes containing HMGB1. In the second part of this work, we investigated whether HMGB1 nucleosome complexes are in fact detectable in vitro and in vivo and may contribute to the breakdown of immunological tolerance against dsDNA and nucleosmes. We found that HMGB1 remains bound to nucleosomes released from late apoptotic cells in vitro. Moreover, HMGB1 nucleosome complexes were detected in sera and plasma from SLE patients. HMGB1 containing nucleosomes from apoptotic cells were potent inducers of cytokines from macrophages and induced cytokine release and maturation of DC, which was crucially dependent on the presence of HMGB1. Cytokine release from macrophages was dependent on the presence of MyD88 and Toll-like receptor (TLR) 2. In vivo, immunizations with nucleosomes from apoptotic cells induced anti-dsDNA and anti-histone IgG responses in non autoimmune mice, whereas nucleosomes from viable cells did not. In conclusion, HMGB1 nucleosome complexes activate antigen presenting cells and, thereby, may crucially contribute to the immunopathogenesis of SLE via breaking the immunological tolerance against nucleosomes/dsDNA and could represent a target for immunomodulatory therapy. HMGB1 (high mobility group box 1) ist nicht nur intrazellulär als strukturelles Kernprotein für die Chromatinarchitektur und Transkriptionskontrolle, sondern auch extrazellulär als proinflammatorisches Zytokin bedeutend. Es wird vermutet, dass HMGB1 eine wichtige Rolle bei der Pathogenesse von Sepsis und rheumatoider Arthritis spielt und somit einen potentiellen therapeutischen Angriffspunkt darstellt. Aufgrund der mangelhaften Nachweismethoden für HMGB1 in biologischen Flüssigkeiten gibt es kaum klinische Untersuchungen insbesondere an größeren Kollektiven. Im ersten Teil dieser Arbeit sollte daher ein sensitives ELISA-System zum Nachweis von HMGB1 in Zellkultur-Überständen und Zelllysaten entwickelt werden. Mit diesem ELISA konnte jedoch kein zuverlässiger Nachweis von HMGB1 in Serum/Plasma Proben erfolgen, da Särumkomponenten, einschließlich IgG- und IgM-Autoantikörper gegen HMGB1, an zirkulierendes HMGB1 binden und dadurch die Detektion im ELISA beeinträchtigen. Außerdem können HMGB1 interagierende Serumproteine die Zytokinaktivität des HMGB1 modulieren. Antikörper gegen doppelsträngige-DNS (dsDNS) und Nukleosomen sind charakteristische serologische Marker für den systemischen Lupus erythematodes (SLE). Die Faktoren, die verantwortlich sind für den Verlust der immunologischen Toleranz gegen die nukleären Autoantigene, sind jedoch noch nicht vollständig charakterisiert. Während HMGB1 bei nekrotischem Zelltod rasch freigesetzt wird, bleibt es beim apoptotischen Zelltod intrazellulär fest mit dem Chromatin assoziiert. Da bei zahlreichen SLE-Patienten ein Defekt in der Phagozytose apoptotischer Zellen besteht, können diese sekundär nekrotisch werden und dabei Nukleosomen freisetzen, die mit dem „endogenen Adjuvans“ HMGB1 assoziiert sind. Dieser Prozess könnte somit die Autoimmunreaktion gegen das Nukleosom, einem zentralen Autoantigen beim SLE, fördern. Daher wurde im zweiten Teil dieser Arbeit untersucht, ob HMGB1-Nukleosomen Komplexe tatsächlich in vitro und in vivo freigesetzt werden und ob sie eine inflammatorische und immunogene Wirkung besitzen. Es wurde gezeigt, dass Nukleosomen, die von spät-apoptotischen Zellen freigesetzt werden, mit HMGB1 assoziiert sind. Auch im Blut von SLE-Patienten wurden HMGB1 Nukleosomen Komplexe nachgewiesen. Ferner wurde demonstriert, dass die HMGB1 beinhaltenden Nukleosomen Induktoren für die Sekretion von Zytokinen durch Makrophagen und für die Reifung dendritischer Zellen (DC) sind, wofür eindeutig das Nukleosomenassoziierte HMGB1 verantwortlich gemacht werden konnte. Die Zytokinfreisetzung von Makrophagen war dabei abhängig vom Toll-like Rezeptor 2 vermittelten Signalweg. Schließlich konnte durch die Immunisierung mit Nukleosomen, isoliert aus apoptotischen Zellen, die Bildung von Antikörpern gegen dsDNS and Histone in nichtautoimmunen Mausstämmen induziert werden. Zusammenfassend konnte gezeigt werden, dass Nukleosomen aus apoptotischen Zellen, die mit dem „endogenen Adjuvans“ HMGB1 assoziiert sind, Antigen-präsentierende Zellen aktivieren und dadurch die Entstehung der Autoimmunreaktion gegen Nukleosomen beim SLE entscheidend fördern können.